Штамм актиномицета streptomyces lydicus для защиты растений от грибковой инфекции, композиция для защиты растений от грибковой инфекции (варианты), способ снижения чувствительности растения к грибковой инфекции (варианты)

Штамм актиномицета streptomyces lydicus для защиты растений от грибковой инфекции, композиция для защиты растений от грибковой инфекции (варианты), способ снижения чувствительности растения к грибковой инфекции (варианты)

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к новому штамму актиномицетов, способному ингибировать рост фитопатогенов и усиливать рост растений, к средствам защиты растений от грибковой инфекции и снижению чувствительности растений к грибковой инфекции. Штамм актиномицета Streptomyces lydicus WYEC 108 выделен из почвы, депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под 55445. Ингибирует рост таких фитопатогенов, как Pythium ultimum, Phanerochaete chrysosporium, Coryolus versicolor, Rhizoctonia solani, Fusarium sambucinetum. На основе вышеуказанного штамма создана композиция, содержащая штамм и доставочную среду, включающую по крайней мере один из компонентов: альгинатный гель, торфяной мох, песок, кукурузную муку. Дополнительно может включаться и источник азота в виде хлорида аммония. Способ снижения чувствительности растения к грибковой инфекции предусматривает обработку корней или семян вышеуказанным штаммом или композицией, содержащей штамм. Данные изобретения позволяют защитить растения от фитопатогенных грибов и стимулировать рост растений. 5 с. и 6 з.п. ф-лы, 9 табл.

Изобретение относится к новому штамму бактерий, способному ингибировать рост патогенов растений почвенного происхождения и усиливать рост растений.

Грибковые фитопатогены являются причиной больших экономических потерь в сельском хозяйстве и садоводстве. Было описано множество различных типов грибковых фитопатогенов: эти патогены вызывают болезни растений, такие как вызревание, белая гниль, бурая гниль и корневая гниль. Такие болезни могут погубить появляющиеся проростки, снизить мощность растений и неблагоприятно повлиять на урожай.

Для того чтобы свести к минимуму грибковые инфекции, можно выращивать рассаду на почве, простерилизованной паром или обработанной химическим способом. Однако подобные обработки уничтожают в почве и полезные микроорганизмы, которые в нормальных условиях конкурируют с почвенными грибами. В этих условиях, если в почву будет случайно занесен грибковый патоген, он может быстро распространиться и вызвать широкое распространение болезни.

В сельскохозяйственном производстве почвы, зараженные фитопатогенными грибами, являются неподходящими для выращивания определенных культур. Например, урожаи соевых бобов в Мичигане и в других штатах, выращивающих сою, часто сильно уменьшаются вследствие корневой гнили, вызванной грибом Phytophera megasperma (Filinow and Lockwood, 1985). Виды гриба Pythium широко распространены на части земель в Калифорнии, штате Вашингтон и Айдахо. Pythium ultimum является наиболее часто встречающимся патогенным видом, ответственным за выпревание проростков до и после прорастания. Этот вид является серьезным патогеном пшеницы, гороха и турецкого гороха и других культур, которые выращиваются на этих почвах и на почвах других штатов и других стран (Trapero-Casas и др. , 1990; Stanghellini и Hancock, 1970; Kraft и Burke, 1971; Westerlund и др. , 1988). Применение химических агентов для контроля грибковых фитопатогенов часто не является практичным, так как они дорого стоят, малоэффективны и вызывают появление резистентных штаммов грибов. Помимо этого применение химических фунгицидов нежелательно с точки зрения экологии.

В патенте США N 4595589 описываются штаммы актиномицетов Streptomyces для защиты растений от грибковой инфекции. Кроме того, раскрывается композиция для защиты растений от грибковых инфекций, содержащая актиномицеты Streptomyces и доставочную среду в виде торфа.

Целью настоящего изобретения явилось создание средств биологического контроля для снижения инфекций растений, вызванных грибковыми патогенами.

Поставленная цель была достигнута путем выделения ряда актиномицетов, активных в отношении ингибирования роста грибковых фитопатогенов. В частности, было показано, что один из выделенных актиномицетов, который в настоящем документе именуется Streptomyces WYEC 108 (также упоминается здесь как WYEC 108), демонстрирует сильный антагонизм в отношении целого ряда грибковых патогенов растений, включая патогены, вызывающие болезни растений, известные как выпревание, корневая гниль, белая гниль и бурая гниль. Так одной особенностью настоящего изобретения является биологически чистая культура Streptomyces WYEC 108.

Настоящее изобретение также предлагает различные композиции, удобные для обработки семян или корней растений штаммов Streptomyces WYEC 108. Такие композиции полезны для снижения чувствительности растений к грибковой инфекции и для усиления роста обработанных растений. В предпочтительном варианте осуществления изобретения такие композиции включает биологически чистую культуру Streptomyces WYEC 108 и доставочную среду. В некоторых вариантах осуществления изобретения доставочная среда может включать альгинатный гель, песок или кукурузную муку. В одном варианте осуществления настоящего изобретения поставочная среда, которая включает торфяной мох, песок и кукурузную муку, объединена со Streptomyces WYEC 108. В другом варианте осуществления изобретения доставочная среда включает по меньшей мере 10⁵ колониеобразующих единиц на 1 г доставочной среды.

