Фракция гиалуроновой кислоты или ее соли, способ очистки этой фракции, способы получения этой фракции, фармацевтический препарат и средства, используемые в офтальмологии

Фракция гиалуроновой кислоты или ее соли, способ очистки этой фракции, способы получения этой фракции, фармацевтический препарат и средства, используемые в офтальмологии

Реферат

 

Высокочистая фракция гиалуроновой кислоты или ее соли со средним м.в. 750000-123000 Дальтон, содержанием белка не более 0,2% в расчете на альбумин и ультрафиолетовым поглощением при 257 нм и при 280 нм, не превышающим 1,0 A. U. , при измерении в 1% (вес./об.) водном растворе (другие характеристики фракции см. в п. 1 ф-лы изобретения) проявляет высокую эффективность при удалении катаракты и имплантации внутриглазных хрусталиков. 9 с. и 17 з.п. ф-лы, 11 табл.

Настоящее изобретение касается нового способа получения высокочистых фракций гиалуроновой кислоты и ее солей. Кроме того, данное изобретение охватывает специфическую фракцию гиалуроновой кислоты и ее соли, в частности ее натриевую соль, получаемую указанным способом и имеющую средний молекулярный вес в определенном специфическом пределе.

Гиалуроновая кислота (ГК) является типичным и очень важным представителем класса макромолекул, известных как гликозаминогликаны (мукополисахариды). ГК является биологическим полимером, который присутствует с идентичной молекулярной структурой во всех соединительных тканях организма позвоночных животных, где она играет структурную и биологическую роль в том отношении, что ее локальные концентрации строго коррелируются мышечным тонусом, трофическими явлениями и восстановлением ткани в случае ее повреждения. Обзорная работа по физиологической роли этих биологических веществ была опубликована в Phys. RW. (Comper W.D., Laurent T.C.) Физиологическая функция полисахаридов соединительной ткани. Phys. RW. 58 (I), 255 - 315, 1978 г). Физическая - химическая природа ГК является характерной для сахаридного биополимера (D-глюкороновая кислота и N-ацетилгликозамин), с поочередной полимеризацией, с образованием длинных неразветвленных молекулярных цепей, различающихся по молекулярному весу, достигающему максимального значения 8000000 Дальтон (Mayer K.,) Химическая структура гиалуроновой кислоты, Fed. Procud., 17, 1075, 1958; Laurent T.C. Химия и молекулярная биология межмолекулярной матрицы, 703 - 732, Academic Press., N.Y., 1970). Поведение данного биополимера в водном растворе таково, что гарантирует специфическое значение вязкости, называемое вязкоупругостью, которое является типичным для некоторых биологических жидкостей, таких как синовиальная жидкость, в которых ГК присутствует с концентрацией 0,12 - 0,24% Balazs E.A. и др. Гиалуроновая кислота и замена стекловидной и водой тканевой жидкости, Mod. Probl. Ophtal., 10, 3 - 21, 1972). Кроме того, обнаружено, что водная тканевая жидкость человеческого происхождения содержит ГК средней концентрации 1,14 мкг/г Laurent U.B.G.: Гиалуронат в водной тканевой жидкости человека. Arch Ophthalmol., 101, 129 - 130, 1983 ).

Собрано достаточное количество опубликованного материала, который показывает, что локальное введение экзогенной ГК имеет явные терапевтические и защитные преимущества при различных паталогических состояния соединительных и эпителиальных тканей, такие как: - регенерация поврежденной ткани при незаживающих кожных язвах; - артрозная дегенерация соединительных тканей суставов; - главная хирургия.

Особенно ценным является способность ГК за счет ее вязкоупругих свойств покрывать ткани, подвергаемые риску повреждения при хирургических операциях. Как утверждают все хирурги, которые использовали ГК, присутствие вязкого слоя экзогенной ГК на тканях, наиболее сильноподвергаемых травматическим воздействиям, таких как роговица, оказывает защитное действие, которое в значительной мере способствует успешному осуществлению операции.

