Биологически активные и/или целевые дендримерные конъюгаты

Биологически активные и/или целевые дендримерные конъюгаты

Реферат

 

Изобретение относится к дендримерным полимерным конъюгатам, содержащим по крайней мере один плотный звездчатый полимер, ассоциированный по крайней мере с одной единицей по крайней мере одного биологического модификатора ответа. Конъюгат может иметь указатель цели (мишени), являясь при этом биологически активным агентом. Плотные звездчатые полимеры используются в качестве носителей с/х, фармацевтических и др. материалов. 14 с. и 118 з.п. ф-лы, 62 ил., 25 табл.

Область техники, к которой относится изобретение.

Изобретение относится к применению плотных звездчатых полимеров в качестве носителей сельскохозяйственных, фармацевтических и других материалов, особенно таких материалов, которые являются биологически активными и/или целевыми. Изобретение также включает в себя дендритные полимеры в качестве носителей биологических модификаторов ответа, которые также могут быть целевыми.

Известна композиция, содержащая дендритный полимер, образующий комплекс по крайней мере с одной единицей несущего материала, (см. WO, заявка 88/01180, кл. A 61 K, 49/02, 1988).

Предпосылки создания изобретения В последние годы разработаны полимеры, названные плотными звездчатыми полимерами, или STARBURST ("ВЗРЫВ ЗВЕЗДЫ") - полимерами (торговая марка фирмы Dendritech Inc.).

Было установлено, что размер, форма и свойства этих плотных звездчатых полимеров могут быть молекулярно оформлены так, чтобы соответствовать конкретному конечному назначению. Плотные звездчатые полимеры имеют значительные преимущества, которые могут дать средства передачи высоких концентраций носимого материала на единицу полимера, контролируемой передачи, целевой передачи и/или многократной передачи или применения частиц.

Краткое описание изобретения В одном аспекте, настоящее изобретение относится к полимерным коньюгативным материалам, содержащим плотные звездчатые полимеры, ассоциированного с желаемыми материалами (далее эти полимерные коньюгаты часто называются "плотными звездчатыми полимерными коньюгатами", или "плотными звездчатыми коньюгатами", или "коньюгатами"), способу получения этих коньюгатов, композициям, содержащим коньюгаты, и способам применения коньюгатов и композиций.

Также изобретение охватывает плотный звездчатый полимер, ассоциированный по крайней мере с одним указателем цели (направителем) и по крайней мере одной единицей переносимого материала. Такие конъюгаты могут быть включены в рецептуры вместе с приемлемыми носителями, разбавителями и наполнителями, предназначенные, например, для фармацевтического или сельскохозяйственного применения.

Конъюгаты настоящего изобретения предназначены для использования в ряде применений, где требуется заданная передача, и, в частности, предназначены для передачи биологически активных агентов. В предпочтительном варианте настоящего изобретения плотные звездчатые конъюгаты состоят из одного или более плотных звездчатых полимеров, ассоциированных с одним или более биоактивных агентов.

В одном аспекте изобретения, плотный звездчатый полимерный конъюгат применяется для передачи переносимого биологически активного агента (например, биологического модификатора), имеющего по крайней мере один плотный звездчатый полимер, ассоциированный по крайней мере с одной единицей по крайней мере одного переносимого биологически активного агента, причем полимер имеет (a) ядро инициатора, (b) не менее двух концентрических дендритных слоя ("генераций") с симметричными разветвлениями, причем слои расходятся радиально в геометрической прогрессии от ветви ядра, поэтому отношение концевых групп к ветви(-ям) ядра составляет не менее 4:1, и (с) наружную поверхность функциональности концевых групп. Другой путь определения этих плотных звездчатых полимеров состоит в виде дендритного полимерного конъюгата, который имеет (i) дендритный полимер, имеющий (a) начальное ядро, (b) внутренний слой по крайней мере трех (3) генераций, состоящих из радиально симметричных повторяющихся единиц, связанных с начальным ядром, и (c) наружную поверхность, составленную концевыми функциональными атомами или атомными группами (концевые функциональные группы), связанные с самой наружной генерацией, и (ii) по крайней мере один переносимый биологически активный материал, который непосредственно ассоциирован с указанным дендритным полимером.