В еще одном варианте осуществления изобретение включает в себя гранулы альгинатного геля, содержащие Streptomyces WYEC 108. Такие гранулы можно непосредственно добавлять к корням растущих растений или вносить в почвы для земледелия или садоводства для уменьшения повреждения растений, вызванного фитопатогенными грибами.

Настоящее изобретение включает также способы снижения чувствительности растений к грибковой инфекции. В одном варианте осуществления изобретения этот способ включает в себя доставку Streptomyces WYEC 108 к корням растения. В другом варианте осуществления изобретения этот способ включает в себя погружение семян в композицию, содержащую Streptomyces WYEC 108, а затем высаживание обработанных семян в подходящую ростовую среду. В этом способе подходящая композиция включает в себя альгинатный гель, содержащий Streptomyces WYEC 108.

Настоящее изобретение описывает выделение ряда штаммов актиномицетов из почвы. Ряд этих штаммов продемонстрировал свою эффективность в снижении эффектов грибковых патогенов на растения, включая латук, турецкий горох и перец. В частности, настоящее изобретение предлагает выделение штамма, называемого в настоящем документе Streptomyces WYEC 108. Показано, что штамм YEC 108 демонстрирует сильный антагонизм в отношении широкого ряда грибковых фитопатогенов, включая патогены, вызывающие выпревание проростков до и после прорастания, корневую гниль, бурую гниль и белую гниль. В качестве такого антагониста штамм WYEC 108 особенно удобен в качестве биоконтролирующего агента, который можно использовать для защиты растений от инфицирования этими фитопатогенами. Так, Streptomyces WYEC 108 является полезным для использования в способах снижения чувствительности растений к грибковой инфекции. Благодаря этому, растения, обработанные Streptomyces WYEC 108, менее подвержены воздействию грибковой инфекции. Грибковая инфекция чувствительных необработанных растений влияет на некоторые ростовые характеристики этих растений. Например, необработанные растения, зараженные грибковыми патогенами, могут демонстрировать значительное снижение высоты, биомассы и урожайности по сравнению с растениями, не зараженными грибковым патогеном. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения растения, обработанные Streptomyces WYEC 108 и затем зараженные грибковым патогеном, демонстрируют менее выраженные снижения высоты, биомассы и урожайности, чем необработанные растения, зараженные грибковым патогеном. В более предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения растения, обработанные Streptomyces WYEC 108 и зараженные грибковым патогеном, демонстрируют те же ростовые характеристики, что и необработанные и незараженные растения. В наиболее предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения растения, обработанные Streptomyces WYEC 108 и зараженные грибковым патогеном, демонстрируют ростовые характеристики, превосходящие таковые необработанных незараженных растений.

Штамм WYEC 108 колонизирует корни растений в присутствии конкуренции микрофлоры ризосферы. Показано, что штамм WYEC 108 усиливает рост растений латука, выращиваемых на почве, стерилизованной паром, и растений перца, выращиваемых на открытом грунте.

Настоящее изобретение также заключает в себе средства производства вегетативных клеток или спор штамма WYEC 108, подходящих для помещения их в доставочную среду. Показано, что композиция, включающая вегетативные клетки и споры WYEC 108 и доставочную среду, имеет длительный срок хранения и удобна для доставки штамма WYEC 108 к растениям.

Материалы и методы.

Среды для роста бактерий.

Все среды для роста бактерий приготавливали, используя дистиллированную воду, и стерилизовали автоклавированием перед использованием. Все бактериальные образцы обрабатывались в соответствии со стандартными асептическими лабораторными методиками для поддержания чистоты.

Среда YGM (дрожжевой экстракт/глюкоза/минеральные соли) включала 0,6% (вес/объем) дрожжевого экстракта (лаборатории Difco, Детройт, Мичиган), 1,0% (вес/объем) глюкозы и раствор фосфатных неорганических солей (5,3 г Na₂HPO₄, 1,98 г KH₂PO₄, 0,2 г MgSO₄ 7H₂O, 0,2 г NaCl, 0,05 г CaCl₂ 2H₂O плюс 1,0 мл микроэлементов (Pridham и Gottlieb, 1948) на 1 л деионизированной воды: pH от 7,1 до 7,2). Раствор микроэлементов состоял из 0,64 г CuSO₄ 5H₂O, 0,11 г FeSO₄ 7H₂O, 0,79 г MnCl₂ 4H₂O, 0,15 г ZnSO₄ 7H₂O в 100 мл дистиллированной воды.