Как защитное, так и облегчающее состояние влияние на заживление ткани при воздействии эндогенной HA на роговицу было показано как на экспериментальных животных /Miller D. и др.: Использование гиалуроната натрия при имплантации внутриглазных хрусталиков у кроликов Ophthalmic. Surgery, 8,(6), 58 - 61, 1977; Miller D. и др. Использование гиалуроната натрия при аутороговичной трансплантации у кроликов. Ophthalmic. Surgery, 11, (1), 19 - 21, 1980; Graue E.L. и др. Защитное действие гиалуроната натрия на эндотелий роговицы. Exp. Eye. Ris, 31, 119 - 127, 1980; Ozaki L, и др. Защитное действие покрытых Геалоном внутриглазных хрусталиков на эндотелий роговицы. Folia Ophthalmologica Japonica, 32, 1301 - 1305; 1981), так и на человеке / Norm M. Предоперационная защита роговицы и соединительной оболочки глаза, Acta Ophthalmologica 59, 587 - 594, 1981; Polaсk F.M. и др. Гиалуронат натрия (Геалон) в кератопластике и имплантации 10 L внутриглазных хрусталиков, Ophthalmologyа, 88, 425 - 431, 1981).

Уже известны некоторые способы получения очищенной гиалуроновой кислоты и определенных фракций высокой степени чистоты, которые используются в терапии, например для указанных выше показаний.

Молекулярные фракции цельных гиалуроновых кислот, полученных непосредственно путем экстракции органических веществ, например из куриных гребешков, имеют молекулярные веса, изменяющиеся в широких пределах, например примерно от 90 - 80% до 0,2% от молекулярного веса цельной гиалуроновой кислоты, предпочтительно в пределах примерно от 5 до 0,2%. Эти фракции могут быть получены из цельных кислот с использованием гидролизующих, или окисляющих, или ферментных химических реагентов или посредством физических процессов, например механического воздействия или обучения, и в связи с этим в одинаковых процедурах очистки образуются первичные экстракты СМ., например, статью Balazs и др. в " Cosmitics and Toilitries." Italien edition N 5/84, стр.8 - 17). Отделение и очистка полученных молекулярных фракций осуществляется известными способами.

Так например, в патенте США N 4141973 описывается способ получения гиалуроновых кислот с молекулярным весом не менее 750000 Дальтон, которые могут использоваться в операциях на глаз ввиду их особой высокой степени чистоты и отсутствия воспалительных эффектов. Данный способ заключается в экстракции натриевой соли гиалуроновой кислоты из исходного материала, удалении кровяных остатков из используемых органов животных, извлечения белков из полученного экстракта, удалении вызывающих воспаление примесей, обработке продукта в водном растворе стерилизующим агентом и осаждении соли гиалуроновой кислоты из водного раствора органическим растворителем. Кровяные остатки удаляются этанолом, НА в форме ее натриевой соли (имеет форму, в которой она находится в исходных материалах) экстрагируется водой, удаление белков осуществляется путем обработки разбавленными кислотами и одновременно экстракцией гидролизованных частей хлороформом или посредством протеолитических ферментов, вредные вызывающие воспаление вещества удаляются путем экстракции хлороформом с величиной pH 6 - 7, и стерилизация осуществляется путем обработки цетилпиридинхлоридом. При таком способе единственно получаемая фракция гиалуроновой кислоты является фракцией, которая подробно описывается в данном патенте как фракция с молекулярным весом 1586000 Дальтон. В отношении химических, физических и биологических свойств данная молекулярная фракция гиалуроновой кислоты соответствует коммерческому продукту, известному под торговым названием "ГЕАЛОН".

Были разработаны новые способы, такие как молекулярная ультрафильтрация. Этим способом очистки можно удалять те фракции ГК, которые имеют молекулярный вес выше или ниже пределов диапазона молекулярных размеров. Так например, в патенте EPO N 01238752, выданном 27.7.1990, описывается способ получения фракций гиалуроната натрия со средними значениями молекулярного веса от 250000 до 350000 Дальтон путем прямой экстракции из данного продукта органических веществ и последующего удаления белков посредством папаина, с двумя молекулярными ультрафильтрациями через мембраны с отсечкой молекулярной фракции 30000 Дальтон, то есть через мембраны, которые улавливают лишь те фракции, которые имеют молекулярные веса более 30000 Дальтон. Этот этап фракционирования очень важен для получения продукта свободного от вторичных воздействий воспалительного характера, поскольку фракции, ответственные за эти эффекты, это фракции с низкими молекулярными весами, например примерно 30000 Дальтон. После последующей молекулярной фильтрации с использованием мембран с пределом исключения 200000 (то есть мембран, улавливающих фракции с молекулярными весами более 200000 Дальтон) полученный отфильтрованный продукт представляет собой фракцию (называемую в данном патенте ГИАЛАСТИНОМ) со средним молекулярным весом в пределах от 50000 до 100000 Дальтон, в то время как часть, оставшаяся на мембране, представляет собой фракцию гиалуроната натрия, которая имеет средний молекулярный вес в пределах от 500000 до 730000 (фракция, называемая ГИАЛЕКТИНОМ).

