Способ активации транскрипционно-молчащего гена

Способ активации транскрипционно-молчащего гена

Реферат

 

Изобретение относится к генной инженерии. Разработан способ активации транскрипционно-молчащего гена в геноме эукариотической клеточной линии и экспрессии продукта указанного гена. При этом осуществляют встройку ДНК-конструкта в геном путем гомологичной рекомбинации. ДНК-конструкт содержит регуляторный сегмент ДНК, способный стимулировать экспрессию гена, и функционально с ним связанный и улавливающий сегмент ДНК, гомологичный области генома в пределах или проксимально указанному гену. ДНК-конструкт встраивают так, что регуляторный сегмент функционально связан с целевым геном. Далее проводят культивирование клеточной линии в условиях, пригодных для экспрессии продукта гена, и сбор этого продукта. Предложенный метод можно использовать для модификации характеристик экспрессии любого эндогенного гена данной клеточной линии. 15 ил.

Изобретение касается процесса модификации характеристик экспрессии гена, который в естественном состоянии присутствует в геноме стабильной клеточной линии или клонируемого микроорганизма. Еще лучше сказать, что изобретение касается процесса активации и экспрессии гена, который представлен в стабильной клеточной линии и в норме является транскрипционно-молчащим или инертным. В результате, белковый продукт такого гена экспрессируется. Этот феномен осуществляется без трансфекции клетки ДНК, которая кодирует продукт. Скорее, постоянный ген, кодирующий желаемый продукт, идентифицируется в клетке и активизируется путем встраивания соответствующего регуляторного сегмента в результате применения метода гомологичной рекомбинации. Позитивные и/или негативные селективные маркеры также могут быть встроены для более эффективного отбора клеток, в которых осуществилась соответствующая гомологичная рекомбинация. Кроме того, специфический ген можно усилить с целью увеличения скорости экспрессии, независимо от того, является ли этот ген в норме транскрипционно-молчащим и активирован с помощью метода данного изобретения, или же экспрессия продукта выполняется эндогенно.

Хорошо известно, что каждая клетка организма содержит генетическую информацию, кодирующую все белки, свойственные данному организму. Однако только очень небольшой процент генов, представленных в соответствующем типе клеток, транскрибируется в данный момент. В настоящее время выяснены внутриклеточные механизмы, регулирующие порядок генов при транскрипции. Специфические белки клеток, присутствующие в ядрах, вступают во взаимодействие с регуляторными сегментами ДНК, которые сцеплены с определенными генами. Взаимодействие ядерных белков с последовательностями ДНК, несущими регуляторную функцию, необходимо для генной транскрипции, которая приводит к биосинтезу мРНК, и в качестве конечного результата, и экспрессии кодируемого белка, (Mitchel и Tjian, Science, 245:371, 1989).

Эти регуляторные сегменты или элементы ДНК для каждого гена лежат "против течения", или, в некоторых случаях, "по течению", или в пределах кодирующих областей. Благодаря взаимодействию со специфическими ядерными белками клетки регуляторные сегменты ДНК оказывают влияние на способность РНК-полимеразы, фермента, определяющего скорость экспрессии белков, получать доступ к гену и инициировать синтез мРНК транскрипта. Таким образом, указанные сегменты ДНК и соответствующие ядерные белки играют важную роль в регуляции экспрессии специфических генов (Johnson и McKnight, Ann. Rev. Biochem, 58:799, 1989).

ДНК регуляторные сегменты представляют собой сайты ДНК, к которым присоединяются ядерные белки. При этом они, очевидно, таким образом изменяют структуру ДНК, что нужный в данном случае ген становится доступным для узнавания РНК-полимеразой, которая участвует в генной транскрипции. Экспрессия этих, специфических для клеток, регуляторных белков определяет, какие именно гены будут транскрибироваться в клетке и с какой скоростью будет осуществляться экспрессия. В качестве примера специфичности такой системы можно привести клетки гипофиза, в которых, в отличие от клеток печени, осуществляется экспрессия гипофизарных белков, хотя гены этих белков представлены также во всех печеночных клетках. Однако ядра последних не содержат специфических, связывающихся с ДНК белков, которые бы вступали во взаимодействие с сегментами гипофизарных генов, присутствующими в клетках печени. Современные методы применяются для экспрессии белков с использованием рекомбинантной ДНК.

