Выделенный фрагмент днк, способ получения рекомбинантного белка с нейротропной активностью, белок nt-3 и фармацевтическая композиция

Выделенный фрагмент днк, способ получения рекомбинантного белка с нейротропной активностью, белок nt-3 и фармацевтическая композиция

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии. Получен белок нейтропин-3 (NT-3) человека культивированием клеток млекопитающих, трансформированных вектором экспрессии, содержащим выделенный фрагмент ДНК, кодирующий указанный белок. Выделенный фрагмент ДНК включает нуклеотидную последовательность, которая кодирует предшественник нейтропина-3 человека, состоящий из аминокислотной последовательности, отщепляемой протеазой и следующей за ней аминокислотной последовательности зрелого белка нейротропина-3. Белок NT-3 имеет мол. м. 14 кД, способен инициировать выживание, рост или дифференциацию нейтронов, прорастание нейритов из корешков нодозных и дорзальных ганглиев. Получена фармацевтическая композиция с нейротропной активностью, содержащая терапевтически эффективное количество белка NT-3 в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый носитель. Полученный белок NT-3 может быть использован для диагностики и лечения различных неврологических нарушений. 4 с.п. ф-лы, 19 ил., 7 табл.

Настоящее изобретение касается нейротропина-3 (NT-3) нового нейротропного фактора, который относится к генному семейству BDNF/NGF. Ген, кодирующий NT-3, был клонирован и секвенирован, и рекомбинантный NT-3 был экспрессирован в клетках млекопитающих. Рекомбинантный NT-3, как оказалось, обладает спектром биологической активности, которая отличается от активности BDNF и NGF. Настоящее изобретение обеспечивает последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие NT-3, для получения в основном чистого белка NT-3, пептидных фрагментов или производных, производимых ими в большом количестве, а также антител, направленных против белка NT-3 и его производных. Продукты гена NT-3 по изобретению могут быть использованы для диагностики и лечения различных неврологических нарушений, включая, в частности, периферийные невропатии, болезнь Альцхаймера и болезнь Паркинсона.

2. Предпосылки изобретения 2.1. Роль нейротропных факторов в нервной системе Развитие и деятельность нервной системы зависит от белков, известных как нейротропные факторы. Широко распространенная гибель нейронных клеток сопровождает нормальное развитие центральной и периферийной нервных систем, и, очевидно, играет решающую роль в регулировании количества нейронов, которые защищают данную мишенную область (Berg, D.K. 1982, Newronal Development 297 - 331; Cowan et. al., 1984, 225 1258-65). Исследование периферийных мишенных тканей экстирпацией и трансплантацией во время их развития показало, что гибель нейронных клеток происходит вследствие конкуренции среди нейронов за ограниченные количества факторов их выживания ("нейротропных факторов"), продуцируемых в областях их защиты. Эти наблюдения привели к идентификации фактора нервного роста (NGF); который пока еще остается лучше всего охарактеризованной нейротропной молекулой (Lebi-Montalcini and Angeletti, P.U. 1968, Physiol Rev. 48 534-69; Thoenen, H. and Barde J.A. 1980, Rev. 60 1284-335). Пониманию роли и механизма действия NGF значительно помогло счастливое открытие богатого источника этого белка в подчелюстных железах самца мыши, которое позволило осуществить очистку и клонирование (Ullrich et. al., 1983, Nature 303:821-5; Scott et. al., 1983, Nature 302 538-40) NGF, так же как генерирование нейтрализующих его антител. Поскольку NGF только поддерживает ограниченное количество нейронных популяций, было постулировано существование дополнительных нейротропных факторов (Varon, S. and Adler, R., 1981, Adv. Cellular Neurobiol. 2:115-63, Barde et. al., 1987, Prog Brain Res. 71:185-9; Shider, W.D. and Johnson, E.M., 1989, Ann. Neurol., 26:489-506). Хотя теперь ясно, что такие факторы действительно существуют, их крайне низкое содержание препятствовало их характеристике на молекулярном уровне. Тем не менее, очистка небольших количеств двух таких белков, а именно мозгового нейротропного фактора (BDNF) и цилиарного нейротропного фактора (CNTF), недавно позволила осуществить их частичное секвенирование на нуклеиновые кислоты (Leibrock et. al., 1989, Nature, 341:149-52; Stockli et al. , 1989, Nature, 342: 21-28 and Lin et. al., Science 246 : 1023-25). Несмотря на специфичность конкретных нейронных популяций, BDNF и NGF (но не CNTF) показали достаточную структурную гомологию, чтобы рассматривать их как членов одного генного семейства (Leibrock et. al., 1989, Nature, 341 149-52).