Еще одним путем для определения этих плотных звездчатых полимеров является определение в виде класса дендритного полимера, где дендритный полимер (i) имеет регулярную разветвленную структуру, фактически представленную последующей формулой (1), которая имеет ядро (C), имеющее число (a) валентности или функциональности 1 или более, причем по крайней мере одна из валентностей указанного ядра (C) связана с группой (B) через группу (A), указанная группа (B), имеющая не менее двух функциональностей (r₁, r₂...), связанных затем с группой (A), причем единица (AB), образованная соединением указанной группы (A) с указанной группой (B), представляет ответвление, причем указанные ответвления (AB) повторяются при желаемом числе генераций (C) не менее трех, и функциональность группы (B) каждого из последних ответвлений (AB) блокируется по крайней мере двумя (r_G) атомами или атомными группами (X): C[AB(AB(AB...(AB(ABXr_G)r_G-1)r_G-2...) r₂)r₁]_s, (1) в которой каждое прибавляемое число из 1, 2, ... G-1 и G из r₁, r₂ ... r_G-1 и r_G определяет число каждой генерации увеличивающегося ответвления (AB), считая первое ответвление или ответвления (AB), которые соединяются с ядром (C) как первую генерацию, а именно G = 1, каждый, r₁, r₂, ... r_G представляет число функциональности группы (B) ответвления (AB) соответствующей генерации, причем указанная функциональность способна соединяться с группой (A) другого ответвления (AB) следующей генерации, S - целое число не менее 1, но большее, чем валентность или функциональность ядра (C).

Каждая из групп (A) и (B) может быть одинаковой или различной для каждой генерации, а X представляет атомы или атомные группы для блокирования функциональности функциональных групп (B) последующих ответвлений, которые могут быть одинаковыми или различными.

Предпочтительные конъюгаты настоящего изобретения включают в себя такие, у которых плотный звездчатый полимерный конъюгат содержит по крайней мере один плотный звездчатый полимер, ассоциированный с по крайней мере одной единицей по крайней мере одного биологического модификатора. Некоторыми примерами этих биологических модификаторов являются интерлейкины, интерфероны, фактор некроза опухоли, фактор, стимулирующий колонии гранулоцитов, вирусы, вирусные фрагменты и другие генетические материалы. Используемый здесь термин "генетический материал" относится к материалам на основе нуклеотидов, включающим в себя без ограничения вирусы и вирусные фрагменты, плазмиды, фаги, космиды, гены и фрагменты генов (т.е., экзоны, интроны), дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) как одноцепочечную, так и двуцепочечную, рибонуклеиновую кислоту (РНК), рибосомную РНК (рРНК), каталитическую РНК (кРНК), ядрышковую РНК (яРНК), информационную РНК (иРНК), транспортную РНК (тРНК), олигонуклеотиды ДНК и РНК (как одно-, так и двуцепочечные) или олигомеры и (антисмысловые) олигонуклеотиды, протеиновые нуклеиновые кислоты (ПНК) и замещенные олигонуклеотиды нуклеиновых кислот. Генетический материал, особенно, вирусы и вирусные фрагменты, может образовать комплекс или быть сопряжен (спарен) с некоторым протеином. Термин "генетический материал" также предназначается для того, чтобы включить в себя "модифицированные нуклеотиды", как описано более полно ниже.

В науке известно, что плотные звездчатые конъюгаты обладают значительными преимуществами по сравнению с другими носителями благодаря превосходным свойствам плотных звездчатых полимеров. Плотные звездчатые полимеры являются частным видом дендритного полимера. Однако в более широких аспектах настоящего изобретения, где биологический модификатор (особенно, генетический материал) является переносимым материалом, могут быть использованы другие типы дендритных полимеров.

"Дендритный полимер" является полимером, имеющим правильное дендритное разветвление, образованное последовательным или генерационным присоединением разветвленных слоев к или от ядра. Термин "дендритный полимер" охватывает "дендримеры", которые характеризуются ядром, по крайне мере, одним внутренним разветвленным слоем и поверхностным разветвленным слоем. (Смотри Petar R. Dvornic and Donald A. Tomalia in Chem. in Britain, 641-645, август 1994). "Дендрон" является частицей дендримера, имеющего разветвления, исходящие из фокальной точки, которая является или может быть соединена с ядром, либо прямо, либо через соединительный остаток с образованием дендримера. Многие дендримеры содержат два или более дендронов, связанных с общим ядром. Однако, термин "дендример" используется широко с охватом простого дендрона.

Дендритные полимеры включают в себя, но не ограничиваются этим, симметричные и несимметричные разветвленные дендримеры, каскадные молекулы, арборомы и т.п., хотя наиболее предпочтительными дендритными полимерами являются плотные звездчатые полимеры. Рассматриваемые здесь плотные звездчатые дендримеры (РАМАМ) являются симметричными, при этом плечи разветвлений имеют равную длину. Разветвление имеет место у водородных атомов концевой NH₂-группы на разветвлении предшествующей генерации. Дендримеры на основе лизина являются несимметричными, при этом плечи ветвей являются различной длины. Одна ветвь имеется при -N молекулы лизина, тогда как другая ветвь имеется при -N, смежный с реакционной карбоксильном группой, которая присоединяет ветвь к ветви предыдущей генерации.