Основываясь на данных, что для активации генной транскрипции в определенных типах клеток требуется участие специфических регуляторных последовательностей ДНК, ученые выполняли экспрессию чужеродных генов путем методов генной инженерии. Обычно, регуляторные сегменты ДНК, которые узнаются ядерными белками клетки, располагаются "против течения" от кодирующей области чужеродного гена, экспрессия которого должна быть осуществлена. И, таким образом, после встраивания в клетку чужеродной ДНК может быть осуществлена ее экспрессия, поскольку ядерные регуляторные белки клетки теперь способны узнавать соответствующие регуляторные последовательности ДНК. Эта технология была применена для получения белков, выделение и очистка которых из природных источников при использовании традиционных методов очистки связана с определенными трудностями.

В добавление к узнаваемым последовательностям ДНК и нужному гену к ДНК-конструкции еще присоединяют выбранный маркер. Таким образом, только клетки, в геном которых включилась ДНК, выживают после культивирования в избирательной среде. Например, в вектор экспрессии может быть включен ген устойчивости к неомицину. После трансфекции клетки культивируют в G 418 с антибиотиком неомицином, который летален по отношению к клеткам млекопитающих. Однако, если клетки получили ген резистентности к неомицину, то они способны противостоять токсическим эффектам препарата. Таким образом, в культуре переживают только те клетки, которые приобрели трансфекционную ДНК. Понятно, что любой селективный маркер можно использовать до тех пор, пока он обеспечивает отбор клеток, которые получили трансфекционную ДНК. Кроме того, естественно, не имеется каких-либо ограничений относительно специфической локализации встраиваемого генетического материала в клетке. Только важно, чтобы этот материал был включен в пределах ядер, так как и регуляторный сегмент, и чужеродный ген (как и селективный маркер) встраиваются вместе.

Хотя вышеуказанные методы в своей основе включают достижения генной инженерии, они не всегда достаточно эффективны для экспрессии генов. Это обусловлено тем фактом, что встраивание ДНК в ядра клеточной линии выполняется обычно путем так называемой трансфекции. ДНК, предназначенная для генно-инженерной обработки с целью экспрессии в необходимой клеточной линии, осаждается, и клеточная мембрана растворяется, чтобы ДНК могла проникнуть в клетку. Как сказано выше, никогда нельзя предугадать точное место включения ДНК; действительно, она может остаться в эписомальной области (без интеграции в геном). Это приводит к непредсказуемости как уровня экспрессии продуцируемого белка, так и стабильности клеточной линии.

Второй недостаток указанной выше техники связан с крайней трудностью конструирования вектора экспрессии в том случае, когда нужный ген имеет относительно крупные размеры (больше 5-10 килобаз (кб)). Многие из белков, экспрессия которых осуществляется путем технологии рекомбинантной ДНК, кодировалась скорее кДНК, чем более крупными геномными клонами, что обеспечивает снижение общего размера вставок. Поскольку использование кДНК делает применение генной инженерии более удобным, то, в результате, могут пострадать скорость генной транскрипции и продукции белка. В последнее время показано, что иногда уровни экспрессии в значительной степени повышены благодаря использованию скорее геномных, чем кДНК вставок (Brinster с соавт., Natl. Acad. Sci. , 85:836-840, 1988, Chung, Perry, Mol. Cell. Biol., 9:2075-2082, 1989). Хотя механизмы, ответственные за вышеуказанный феномен, еще не совсем понятны, однако известно, что в определенных условиях усиливающие элементы, представленные в интронах, могут повышать эффективность генной транскрипции. Имеется целый ряд данных, согласно которым интроны или связанные с ними события могут оказывать влияние на процессинг РНК после инициации транскрипции (Buchman, Berg, Mol. Cell. Biol., 8:4395-4405, 1988). Это может привести к стабилизации транскрипта и, таким образом, к повышению скорости накопления мРНК. В вышеуказанном сообщении также предполагается, что положение интронов внутри гена может иметь значение для "фазирования" нуклеосом относительно промотора. Влияние различных регуляторных элементов на транскрипцию генов эукариот обсуждается у Khoury с соавт., Cell., 33:313-14 (1983), Maniatis с соавт., Science, 236:1237-45 (1987) и Muller с соавт., Eur. J.Biochem., 176: 485-95 (1988).