2.2. Другие нейротропные факторы За прошедшее десятилетие было множество сообщений о нейротропной активности, выявленной в экстрактах большого разнообразия тканей и в кондиционированной культуральной среде многих различных типов клеток. Почти во всех случаях, однако, прогресс в очистке и характеристике этих активностей был замедлен тем, что такие активности присутствуют в крайне малых количествах, в пределах от пикограммов до нанограммов на грамм ткани. Кроме того, в то время как для периферийных нейронов были поставлены адекватные биоопыты, для нейронов центральной нервной системы проведение надежных, воспроизводимых и специфичных опытов оказалось проблематичным. Тогда как отдельные типы периферийных нейронов были обнаружены в виде дискретных, легко иссекаемых ганглиев, нейроны центральной нервной системы (ЦНС) неизменно являются высоко гетерогенными в их распределении. Так, требуются специфичные маркеры для идентификации или обогащения некоторых классов нейронов ЦНС. Прогресс в получении таких маркеров, например, антител, направленных на клеточную поверхность или цитоструктурные компоненты, или специфичных гистокрасок, весьма невелик. Соответственно, крайне трудным оказалось охарактеризовать нейротропные факторы, которые: (I) не так обильны, как NGF, (II) трудны для опытов, и (III) отсутствуют в достаточном количестве для обеспечения производства антител.

2.2.1 Сравнение извлеченного из мозга росткового фактора и фактора нервного роста Нейротропная активность, способная поддерживать жизнеспособность нейронов дорсальных корневых ганглиев эмбрионов цыплят, была идентифицирована в "кондиционированной среде", в которой выращивали клетки C-6 крысиной глиомы. (Barde et. al. , 1978, Nature 274 818). Эта активность не нейтрализовалась антителами к мышиному NGF, указывая на присутствие другого нейротропного фактора в кондиционированной среде. Подобные активности, не блокируемые NGF антителами, были впоследствии описаны в культурах астроглиальных клеток нормального мозга взрослых крыс (Lindsay, 1979, Nature, 282 80-82, Lindsay et al. , 1982, Brain Res. 243 329-343) и в экстрактах из мозга развивающейся и взрослой крысы (Barde et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 1199-1203), и из развивающегося и зрелого спинного мозга цыпленка (Lindsay and Peters, 1984, Neuroscience, 12 45-51). Однако ни в одном из случаев не был выделен или идентифицирован активный фактор (факторы) и остается под вопросом, относятся ли замеченные активности к одному и тому же, или к разным факторам.

Использовав мозг свиньи в качестве исходного материала, Barde и др. (1982, EMBO 1: 549-553) сообщил о факторе, теперь называемом мозговым (извлеченном из мозга) нейротропным фактором (BDNG), который, очевидно, содействовал выживанию нейронов дорсальных корневых ганглиев из цыплячьих эмбрионов E10/E11. Было обнаружено, что нейротропная активность расположена на высокоосновном белке (изоэлектрическая точка с pH более 10,1), который мигрирует при электрофорезе в геле SDS (натрия додецилсульфат) в виде одной полосы молекулярным весом 12,3 кД. Очищенный фактор был оценен как 1,4 10⁶, но выход был очень низок, приблизительно только 1 г BDNF, очищенного из 1,5 кг свиного мозга. Кроме того, поскольку последней процедурой в этом процессе очистки был гелевый электрофорез, то активность BDNF не могла полностью ренатурировать вторично к присутствию остаточного SDS (Barde and Thoenen, 1985 в "Hormones and Cell regulation", vol. 9, Dumont et al., eds Elsevier Science Publishers, 385-390). Отмечено, что высокоосновная природа и молекулярный размер BDNF очень похожи на NGF мономер. Однако BDNF показал, что он обладает свойствами, которые отличаются от известных свойств NGF тем, что (а) в биоопыте на ганглиях дорсального корня цыпленка, антитела к NGF не проявили действия на биологическую активность BDNF, (б) в том же опыте, эффекты BDNF и NGF оказались дополняющими, и (с) в отличие от NGF было обнаружено, что BDNF не оказывает влияния на выживание симпатических нейронов E 12 эмбриона цыпленка. В дополнение, при предыдущих исследованиях мозговых экстрактов наблюдалось, что нейротропная активность в этих источниках действует, очевидно, на сенсорные нейроны на более поздних стадиях развития, чем связанных с NGF. С использованием диссоциированных культур нейронов эмбрионов цыплят, выращиваемых на поликатионном субстрате, таком, как полилизин или полиорнитин, было обнаружено, что BDNF поддерживает выживание более 30% E10 - E11 (т.е. десятого или 11-го дня развития эмбриона) нейронов ганглиев дорсального корня, но, похоже, слабо влияет на выживание тех же нейронов у E6 (Barde et al., 1980, Proc. Natl. Acad. USA 77 1199-1203 см. выше). При подобных условиях NGF поддерживает выживание 30 - 40% E6 DRG нейронов. Любопытно, что позднее было обнаружено, что при культурировании на субстрате, покрытом внеклеточным маточным гликопротеином ламинином, как NGF, так и BDNF поддерживали выживание около 50% DRG нейронов из цыплячьих эмбрионов возраста E6 - E12 (Lindsay et al., 1985, Develop. Biol., 112 319-328). В более позднем исследовании было обнаружено, что действие NGF и BDNF является дополняющим, когда оба присутствуют в насыщенных концентрациях.