Среда WYE (вода/дрожжевой экстракт/агар), модифицированная Reddi и Rao (1971), содержала дрожжевой экстракт (Oxoid, 0,25 г/л) в качестве единственного источника углерода и азота и агар (Oxoid, 18,0 г/л). pH среды доводили до 7,2 - 7,4 буфером K₂HPO₄ (0,5 г/л). WYEC (вода/дрожжевой экстракт/целлюлоза/агар) представляла агар WYE, к которому добавили тонкий покрывающий слой агара. Покрывающий агар содержал 0,25 г/л целлюлозы (Solka Floc, химическая компания Sigma) и 18,0 г/л агара в дистиллированной воде.

Среда CYD (казаминокислоты/дрожжевой экстракт/декстрозный агар) содержала казаминокислоты (Difco 0,5 г/л), дрожжевой экстракт (Oxoid или Difco : 0,8 г/л), D-глюкозу (0,4 г/л), K₂HPO₄ (2,0 г/л; pH 7,2-7,4) и 18,0 г/л агара в дистиллированной воде.

Среда УCED (казаминокислоты/дрожжевой экстракт/декстроза/агар), модифицированная среда Reddi; и Rao (1971), содержала дрожжевой экстракт (Oxoid, 0,3 г/л), казаминокислоты (Difro 0,3 г/л), D - глюкозу (0,3 г/л) и агар (Oxoid, 18,0 г/л). pH среды доводили буфером K₂HPO₄ (2,0 г/л).

Среда CYPC (целлюлоза/дрожжевой экстракт/пептон/экстракт компоста/агар) содержала целлюлозу (Solka Flock, химическая компания Sigma, 5,0 г/л), дрожжевой экстракт (1,0 г/л), пептон (Oxoid, 1,0 г/л), фосфатный буфер (K₂HPO₄, 0,75 г/л), агар (18,0 г/л) и экстракт компоста (100 мл/л), замещающий 100 мл дистиллированной воды в среде. Эта серия наливается непосредственно и не используется в качестве покрывающего агара.

Среда MSSC (неорганические соли/крахмал/казеин/агар; Turhan, 1981) содержала раствор неорганических солей, состоящий из NaCl (2,0 г/л), MgSO₄ 17H₂O (0,05 г/л), CaCO₃ (0,02 г/л), FeSO₄ 18H₂O (0,01 г/л) и KNO₃ (2,0 г/л) плюс органические составляющие, включающие растворимый крахмал (10,0 г/л) и казеин (0,3 г/л) плюс агар (18,0 г/л). К среде прибавляли буфер K₂HPO₄ (2,0 г/л).

Среда для споруляции (АТСС Medium # 5) содержала дрожжевой экстракт (1,0 г/л), мясной экстракт (1,0 г/л), триптозу (2,0 г/л), FeSO₄ (0,01 г/л), глюкозу (10,0 г/л) и агар (15,0 г/л). Перед автоклавированием pH среды доводили до 7,2 (17-е издание каталога ATCC бактерий и бактериофагов).

CYG - среда содержала казаминокислоты (кислотный гидролизат, 5,0 г/л), дрожжевой экстракт (5,0 г/л) и глюкозу (10,0 г/л) в дистиллированной воде, pH 7,1-7,2.

Доставочная среда (включающая песок/кукурузную муку/воду или торфяной мох/песок/кукурузную муку в соотношениях, приведенных ниже) стерилизовалась паром перед использованием. Стерилизацию выполняли обычно путем трехкратного автоклавирования, каждый раз по 90 мин.

Сбор бактериальной культуры.

Для мицелиального роста Streptomyces WYEC 108 в 1-литровые колбы Эрлейнмейера, содержащие 500 мл среды YGM (pH 7,1-7,2) инокулировали 20 мл культуры штамма, приготовленной как описано в примере II, и инкубировали при встряхивании на 250 об/мин при 30^oC в течение трех дней. Затем собирали мицелий центрифугированием на 5000 об/мин. в течение 10 мин. Иначе мицелий собирали, оставляя культуры стоять до оседания на дно колб Эрленмейера и спор. Надосадок затем декантировали, а концентрированную суспензию мицелия и спор использовали непосредственно для инокуляции в доставочную среду.

Клетки и споры получали также путем роста на твердой среде (например, на агаре для споруляции). Мицелий и споры собирали с агара, соскребая поверхность агара в дистиллированную воду. Эту суспензию спор и мицелия затем непосредственно смешивали с доставочной средой.

Для получения спор Streptomyces WYEC 108 в 2-литровые колбы Эрленмейера, содержащие 1200 мл среды YGM, инокулировали 50 мл культуры штамма и инкубировали при встряхивании на 250 об/мин. при 30^oC в течение 12-18 дней. Споры собирали центрифугированием на 9000 об/мин. в течение 10 мин.

Грибковые патогены.