Настоящее изобретение охватывает другой способ получения фракции гиалуроновой кислоты, которая является высокочистой и имеет определенный диапазон значений молекулярного веса. Эта фракция находит интересное применение в глазной хирургии: данный продукт, безусловно, очень хорошо переносим, не вызывает воспалительных процессов и не вызывает послеоперационных осложнений. Кроме того, данный продукт имеет значительное преимущество в том, что может оставаться на месте после операции, не вызывая при этом послеоперационных осложнений, таких как слишком высокое глазное давление, снижая, таким образом, риск, связанный с его удалением, что практиковалось до сих пор. Эта новая фракция чистой гиалуроновой кислоты в форме ее натриевой соли, в последующем описании будет называться "ГК-1".

Согласно настоящему изобретению можно усовершенствовать процедуры очистки цельных гиалуроновых кислот или их солей, особенно щелочных солей, таких как прежде всего натриевая соль, путем конверсии этих кислот или солей в четвертичные аммониевые соли данного типа. Такое солеобразование может осуществляться в любой из стадий процедуры очистки. Поскольку эти четвертичные аммониевые соли легко растворимы в некоторых органических растворителях, таких как апротонные растворители, особенно, например, N-метилпарролидон, они могут быть экстрагированы такими растворителями из водной фазы, обеспечивая таким путем специальную и дополнительную очистку наряду с примерами, описанными ранее, операция, которая ответственна за степень чистоты продуктов, получаемых в конце данной процедуры. Конверсия гиалуронового компонента в четвертичные аммониевые соли может осуществляться, например, путем обработки водного раствора натриевой соли, содержащего другие соли, такие как, особенно, NaCl, с использованием реактора или колонны, заключающей в себе макромолекулярный сульфоновый ионообменный агент в форме соли, образуемой с четвертичным аммониевым основанием, например, смолу DOWEX M-15, приготовленную в форме тетрабутиламмониевой соли, получаемой путем обработки сульфоновой смолы гидроокисями четвертичного аммония, например гидроокисью тетрабутиламмония. Аммониевая соль проходит в элюат и полностью элюируется ионообменным агентом с водой. Этот водный экстракт выпаривается досуха, и остаточный продукт, состоящий из аммониевой соли полисахарида, растворяется в одном из указанных выше растворителей, после чего нерастворимые твердые фракции фильтруются. Таким образом, способ, отвечающий данному изобретению, в его более общем аспекте, отличается очисткой гиалуроновой кислоты или одной из ее молекулярных фракций или одной из ее солей путем их конверсии в соответствующую четвертичную аммониевую соль с заместителями низшими (C_1-6) алифатическими гидрокарбидами.

Кроме того, способ, отвечающий данному изобретению, отличается вводом четвертичной аммониевой соли гиалуроновой кислоты или ее молекулярных фракций в органический растворитель, который способен растворять такие соли, и извлечением из фильтрованного раствора гиалуроновой кислоты или ее молекулярной фракции в форме металлической соли, и, при желании, дальнейшей очисткой полученной соли, уже известным способом. Таким образом, настоящее изобретение касается использования четвертичных аммониевых солей гиалуроновых кислот как в процедурах экстракции полисахарида из органов животного и из общих экстрактов, в которых очистка согласно данному изобретению может осуществляться в любой подходящей стадии данной процедуры, включая операции, в которых осуществляются фрагментация и разделение молекулярных фракций, так и в дальнейших процедурах обработки этих фракций и в последующих операциях очистки уже выделенных фракций, чистых или нечистых, новых или уже известных.

Как говорилось выше, конверсия полисахарида гиалуроновой кислоты может осуществляться в любой нужной стадии очистки, и специалисты в данной области в состоянии сами выбрать, когда это нужно сделать в каждом конкретном случае в соответствии с критериями, диктуемыми определенной комбинацией различных известных этапов, которые были выбраны. Эти обычные известные этапы включают в основном и в общих аспектах следующие: 1) Экстракцию полисахарида (в основном и предпочтительно в форме натриевой соли) из органов животного, предварительно измельченных и гомогенизированных. Обычно это осуществляется с использованием органического растворителя, который может смешиваться с водой, например алифатического спирта или низшего алифатического кетона (C_1-6), таких как этанол или ацетон.

2) Удаление беловых веществ путем экстракции подходящими растворителями или путем выпаривания водного раствора экстракта, полученного в 1) c протеалитическим ферментом, таким как папаин, пепсин, тригсин или преназа, в присутствии буферного раствора, например хлоргидрата цистеина - фосфата.