Предыдущие исследования Levi-Montalcini (1966, "The Harvey lectures" 60: 217-259) нейронной специфичности NGF предполагали, что NGF не является вездесущим нейротропным фактором даже для сенсорных нейронов, поскольку NGF, как оказалось, не оказывает влияния на нейроны определенных сенсорных ганглиев головы цыпленка, особенно нодозного ганглия десятого черепного нерва. Позднее, исследования "ин виво" (Johnson et al., 1980, Science 210: 916-918, Pearson et al., 1983, Development Biol., 96:32-36) показали, что удаление во время эмбриогенеза не оказало действия на выживание нейронов в большинстве головных сенсорных ганглиев крысы, тогда как подобная обработка значительно уменьшила нейронное количество на сенсорных ганглиях, извлеченных из нейронного гребня. Более тщательные исследования "ин витро" (Lindsay and Rohrer, 1985, Develop Biol., 112:30-48, Davies and Lindsay, 1985, Develop Biol., 111:62-72, Lindsay et al., 1985, J. Cell Sci. Suppl. 3: 115-129) ясно показали, что NGF поддерживает выживание большинства извлеченных из нейронного гребня сенсорных нейронов, но не оказывает видимого эффекта на выживание головных сенсорных нейронов, выделенных из нейронных плакод.

Первой демонстрацией нейронной специфичности BDNF, отличающейся от NGF, был опыт "ин витро", при котором очищенный BDNF поддерживал выживание 40 - 50% сенсорных нейронов, диссоциированных из нодозного ганглия, извлеченного из нейронной плакоды цыплячьего эмбриона E6, E9 или E12 (Lindsay et al., 1985, J. Cell Sci. Suppl., 3:115-129) NGF не оказал видимого эффекта на эти нейроны как сам по себе, так и совместно с BDNF. Позднее, при исследованиях культур эксплантантов было показано, что BDNF, вероятно поддерживает выживание и отрастание нейритов от других сенсорных ганглиев, извлеченных из нейронной плакоды, включая височные, коленчатые и вентролатеральные тройничные ганглии (Davies et al., 1986, J. Neurosci, 6:1897-1904), ни один из которых не проявил чувствительности к NGF. Во всех вышеупомянутых исследованиях нейтрализующие антитела к NGF не оказывали действия на наблюдаемую активность BDNF. В дополнение к этим воздействиям на культурируемые нейроны из периферийных ганглиев, было обнаружено, что BDNF стимулирует выживание и нейронную дифференциацию клеток, культурированных из нейронного гребня перепелки (Kalcheim and Gendreau, 1988, Development Brain. Res., 41 : 79-86).

До настоящего изобретения, неспособность получать достаточные количества BDNF для иммунизации препятствовала производству анти-BDNF антител в сравнении с анти-NGF антителами по их действию на нейронные популяции и не позволяла осуществить эксперименты по BDNF/NGF перекрестной нейтрализации. Два недавних исследования, проведенных с BDNF (Kalcheim et al., 1987, EMBO, 6: 2871-2873), Hofer and Barde 1988 Nature 331:261-262/ показали, однако, физиологическую роль, играемую BDNF в развитии птичьей периферийной нервной системы (ПНС). Если "ин ово" (в яйце) помещали механический барьер между E3/E4 DRG (3-ий или 4-ый эмбриональный день дорсальных корневых ганглиев) и их мишенью центральной нервной системой в нервной трубке, то наблюдали гибель многих DRG нейронов (Kalcheim and Douarin, 1986, Develop Biol., 116: 451-466). Предположили, что эта гибель нейронов может быть вызвана отсутствием происходящего от ЦНС (нервной трубки) нейротропного фактора. В последующем наблюдали, что BDNF, прикрепленный к покрытой ламинином сиаластиковой мембране, может предотвращать эту гибель клеток (Kalcheim et al., 1987, EMBO, 6:2871-2873).

Было обнаружено, что инъекции BDNF в развивающиеся яйца перепелки снижают естественную гибель клеток в нодозных ганглиях, эффект, не наблюдавшийся с NGF (Hofer and Barde, 1988, Nature, 331:261-262). В дополнение к этому действию на периферийные сенсорные нейроны происхождения как из нейронного гребня, так и нейронной плакоды, было обнаружено, что BDNF поддерживает выживание развивающихся нейронов ЦНС. Джонсон и др. (1986, J. Neurosci, 6 3031-3938) представил данные, указывающие, что BDNF поддерживает выживание клеток ганглия сетчатки, культурированных из E17 эмбрионов крыс. Это продолжило предыдущие исследования, показавшие, что кондиционированная среда и мозговые экстракты, приготовленные из мишенных областей клеток ганглия сетчатки, очевидно, поддерживают выживание этих нейронов (McCaffery et al., 1982, Ex. Brain. Res. , 48: 37-386, Sarthy et al., 1983, J. Neurosci., 3: 2532-2544, Turner et al., 1983, Dev. Brain. Res).