В-третьих, трансфекционная ДНК, включающая полную кодирующую область чужеродного гена, чтобы проникнуть в ядро, должна пересечь цитоплазму после прохождения через проницаемую плазменную мембрану клетки. В течение этого времени возможен контакт ДНК с лизосомальными ферментами, которые могут изменять или полностью разрушать ее целостность. Поэтому кодирующая область ДНК не может быть идентичной всей ДНК, подвергаемой трансфекции.

Новый метод активации генов и/или модификации экспрессии, который мы описываем ниже, не может приводить к получению мутантных форм нужного белка, так как кодирующая область гена этого белка не подвергается модификациям со стороны ферментов.

В качестве резюме, при использовании традиционных методов не может с точностью транскрибироваться большое количество трансфектируемой в клетку ДНК и особенно ее кодирующей части. Перед проникновением в ядро она может быть подвергнута разрушающему действию ферментов и, в связи с этим, потеряет способность кодировать нужный белок, или же она может не содержать какой-либо из необходимых для транскрипции регуляторных сегментов. Она может встраиваться в часть генома, которая препятствует транскрипции. Если транскрибируется кДНК, то производство нужного белка не всегда может быть эффективно, что обусловлено пропуском интронов, содержащих усилители или способных обеспечивать эффективный процессинг мРНК. И, наконец, она может оставаться на уровне эписом, обеспечивать синтез белка, но быть нестабильной в процессе роста клеточной популяции посредством деления клеток.

Было бы целесообразно разработать такой метод индукции генной экспрессии, с помощью которого можно было бы получить клеточную линию и который бы заключал в себе все положительные характеристики существующих методов, но был лишен всех нежелательных, присущих им черт. Далее, было бы желательно выполнить экспрессию или модификацию эндогенной экспрессии специфических генов выбранного клеточного типа.

Кроме того, было бы целесообразно использовать те выгодные возможности, которые потенциально присущи полной геномной последовательности, включающей скрытые усилители транскрипции, расположенные внутри интронов, путем соответствующего помещения интронов для надлежащего нуклеосомного фазирования или путем более эффективного процессинга мРНК. Эти преимущества обычно не используются в методах экспрессии с применением рекомбинатной ДНК, что обусловлено размерами гена. В том случае, если найти способ выполнить экспрессию гена, который уже имеется в геноме, то есть эндогенного гена, то стабильность клеточной линии и скорость экспрессии стали бы более постоянными и предсказуемыми.

Основная цель изобретения заключается в оптимизации существующих методов, в частности уменьшении количества вышеуказанных недостатков.

Другой целью изобретения является обеспечение метода регуляции и/или усиления генной экспрессии, при этом метод включает положительные характеристики технологии рекомбинантных генов, однако лишен ее нежелательных черт.

Далее, цель изобретения заключается в обеспечении метода экспрессии специфических генов, которые представлены в геноме выбранной клеточной линии, однако, в норме являются транскрипционно-молчащими генами.

Цель изобретения также состоит в разработке метода зкспрессии белков, в основу которого легли бы все преимущества полной геномной последовательности, ответственной за накопление мРНК и/или транскрипцию.

Далее, целью изобретения является разработка метода модификации характеристик экспрессии нужного гена путем встраивания ДНК регуляторных сегментов и/или амплификаторных (усиливающих) сегментов в положения "против течения" в пределах или же проксимально по отношению к нативному, представляющему интерес гену в клетках стабильной клеточной линии или клонируемого микроорганизма.

Кроме того, цель изобретения состоит в том, чтобы обеспечить метод для модификации характеристик экспрессии гена, который естественно присутствует в геноме устойчивой клеточной линии или клонируемого микроорганизма, и в то же время, метод позволяет включить характеристики, которые помогут отбору определенным образом модифицированных клеток.

Другой целью изобретения является получить, в данном случае, геном, который обладает проксимально к кодирующей области или экзонам нужного гена регуляторным или амплификаторным сегментом, отсутствующим в данных местах природного генома.

Цель изобретения также состоит в получении конструкций ДНК, которые можно использовать в методах гомологичной рекомбинации данного изобретения.

Далее, цель изобретения заключается в получении клеточных линий и микроорганизмов, содержащих геномы в соответствии с настоящим изобретением.