3) Диализ полученного согласно (1) или (2) экстракта.

4) Стерилизацию раствора, полученного в любой из предыдущих стадий, известными бактерицидами, например цетилпиридинхлоридом в растворе хлорида натрия. Эта операция обычно повторяется несколько раз.

5) Разделение фракций полисахарида гиалуроновой кислоты или их соответствующих солей с различными молекулярными весами, или, соответственно, удаление нежелаемых фракций, например с предельными значениями молекулярного веса, то есть значениями молекулярного веса, далекими от нужного диапазона молекулярного размера. Эта операция осуществляется предпочтительно путем молекулярной ультрафильтрации, например, уже известным приемом.

б) Извлечение очищенной фракции или соответствующей соли (например, натриевой соли) из водного раствора путем осаждения подходящим органическим растворителем, например спиртом.

Последовательность осуществления этих этапов, и, возможно, других, которые уже ранее были использованы или разработаны специалистами в данной области, может в значительной мере изменяться. Таким специфическим этапом согласно данному изобретению является этап солеобразования ионов четвертичного аммония, который может быть введен и успешно осуществлен с ожидаемым огромным техническим эффектом.

Аммониевая соль полисахарида может быть непосредственно выделена из ионообменной смолы с помощью вышеупомянутых растворителей, которые способны растворять такие соли, как те, что указаны далее, но предпочтительнее соль аммония сначала экстрагируется водой и выпаривается досуха. Выделенная таким образом соль аммония вводится в вышеупомянутые растворители, и затем раствор фильтруется.

Один из путей осуществления способа данного изобретения заключается в комбинации операций в указанном выше порядке между этапами 2) и 3). Не считая известных приемов очистки и специфического этапа, отвечающего данному изобретению, то есть конверсии металлической соли гиалуроновой кислоты в четвертичные аммониевые соли, согласно следующему аспекту данного изобретения можно использовать хелатообразующие агенты для ионов железа, предпочтительно в указанном выше этапе экстракции 1). Фактически известно, что ионы железа, всегда присутствующие в экстрактах исходной гиалуроновой кислоты, полученных из кровяных остатков используемых органов животных, ответственны за процессы дополимеризации полисахаридной молекулярной цепи. Удаление металлических ионов, как доказано, очень важно для получения фракции гиалуроновой кислоты с относительно высоким молекулярными весами, и это может быть достигнуто путем хелатеобразования. Осуществляя такой прием, можно не только получать гиалуроновые кислоты или их соли с возможно высокими молекулярными весами, но и получить особо чистые продукты, стойкие в водных растворах благодаря полному отсутствию указанных ионов железа.

Таким образом, предпочтительным объектом настоящего изобретения является способ, отличающийся экстракцией органов животных, содержащих гиалуроновую кислоту и/или одну из ее солей, органическим растворителем, который может быть смешан с водой в присутствии хелатообразующих агентов для ионов железа, вводом предварительно высушенного осадка этих промывок в водном растворителе в присутствии протеолетического агента и соответствующего буфера и пропусканием этого раствора, предварительно освобожденного от твердых остатков, через ионообменный препарат, состоящий из макромолекулярной ионообменной смолы в форме одной из ее четвертичных аммониевых солей с радикалами низшего (С_1-6) алифатического углеводорода. Элюат, экстрагированный из этой ионообменной смолы, затем высушивается и растворяется в органическом растворителе, способном растворять четвертичные аммониевые соли гиалуроновой кислоты и ее фракции. Аммониевая соль затем превращается в натриевую соль путем добавления водного раствора галогенида натрия, например хлорида или бромида натрия, в органический раствор. Полученный таким путем водный раствор натриевой соли затем экстрагируется органическими растворителями, которые не могут быть смешаны с водой, и при желании подвергается повторному диализу. Полученный раствор затем обрабатывается стерилизующим агентом, и при желании полученный раствор после стерилизации может подвергаться ультрамолекулярной фильтрации. Затем любые нежелаемые фракции полисахарида гиалуроновой кислоты удаляются, и желаемые фракции гиалуроната натрия извлекается уже известными приемами.

Растворители, используемые согласно данному изобретению для растворения четвертичных аммониевых солей, представляют собой апротонные растворители, такие как N-алкилпирролидоны, в частности N-метилпирролидон, диалкилсульфоксиды, диалкилкарбоксиламиды, такие как низшие (C_1-6) диалкилсульфоксиды, особенно диметилсульфоксиды, и низшие (C_1-6) диалкиламиды низших (C_1-6) алифатических кислот, такие как диметил- или диметилформадид- или диметил- или диацетилацетамид.

