Протеин, ингибирующий вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов млекопитающих, рекомбинантный протеин, ингибирующий вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов, фрагмент днк, кодирующий рекомбинантный протеин, вектор экспрессии (варианты), штамм культивируемых животных клеток внк - продуцент рекомбинантного протеина (варианты), способ получения рекомбинантного протеина, фармацевтическая композиция

Протеин, ингибирующий вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов млекопитающих, рекомбинантный протеин, ингибирующий вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов, фрагмент днк, кодирующий рекомбинантный протеин, вектор экспрессии (варианты), штамм культивируемых животных клеток внк - продуцент рекомбинантного протеина (варианты), способ получения рекомбинантного протеина, фармацевтическая композиция

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии. Выделен природный протеин, ингибирующий вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов млекопитающих из слюны Friatoma и установлена его N-концевая аминокислотная последовательность. Получен рекомбинантным путем протеин с активностью, аналогичной природному протеину. Установлена его аминокислотная последовательность. Также определена нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, кодирующего рекомбинантный протеин. Сконструированы векторы экспрессии рМРSV /СMV - ингитор - I (DSM 7223) и рМРSV/СМV - ингибитор-II, содержащие фрагменты ДНК, кодирующие рекомбинантный протеин. Способ получения рекомбинантного протеина осуществляют культивированием штаммов культивируемых животных клеток ВНК, трансформированных упомянутыми векторами экспрессии, способными продуцировать рекомбинантный протеин. Далее проводят его выделение и очистку гель-фильтрацией на "Superose 12" и в системе электрофорез - хроматография. Фармацевтическая композиция, ингибирующая индуцируемую коллагеном агрегацию тромбоцитов содержит природный или рекомбинантный протеин в качестве активного вещества в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Протеины могут быть использованы в качестве лекарства для ингибирования вызываемой коллагеном агрегации тромбоцитов человека или лечения раковых болезней с метастатическими опухолевыми клетками. 9 с. и 6 з.п.ф-лы, 29 ил., 3 табл.

Коллаген представляет собой наиболее эффективный из известных индукторов агрегации тромбоцитов человека. Так, например, после повреждения стенок сосудов и экспонирования их коллагену тромбоциты быстро прилипают к этому месту и активируются /Baumgaptner/ 1977/, Thromb, Haemostas. 37, 1 - 16, Hauriger /1987/ Human Pathol. 18.111-122/.

Таким образом, вызываемая коллагеном агрегация тромбоцитов у человека представляет фактор риска для пациентов, подвергающихся процедурам, влияющим на кровеносные сосуды, например, пластическим операциям на сосудах или сепсису, для пациентов с инфарктом миокарда и для выздоравливающих после инфаркта миокарда, и др.

Ингибиторы вызываемой коллагеном агрегации тромбоцитов включают синтетические олигопептиды, соответствующие коллагеновой последовательности, протеины змеиного яда и халин, протеин медицинских пиявок. Синтетические олигопептиды, ингибируют вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов за счет того, что связывают тромбоциты. Их недостатком является то, что они оказывают влияние на агрегацию тромбоцитов только в относительно высоких дозах /около 70 мкг пептида/ мл обеспечивают 65% ингибирования/. См. Bevers et al. /1985/ "Полученный из октапептида коллаген ингибирует прокаагулянтную активность тромбоцитов, вызванную совместным действием коллагена и тромбина "Thrombosis Research, 37, 365 - 370, Karniguian et al. - 1983/ "Влияние полученного из октапептида коллагена на различные стадии взаимодействия тромбоцит/коллаген", Thrombosis Research, 32: 593-604 и Caen et al. /1981/ "Олигопептиды со специфическими ингибирующими свойствами вызываемых коллагеном агрегаций, способ их получения и содержащие их фармацевтические композиции" EPA 0040149. Ингибиторный механизм протеина змеиного яда до сих пор не известен. См. Smith et al. "Идентификация 50 кД протеинов змеиного яда, которые специфически ингибируют адгезию тромбоцитов к коллагену". Thrombosis and Haemostasis /1991, 65, 678/ труды XIII Конгресса Международного общества по проблемам тромбозов и гемостаза, июнь 30 - июль 6, 1991, Амстердам/. Халин реагирует с коллагеном, но не реагирует с тромбоцитами. Таким образом, он не специфичен для взаимодействия тромбоцит-коллаген, но он взаимодействует с коллагеном также и в отсутствии тромбоцитов. См. Munro et al /1991/ "Халлин - ингибитор адгезии тромбоцитов, полученный из слюны медицинских пиявок", Blood Coagulation and Tebrinolysis 2, 179 - 184.

В опубликованной Европейской патентной заявке EP 0480651 "Мегск and Co., Inc. , опубликованной 15 апреля 1992/, раскрыт протеин с молекулярным весом около 16 кД и его способность ингибировать вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов человека, причем протеин этот получен из слюнных желез пиявок Haemaenteria officinalis.