Даже несмотря на то, что не образуется регулярное последовательное присоединение разветвленных слоев, гиперразветвленные полимеры, например гиперразветвленные полиолы, могут быть эквивалентны дендритному полимеру, где структура разветвления имеет степень регулярности, приближающуюся к дендримеру.

Плотные звездчатые полимеры имеют молекулярное строение, характеризующееся регулярным дендритным разветвлением с радиальной симметрией, т.е. в точке разветвления. Эти радиально симметричные молекулы относятся к обладающим "плотной звездчатой топологией". Эти полимеры выполняются в манере, которая может дать концентрические дендритные ряды вокруг ядра инициатора. Плотная звездчатая топология достигается упорядоченной сборкой органических повторяющихся единиц в концентрические дендритные ряды вокруг ядра инициатора; это сопровождается введением многократности (мультиплетности) и саморепликации (в каждый ряд) в геометрической прогрессии через ряд молекулярных генераций. Получающиеся высокофункционализированные молекулы называются "дендримерами" в отличие от их разветвленной (древовидной) структуры, а также их олигомерной природы. Таким образом, термины "плотный звездчатый олигомер", плотный звездчатый дендример" и "STARBURST - дендример" охватываются термином "плотный звездчатый полимер" или "STARBURST полимер".

Топологическими полимерами с доменами контролируемых размеров и формы, являются дендримеры, которые ассоциируются друг с другом (например, ковалентными мостиками или через другую ассоциацию, как определено далее) через их концевые реакционные группы, которые называются плотными звездчатыми "мостиковыми дендримерами". Термин "мостиковый дендример" также охватывается термином "плотный звездчатый полимер" или "STARBURST-полимер". Когда более двух плотных звездчатых дендримера ассоциируются вместе, они называются "плотными звездчатыми агрегатами" или "STARBURST-агрегатами" и также охватываются термином "плотный звездчатый полимер" или "STARBURST-полимер".

Поэтому, дендритные полимеры включают в себя мостиковые дендримеры и дендримерные агрегаты. Дендритные полимеры охватывают как генерационно монодисперсные, так и генерационно полидисперсные растворы дендримеров. Дендримеры в монодисперсном растворе все являются фактически одной генерации, и поэтому одного размера и формы. Дендримеры в полидисперсном растворе содержат распределение дендримеров различных генераций.

Дендримерные полимеры также включают в себя поверхностно-модифицированные дендримеры. Например, поверхность ПАМАМ (РАМАМ)-дендримера может быть модифицирована присоединением аминокислоты, например лизина или аргинина.

Необходимо понимать, что ссылка на любой конкретный тип дендритного полимера, как, например, "полимер", "плотный звездчатый полимер, "несимметричный дендритный полимер", "каскадный полимер", также предназначена охватить мостиковые дендримеры этого типа, дендримерные агрегаты этого типа, полидисперсные дендримеры этого типа и поверхностно-модифицированные дендримеры этого типа.

Дендримерные полимерные конъюгаты биологических модификаторов используются в широком ряду терапевтических и диагностических применений. Например, дендритные полимерные конъюгаты биологических модификаторов, содержащие генетические материалы, имеют широкую применимость в областях генной терапии, анализе, модификации, активации, антисмысловых применениях и т.п.; а дендритные полимерные конъюгаты биологических модуляторов, содержащие негенетические материалы, такие как протеины (например, интерлейкины, интерфероны, фактор некроза опухоли, фактор, стимулирующий гранулоцитные колонии, и другие протеины), используются в качестве терапевтических агентов (например, противовирусных агентов) и диагностических агентов.

Так, сюда входят: композиция, которая содержит комплекс дендритного полимера с генетическим материалом, необязательно, в растворе с DEAE-декстраном; и композиция, которая содержит комплекс первого дендритного полимера и генетического материала, который помещается в раствор, содержащий второй дендритный полимер, причем второй дендритный полимер больше, чем указанный первый дендритный полимер.