Тетраалкиламмониевые основания, используемые для получения ионообменной смолы, и, следовательно, характерные аммониевые соли гиалуроновой кислоты согласно данному изобретению представляют собой основания, образуемые с низшими алифатическими радикалами, предпочтительно алкилами, содержащими 1 - 6 атомов углерода. Предпочтение отдается использованию смолы, образующей соль с тетрабутиламмонием.

В указанных выше комбинациях, используемых для процедур экстракции, очистки и выделения гиалуроновых кислот или их молекулярных фракций и их солей, и в частности в указанной выше комбинации, которая является предпочтительной процедурой согласно данному изобретению, желательно использование указанных ниже агентов: (a) для экстракции исходного материала из органов животного: этанол или ацетон.

(b) в качестве хелатообразующего агента для ионов железа: 1,10 - фенантродин или диметиловое производство.

(c) в качестве протеолитических агентов: те, что указаны выше.

(d) в качестве растворителей для четвертичных аммониевых солей: N - метилпирролиден или диметилсульфоксид.

(e) в качестве растворителя для очистки водного экстракта натриевой соли, полученной из органического раствора аммониевой соли: хлористой метилен, этилацетат.

(f) в качестве стерилизующего агента: цетилпиридинхлорид в присутствии фосфатного буферного раствора.

(g) в качестве органического растворителя для осаждения натриевой соли из очищенного водного раствора, возможно после ультрафильтрации этанол.

В указанные выше процедуры возможно вносить изменения, которые могут способствовать успешному получению еще более чистого конечного продукта. Так например, использование стерилизующих агентов указанного выше типа, то есть четвертичных аммониевых солей с гетероциклическим кольцом, и содержащих длинноцепные алкилы (например цитил), например, цетилпиридинхлорида, может одновременно служить этапом очистки, поскольку ввод их в раствор гиалуроната натрия приводит к образованию соответствующей аммониевой соли с ионом гиалуроновой кислоты. Эти соли осаждаются в водном растворе, и такая обработка дает возможность получать, путем последовательных повторных осаждений промывок осадков и последующего растворения в растворе NaCl, раствор гиалуроната натрия, из которого должны выделяться ультрачистые продукты. Эти продукты особенно полезны в глазной хирургии.

Молекулярная ультрафильтрация осуществляется уже известным приемом. Используются мембраны, например, улавливают фракции с более высокими молекулярными весами, например более 200000 Дальтон, и если желательно, отдельные фракции могут быть извлечены как из отфильтрованного продукта, так и из мембраны. Особенно интересный прием осуществления способа данного изобретения заключается в комбинации указанных выше операций очистки с молекулярной ультрафильтрацией, которая удаляет гиалуроновые фракции с низкими молекулярными весами. Такие фракции, как установлено, ответственны за инициирование воспалительных эффектов при их присутствии в продуктах терапевтического назначения, как это сообщается о фракциях, описанных в указанном выше патенте EPO N 0138572, выданном 25.7.1990.

Следующим предпочтительным объектом данного изобретения является описанный выше способ, заключающий в себе специфическую комбинацию операций очистки, в котором как обязательный этап осуществляется молекулярная ультрафильтрация для удаления молекулярных фракций с низким молекулярным весом, особенно фракций с молекулярным весом менее, чем 30000. При осуществлении данной процедуры, или если говорить еще более точно, при осуществлении процесса, иллюстрированного на примерах 1 и 2, получается фракция гиалуроната натрия, которая является очень ценной с терапевтической точки зрения и которая, как уже говорилось вначале, носит название ГК-1. Она особенно интересна для использования в хирургии глаза.

Гиалуроновые кислоты, описание в имеющейся литературе и рекомендованные для использования в операциях на глаза, не отвечают критериям абсолютного совершенства, особенно ввиду того, что они не могут оставаться на месте после хирургической операции, например после операции катаракты, ввиду присутствия как остатков или следов, вызывающих воспаление веществ, так и компонентов со слишком высоким молекулярным весом, а следовательно с чрезвычайно большой вязкостью. Кроме того, они могут вызвать, как указывалось ранее, нежелательное и опасное увеличение глазного давления.