Реализация этих и других целей изобретения осуществляется при помощи методов гомологичной рекомбинации. Используя эти, общепринятые в данной области методы, можно добиться экспрессии или, предпочтительно, амплификации постоянных, хотя и транскрипционно-молчащих генов. Применяя эту же технику, можно также модифицировать характеристики экспрессии гена, который в природе является, правда не всегда, "молчащим" или инертным и присутствует в геноме устойчивой клеточной линии. Модификация может выражаться, например, в изменении условий экспрессии, ее подавлении, или, наоборот, индукции, или увеличении ее скорости.

Изобретение обеспечивает метод модификации характеристик экспрессии гена в геноме клеточной линии или микроорганизма. Определенная конструкция ДНК включается в геном путем использования техники гомологичной рекомбинации. Конструкция ДНК включает регуляторный сегмент ДНК, способный к модификации характеристик экспрессии любого гена, с которым сегмент сцеплен оперативно, в клетках хозяина, представленного клеточной линией или микроорганизмом, а также улавливающий сегмент, гомологичный области генома, в которую желательно встроить ДНК регуляторный сегмент. Техника конструирования и встраивания предназначается для обеспечения оперативного сцепления нового ДНК регуляторного сегмента с нужным геном. Таким образом, осуществляется модификация характеристик экспрессии соответствующего гена без необходимости встраивания каких-либо новых кодирующих экзонов. В предпочитаемом варианте ген является транскрипционно-молчащим или инертным в норме в клетках хозяина: клеточной линии или микроорганизме. Посредством ДНК регуляторной области, которая встраивается путем использования техники гомологичной рекомбинации в соответствующее положение по отношению к указанному гену, последний, таким образом, активируется для экспрессии своего продукта.

ДНК-конструкция в предпочитаемом варианте включает два улавливающих сегмента, которые располагаются близко друг к другу в нативном гене, и в то же время разделены друг от друга в конструкции ДНК теми элементами, которые встраиваются в геном.

Далее, конструкция, предпочтительно, включает по крайней мере один экспрессируемый, селективный, маркерный ген, например ген, обуславливающий резистентность к неомицину. Этот маркерный ген, включая его промотор, также расположен между двумя улавливающими областями конструкции.

В другом случае, конструкция включает экспрессируемый ген амплификатор для усиления экспрессии нужного гена. Данный ген, включая его промотор, также располагается между двумя улавливающими областями конструкции. В некоторых случаях функции селективного маркера и гена-амплификатора может выполнять один и тот же ген.

Еще один вариант изобретения состоит в том, что ДНК конструкция включает негативный, селективный, маркерный ген, не подвергающийся экспрессии в клетках, в которые надлежащим образом встроена ДНК-конструкция. Этот негативный, селективный маркер расположен за пределами двух улавливающих областей, поэтому может быть удален, если конструкция правильно встраивается в геном путем гомологичной рекомбинации. Примером такого негативного, селективного маркерного гена может быть ген тимидин киназы Herpes Simplex Virus.

В следующем варианте, изобретение может обеспечивать модификацию характеристик экспрессии специфического гена, продукт которого в данный момент уже экспрессируется в клеточной линии или микроорганизме, представляющих интерес для специалиста. Модификация может быть выполнена путем гомологичной рекомбинации в результате встраивания ДНК конструкции, в состав которой входят (1) экспрессируемый ген-амплификатор, обуславливающий увеличение количества копий нужного гена в случае, если клеточная линия или микроорганизм подвержены влиянию условий усиления, и/или (2) промотор (усилитель-элемент или другой регуляторный элемент), с помощью которого осуществляется модификация экспрессии нужного гена, например, путем повышения скорости транскрипции, повышения эффективности трансляции, увеличения накопления мРНК, обеспечения индуцибельной экспрессии и т.д. Экспрессия гена, которая модифицируется таким образом, может быть естественной или вызванной предварительными генетическими манипуляциями с клеточной линией или микроорганизмом. Такого рода манипуляция может осуществляться обычными методами или путем гомологичной рекомбинации в соответствии с изобретением. В последнем случае встраивание ДНК, приводящее к модификации характеристик экспрессии, может быть выполнено как часть той же самой генетической манипуляции, в результате которой происходит экспрессия гена, или как последующая ступень.