В дополнение к его действию на выживание развивающихся в культуре нейронов, оказалось, что BDNF воздействует на нейроны периферийной и центральной нервной системы, которые находятся в культуре в зрелом состоянии. Было показано, что BDNF как и NGF, стимулирует аксонную регенерацию в культуре из DPG нейронов взрослой крысы (Lindsay., 1988, J. Neurosci., 8: 2394-2405), хотя зрелые сенсорные нейроны не проявили потребности в нейротропных факторах для поддержания "ин витро" более 3 или 4 недель. Кроме того, в культурах сетчатки взрослых крыс наблюдалось, что BDNF способствует как выживанию, так и удлинению аксонов из клеток ганглия сетчатки (Thanos et al., 1989, Eur. J. Neurosci., 1: 19-26). Сравнение биологического действия NGF и BDNF представлено в табл. I.

2.2.2. Нейронные мишени мозгового нейротропного фактора Сенсорные нейроны периферийных нервных ганглиев происходят, как было обнаружено, из двух четко отличающихся, временных эмбриологических структур, а именно, из нейронного гребня и нейронных плакод. Нейронный гребень дает начало как нейронам, так и сателлитным клеткам автономных ганглиев и сенсорных ганглиев позвоночного нерва, т.е. DRG. Вклад нейронного гребня и нейронных плакод в формирование сенсорных ганглиев черепного нерва было изучено с использованием химерной (перепелка / цыпленок) трансплантационной системы, придуманной Le Douarin (1973, Develop Biol., 20: 217-222, Noden, 1978, Develop Biol. , 67: 313-329, Narayanan and Narayanan, 1980, Anat. Rec., 196: 71-82, Ayer-Le Lievu and Le Douarin, 1982, Develop Biol., 94: 291-310, D'Amico-Martel and Noden, 1983, Am. J. Anat, 166: 445-468). Как отмечено у Lindsay и др. (1985, J. Cell Sci. Suppl., 3: 115-129), теперь полагают, по крайней мере, для птиц, что нейроны дистальных ганглиев VII-го, IX-го и X-го черепных нервов (коленчатый, височный и нодозный ганглии, соответственно) и нейроны вестибулоакустического комплекса VIII-го черепного нерва имеют исключительно плакодное происхождение. Тройничный ганглий V-го черепного нерва содержит нейроны как гребешкового, так и плакодного происхождения (с нейронами плакодного происхождения, преобладающими на вентролатеральном полюсе максилло-мандибулярной доли), тогда как было обнаружено, что сателлитные клетки всех черепных ганглиев - полностью гребневого происхождения.

Из экспериментов "ин витро" с использованием как эксплантированных, так и диссоциированных, обогащенных нейронами культур сенсорных нейронов позвоночного и черепных нервов, было найдено, что сенсорные нейроны происходящие из нейронного гребня реагируют на NGF, напротив, нейроны, происходящие из нейронных плакод (включая нейроны вентролатеральной части тройничного ганглия и всю нейронную популяцию вестибулярного, коленчатого, височного и нодозного ганглиев), в основном, не отвечают на NGF во время эмбрионального развития. В контрасте к отличиям их потребностей и реакции на NGF, было обнаружено, что (см. Табл. I) как сенсорные нейроны плакодного, так и сенсорные нейроны гребневого происхождения отвечают на активность BDNF в отношении выживаемости и развития нейритов (Lindsay et al., 1985, J. Cell Sci. Suppl. , 3: 115-129, Lindsay et al., 1985, Develop Biol., 112: 319-328, Kalcheim and Gendrean, 1988, Develop Brain. Res., 41: 79-86).

Tebar и Barde, (1988, J. Neurosci, 8: 3337-3342) исследовали параметры связывания радиоактивно помеченного BDNF к нейронам ганглия дорсального корня эмбриона цыпленка; их результаты согласуются с существованием двух классов BDNF рецепторов, одного - с высокой аффинностью к BDNF, и другого - с низкой аффинностью. На симпатических нейронах не наблюдалось рецепторов с высокой аффинностью.

Barde et al. , 1987, Prog. Brain. Res., 71: 185-189) сделал дальнейший обзор известных нейронных мишеней BDNF. До настоящего изобретения, идентификация клеток, синтезирующих BDNF, была невозможна из-за отсутствия проб нуклеиновых кислот или антител, специфичных к BDNF. Попытки приготовить поликлональные или моноклональные антитела к BDNF были безуспешными. Эта неудача в получении антител воспрепятствовала молекулярному клонированию BDNF, определению физиологического эффекта лишения развивающихся нейронов BDNF "ин виво", количественному определению BDNF в тканях с использованием иммунологических исследований, и локализации BDNF с использованием иммунной цитохимии.

2.2.3. Клонирование гена, кодирующего мозговой нейротропный фактор Клонирование гена BDNF было впервые осуществлено, как описано в патентной заявке США серийный номер 07/400591, поданной 30.08.89, которая полностью включена в настоящее описание путем ссылки. Вкратце, из свиного мозга были очищены крошечные количества белка BDNF, которые позволили определить фрагменты аминокислотных последовательностей, которые, в свою очередь, могли быть использованы для конструирования соответствующих олигонуклеотидов. Эти синтетические олигонуклеотиды затем использовали в качестве праймеров в цепной реакции полимеризации (PCR) с кДНК-матрицей, полученной из клеток, продуцирующих BDNF. PCR-продукты были использованы в качестве зондов для обеспечения клонирования полной кДНК и/или геномных генов BDNF различных видов животных, включая человека, свинью, крысу и мышь, и определили последовательности этих генов. Экспрессия рекомбинантных BDNF была осуществлена в COS клетках.