Также в настоящее изобретение входит способ получения этих конъюгатов. Например, способ получения конъюгата дендритного полимера и биологического модификатора включает в себя взаимодействие дендритного полимера с биологическим модификатором с соответствующим растворителем при температуре, которая облегчает соединение биологического модификатора и дендритного полимера. Если биологический модификатор является генетическим материалом, получается комплекс при: (1) взаимодействии указанного дендритного полимера с указанным генетическим материалом в соответствующем растворителе при температуре, которая облегчает образование комплекса указанного генетического материала с указанным дендритным полимером, причем указанный способ необязательно включает помещение указанного комплекса в раствор с DEAE-декстраном; или (2) образовании комплекса генетического материала с первым дендритным полимером при взаимодействии полимера с генетическим материалом в соответствующем растворителе при температуре, которая облегчает соединение генетического материала с полимером, затем помещении указанного комплекса в раствор, содержащий второй дендритный полимер, причем указанный второй дендритный полимер больше, чем указанный первый дендритный полимер. Более конкретно, по отношению к указанному выше способу (1), 1-10 мкг генетического материала на 1 мл или на 20 мкл, в зависимости от требуемой концентрации, взаимодействует с достаточным количеством дендритного полимера при pH около 5 - 10 и температуре примерно 20 - 40^oC с получением комплекса генетический материал : дендритный полимер при соотношении зарядов от примерно 3:1 до примерно 1:10000. Более полное рассмотрение способов приводится ниже.

Способы применения этих конъюгатов включают в себя эффективную клеточную трансфекцию и биологическую доступность генетического материала, включая обеспечение комплекса дендритного полимера и генетического материала и превращение указанного комплекса в доступный для клеток, предназначенных для трансфекции. Образование комплекса стабилизирует и уплотняет генетический материал, защищает генетический материал от гидролиза в процессе прохождения к и трансфекции в клетку, и облегчает перенос генетического материала через клеточную мембрану и в клетку, включая ядро клетки.

Кроме того, способами изобретения являются: перенос (транспортирование) генетического материала через клеточную мембрану и в ядро клетки, содержащий комплексообразование генетического материала с дендритным полимером, последующее превращение указанного комплекса в доступный для клеток, предназначенных для трансфекции; и защита генетического материала от гидролиза в процессе прохождения к и трансфекции в клетку, содержащая комплексообразование указанного генетического материала с дендритным полимером перед выдержкой указанного генетического материала в пищеварительных ферментах (гидролизующих энзимах); и стабилизация и уплотнение генетического материала, содержащее комплексообразование указанного генетического материала с дендритным полимером.

Следующее описание фигур поможет в понимании настоящего изобретения.

На фиг. 1 представлены различные генерации плотных звездчатых дендримеров.

На фиг. 2 (A) показан дендример, имеющий несимметричные (неравные) соединения ветвей.

На фиг. 2 (B) показан дендример, имеющий симметричные (равные) соединения ветвей.

На фиг. 3 представлены размеры различных семейств дендримеров [I, II, III - (B)] относительно размеров антитела (A).

На фиг. 4 представлено время С¹³-спин-релаксации (T₁) решетки для аспирина, введенного в различные дендримерные генерации, пример 1. По вертикальной оси отложено время (секунды), а по горизонтальной оси - генерация присоединенного плотного звездчатого ПАМАМ (РАМАМ) дендримера.

На фиг. 5 представлены результаты динамического анализа примера 2. По вертикальной оси отложено процентное содержание (%) лекарств в рецепторной фазе, по горизонтальной оси - время (часы).

Фиг. 6 показывает влияние генерации 6,5 дендримера на скорость диализа псевдоэфедрина при pH 9,5 из примера 2. На вертикальной оси представлено процентное содержание (%) лекарства в рецепторном участке, а по горизонтальной оси - время (часы).

Фиг. 7 показывает влияние гидролиза дендримера на проницаемость псевдоэфедрина из примера 3. На вертикальной оси отложено процентное содержание (%) лекарства в рецепторном участке, а по горизонтальной оси - время (часы).

Фиг. 8 показывает сравнение процентного содержания салициловой кислоты, высвобожденной в рецепторном участке в присутствии плотного звездчатого полимера (Gen=4,0) при pH 5,0 и 6,65 с контролем салициловой кислоты, пример 4. По вертикальной оси отложено процентное содержание (%) лекарства в рецепторном участке, а по горизонтальной оси - время (часы).

Фиг. 9 показывает сравнение процентного содержания салициловой кислоты, теряемой из донорного участка с плотным звездчатым полимером (Gen=4,0) в рецепторном участке при pH 8,0 к содержанию салициловой кислоты, пример 4. По вертикальной; оси отложено процентное содержание (%) лекарства в донорном участке, а по горизонтальной оси - время (часы).

Фиг. 10 показывает сравнение процентного содержания салициловой кислоты, теряемой из донорного участка в присутствии плотного звездчатого полимера (Gen= 4,5), с контролем салициловой кислоты, пример 4. По вертикальной оси отложено процентное содержание (%) лекарства в донорном участке, а по горизонтальной оси - время (часы).