Изобретение также включает конструкции, приготовленные в соответствии с вышеприведенным обсуждением, так же, как геномы, которые должным образом подвергались гомологичной рекомбинации с использованием этих конструкций, а также клеточных линий и микроорганизмов, включающих эти геномы.

Более того, изобретение также касается процесса получения нужного продукта путем культивирования трансформированных клеток в соответствии с настоящим изобретением.

Фиг.1. дает общую схему ДНК-конструкции в соответствии с изобретением.

Фиг .2А представляет способ интеграции ДНК-конструкции в геном в случае негомологичной или случайной рекомбинации.

Фиг. 2Б представляет способ интеграции ДНК-конструкции в случае гомологичной рекомбинации.

Фиг. 3 представляет конструкцию предпочитаемого вектора гомологичной рекомбинации в соответствии с изобретением.

Фиг. 4 представляет способ интеграции кольцевого куска ДНК путем гомологичной рекомбинации в случае использования только одного улавливающего сегмента ДНК.

Фиг.5 представляет pRSVCAT плазмиду, включая ее сайты рестрикции.

Фиг. 6 представляет конструкцию pRSV плазмиды, включая ее сайты рекстрикции.

Фиг.7 представляет pSV2NEO плазмиду, включая ее сайты рестрикции.

Фиг.8 представляет pSVNEOBAM плазмиды, включая ее сайты рестрикции.

Фиг.9 представляет конструкцию pRSVNEO плазмиды, включая ее сайты рестрикции.

Фиг. 10 представляет конструкцию pRSVCATNEO плазмиды, включая ее сайты рестрикции.

Фиг.11 представляет фрагмент 15,3 кб гена крыс TSH и различные сегменты рестрикции.

Фиг. 12 представляет конструкцию pRSVCATNEOTSHB3 плазмиды, включая ее сайты рестрикции.

Фиг. 13 представляет конструкцию pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI плазмиды, включая ее сайты рестрикции.

Фиг. 14 представляет часть нуклеотидной последовательности TSH вместе с ее участками, которым соответствуют праймары для РПЦ амплификации. Экзоны 2 и 3 указаны заглавными буквами. 247 усиливаемый фрагмент подчеркнут звездочками.

Фиг. 15 представляет результаты электрофореза в полиакриламидном геле кДНК, синтезированной с помощью РНК, которая экстрагирована из различных клеточных популяций и TSH, кДНК которой, если представлена, амплифицирована путем РПЦ. Природа клеток, представляющих различные линии, указывается на фиг.15 ниже геля.

Гомологичная рекомбинация как метод была разработана в течение последних нескольких лет для "улавливающих" генов с целью индукции или коррекции мутаций в транскрипционно активных генах (Kucherlapati, Prog. in Nucl. Acid. Res. and Mol. Biol., 36:301 (1989). Данная техника гомологичной рекомбинации разработана в качестве метода для введения специфических мутаций в определенные области генома млекопитающих (Thomas et al., Cell, 44:419-428, 1986; Thomas and Capecchi, Cell, 51:503-512, 1987; Doetschman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , 85:8583-8587, 1988) или для коррекции специфических мутаций в пораженных генах (Doetschman et al., Nature, 330:576-578, 1987).

Посредством этой техники кусок ДНК, который желательно встроить в геном, может быть помещен в специфическую область гена, интересующего исследователя, путем присоединения его к так называемой улавливающей ДНК. Эта улавливающая ДНК комплементарна (гомологична) соответствующей области геномной ДНК. Если два гомологичных куска одноцепочечной ДНК (т.е. улавливающая и геномная ДНК) находятся в тесной близости, то они подвергаются гибридизации с образованием двухцепочечной спирали. ДНК-последовательность, присоединенную к улавливающей ДНК, желательно встроить в геном.

Гомологичная рекомбинация может осуществляться с помощью целого ряда методов. Одним из примеров является рекомбинация, происходящая в ходе процесса репликации ДНК во время митоза в клетке.