Pythium ultimum pUMXL получали из коллекции культур в департаменте микробиологии и защиты растений в Horticulture Research International, Worthing Road, Литтлгемптон, Западный Суссекс BN17 6ZP, Великобритания). Грибы белой гнили Phanerochaete chysosporium и Coriolus versicolor; грибы бурой гнили Postia placenta, Caldariomyces fumago и Gloeophyllum trabeum; почвенные грибковые патогены Rhijoctonia solani, Fusarium sambucinctum, Geotrichum candidum и Verticillum dahlliae получили из коллекции культур профессора Don Z. Crawford факультет бактериологии университета Айдахо, Москва, Айдахо. Pythium irregulare, Phytophthora capsici, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora parasitica, Selerotinia cepivorum и Sclerotinia selerotiorum получили из коллекции культур д-ра Wersley chun, Department of Plant soil Entomology science, университет Айдахо, Москва, Айдахо, Fusarium oxysporum получили из коллекции культур д-ра Arthur D.Partridge, Department of Forest Resources, университет Айдахо, Москва, Айдахо. Все культуры выращивали на картофельном декстрозном агаре или кукурузном агаре при 25^oC. Эти штаммы при получении были идентифицированы как "патогены", но повторно на патогенность не проверялись.

Исследование почвы.

Для использования в биологическом исследовании собирали почву, естественно инфицированную Pythium ultimum из нескольких мест района Palouse неподалеку от Москвы, Айдахо. Эту почву собирали из 15-сантиметрового слоя на полях, засеянных и горохом в предыдущие два сезона. Почвенную популяцию видов Pythium определяли следующим образом: взвесь из 1,0 г высушенной воздухом почвы в 50 мл стерилизованной дистиллированной воды тщательно перемешивали с помощью миксера Vortex, 0,1 мл образца тщательно перемешанной извести помещали в виде маленьких капель на трехдневный 2%-ный водный агар на чашках Петри (Stanghellini и Hancock, 1970). Чашки инкубировали при 25^oC и просматривали периодически под препаровальной лупой (х 10) с флюоресцентной подсветкой для определения идентичности и количества присутствующих видов Pythium. Колонии на каждой чашке проверяли спустя 12, 48 и 72 ч после инкубации до установления окончательной популяции. Идентификация основывалась на морфологических характеристиках мицелия гриба Pythium под микроскопом и характере роста на 2%-ном (вес/объем) водном агаре. Колонии гриба чистой культуры, выращенные на 2%-ном (вес/объем) агаре, служили контролем для целей визуальной идентификации (Stanghellini и Hancock, 1970; Stasz и др., 1980).

Исследование показало, что популяционная плотность P. ultimum и P. irregulare составляла 354 15 и 194 11 кое/г высушенной воздухом почвы во время посевной (весна 1992) соответственно. Популяционная плотность других видов Pythium составляла 57 9 кое/г высушенной воздухом почвы. P. ultimum и P. irregulare были превалирующими видами в собранной почве.

Пример 1 Выделение штаммов актиномицетов, демонстрирующих антагонизм в отношении грибковых фитопатогенов.

Актиномицетные штаммы выделяли из четырех связанных с ризосферой и четырех несвязанных с ризосферой почвенных образцов. Эти штаммы затем тестировали на пригодность в качестве ингибиторов грибковых фитопатогенов.

Выделение актиномицетов.

Актиномицеты выделяли из 8 различных почв с помощью методики серийного разведения и посева на чашки. Разведения (10^-5 - 10^-7) засевали на различные селективные агаровые среды. Состав этих сред приводился в разделе "Материалы и методы" выше. Изоляты актиномицетов обозначали согласно среде, на которой они были выделены. Например, WYEC 108 был выделен на среде WYEC, а YCED 9 был выделен на среде YCED. В целом эти среды бедны органическим углеродом, который эффективно контролирует эубактериальный и грибковый рост и помогает выделить медленно растущие актиномицеты. Поскольку WYE и YCED агары были особенно эффективными изоляционными средами, их использовали прежде всего. Разведения на агаре инкубировали при 25^oC от 4 до 10 дней, чтобы позволить актиномицетам образовать споры, а затем колонии собирали и помещали на чашки с агаром WYE или YCED для очистки. Чистые колонии переносили с этих чашек на агар YCED или агар CYD (скошенные), инкубировали при 25^oC или 37^oC до достижения спорообразования и хранили при 5^oC вплоть до использования. Маточные культуры пересевали каждые 3 - 4 недели.

Почвы.

(1) Не связанные с ризосферой почвы Образцы (100 - 200 г) почвы отбирали из поверхностного 7,5-10 см слоя почвы в 4 районах Великобритании, включая культивированный розовый сад (почва S1) в Растингтоне, Западный Суссекс; в междурядье на пшеничном поле (почва S2) на ферме Horticullure Research International (H.R.1.) в Литтлгемптоне, Западный Суссекс; лесную почву (почва S6) из заповедника деревьев с твердой древесиной в Винд Клифф, Южный Уэльс и почву лугопастбищного угодья (почва S7), на которой периодически выпасают овец в Гастингс Хилл, Саут Даунс, Западный Суссекс. Эти почвы считали не связанными с ризосферой, хотя они и содержали корни растений в разных количествах.

(2) Связанные с ризосферой почвы.