3. Краткое содержание изобретения Настоящее изобретение касается нейротропина-3 (NT-3), недавно открытого члена генного семейства BDNF. Оно основано, отчасти, на идентификации областей с гомологией нуклеиновокислотных последовательностей BDNF и NGF (заявка США 07/400591, см. выше). Согласно настоящему изобретению, эти гомологичные области могут быть использованы для идентификации новых членов генного семейства BDNF/NGF, такую методику использовали для идентифицирования NT-3. Настоящее изобретение обеспечивает гены и генные продукты относящихся к BDNF/NGF нейротропных факторов, идентифицированных таким методом.

Настоящее изобретение касается, отчасти, молекул рекомбинантной ДНК, кодирующих NT-3. В частности, вариант выполнения изобретения предусматривает, что ДНК, кодирующая NT-3, извлекается из человеческой ДНК, или ДНК морской свинки, или ДНК крысы. Настоящее изобретение также обеспечивает векторы экспрессии рекомбинантной ДНК, включающие по меньшей мере часть нуклеиновых последовательностей, в основном, таких, как описано на Фиг. 2 (NT-3 морской свинки), Фиг. 7 (NT-3 крысы), или Фиг. 11 (NT-3 человека). Настоящее изобретение также обеспечивает векторы экспрессии рекомбинантной ДНК, которые могут быть использованы для производства рекомбинантного NT-3 протеина относящихся к нему пептидов.

В альтернативном выполнении настоящее изобретение обеспечивает NT-3 протеины и соответствующие пептиды, а также способы получения и приготовления таких пептидов и протеинов. Настоящее изобретение также относится к антителам, направленным против NT-3 протеинов и пептидов.

Согласно изобретению, NT-3 могут быть использованы для диагностики и/или лечения неврологических нарушений, включая, но не ограничиваясь этим, периферийные нейропатии, такие как диабетические нейропатии, токсические и пищевые нейропатии, наследственные нейропатии и нейропатии, связанные со СПИДом, а также дегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцхаймера. Было показано, что NT-3 поддерживает выживание допаминэргических нейронов; соответственно, в предпочтительном выполнении изобретения, NT-3 может быть использован для лечения болезни Паркинсона. Поскольку установлено, что NT-3 проявляет спектр активности, отличающийся от специфичности BDNF или NGF, NT-3 обеспечивает новые и ценные возможности для стимулирования роста и "ремонта" центральной нервной системы.

4. Описание фигур Фиг. 1. Сравнение последовательностей BDNF и NGF различных видов животных. Анализ последовательности гена, кодирующего BDNF и дедукция аминокислотной последовательности выявили, что этот белок имеет множество структурных подобий с NGF. Первичная последовательность зрелого BDNF, так же как общая структура и вероятный характер процесса от предшествующего белка, предполагает со значительной уверенностью, что гены NGF и BDNF могут быть получены из общего предшественника-гена. Внутри области зрелых полипептидов, если в последовательность NGF для оптимизирования совместимости введено только три разрыва, то всего 51 аминокислотных тождественностей являются общими для ранее известных NGF многих видов, и для свиного и человеческого BDNF. Эти тождественности включают все шесть цистеиновых остатков, предполагая, что NGF и BDNF имеют очень похожую вторичную структуру. Кроме того, четыре сегмента из шести или более аминокислот также видны на этой фиг., у которых NGF всех приведенных выше в списке видов и из свиного BDNF являются также идентичными, или отличаются не более чем на примерно одну консервативную аминокислотную замену. Таким образом, разумно заключить, что NGF и BDNF являются тесно связанными членами генного семейства.

Фиг. 2. Геномная последовательность и выведенная аминокислотная последовательность NT-3 морской свинки. Аминокислотная последовательность начинается с первого АТГ-кодона, находящегося после 3 рамочных стоп-кодонов. Подчеркнутые последовательности указывают расположение праймеров, используемых на первом круге PCR. Единственная консенсусная последовательность N-гликозилирования подчеркнута дважды, а стрелки показывают предположительный старт получаемой зрелой NT-3.

Фиг. 3. Сравнение аминокислотных последовательностей между NT-3 зрелой мыши, NGF (Scott et al., 1983, Nature 302: 538-540) и BDNF (Leibrock et al., 1989, Nature, 341: 149-152). Показанная здесь последовательность BDNF зрелой мыши является на 100% идентичной последовательности свиного BDNF. Жирным шрифтом и тенями указаны аминокислоты, обнаруженные в идентичных положениях у всех трех белков, а стрелки показывают на все протеиновые остатки. Звездочками помечены разрывы, введенные для оптимизации структуры. V1 - V4 показывает 4 изменяемые области (домена), состоящие из более трех смежных аминокислот.