Посредством механизма, который еще не совсем понятен, родительская двухцепочечная ДНК раскручивается непосредственно перед клеточным делением на определенном участке, называемом пузырем репликации. Теперь две отдельных цепи ДНК могут служить в качестве матриц для синтеза новых цепей ДНК. Одно из плеч репликативной вилки характеризуется направленностью кода ДНК от 5'- к 3'-концу, которая служит соответствующей ориентацией для считывания ДНК-полимеразой. Этот фермент присоединяется к 5'-концу одноцепочечной ДНК и, используя цепочку в качестве матрицы, инициирует синтез цепочки комплементарной ДНК. Направленность кодирования другой родительской цепочки ДНК от 3' к 5'. Для ДНК-полимеразы считывание информации невозможно в этом направлении, и, очевидно, репликация указанной цепочки ДНК должна осуществляться посредством особого механизма.

Специфический фермент РНК-праймаза присоединяется к 3' ---> 5'-цепи ДНК, обеспечивая синтез короткой затравки РНК с интервалами вдоль цепочки. Используя эти фрагменты РНК в качестве затравок, ДНК-полимераза теперь присоединяется к ДНК с затравочной РНК и обусловливает синтез комплементарного куска ДНК в направлении от 5'-к 3'-концу. Эти куски вновь синтезированной ДНК получили название фрагментов Оказаки. РНК затравки, которые ответственны за инициацию полной реакции, удаляются в результате экзонуклеазной активности ДНК полимеразы и замещаются ДНК. Этот процесс продолжается, пока полимераза не достигнет участка ДНК, лишенного затравочной РНК, где прекращается локальный синтез. Таким образом, хотя комплементарная родительская цепь в общем синтезируется в направлении 3' ---> 5', фактически она формируется путем "прострочивания" от конца 5' к 3'. Какие-либо повреждения, имеющие место в ДНК в ходе процесса "прострочивания", устраняются ферментом ДНК-лигазой.

Для сохранения абсолютно точного кода ДНК ДНК-полимераза наделена функцией надежного считывания. Для синтеза новых ДНК-цепей ДНК-полимеразе необходимы затравочные куски ДНК. Как уже упоминалось выше, это может быть одиночная цепочка ДНК с затравочной РНК или комплементарная цепь ДНК.

Если ДНК-полимераза находит комплементарно несоответствующие куски ДНК, она может выполнять функцию экзонуклеазы и удалять ДНК-основания в направлении 3' ---> 5', пока снова не достигнет полного соответствия.

Принимая во внимание все выше сказанное, становится непонятной основа описываемой здесь техники. Небольшие куски улавливающей ДНК, которые комплементарны специфической области генома, вступают в контакт с родительской цепью в ходе процесса ДНК-репликации. Это основное свойство ДНК, которая встраивается в клетку для гибридизации и последующей рекомбинации с другими кусками ДНК посредством раздельных гомологичных областей. В том случае, если комплементарная цепь присоединяется к олигонуклеотиду, содержащему мутацию или другую последовательность ДНК, то он также включается во вновь синтезированную цепочку в результате рекомбинации. Вследствие функции точного считывания новая последовательность ДНК может служить в качестве матрицы. Таким образом, трансфекционная ДНК включается в геном.

Если известна последовательность специфического гена, кусок ДНК, комплементарный выбранному участку гена, может быть синтезирован или получен иным путем, например путем соответствующей рестрикции нативной ДНК в специфических сайтах узнавания, связывающих нужную область. Этот кусок будет выполнять роль улавливающего приспособления при встраивании в клетку и гибридизации со своим гомологичным участком внутри генома. Если гибридизация происходит в ходе ДНК-репликации, то этот кусок и любая дополнительная, присоединенная к нему последовательность будет функционировать в качестве фрагмента Оказаки и участвовать в процессе "прострочивания" для вновь синтезированной дочерней цепи ДНК.

В методе изобретения к этим кускам улавливающей ДНК присоединяются области ДНК, которые известны как взаимодействующие с ядерными регуляторными белками, содержащимися в клетке, и, правда, необязательно с амплификаторными и селективными маркерами ДНК. Таким образом, экспрессия специфических белков может быть достигнута не только путем трансфекции ДНК, с кодом самого гена и маркерного гена, что обычно, но также и путем использования улавливающей ДНК (участки гомологии с нужным, эндогенным геном), связанной с ДНК регуляторными сегментами, которые обеспечивают ген сигналами узнавания для транскрипции. С помощью представленного метода возможно добиться экспрессии и амплификации любого родственного гена, представленного в клеточном типе без фактической трансфекции соответствующего гена. Кроме того, экспрессия этого гена контролируется скорее полной геномной ДНК, чем его частями или кДНК, тем самым обусловливая повышение скорости транскрипции и эффективности процессинга мРНК. Более того, характеристики экспрессии любого родственного гена, представленного в клеточном типе, можно изменить путем соответствующего встраивания ДНК регуляторных сегментов и без встраивания целых кодирующих областей нужного гена.