Образцы связанной с ризосферой почвы из 4 мест были приготовлены в основном согласно способу Miller и др. (1990). Почва 3 (S3) была связана с корнями растения одуванчика (Taracum officinale) в розовом саду HR1 в Западном Суссексе, Англия. Почва 5 (S5) была связана с с корнями пшеницы и была взята с того же поля, что и S2, пшеничного поля на ферме HR1 в Литттлгемптоне, Западный Суссекс. Почва 4 (S4) была также связана с корнями пшеницы, но почва была взята с поля в Bignor Hill неподалеку от South Downs Way, Западный Суссекс. Почва 8 (S8) была связана с корнями растений льна и была взята с поля, прилегающего к участку, на котором был взят образец S7, на лугопастбищном угодье в Гастингс Хилл, Саут Даунс, Западный Суссекс.

Актиномицеты, выделенные из почв, могут быть разделены на изолированные из почв, связанных с ризосферой, и из почв, не связанных с ризосферой (S3, S4, S5 и S8) и (S1, S2, S6 и S7) соответственно. Во всех образцах оценивали влажность почвы путем высушивания 3 г (сырой вес) образцов (три повторности) при 100^oC в течение 58 часов и затем повторного взвешивания. pH почв определяли путем тщательного перемешивания взвеси почвы в воде (1:1), оседания твердых частиц в течение 2 ч, и определения pH надосадка. После отбора почвы хранили при 4^oC вплоть до использования (от 24 до 48 ч). То, что изоляты являлись штаммами актиномицетов, подтверждалось при визуальном исследовании, показавшем, что колонии, образованные этими штаммами, являются типичными колониями актиномицетов (твердые и кожистые, с воздушным мицелием, содержавшим споры). Дальнейшее подтверждение идентичности этих штаммов актиномицетам было получено при микроскопии.

Определение пределов pH для роста.

Каждый изолят актиномицетов испытывали на способность расти при pH от 5,5 до 8,0. Культуры засевали на чашки с агаром CYD, pH доводили до 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 и 8,0 с помощью комбинаций буфера K₂HPO₄ и KH₂PO₄ с концентрацией 100 мМ. Конечное значение pH в каждой среде доводили до ее конечного значения непосредственно перед автоклавированием. Рост культур проверяли спустя 5 - 7 дней инкубации при 25^oC или 37^oC. Чашки оценивали визуально: малый рост или отсутствие роста (), небольшой рост (+ или ++) или отличный рост (+++).

Как видно из таблицы 1, почвы, связанные с ризосферой, дали почти в два раза больше изолятов, чем почвы, не связанные с ризосферой. Каждый изолят испытывали на рост на агаре CYD при pH от 5,5 до 8,0. Все изоляты росли в пределах pH от 6,5 до 8,0. Только 9 изолятов не росли при pH 6,0, в то время как 57 (21%) не росли при pH 5,5. Среди изолятов, росших при pH 5,5, рост варьировал от слабого до отличного, в зависимости от изолята. Способность изолятов образовывать споры на агаре CYD определяли также визуально и под микроскопом спустя 5 - 10 дней инкубации.

Исследование антагонизма in vitro.

Отобрали 82 изолята по их способности хорошо расти и образовывать много спор на агаре CYD.

Для испытания способности изолятов ингибировать рост P. ultimum использовали исследование на чашках in vitro. Каждый актиномицет сеяли штрихом на кукурузный агар (КА), на одной половине. Культуру инкубировали при 25^oC в течение приблизительно 8 дней или до образования спор. Агаровый блок из КА (0,5 см²), содержавший активно растущий мицелий P. ultimum переносили в асептических условиях в центр чашки. Инкубацию продолжали еще 96 ч. Спустя 48 и 96 ч чашки изучали на предмет ингибирования роста P. ultimum. На ингибирование указывало то, что рост мицелия P. ultimum по направлению к колонии актиномицетов задерживался или предотвращался. Результаты этого исследования представлены в таблице II.

Спустя 96 ч пять изолятов (WYEC 108, YCED 9, WYE 91, WYE 90 и YCED 106) демонстрировали очень сильный антагонизм по отношению к P. ultimum, четыре (YCED 1, YCED 106, WYE 97 и WYE 98) демонстрировали сильный антагонизм, а десять других демонстрировали слабый антагонизм. Остальные изоляты демонстрировали слабый антагонизм. Остальные изоляты демонстрировали или очень слабый антагонизм, или вовсе его не демонстрировали. Культуры, которые четко ингибировали рост P. ultimum, примерно пополам распределялись между связанными и не связанными с ризосферой почвами.