Фиг. 11 показывают время (T₁) C¹³-спин-релаксации решетки для 24-D, введенного в различные генерации дендримеров, пример 15. По вертикальной оси отложено время (секунды), а по горизонтальной оси - генерация присоединенного плотного звездчатого ПАМАМ (РАМАМ)-дендримера.

Фиг. 12 является столбцовой диаграммой, содержащей способность трансфекции ДНК дендримеров при различных соотношениях зарядов ДНК: дендример, при исследовании активности люциферазы после трансфекции, пример 44. По вертикальной оси отложены относительные единицы света/мкг протеина, а цифры на горизонтальной оси - номера образцов (описанных в примере 44) для контроля как различного дендримера, так и ДНК-комплексов при различных соотношениях зарядов ДНК:дендример, как представлено в таблице XV.

На фиг. 13 представлен электрофоретический гель, содержащий ДНК-связывающую способность дендримеров при различных соотношениях зарядов ДНК: дендример, при использовании тех же комплексов ДНК: дендример, которые были использованы на рисунке 12, пример 44.

Фиг. 14 представляет график процентного увеличения трансфекции по сравнению с контролем по отношению к генерации дендримера, использованного в комплексе ДНК:дендример, пример 45. По вертикальной оси отложено процентное увеличение трансфекции по отношению к контролю декстрана, а по горизонтальной оси - генерация дендримера. Сплошные кружки - дендримеры с аммиачным (NH₃) ядром, а сплошные квадраты - дендримеры с этилендиаминным (ЭДА) ядром.

Фиг. 15 является столбцовой диаграммой, представляющей влияние порядка присоединения различных дендримеров к ДНК-дендримерному комплексу на трансфекционную эффективность в клетках RAT-2 для дендримеров с ЭДА-ядром, пример 46. По вертикальной оси отложено относительные единицы света/мкг протеина, а по горизонтальной оси - концентрация (мкМ) второго дендримера. Незаштрихованные столбцы - результаты для комплекса ДНК-G9-дендример, с последующим присоединением G5- дендримера. Заштрихованные по диагонали столбцы - результаты для комплекса ДНК-G5-дендример, с последующим присоединением G9-дендримера.

Фиг. 16 представляет ту же информацию, что и на фиг. 15, но для дендримеров с NH₃-ядром, пример 46. По вертикальной оси отложены относительные единицы света/мкг протеина, а на горизонтальной оси - концентрация (мкМ) второго дендримера. Незаштрихованные столбцы - результаты для комплекса ДНК-G9-дендример, с последующим присоединением G5-дендримера. Заштрихованные по диагонали столбцы - результаты для комплекса ДНК-G5-дендример, с последующим присоединением G9-дендримера.

Фиг. 17 представляет единицы света на мкг протеина после трансфекций, осуществленных с различными ДНК-дендримерными конъюгатами и контрольными в различных условиях, пример 42. На вертикальной оси отложены относительные световые единицы на мкг протеина, а цифры на горизонтальной оси являются номерами образцов для контрольный и различных ДНК-дендримерных комплексов при различных соотношениях ДНК:дендример, как представлено в таблице XIII.

Фиг. 18 подобна фиг. 17, но данные представлены для широкой вариации отношения дендример: ДНК, пример 42. На вертикальной оси даны относительные световые единицы на мкг протеин, а цифры на горизонтальной оси являются номерами образцов для контрольных и различных ДНК-дендримерных комплексов при различных соотношениях ДНК:дендример, как представлено в таблице XIV.

Фиг. 19 является столбцовой диаграммой относительных световых единиц на мкг протеина для трансфекции конъюгата дендример:ДНК для дендримера A-S, пример 42. На вертикальной оси указаны относительные световые единицы/мкг протеина, а на горизонтальной оси - использованный дендример и соотношение ДНК:дендример в каждом сегменте оси 1:2, 1:2, 1:10, 1:10, 1:20 и 1:20.

Фиг. 20 представляет электрофоретический гель, содержащий комплексообразующие свойства нескольких дендримеров с (NH₃)-ядром с синтетической одноцепочной ДНК длиной 15 нуклеотидов, пример 47.