В соответствии с указанными аспектами изобретение непосредственно обеспечивает новые методы экспрессии генов, в норме транскрипционно молчащих, но представляющих интерес, или для модификации экспрессии эндогенно экспрессирующихся нужных генов в дифференцированной клеточной линии. Родственные геномные последовательности, экспрессию которых желательно осуществить или достичь ее модификации, обеспечиваются необходимыми последовательностями специфической клеточной ДНК (регуляторными и/или амплификаторными сегментами) для управления или модификации экспрессии гена внутри клетки.

Полученная ДНК включает ДНК-последовательность, кодирующую нужный белок, сцепленную оперативным путем с гетерологичными (для родственной ДНК-последовательности) регуляторными и/или амплификаторными сегментами. Для повышения качества скрининга полученных клеток в конструкцию, правда необязательно, включается положительный селективный маркер. Предпочитается использование резистентного к неомицину гена, хотя может быть применен любой выбранный маркер. Могут быть также использованы, тоже необязательно, негативные селективные маркеры.

Например, ген тимидин киназы Herpes Simplex Virus (HSVtk) можно применять как маркер для выбраковки случайно интегрированных векторных ДНК. Соединенные ДНК или ДНК, экспрессия которых уже осуществляется, можно подвергнуть амплификации, если улавливающая ДНК связывается с амплификаторным маркером.

Следовательно, в соответствии с методом изобретения любой ген, который в норме экспрессируется в своей линии клеток эукариот, особенно, в дифференцированной клеточной линии, можно подвергнуть экспрессии в неспецифической для него клеточной линии, где этот ген находится в "молчащем" состоянии. Это осуществляется без встраивания полной последовательности ДНК этого гена. Кроме того, указанный ген или в норме экспрессирующийся ген можно подвергнуть амплификации с целью повышения скорости экспрессии. Далее, можно изменить характеристики экспрессии генов, которые в целом не являются транскрипционно молчащими, как, например, характеристики экспрессии генов микроорганизмов.

В одном из вариантов изобретения клетки эукариот, содержащие специфический нужный ген, транскрипция которого, однако, нарушена, подвергают индукции, используя описанную ниже технику. Вектор гомологичной рекомбинации, описание которого будет представлено в дальнейшем, встраивается в клональную клеточную линию и после химического отбора проверяется на продукцию специфического генного продукта путем соответствующих методов, таких, например, как обнаружение мРНК, транскрибируемой с вновь активированного гена, иммунологическое определение специфического генного продукта или функциональная проба на специфический генный продукт.

Общая схема конструкции ДНК, которая используется для активирования транскрипции эндогенных генов посредством гомологичной рекомбинации, представлена на фиг.1.

Обычно, конструкция ДНК включает по крайней мере от двух до шести или более отдельных ДНК-сегментов. Сегменты состоят из одного, предпочтительно двух, улавливающих ДНК-фрагментов (A и B), гомологичных области клеточного генома, располагающейся в пределах или проксимально от нужного гена, который должен быть экспрессирован, позитивный селективный ген (С), амплификаторный ген (D), негативный селективный ген (E) и ДНК-регуляторный сегмент (F), который транскрипционно активен в клетке для трансфекции. В основном варианте изобретения должны быть представлены только единственный улавливающий сегмент (B) и регуляторный сегмент (F). Каждый из других указанных участков необязателен и обеспечивает предпочитаемые конструкции.

Области A и B представлены последовательностями ДНК, гомологичными участкам эндогенного нужного гена, который должен быть активирован для транскрипции. Специфические области A и B эндогенного гена выбираются таким образом, чтобы расположение их было "против течения" и "вниз по течению" соответственно, от специфического положения, в которое желательно встроить регуляторный сегмент. И хотя в конструкции эти области разделены, в эндогенном гене они, в основном, близко расположены друг к другу. Возможны случаи, где в качестве улавливающих сегментов используются несоприкасающиеся части генома, например, где желательно устранить часть генома, такие, например, как негативный регуляторный элемент.