Шестьдесят изолятов, которые росли при pH 5,5, также испытывали на антагонизм in vitro по отношению к грибу белой гнили Phanerochaete chrysosporium на кукурузном агаре (КА). Тринадцать изолятов демонстрировали определенную степень антагонизма по отношению к грибу белой гнили, как показано в таблице III. Степень антагонизма варьировала от очень высокой (+++) до относительно низкой (+), что определяли при размеру зоны ингибирования. Пять из этих культур, которые демонстрировали антагонизм по отношению к P. Chrysosporium (WYEC 108, WYE 78, WYE 90, YCED 9 и MSSC 2) испытывали далее на КА против еще одного гриба белой гнили (Coriolus versicolor) и против двух типов грибов бурой гнили (Postia placenta и Gloephyllum trabeum). Четыре изолята (MSSC 2, YCED 9, WYE 90, WYEC 108) демонстрировали очень сильный антагонизм по отношению к вышеупомянутым грибам белой и бурой гнили. Один изолят, WYEC 78, демонстрировал сильный антагонизм только по отношению к двум грибам белой гнили.

Для исследования 12 изолятов в отношении их воздействия на всхожесть семян и рост латука (Latuca Sativa) применяли методику Zynch и др. (1991, 1992).

Для наблюдения за растениями пластиковые горшки диаметром 9 см наполняли смесью для выращивания растений латука и утрамбовывали чашкой Петри. Десять семян латука помещали на поверхность, слегка вдавливали в смесь и слегка покрывали лишней смесью. Затем горшки помещали на лотки в воду и инкубировали в темноте при 20 - 22^oC, пока прорастание не становилось очевидным (приблизительно 3 дня). Лотки затем переносили в теплицу на капиллярные циновки и содержали при 15 - 25^oC и поливали по потребности. Количество проросших семян в каждом горшке периодически подсчитывали вплоть до 18-го дня.

Для растений, обработанных актиномицетами, горшки наполняли смесью, инокулированной спорами определенного актиномицета. Смесь инокулировали спорами из штаммов с косячков CYD в количестве в среднем 10⁸ - 10⁹ кое/г (сухой вес) смеси для выращивания. Кое/г в смеси для выращивания определяли подсчетом жизнеспособных колоний на чашках с агаром CYD на время инокуляции. Затем семена латука высаживали, как описано выше, покрывали небольшим количеством инокулированной смеси для выращивания, а затем обрабатывали так же, как контроль.

Для растений, обработанных актиномицетами и грибом выпревания Pythium ultimum (штамм PUMXZ, Lynch и др., 1991), смесь также инокулировали грибковым патогеном в количестве приблизительно 200 спорангиев на 1 г (сухой вес) смеси. Для получения спорангиев патогена и инокуляции смеси использовали методику Lynch и др. (1991, 1992). Подсчет спорангиев производили на гемоцитометре, а патогенность штамма P. ultimum подтверждали перед применением путем пассажа на латуке.

Для всех видов обработки брали по пять горшков. В теплице горшки помещали произвольными блоками, окруженными "сторожевыми растениями"; "сторожевые растения" служили для обеспечения одинаковых условий и действия в качестве буфера. Восемнадцать дней спустя после посадки растения собирали, определяли их количество, а также сухой и сырой вес (надземные листья и стебли). Сырой и сухой вес растений фиксировали как общую биомассу горшка в мг и как среднюю биомассу растений в мг. Величины представляли как средние пяти повторностей стандартное отклонение. Так, каждая величина основывалась на 50 семенах, высаженных для дальнейшей обработки (пять горшков по десять семян в каждом). Процент всхожести семян и количество выросших растений оценивали сходным образом (таблица IV).

В отсутствие патогенов (обозначены как -P1 в таблице IV) не было значимой разницы между инокулированными актиномицетами и контрольными горшками (без актиномицетов) в проценте семян, которые взошли и дали здоровые растения. Всхожесть семян и их прорастание усредняли в 98% всех случаев. Однако присутствие актиномицетов иногда задерживало прорастание семян на 1 - 3 дня (данные не показаны). Подобно этому в отсутствие патогенов обычно не было значимой разницы между инокулированными актиномицетами и контрольными горшками по весу побегов растений, измеренному как сырой и сухой вес. Исключение составляли горшки с WYEC 107, в которых присутствие актиномицетов значимо повышало выход биомассы растений.

В присутствии патогена (+P1) количество здоровых растений на горшок спустя 20 дней после посева в среднем составляло 3,6 из 10,0 в контрольных горшках по сравнению с 9,8 из 10,0 в контрольных горшках без патогена. В присутствии специфических актиномицетов, однако, наблюдались некоторые значимые улучшения в количестве здоровых растений и инокулированных патогенами горшках. Семь из 12 актиномицетов (YCED 85, YCED 64, WYEC 107, YCED 106, YCED 71, WYE 88 и WYE 21) значимо улучшали выход здоровых растений. Из них YCED 85, YCED 64 и WYE 21 также значимо улучшали показатели выхода сухого веса растений по сравнению с контролями, содержавшими только патоген. WYE 21 также значимо улучшал выходы сырого веса растений по сравнению с контролями, содержавшими только патоген. Один штамм, который не улучшал значимо выход здоровых растений (MSSC 1), улучшал показатели сырого и сухого веса побегов растений (таблица IV, колонки 5 и 7). Таким образом, MSSC 1 может оказаться полезным для защиты растений от более низких доз P. ultimum, чем те, которые использовались в настоящем эксперименте.