Фиг. 21 представляет поглощение радиомеченного синтетического двуцепочечного олигомера длиной 23 нуклеотида в линии моноцитной клетки во времени, сравнивая трансфекцию отдельной ДНК, трансфекцию ДНК в комплексе с генерацией 8 (G8) дендримера с (NH₃)-ядром (т.е., G8 (NH₃)-дендример) и трансфекцию комплексов ДНК-дендример в присутствии азида натрия, пример 47. На вертикальной оси отложено 10² спм/10⁴ клеток, а по горизонтальной оси - время (часы). Сплошные (затушеванные) квадраты представляют синтетический одноцепочечный олигомер длиной 23 нуклеотида; сплошные (затушеванные) кружки представляют ДНК/G8 (NH₃)-дендример; а сплошные (затушеванные) треугольники представляют ДНК/G8 (NH₃)-дендример + азид натрия.

Фиг. 22 является столбцовой диаграммой трансфекции по отношению к комплексу дендример-ДНК, где часть ДНК является линейной, а часть кольцевой или суперскрученной, пример 48. На вертикальной оси отложены относительные световые единицы на мкг протеина, а по горизонтальной оси - комплекс дендример - ДНК. Незатушеванные столбцы представляют результаты для случая отсутствия DEAE-декстрана. Затушеванные столбцы представляют результаты для 0,5 мкМ DEAE-декстрана.

Фиг. 23 (A) - (D) представляет четыре электрофоретических геля, показывающих комплексообразующую по отношению к ДНК способность G8 (NH₃)-дендримера и G8 (ЭДА)-дендримера при различных соотношениях и в различных условиях, пример 49.

Фиг. 24 представляет электрофоретический гель, содержащий соединительные по отношению к ДНК свойства G8 (NH₃)-дендримеров и G11 (ЭДА)-дендримеров с различными мольными соотношениями, пример 50.

Фиг. 25 представляет электрофоретический гель, показывающий соединительные по отношению к ДНК свойства G8 (NH₃)-дендримеров и G8 (ЭДА)-дендримеров в широком интервале pH, пример 51.

Фиг. 26 (A) и (B) представляет электрофоретические гели, показывающие ДНК-дендримерную соединительную стабильность в солевых растворах с увеличивающейся концентрацией хлористого натрия, пример 52.

Фиг. 27 представляет электрофоретический гель, показывающий стабильность и защиту ДНК, образующую комплекс с G8 (NH₃)-дендримерами и G11 (ЭДА)-дендримерами в присутствии различных ферментов рестрикции ДНК, пример 53.

Фиг. 28 представляет электрофоретический гель, показывающий стабильность и защиту ДНК, образующую комплекс с G8 (ЭДА)-дендримерами в присутствии клеточных нуклеаз, пример 54.

На фиг. 29 представлено сравнение степени трансфекции ДНК, образующей комплекс с дендрикерами при различных соотношениях зарядов ДНК:дендример и различных концентрациях ДНК, по отношению к тем же комбинациям в присутствии диэтиламиноэтилового эфира декстрана (DEAE-декстрана). Имеются примеры трансфекции с липидами, т.е. подставляя ЛИПОФЕКТИН (LIPOFECTIN), использованный вместо дендримера, и в отсутствии DEAE-декстрана, пример 55. На вертикальной оси указаны контрольный образец плазмиды, контрольный образец декстрана и различные комплексы плазмида-ДНК 1 мкг, 5 мкг и 10 мкг, а по горизонтальной оси - относительные световые единицы на мкг протеина. Заштрихованные по диагонали столбцы представляют результаты для дендример/DEAE - декстрана. Заштрихованные поперек столбцы представляют результаты только для одного дендримера. В крапинку (заполненные точками) столбцы представляют результаты для (LIPOFECTIH) ЛИПОФЕКТИНА.

Фиг. 30 представляет степень трансфекции для (NH₃)-дендримеров и (ЭДА)-дендримеров при различных соотношениях зарядов ДНК:дендример, в присутствии DEAE-декстрана в ряде случаев и без DEAE-декстрана в других, пример 56. На вертикальной оси указываются относительные световые единицы/мкг протеина, а по горизонтальное оси - соотношение ДНК:дендример. Затушеванные квадраты с сплошными линиями представляют G9 (ЭДА)-дендример; незатушеванные квадраты с штриховыми линиями представляют G9 (ЭДА)-дендример + DEAE-декстран; затушеванные кружки с сплошными линиями представляют G9 (NH₃)-дендример; и незатушеванные кружки с штриховыми линиями представляют G9 (NH₃)-дендример + DEAE-декстран.

Фиг. 31 аналогична фиг. 30, но для G8 (NH₃)-дендримеров и G11 (ЭДА)-дендримеров, и везде в присутствии DEAE-декстрана, пример 56. По вертикальной оси отложены относительные световые единицы на мкг протеина, и по горизонтальной оси - соотношение зарядов ДНК:дендример. Затушеванные кружки представляют G8 (NH₃)-дендример; и затушеванные треугольники представляют G11 (ЭДА)-дендример.