В то время как две улавливающие области предпочтительны для целей увеличения общей области гомологии и, тем самым, повышения эффективности рекомбинации, процесс изобретения также включает применение только одной улавливающей области. В самой простой форме (когда встраиваются только регуляторный сегмент F и селективный маркерный ген C с промотором C') применяется кольцевой кусок ДНК, который содержит эти элементы вместе с улавливающей ДНК (см. фиг.4).

Таким образом, осуществляется гибридизация гомологичной области (B) с ее геномным двойником. Сегменты C', C и F встраиваются в пределы B части родственного гена после кроссинговера.

Если желательно, чтобы регуляторная ДНК последовательность была встроена против течения нужного гена, как, например, если требуется осуществить активацию и экспрессию в норме транскрипционно молчащего гена, предпочтительной является область гомологии, которая гомологична некодирующей части генома против течения от кодирующих частей нужного гена. Если присутствуют два улавливающих участка, то область по течению (A) может включать часть кодирующего участка, хотя предпочтительнее, чтобы он тоже был в основном против течения от кодирующей области. Наиболее предпочтительно выбирать гомологичные области таким образом, чтобы ДНК-регуляторная последовательность встраивалась по течению от нативного промотора нужного гена, особенно если нативный промотор является скорее негативным промотором, чем выключенным положительным промотором.

Размер областей улавливания, то есть областей гомологии, не является строго определенным, хотя чем короче эти области, тем с меньшей вероятностью они находят соответствующие гомологичные участки и включаются в рекомбинацию в желаемом месте. Таким образом, чем короче области гомологии, тем менее эффективна гомологичная рекомбинация, то есть тем ниже процент успешно рекомбинированных клонов. Предполагается, что минимум для последовательности гомологии составляет 25 пар оснований (Ayares с соавт., PNAS, США, 83:5199-5203, 1986). Более того, если в геноме клеток хозяина также попадаются какие-либо другие элементы конструкции, то возникает возможность рекомбинации в ошибочном месте. Однако, принимая во внимание высокую степень позитивной и негативной избирательности, обеспечиваемую изобретением, можно с успехом использовать метод даже с низкой эффективностью. Оптимальные результаты получают, если целая область гомологии, включая улавливающие области, имеет крупные размеры. До тех пор, пока регуляторный сегмент F можно оперативно связывать с нужным геном, нет предела размеру улавливающей области, и особенно области улавливания B "против течения".

Можно легко определить эмпирическим путем, являются ли улавливающие области слишком крупными и расположен ли регуляторный сегмент F слишком далеко от кодирующей области гена, к которому он должен быть присоединен. В таком случае, можно получать области A и B, гомологичные различным участкам нужного гена, причем повторять процедуру до тех пор, пока регуляторный сегмент F не будет встроен должным образом, чтобы возникла действенная связь между ним и нужным геном. Например, можно изменять сайт рестрикции комбинированной области A-B эндогенного гена и повторять процесс. Однажды познакомившись с концепцией изобретения и методами, описанными здесь, любой из специалистов данной области будет способен использовать настоящее изобретение в отношении нужного гена какой-либо клеточной линии или микроорганизма без выполнения несвоевременных экспериментов.

Область C представляет собой позитивный селективный маркерный ген, который способен переводить трансфектируемую клеточную линию в состояние резистентности к токсическим условиям. Примерами таких генов являются гены аденозин деаминазы (ADA), амидогликозит фосфотрансферазы (neo), дигидрофолат редуктазы (DHFR), гидромицин-B-фосфотрансферазы (HPH), тимидин киназы (tk), ксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (gpt), ген множественной устойчивости к лекарствам (MDR), ген резистентности к орнитин декарбоксилазе (ODC) и N-(фосфонацетил)-L-аспартату (CAD).

В дополнение к позитивному селективному маркерному гену в конструкцию может быть включен, правда необязательно, амплификаторный ген в области D. К амплификаторным относятся гены, обусловливающие увеличение количества копий при соответствующем отборе. Количество копий гена, расположенного по соседству с геном-амплификатором, также будет возрастать. Амплификаторные гены, которые можно использовать, включают DHFR, MDR, ODC,