Пример II.

Выделение Srteptomyces WYEC 108.

Штамм WYEC 108 был идентифицирован как вид Srteptomyces на основании морфологических характеристик рода Srteptomyces, которые определены в руководстве по систематической бактериологии Bergey (1986). WYEC 108 является нитевидной бактерией, которая образует цепочки спор на воздушном мицелии. Как описано выше, Srteptomyces WYEC 108 был выделен в числе других штаммов актиномицетов, выделенных из почвы, взятой из восьми различных мест в Великобритании. Srteptomyces WYEC 108 был выделен среди других актиномицетов путем серийного разведения и посева ризосферной почвы, связанной с корнями растений льна на поле в Гастингс Хилс, Саут Даунс, Западный Суссекс, Англия. Разведения (10^-5 - 10^-7) этой почвы высевали на селективный агар WYE. Чашки с разведениями инкубировали при 25^oC в течение 4 - 10 дней, чтобы дать возможность колониям актиномицетов вырасти и образовать споры. Затем колонии собирали и сеяли штрихом на агар WYEC для очистки. Чистые колонии WYEC 108 переносили с этих чашек на скошенный агар CYD, инкубировали при 25^oC до образования спор и хранили при 4^oC вплоть до использования. Исходные культуры пересевали каждые 3 - 4 недели.

Идентификация Srteptomyces WYEC 108.

Как описано выше, выделенные штаммы актиномицетов изучали на предмет способности хорошо расти и образовывать много спор на агаре CYD. После этого ряд изолятов испытывали на способность ингибирования рост in vivo фитопатогена Pythium ultimum. Эти изоляты испытывали также на предмет антагонизма in vitro в отношении грибов белой гнили Phanerochaete chrysosporium и Coryolus versicolor, а также грибов бурой гнили Postia placenta и Gloeophyllum trabeum. В результате этих испытаний был выбран один их этих штаммов, в настоящем документе называемый Streptomyces WYEC 108, благодаря его благоприятным характеристикам.

Колонии Streptomyces WYEC 108, выращенные на чашках с агаром казиминокислота /дрожжевой экстракт/декстроза (CYD) исследовали под сканирующим электронным микроскопом. Образцы приготавливали следующим образом: (1) колонии Streptomyces WYEC 108 на чашках с CYD покрывали 1,5%-ным раствором глутарового альдегида в 0,2 M буфере натрия какодилата и фиксировали в течение по меньшей мере двух часов; (2) колонии полностью отмывали (2 x) 0,2 M буфером какодилата натрия путем аспирации предыдущей жидкости пипеткой и замены ее раствором буфера. Следили за тем, чтобы образец не высох; (3) колонии затем снимали путем забора "пробок" агара, содержащих колонии; (4) "пробки" помещали в отдельные контейнеры с отверстиями и подвергали дегидратации 100%-ным этанолом (2x) (J.T.Baker Inc., Phillipsberg, NJ); (5) образцы затем высушивали в сушильной "бомбе" критической точки высушивали и помещали на отдельные штыри для образцов, используя окраску коллоидным серебром. Затем их покрывали 60/40 золотом/палладием и просматривали на сканирующем электронном микроскопе.

Определяли также различные физиологические характеристики штамма WYEC 108.

Штамм WYEC 108 не вырабатывает меланин или H₂S на пептонном агаре с дрожжевым экстрактом и железом и пептонном агаре с железом (лаборатории Difco, Детройт, Мичиган) соответственно. Споровая масса, образуемая Streptomyces WYEC 108 на CYD была серого цвета. Этот штамм не рос при 45^oC. Streptomyces WYEC 108 может принадлежать к виду Streptomyces ludicus, как определено в руководстве по определительной бактериологии Bergey (1986). Соответственно этот организм может быть отнесен к Streptomyces WYEC 108. Для краткости в настоящем документе этот организм упоминается как Streptomyces WYEC 108 или просто WYEC 108.

Присвоение номера АТСС.

Депозит Streptomyces WYEC 108 был осуществлен на условиях Будапештского договора с Американской коллекцией типированных культур (АТСС), Rockvill, MD, 29 июня 1993. Этот штамм зарегистрирован под номером АТСС 55445.

Приготовление исходных культур Streptomyces WYEC 108.

Для быстрого использования Streptomyces WYEC 108 инкубировали на агаре CYD или агаре для спорообразования (косячках) при 25^oC до спорообразования и хранили при 4^oC вплоть до использования. Для долговременного хранения культур 10 мл споровых суспензий приготавливали путем суспендирования спор с одного скошенного агара или чашки в 10 мл среды YGM. Эту споровую суспензию затем использовали для инокуляции в 250-мл колбы Эрленмейера, содержащие 100 мл среды YGM (дрожжевой экстракт/глюкоза/неорганические соли). Колбы затем инкубировали при встряхивании на 250 об/мин в течение 32 - 36 ч при 30^oC для получения стандартного инокулюма.