Экзогенная ГК, введенная в переднюю полость в процессе операции, не должна вызывать отрицательных эффектов на послеоперационное внутриглазное давление и не должна вызвать воспалительных явлений во внутриглазном окружении. Первый отрицательный эффект неоднократно описывался в литературе после использования очень высокомолекулярной ГК, имеющей чрезвычайно высокую вязкость Binkhorst C.D. Воспаление и внутриглазное давление после использования Геалона в хирургии, связанной с внутриглазными хрусталиками. Am Intra - Owlar implant. Soc. J. 6,(4), 342 - 343, 1980; Pape L. G. Внутрикапсуларный и внекапсуларный способ имплантации хрусталиков с Геаленом. Am. Intra - Owlar implant. Soc.J. 6,(4), 342 - 343, 1980; Passo M. S. и др. Внутриглазное давление после хирургии катаракты с использованием Геалона ARVO Abstracts 10, 10:45, 1981; Pereival P. и др.

Практическое использование хрусталиков Boberg Ans и гиалуроната натрия (Гиалонида) Trans. Ophthal . Soc. UK, 102, (2): 294 - 297 , 1982; Mc Rac S. M. и др.: Влияние гиалуроната натрия, сульфата хондрантина и метилцеллюлозы и эндотелий роговицы и внутриглазное давление (Ann. J. Ophthalmol. 95, 332 - 341, 1983).

Приведение практические работы позволили дать рекомендацию удалять данное вещество путем промывки физиологическим солевым раствором после операции. Berson и др. (Berson F.G. и др. Непроходимость водного оттока за счет гиалуроната натрия в энуклеированном человеческом глазе. Am. J. Ophthalmol 95, 668 - 672, 1983) изучали механизм данного нежелательного явления в энуклеированном человеческом глазе после операции, и они считают, что основной причиной этого явления является механическая закупорка дренажной системы в передней полости за счет чрезвычайно высокой вязкости вводимого вещества.

Фракция гиалуроната натрия, которая описывается в патенте США N 4141973, Balazs и имеющая молекулярный вес 1586000 (см. колонку 13 этого патента) является веществом, которое в отношении его физико-химических и биологических свойств является наилучшим для глазных операций продуктом на современном рынке. Он известен под названием "Геалон" и не лишен указанных выше недостатков. В частности, его молекулярный вес чрезвычайно высок и, следовательно, он имеет нежелательно высокую вязкость для некоторых глазных операций.

В самом деле, хотя осуществляемые в данном патенте испытания (для измерения противовоспалительного эффекта) дали хорошие результаты, геалон не может быть оставлен на поверхности послехирургического вмешательства, например после операции катаракты, так как он может вызвать послеоперационные осложнения, такие как повышение глазного давления.

В патенте США 4920104 Dale P. De Vore (принадлежащем Mid. Chem. Products, Mc. Acton Mass) описан и заявлен вязкоупругий раствор гиалуроната натрия в физиологическом солевом растворе, который имеет кинематическую вязкость от 45000 до 64000 сСт и содержит гиалуронат натрия со среднемолекулярным весом в пределах от 1000000 до 2000000 Дальтон. Этот продукт также заявлен для использования в хирургических операциях на глазах, где он может быть использован более успешно, чем другие препараты, благодаря его мизерным послеоперационным побочным эффектам, особенно таким, как повышение послеоперационного глазного давления.

Однако этот продукт также должен быть удален после хирургического вмешательства, как можно заметить из таблиц 2 и 3 в колонке 4 настоящего патента, тогда как таблица 1 показывает, что глазное давление поднимается после хирургического вмешательства, если продукт не удален с поверхности.

В Европейском патенте N 0138572 описывается другая фракция гиалуроната натрия, предназначенная для использования в офтальмологии, которая имеет средний молекулярный вес, изменяющийся в пределах от 500000 до 730000 Дальтон (Гиалектин). Обычно она может использоваться для замены эндобулярных жидкостей, а также в операциях на глаза, таких как катаракта и введение глазных имплантантов. Однако имеется потребность в продуктах с более высокими вязкоупругими свойствами, которые в состоянии сохранять правильные интервалы в передней полости в ходе операции для противобаланса стекловидной реакции с тем, чтобы оказывалось эффективное защитное действие на эндоокулярную структуру без их удаления после операции. Как уже было сказано ранее, данные продукты с высокими молекулярными весами, описанные в имеющейся литературе и используемые в указанных операциях на глаза, должны всегда удаляться после операции. Достоинство настоящего изобретения заключается в том, что разработан оригинальный способ получения фракций гиалуроната натрия с относительно высоким молекулярным весом путем ввода хелатообразующих агентов для ионов железа в экстракционный раствор, что предотвращает, таким образом, дополимеризацию в фракции с низким молекулярным весом, свободные от тех примесей или фракций, которые не позволяют удалить данный продукт в организме. Эта новая фракция согласно данному изобретению, называемая фракцией ГК-1, обладает признаком новизны и является этапом к прогрессу в данной области науки.