Фиг. 4. Тканевое распределение NT-3 мРНК у мыши. Двадцать микрограммов общей РНК наносили на каждую дорожку и гибридизировали меченой ³²P пробой двухнитевой ДНК. (A) Во всех тканях видна единственная полоса, соответствующая примерно 1,4 кб (тысяч оснований), слабейший сигнал наблюдался в легких и сильнейший в сердце. Скелетную мышцу брали из бедра. (B) В головном мозгу сильнейший сигнал был получен из аммонова рога и мозжечка.

Фиг. 5. Выживание сенсорных нейронов, выделенных из нодозных ганглиев, полученных от цыпленка на 8-й день эмбрионального развития. 5 тыс. клеток были помещены в чашку на полиорнитин-ламининовый субстрат, а выжившие нейроны подсчитывали через 24 часа. Используемая BDNF втрое больше минимальной концентрации, требуемой для получения максимального выживания. Не был обнаружен ни один выживший без добавления нейрон, или с кондиционированной средой, используемой при разведении 1 : 50 с нетрансфецированными COS клетками, или клетками, трансфецированными контрольной ДНК.

Фиг. 6. (A) PCR-продукт, полученный с использованием дегенеративных 1B и 2C праймеров (обозначенных R1B(2C) обнаруживает новый ген, NT-3, так же как и NGF и BDNF гены в геномной ДНК крысы. (B) Карта рестрикции крысиного NT-3 геномного клона. Два независимых клона бактериофагов, специфически гибридизирующихся к R1B/2C зонду, были выделены из геномной библиотеки крысы. Схематически представлена карта рестрикции одного из этих клонов, содержащего вставку размером 19,5 кб. Утолщенная линия указывает открытую рамку считывания (ORF) NT-3 (см. Фиг. 7A). Указано положение пробы R1B/2C.

Фиг. 7. Последовательность крысиного NT-3 и его гомология к крысиному NGF и крысиному BDNF. (A) нуклеотидная и аминокислотная последовательность NT-3. ORF, охватывающая последовательность ДНК, кодируемую NT-3 геном, с аминокислотной трансляцией, указанной выше последовательности ДНК, звездочками отмечены начало и конец открытой рамки считывания. Аминокислоты пронумерованы с позицией +1, относящейся к первому остатку зрелого NT-3 (119 аминокислот). Сайт расщепления, использованный для освобождения зрелого NT-3, взят в рамку, так же как консервированный сайт гликозилирования выше этого сайта расщепления; другой потенциальный сайт расщепления, подобным образом расположенный у предлагаемого промежуточного сайта прессинга а NGF (Darling et al. , 1987. , Cold Spring Harb Symp. Anant Biol. 1: 427-34), но который не консервирован в BDNF, взят в рамку и помечен "? CLEAVE". Шесть цистеинов в зрелом NT-3 подчеркнуты. Метиониновый кодон инициации короткой предшествующей формы NT-3 (в позиции - 139), который отмечает стартовый сайт "B" как обсуждается в тексте, также подчеркнут. На этой фиг. указана граница сайт-акцептор предлагаемой вставки/ интрон, расположенный вверх от стартового сайта "B". (B) Сравнительный анализ последовательностей крысиного NT-3 с крысиным NGF и крысиными BDNF. Компьютерная программа секвенирующего анализа МакВектора (купленная у Интернешнал Биотехнолоджиез Инк.) была использована для проведения матричного сравнительного анализа ORF крысиного NT-3 с ORF генов NGF и BDNF (с использованием размера окна 20 и минимальной совместимостью 20%). Значительные совместимости видны по диагонали этой матрицы и представлен внизу схематически продукт- NT-3 протеин; две гомологичные области вверх по зрелому NT-3, которые видны в сравнении с NGF и BDNF обозначены I и II. Как показано на этой фигуре, область I простирается вверх от стартового сайта "B", используемого для генерирования короткой предшествующей формы NT-3, подтверждая точку зрения, что существует более длинный предшественник. (C) Сравнение последовательностей NT-3, NGF и BDNF в гомологичных областях I и II. Последовательности в этих областях выравнены для максимизации гомологии, с разрывами, вставленными для такого выравнивания, которые обозначены "-". Совпадения BDNF или NGF с последовательностью NT-3 указаны звездочками, тогда как совпадения NGF с BDNF помечены точками в последовательности NGF. "+" вверху последовательности указывает остатки, которые полностью консервированы между крысиными NT-3, NGF и BDNF последовательностями всех исследованных видов животных. Показаны следующие сайты, определенные для NGF, ранее предсказанные BDNF и предложенные здесь для NT-3: стартовый сайт "B" метионинового кодона инициации, сайт расщепления сигнальной последовательности (Edwards et al. , 1988, Mol. Cell. Biol., 8: 2456-64); предложенный промежуточный сайт расщепления NGF, который отсутствует у BDNF, но имеется у NT-3; сайт-акцептор гликозилирования; сайт протеолитического расщепления, который освобождает зрелые факторы. (D) Сравнение последовательностей зрелых форм NT-3, NGF и BDNF. Консервированные цистеины помечены жирными квадратиками. "Звездочка", "точка" и "-", - как в (C). Указан также C-терминальный сайт расщепления, присутствующий только в последовательности NGF.