Фиг. 32 представляет трансфекционную эффективность комплексов ДНК:G7 (NH₃)-дендример в присутствии или DEAE-декстрана, или буферного солевого раствора Хенкса (HB5), пример 57. По вертикальной оси отложены относительные световые единицы на мкг протеина; а по горизонтальной оси - отношение ДНК: дендример. Затушеванные кружки представляют буферный солевой раствор Хенкса, а затушеванные треугольники представляют DEAE-декстран.

Фиг. 33 представляет процентное увеличение трансфекции для комплексов (NH₃)-дендример-ДНК в DEAE-декстране при различных соотношениях зарядов ДНК: дендример, пример 58. По вертикальной оси указывается процентное увеличение трансфекции (по отношению к контролю DEAE-декстран), а по горизонтальной оси - дендримерная генерация. Столбцы, заштрихованные по диагонали, представляют соотношение зарядов 1: 1, незатушеванные столбцы представляют соотношение зарядов 1: 5, а заштрихованные поперек столбцы представляют соотношение зарядов 1:10.

Фиг. 34 представляет эффективность трансфекции комплексов ДНК-дендример при различных соотношениях зарядов, в присутствии DEAE-декстрана и без DEAE-декстрана, пример 59. По вертикальной оси указываются относительные световые единицы на мкг протеина, а по горизонтальной оси - соотношение зарядов ДНК: дендример (довольно правильная запись имеет контроль плазмида - DEAE-декстран). Незатушеванные столбцы представляют DEAE-декстран; а затушеванные столбцы представляют случай без DEAE-декстрана.

На фиг. 35 представлена эффективность трансфекции для комплексов ДНК:дендример при различных соотношениях зарядов и при различных концентрациях DEAE-декстрана, пример 60. По вертикальной оси указываются относительные световые единицы на мкг протеина, по верхней горизонтальной оси концентрация DEAE-декстрана в мкМ; а по нижней горизонтальной оси - различные соотношения зарядов ДНК: дендример для каждого сегмента, включая контрольный образец плазмид.

На фиг. 36 представлена эффективность трансфекции для комплексов ДНК:дендример соотношением 1:5, по сравнению с трансфекциями с помощью ЛИПОФЕКТИНА (LIPOFECTIN); в различных клеточных линиях, пример 61. Цифры на вертикальной оси являются номерами образцов, идентифицирующими используемые агенты трансфекции (как определено в примере 61), а на горизонтальной оси указываются относительные световые единицы на мкг протеина. Различными сегментами (данные под диаграммой) для линий испытываемых клеток являются: обезьяна:COS 7; человек:HMEC-1; мышь:10-1; мышь: NJH 3T3; и крыса:Clone9.

На фиг. 37 представлена эффективность трансфекции для комплексов ДНК-дендример при соотношении зарядов 1:5 в двух различных линиях трансфекционных клеток по сравнению с трансфекциями с помощью ЛИПОФЕКТИНА (LIPOFECTIN) в таких линиях клеток, пример 62. На вертикальной оси указаны номера примеров, а по горизонтальной оси - относительные световые единицы на мкг протеина. Использованные линии клеток представлены наклонно заштрихованными столбцами для NRK52E и затушеванными столбцами для YB2.

На фиг. 38 представлена эффективность трансфекции различных комплексов ДНК-дендример с и без DEAE-декстрана, по сравнению с трансфекциями с помощью ЛИПОФЕКТИНА и ЛИПОФЕКТАМИНА (LIPOFECTIN and LIPOFECTAMIN), пример 63. На вертикальной оси указываются относительные световые единицы, а на горизонтальной оси - соотношение или доза, включая контрольные. Незаштрихованные столбцы представляют G8 (NH₃) дендример; заштрихованные вертикально столбцы представляют ЛИПОФЕКТИН (LIPOFECTIN); затушеванные по диагонали столбцы представляют G8 (NH₃) дендример с DEAE-декстраном; в крапинку столбцы представляют ЛИПОФЕКТАМИН (LIPOFECTAMIN), и наклонно заштрихованные столбцы представляют C11 (ЭДА)-дендример с DEAE-декстраном.

На фиг. 39 представлена эффективность трансфекции комплексов ДНК:дендример при различных соотношениях и в присутствии либо DEAE-декстрана, диметилсульфоксида (ДМСО), смеси вышеуказанного, ничего из вышеуказанного, пример 64. На вертикальной оси указываются относительные световые единицы на мкг протеина; а на горизонтальной оси - соотношение зарядов, включая контрольные образцы плазмид. В крапинку столбцы представляют DEAE-декстран с ДМСО-стадией; заштрихованные по диагонали столбцы представляют DEAE-декстран с стадией не-ДМСО; наклонно заштрихованные столбцы представляют не-DEAE-декстрана с ДМСО-стадией; и вертикально заштрихованные столбцы представляют не-DEAE-декстран с стадией не-ДМСО.