Фракция "ГК-1", согласно данному изобретению, получаемая по способу, описанному в примерах 1 и 2, имеет следующие свойства: - Вязкость: Показатель статической вязкости в пределах от 14,5 до 21 дл/г, измеренный в вискозиметре Убеллоде при 25^oC в 0,15 М NaCl с величиной pH 7,0. Эта вязкость соответствует молекулярному весу в пределах от 750000 до 1230000 Дальтон (предпочтительно в пределах от 925000 до 1230000 Дальтон).

- Содержание белка: Содержание белка в расчете на альбумин не превышает 0,2% при измерении согласно испытанию Lowry/Lowry J. и др. Определение белка с использованием реагента фолинфенола. J.Biol. Chem. 193, 265 - 275, 1951).

- Ультрафиолетовый спектр: Спектр ультрафиолетового поглощения, определяемый при 257 нм и 280 нм, не превышает 1,0 A.U. при измерении в водной растворе концентрацией 1% (вес./об.).

- Динамическая вязкость: Динамическая вязкость 1%-ного вес./об. раствора в 0,15 М NaCl при величине pH 7,0, не превышает указанные ниже пределы при определенных скоростях сдвига. Используется ротационный вискозиметр, описанный, например, в публикации U.S. Pharmacopia XXXII ed., (911) стр.1619. Температура измерения составляет 20^oC.

Скорость сдвига - Динамическая вязкость (мПа с при 20^oC) 1 сек^-1 - Не более чем 20000 мПа сек 10 сек^-1 - Не более чем 2000 мПа с 100 сек^-1 - Не более чем 1000 мПа с 350 сек^-1 - Не более чем 500 мПа с Сульфатированный мукополисахарид: Содержание его не превышает 0,07% в расчете на серу, при определении на приборе с индукционно связанной плазмой (I.C.P.) с использованием подходящего вещества в качестве стандарта.

- Железо: Содержание железа не превышает 10 ч./млн. при определении методом спектрального атомного поглощения или методом I.C.P.

- Стабильность: Стабильность буферных изотонических растворов (со значением pH физиологического раствора) фракции НА-1, подвергнутых естественному старению и тепловой стерилизации, измеренная путем определения показателя статической вязкости и выраженная как соответствующее понижение среднего молекулярного веса, не превышает указанных ниже предельных значений - 97% от исходного значения (хранение при 25^oC в течение 6 месяцев) - 75% от исходного значения стерилизации при 118^oC в течение 32 минут) - 80% от исходного значения стерилизации при 121^oC в течение 16 минут) - 90% от исходного значения стерилизации при 124^oC в течение 8 минут).

Гиалуроновая фракции ГК-1 наилучшего качества согласно данному изобретению может быть получена при осуществлении указанных выше экспериментов.

Внутриглазная переносимость фракции ГК-1 у обезьян Данное испытание проводилось с целью оценки офтальмологической переносимости обезьян после инъекции ГК-1 в стекловидное тело глаза.

1. Испытуемый вид Шесть молодых зрелых женских особей обезьян циномолгус (Макака фаспикулярис) использовались в этом испытании. Они обладали хорошим здоровьем и не имели выявленных повреждений глаз.

Приматы были выбраны для данного испытания, потому что они считаются лучшим видом для изучения офтальмической переносимости вязкоупругого продукта, используемого в офтальмической хирургии.

Были выбраны обезьяны циномолгус, потому что обезьяны Доурокоу лис, которые ранее использовались для изучения офтальмической переносимости, являются сейчас исчезающим видом и взяты под официальную защиту.

2. Экспериментальные группы и их обработка.

Обозначение группы и уровни доз.

Обезьяны обрабатывались единожды согласно таблице 1.

3. Приготовление и применение смеси.