Фиг. 8. Сравнение активностей NGF, BDNF и NT-3 по результатам исследований на эксплантированных эмбриональных (8 день) ганглиях цыпленка. Фотомикрографии ганглиев дорсального корня (DRG) (панели A-D), нодозных ганглиев (панели E-H), и ганглиев симпатической цепи (SG) (панели 1-L) культивировали 24 часа (DRG и NG) или 48 часов. (SG) как в отсутствие любого нейтропного фактора (Контроль: A, E, 1) так и в присутствии супернатантов COS - клеток, содержащих NGF (B, F, Y), или BDNF (C, G, K), или NT-3 (D, H, L). Почти нет отрастания нейритов в контрольных культурах (500 л COS-клеточного супернатанта от mock-трансфецированных клеток). NGF (10 л COS - клеточного супернатанта) вызвал обильное отрастание нитей от DRG и SG, но не от NG. Увеличение количества NGF COS-клеточного супернатанта от 20 до 500 л не оказало действия на NG. BDNF (10 л COS-клеточного супернатанта) вызвало отрастания нитей от DRG и NG, но не от SG, более высокое количество (от 20 до 500 л) не оказало влияния на SG. NT-3 (20 л COS-клеточного супернатанта на DRS и NG, и 200 л на SC) вызвало отрастание нитей у всех трех типов ганглиев, хотя инициация роста была более медленной и менее обильной, чем от SG. Ганглии культивировали в виде эксплантантов в коллагеновом геле (Lindsay R.M. и Rohrer H., 1985, Dev. Biol. 112: 30-48) в среде F14, с добавлением 5% лошадиной сыворотки, как было описано ранее (Lindsay и др. 1985, Dev. Biol. 112: 319-28). Цена деления = 200 л.

Фиг. 9. NT-3 способствует выживанию и отрастанию нейритов в высокообогащенных культурах DRG нейронов. Фотомикрографии обогащенных нейронами (более 95% нейронов) культур диссоциированных DRG эмбриона (8 дней) цыпленка, обработанных в течение 48 часов или (A) супернатантом (500 л) из mock-трансфецированных COS-клеток, или (B, C) супернатантом (50 л) из NT-3 трансфецированных клеток. A и B - микрографии в темном поле; в A (контрольная культура) выжило менее 5% нейронов на чашке; в B число нейронов, перенесших этот процесс, составило примерно 60% от помещенных на чашку нейронов. Из кривой реакции на дозировку обнаружено, что максимальный эффект NT-3 оказывает на цыплячьи E8 DRG-нейроны. (C) Фазоконтрастная микрография той же культуры, что и в B, но при большем увеличении. Обратите внимание на большое количество ярких нейронных клеточных тел и фактическое отсутствие каких-либо не-нейронных клеток. Культуры были созданы, как описано ранее (Lindsay et al., 1985, Dev. Biol. 112: 319-28). Цена деления = 150 л. (C) Фиг. 10. Сравнение, путем назерн-блоттинга, экспрессии NT-3, NGF и BDNF в тканях грызунов. Из указанных тканей крыс (левые панели) или мышей (правые панели) была приготовлена РНК (Auffray, C. и Rougeon F., 1980, Eur. J. Biochem. , 107: 303-14). Десять микрограмм РНК из указанных источников затем фракционировали на 1%-ных формальдегид-агарозных гелях и переносили на нейлоновую мембрану в 10X SSC; тройные назерн-блоты гибридизировали (Mahmoud, M. и Lin V. K. , 1989, Biotechniques 7: 331-3) при 68^oC с ³²P-меченого (Feinbern, A. P. и Vogelstein, 1984, Anal. Biochem, 137: 266-7) крысиного NT-3, крысиного BDNF и крысиного NGF фрагментов ДНК, а затем промывали при 68^oC в 2X SSC, 0,1% SDS. Фрагменты ДНК для NT-3, BDNF и NGF извлекли из экспрессионных конструкций, содержащих эти гены в pCDM18, xhoI инсерты размером примерно 775 бр в этих конструкциях были очищены на геле перед радиомечением. Включена картинка геля, окрашенного этид-бромидом, позволяющая сравнить общее количество РНК на образец.

Фиг. 11. Сравнительные последовательности ДНК крысиного и человеческого NT-3 генов. Прогнозируемый сайт начала трансляции указан "PREPRO-" и прогнозируемое начало зрелого NT-3 указан словом "MATURE". Зрелые крысиный и человеческий NT-3 протеины имеют идентичные аминокислотные последовательности, тогда как их "рrерrо" - области отличаются в одиннадцати положениях, которые подчеркнуты.