Образцы из выращенного на YGM стандартного инокулюма также использовали для приготовления глицериновых культур, удобных для долговременного хранения при -70^oC и для лиофилизации.

Пример III Streptomyces WYEC 108 по отношению к грибковым патогенам in vitro Способность Streptomyces WYEC 108 ингибировать рост ряда выбранных грибковых фитопатогенов измеряли степенью ингибирования роста колоний Streptomyces WYEC 108 сеяли штрихом на одну половину в центре чашек с кукурузным агаром (лаборатории Difco, Детройт, Мичиган). Инокулированные чашки инкубировали при 25^oC в течение приблизительно 8 - 12 дней до образования культурами спор. Споруляцию определяли невооруженным глазом как массу серого воздушного мицелия и спор. Споруляцию определяли также под фазово-контрастным микроскопом (x 1000), 5-мм агаровый диск КА, содержавший активно растущий мицелий специфического грибкового фитопатогена, брали с ведущего края грибковой культуры и асептически переносили в центр чашки с агаром. Эти чашки инкубировали при 25^oC до тех пор, пока тест-гриб не достигал края контрольной чашки, не содержавшего Streptomyces WYEC 108. Ингибирование грибкого роста оценивали количественно путем определения отношения радиального роста грибкового патогена под влиянием Streptomyces WYEC 108 к отдельному его росту на контрольных чашках. Процент ингибирования грибкового роста регистрировали спустя 48, 96 и 192 ч инкубации, в зависимости от выбранного патогенного гриба. Это исследование повторяли на пяти чашках, ингибирование измеряли по отдельности и выражали как среднее стандартное отклонение.

Результаты этих исследований in vitro приведены в таблице V. Эти данные свидетельствуют о том, что Streptomyces WYEC 108 демонстрировал очень сильный антагонизм в отношении широкого спектра грибковых патогенов растений, включая грибы-возбудители выпревания (Pythium Ultimum), корневой гнили (Pythium ultimum, Rhigoetonia solani, Fusarium solani и Phytophthora cinnamomi), белой гнили (Phanerochaete chrysosporium и Coriolus versicolor) бурой гнили (Postia placenta и Gloephillum trabeum) и листовой и стеблевой гнили (Sclerotinia sp).

Пример IV Использование Streptomyces WYEC 108 для обработки семян Эффективность Streptomyces WYEC 108 в отношении защиты растений от фитопатогенов определяли обработкой штаммов Streptomyces WYEC 108 непроросших семян турецкого гороха и последующим высевом этих семян на почву, зараженную грибковыми фитопатогенами P.ultimum и P.irregulare.

Внеклеточные метаболиты, вырабатываемые штаммом WYEC 108, получали из культур путем экстракции. Эффект этих метаболитов на грибковую инфекцию прорастающих семян турецкого гороха также определялся.

Рост Streptomyces WYEC 108.

Для роста клеток штамма WYEC 108 1-литровые колбы Эрленмейера, содержавшие 500 мл YGM (pH 7,1-7,2) инокулировали 20 мл исходной культуры и инкубировали при встряхивании на 250 об/мин при 30^oC в течение 3 дней для получения клеточной массы. Для получения противогрибковых метаболитов 1-литровые колбы Эрленмейера, содержавшие 500 мл CYD (pH 7,1-7,2), инокулировали 20 мл исходной культуры и инкубировали при встряхивании на 250 об/мин при 30^oC в течение 7 дней.

Обработка семян Streptomyces WYEC 108 и противогрибковыми метаболитами.

Мицелиальную суспензию Streptomyces WYEC 108 собирали центрифугировали на 5000 об/мин в течение 10 мин 500 мл трехдневной жидкой YGM культуры. Собранный мицелий ресуспендировали в 200 - 300 мл стерильного 3%-ного (вес/объем) раствора альгинатта натрия до плотности культуры 1,0-1,210⁴ кое/мл. Затем к хорошо перемешанной клеточно-альгинатной суспензии добавляли семена турецкого гороха, которые затем переносили по одному в стерильный 0,25 М раствор CaCl₂ в дистиллированной воде. Эти семена использовали для эксперимента по биологическому контролю, описанного выше.

Противогрибковые метаболиты, вырабатываемые Steptomyces WYEC 108, получали в чистом виде следующим образом. Семидневные культуры (500 мл) фильтровали для удаления клеток и последовательно экстрагировали 150 мл эфира, используя экстракционную воронку. Затем эфир удаляли путем выпаривания в вакууме, а полученные экстракты вновь растворяли в 1,5 мл дистиллированной воды. Этот раствор затем стерилизовали фильтрованием через стерильный 0,45 мкм фильтр и добавляли в 10 мл 3% (вес/объем) раствора альгината натрия. Очищенные противогрибковые метаболиты можно использовать для защиты растений от грибковой инфекции. Предпочтительно противогрибковые метаболиты нужно очищать так, чтобы они практически не