В день операции обезьяны были анестезированы гидрохлоридом кетамина, разбавленным пентабарбиталом натрия. Затем зрачки были расширены локальным вводом 1,0% тропикамида /Mydriacyl, alcon laboratories/. Роговица, коньюктива, придатки и передний сегмент исследовались с помощью лампощелевого биомикроскопа, а задний сегмент с помощью непрямого офтальмоскопа. Перипалцебральная оболочка была приготовлена для хирургического вмешательства путем использования двух промываний и промыванием напором струи 0,5% повидонйода и стерильного солевого раствора. Стерильная хирургическая простыня и векорасширитель были зафиксированы, а сфера стабилизирована с помощью небольших зубных щипцов. Острое и прямое рассечение использовалось для формирования коньюктивного лоскута, базирующегося на конечности, на расстоянии примерно 10 мм от верхней конечности и параллельно ей, и примерно 10 - 15 мм длиной. Рассечение было проведено через коньюктивную и тенонову капсулу к эписклере. Этот лоскут был приготовлен передним рассечением до конечности, экспонирующей нижележащую склеру, перекрывающую парс плана. На расстоянии примерно 5 - 6 мм от конечности был наложен интрасклеральный матрацный шов 7 - 0 Vicyrl /Ethicon/ со следом примерно 3 мм в сторону.

Использовалась игла 25-го размера для аспирации 0,5 мл стекловидного тела (для двух животных оказалось возможным аспирация только 0,4 мл); это стекловидное тело было замещено равным объемом НА-12 (12 кг/мл) или стерильным солевым раствором. Матрацный шов был обезопасен от возможного просачивания и коньюктивный лоскут заменялся. Было произведено локальное применение антибиотической мази. Осуществляли определение стекловидных клеток в аспирированном стекловидном теле, используя гомоцитометр перед введением и примерно через 48 часов после него.

4. Наблюдение и регистрация.

Примерно через 48 часов после хирургической операции животных анестезировали и осуществляли офтальмоскопическое исследование. Анестезию, делатацию и исследование осуществляли как описано выше. Исследование осуществляли слепым методом, независимо от того, осуществляли ли инъекцию в исследуемый глаз ГК-1 или контрольного материала. Глазные параметры оценивались как показано в стандартной ключевой классификации для глазной оценочной шкалы, приведенной ниже.

Отек конъюктивы, инъекция и выделение; отек роговицы, гем и воспалительная гипермия: 0 = нормальные +1 = слабые +2 = умеренные +3 = сильные или чрезвычайно сильные Прозрачность стекловидного тела: 0 = прозрачное 1 = слабое помутнение - видимое глазное дно 2 = умеренное помутнение - едва видимое глазное дно 3 = помутнение - красный рефлекс глазного дна 4 = помутнение - серый рефлекс глазного дна 5 = глазное дно невидимо Глаза препарировали для аспирации с использованием раствора повидонйода, как описано выше. Устанавливали глазное зеркало, и глазное яблоко стабилизировали небольшим зубным иглодержателем. Стекловидное тело (0,1 - 0,2 мл) аспирировалось непосредственно через конъюнктиву и склеру на расстоянии 6 мм от конечности в верхнем височном квадранте. Следили за тем, чтобы был исключен исходный участок хирургического воздействия. Вызывающие воспаление клетки рассчитывали с использованием гемацитометра. Снова наносилась локальная антибиотическая мазь.

РЕЗУЛЬТАТЫ Данные, представленные в таблице 2, показывают, что НА-1 очень хорошо переносима и не дает никакого глазного раздражения по сравнению с контрольным препаратом (физиологическим солевым раствором).

Двое животных из группы, подвергнутой обработке солевым раствором, показали слабую водную инфильтрацию клеток и воспалительную гипермию. Контрольные значения лейкоцитов стекловидного тела составляли от 10 до 60 на мм³. Один глаз, подвергнутый инъекции НА-1, показан слабую водную инфильтрацию клеток и воспалительную гипермию. Число лейкоцитов стекловидного тела в подвергнутых испытанию глазах составляло от 0 до 30 на мм³.

Таким образом, проведя сопоставления с контрольными экспериментами с физиологическим солевым раствором, можно сделать вывод, что ГК-1 очень хорошо переносима глазными тканями после внутривитреального вытеснения.

Клиническое исследование с целью определения эффективности ГК-1 в сравнении с ГЕАЛОНОМ в хирургии для внекапсулярной катаракты с имплантацией внутриглазных хрусталиков задней полости.

Описанные ниже эксперименты проводились с целью оценки эффективности и безопасности ГК-1 по сравнению с основными пользующимися спросом на рынке вязкоупругими материалами (ГЕАЛОНОМ) при удалении катаракты и имплантации внутриглазных хрусталиков на двух клинических исследованиях. В первом клиническом исследовании проводили испытание ГК-1 и ГЕАЛОНА в одинаковых экспериментальных условиях (в обоих случаях осуще