Фиг. 12. Экспрессия человеческого NT-3 полипептида, обнаруженная метаболическим мечением. 5 10⁵ COS-M5 клеток на чашку посеяны в 60 мм чашки Петри и выращивались в течение ночи при 37^oC в полной ДМЕМ среде с 10% общей бычьей сыворотки (FBS). Эти клетки трансфецировали (с использованием CaPO₄ метода, описанного Chen и Okayama, 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745-52) с 20 л плазмид pC8-hN3 (P1), содержащих ген человеческого NT-3 при регулировании промотором цитомегаловируса или же mock-трансфецировались (без плазмидной ДНК). Через 48 часов, клетки промывали и инкубировали в течение 1 часа в 1 мл свободной от метионина и цистеина среде ДМЕМ с 1% бычьей сыворотки. К каждой культуре добавляли смесь ³⁵S метионина и ³⁵S цистеина (по 100 л Ci каждого, от New England Nuclear), затем клетки инкубировали дальше в течение 4 часов при 37^oC, в полученной среде. Образцы по 50 л смешивали с 25 л буфера двойной силы образца, содержащего Na-додецил-сульфат (SDS), кипятили 5 минут и подвергали электрофорезу на 15%-ном полиакриламидном геле в присутствии SDS (Laemueli, 1970, Nature, 227: 680-685). Эти протеины с помощью электрофореза (3 часа, 100 мА) переносили на нейлоновую мембрану ("иммобилон" от "Миллипор"), с использованием буферов, описанных Towbin et al. , 1979, Proc. Natl. Acad. Sci USA. 76: 4350-4354. Фильтры высушивали воздухом, и меченые белки обнаруживали авторадиографией (16 часов при температуре окружающей среды, с использованием Кодак X-AR пленки с усиливающим экраном - Cronex, Du Pont).

Фиг. 13. Линейный график, показывающий количество выживших тирозин гидроксилазных клеток на культуру без NT-3 супернатанта (O) или с разведениями 1:300, 1:100, 1:50 или 1:25 содержащего NT-3 супернатанта.

Фиг. 14. Линейный график, аналогично описанию Фиг. 13, за исключением того, что клетки находились в чашках с плотностью 9000.000 на чашку.

Фиг. 15-A. Сравнение синтетических транскриптов NT-3, BDNF и NGF. Гибридизация дот-блоттингом с использованием радиомеченых олигонуклеотидов, гомологичных обменной последовательности у 5' конца всех трех транскриптов контролирует, чтобы равные количества (2 нг) синтетических транскриптов NT-3, BDNF и NGF, вначале подсчитанные спектрофотометрически, использовались в виде определенных стандартов.

-B. Определение уровней NT-3, BDNF и NGF мРНК в общей РНК, приготовленной из головного мозга взрослой крысы, в сравнении с определенными стандартами синтетических РНК, 10 мкг общей РНК. выделенной из головного мозга взрослой крысы, и 4, 10 и 20 пг синтетических транскриптов, соответствующих каждому нейротропину, были подвергнуты назерн-блоттингу и гибридизации к радиомеченым зондам, специфичным к каждому нейротропину.

Фиг. 16. Экспрессия генов NT-3, BDNF, NGFR и в общей РНК (по 10 г на дорожку), приготовленной из крысиных эмбрионов (A), развивающегося головного мозга крысы (B) и в выбранных перинатальных и взрослых тканях (C). Ткани: A. BR: образец взрослого головного мозга, стандартизированный на Фиг. 1B; PLAC: плацента, EMB: весь эмбрион, SP.C: спинной мозг; THY: тимус, LIV: печень; HRT: сердце; BR: головной мозг. Размеры транскриптов указаны справа в тысячах оснований (кб).

Фиг. 17. Экспрессия генов NT-3, BDNF, NGF и NGFR в общей РНК (по 10 г на дорожку), приготовленной из дискретных областей нервной системы новорожденных (A) и взрослых (B).

Области: A. BR: образец взрослого головного мозга, стандартизированного на Фиг. 17B; CBL: мозжечок; HBR: задний мозг; MBR: средний мозг; DIEN: промежуточный мозг; STR: striatum; H1P: аммонов рог; CTX: неокортекс; ADR: надпочечник; RET: сетчатка; SC.N: седалищный нерв; SP.C: спинной мозг.

Фиг. 18. Количественное определение уровней транскриптов NT-3, BDNF и NGF (фиг. 18A, 18B) в участках ЦНС и периферийных тканях, новорожденных и взрослых. Денситометрическое сканирование многих продуктов назерн-блоттинга, включая описанные на Фиг. 16, 17, 19 и у Мэзонпьера (Maisonpierre et al., 1990, Science, 247: 1446-1451), было использовано для получения результатов. Все уровни стандартизированы относительно уровней нейротропина во взрослом головном мозге; уровни во взрослом головном мозге, сходные у трех нейротропинов (см. текст) установлены за единицу для каждого нейротропина. Значения вне масштаба включены на верху сломанных вертикальных полос. Невральные и не-невральные образцы указаны на фигуре. Образцы: BRN: головной мозг, не включающий мозжечок, CBL: мозжечок, HBR: задний мозг, MBR: средний мозг, DIB: промежуточный мозг, STR: Striatum, H1P: аммонов рог, CTX: неокортекс, OLF: обонятельная луковица, SP.C: спинной мозг, SC.N: седалищный нерв, RET: сетчатка, ADR: надпочечник, HRT: сердце, LIV: печень, THY: тимус, SKN: кожа, MUS: скелетная