На фиг. 40 представлена эффективность трансфекции ASGPR целевой ДНК, образующей комплекс с конъюгированным с галактоза-трисахаридом дендримером, пример 65. На вертикальной оси представлены относительные световые единицы на мкг протеина, а на горизонтальной оси - клеточные линии и уровень рецептора. Незаштрихованные столбцы представляют конъюгированные дендримеры; а заштрихованные по диагонали столбцы представляют неконъюгированные дендримеры.

На фиг. 41 представлен электрофоретический гель, иллюстрирующий соединительную с ДНК способность G11 (ЭДА) с и без галактоза-трисахарида, конъюгированного с ним, пример 65.

На фиг. 42 представлена эффективность трансфекции для комплекса ДНК с G8 (NH₃)-дендримером при различных концентрациях дендримера и в различных концентрациях сыворотки, пример 66. На вертикальной оси указываются относительные единицы света на мкг протеина, а на горизонтальной оси - концентрация сыворотки. Незаштрихованные столбцы представляют 0,05 мкМ G8 (NH₃)-дендримеры; в крапинку столбцы представляют 0,1 мкМ G8 (NH₃)-дендримеры; заштрихованные по диагонали столбцы представляют 0,5 мкМ G8 (NH₃)-дендримеры; а затушеванные столбцы представляют недендример.

На фиг. 43 представлена эффективность трансфекции для комплексов ДНК с различными целевыми, нецелевыми и поверхностно-модифицированными дендримерами, пример 67. По вертикальной оси отложено процентное увеличение плазмидного контроля, а по горизонтальной оси - различные комплексы ДНК-дендример. Незаштрихованные столбцы соотношение зарядов ДНК:дендример = 1:1; затушеванные столбцы - соотношение зарядов ДНК:дендример = 1:5; и заштрихованные по диагонали столбцы - соотношение зарядов ДНК:дендример = 1:10.

На фиг. 44 представлена эффективность трансфекции для комплексов ДНК с дендримерами, где определяется экспрессия трансфекционных ДНК, пример 68. По вертикальной оси отложены относительные световые единицы на мкг протеина; а по горизонтальной оси - различные комплексы ДНК-дендример. Столбцы представляют время (часы) между трансфекцией и сбором выросших клеток. Незаштрихованные столбцы представляют 21 час, столбцы, заштрихованные по диагонали сверху вниз слева направо, представляют 45 часов; столбцы, заштрихованные сверху вниз справа налево, представляют 69 часов; а затушеванные столбцы представляют 141 час.

На фиг. 45 представлена цитотоксичность в клеточной линии RAT-2 G8 (NH₃)дендримеров и G8 (ЭДА) дендримеров с и без ДНК и с и без присутствия DEAE-декстрана, пример 69. По вертикальной оси отложено процентное содержание мертвых клеток; а по горизонтальной оси - концентрация дендримера на левом сегменте и концентрация дендример-DEAE-декстрана на правом сегменте. Незаштрихованные столбцы представляют G8 (ЭДА) дендример, а заштрихованные по диагонали столбцы представляют G8 (NH₃) дендример.

На фиг. 46 представлена цитотоксичность G8 (NH₃) дендримеров и G8 (ЭДА) дендримеров в различных клеточных линиях, пример 69. На вертикальной оси отложено процентное содержание отмерших клеток, а на горизонтальной оси - концентрация различных испытываемых дендримеров. Незатушеванные столбцы представляют не-DEAE-декстран, а затушеванные столбцы представляют 0,5 мкМ DEAE-декстран. Используемыми клеточными линиями (смотри сегменты слева направо) являются Clone9, NlH 3T3, 10-1 и COS7.

На фиг. 47 (A) - (F) представлено клеточное поглощение и локализация ДНК в двух различных клеточных линиях, часть из которых была трансфекцирована без дендримера, часть - с дендримером, а часть с дендримером в присутствии азида натрия, пример 70. На вертикальной оси все цифры указывают клеточное поглощение в 10² спм/10⁴ клеток, а на нижней горизонтальной оси - время (часы). На фигурах (A) - (C) представлены случаи с использованием U937-клеток, а на фигурах (D) - (F) - клетки PAT-2. Верхняя горизонтальная ось на фигурах (A) и (D) - только