Необходимы другие ингибиторы такой агрегации, обладающие другими или усовершенствованными характеристиками.

В настоящем изобретении предложен природный выделенный, синтетически полученный или рекомбинантный протеин, который ингибирует вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов, и который выделяют, или который можно выделить из слюнных желез насекомых, сосущих кровь у млекопитающих.

Более предпочтительны тромбоциты приматов, и наиболее предпочтительны тромбоциты человека. Чувствительны также и тромбоциты других видов, например, лошадей, овец, рогатого скота, свиней, собак и кошек.

Синтетические протеины можно получить по способам J.M. Steward and J.D. Young, 1984 /, Твердофазный синтез пептидов Piеrce Chem. Company, Fockford III и Methoden der Organischen Chemie /Houben/ Weyl/. vol. 15, N 1 и 2, E. Wunsch /ed./, Thieme Verlag Stuttgart 1974.

Предпочтительны протеины настоящего изобретения, которые выделяют из слюны подсемейства /пат. Faminia /Tratomae и, наиболее предпочтительно, Triatoma pallidipennis.

Настоящее изобретение включает природный выделенный, синтетически полученный или рекомбинантный протеин, который ингибирует вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов млекопитающих, и который имеет следующую П-терминальную аминокислотную последовательность: В другом варианте изобретения представлен протеин, который ингибирует вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов млекопитающих, и причем протеин этот имеет следующую аминокислотную последовательность: a/ последовательность, представленную в aa/ последовательность Id N 1; bb/ последовательность Id N 2 или cc/ последовательность Id N 3, или b/ аллельные модификации или мутации последовательностей в любой из последовательностей Id N 1 - 3, причем эти модификации или мутации не оказывают существенного влияния на активность протеина, или c/ протеин по любой из последовательностей Id N 1 - 3 или их модификациям или мутациям, указанным в пункте b/, содержащий посттрансляционные модификации, которые не оказывают существенного влияния на активность зрелого протеина.

Наиболее предпочтительным из указанных протеинов является рекомбинантный протеин.

Настоящее изобретение включает протеин, который не гликозилирован.

Следующим вариантом изобретения являются кДНК или ДНК a/ кодирующие протеин, со следующей аминокислотной последовательностью: a/ последовательность, представленную в aa/ последовательности Id N 1, bb/ последовательности Id N 2 или cc/ последовательности Id N 3, или b/ кодирующие протеин, который имеет последовательность аминокислот, согласно любой из последовательностей N 1 - 3, с, по крайней мере, одной аллельной модификацией или мутацией, которая не оказывает существенного влияния на активность зрелого протеина, кодируемого соответствующей кДНК или ДНК последовательностью.

Протеин настоящего изобретения включает зрелый протеин и протеин, который содержит сигнальную последовательность, предшествующую N-терминальной последовательности зрелого протеина. Сигнальные последовательности представлены на фиг. 13a и 13b, и им соответствует отрицательная нумерация. Она начинается с Мет. Lys. Val.IIe.IIe и оканчивается His. Ala, Phe. Ala. Эта сигнальная последовательность отвечает за проникновение через мембрану после биосинтеза протеина. Секретируемый протеин представляет собой зрелый протеин, начинающийся с Glu.Cys.Glu.Leu... Эта сигнальная последовательность отщепляется до секретирования.

Настоящее изобретение, предпочтительно, содержит кДНК или ДНК со следующей нуклеотидной последовательностью: a/ нуклеотидная последовательность, представленная в aa/ последовательность I d N 4, bb/ последовательность I d N 5, или cc/ последовательность I d N 6, или b/ последовательность нуклеотидов по любой из последовательностей N 4 - 6, с, по крайней мере, одной аллельной модификацией или мутацией, которые существенно не влияют на активность зрелого протеина, который кодируется соответствующей нуклеотидной последовательностью.

Следующую часть изобретения составляет вектор, содержащий кДНК или ДНК, указанные ранее, который, кроме того, содержит подходящий сигнальный пептид, подходящий промотор и, при необходимости, подходящий энхансер. Векторы подробно описаны в примерах, а также в Европейской патентной заявке EP 0480651; 0463632 и 0173177.

Следующий вариант изобретения составляет клетки эукариотных или прокариотных хозяев, трансформированные указанным ранее вектором.

Наиболее предпочтительными клетками-хозяевами являются клетки почек детенышей хомяков. Так как законные требования делают депонирование таких клеток невозможным, плазмидную экспрессирующую конструкцию, содержащую ДНК последовательность Id N 1 депонировали 2 сентября 1992 г при регистрационным номерам DSM...

Дополнительно настоящее изобретение включает способ получения протеина, отличающийся тем, что включает культивирование клетки хозяина, трансформированной вектором, содержащим ген, кодирующий протеин, и выделение и очистку протеина. Конкретные варианты описаны в примерах изобретения, а общие способы можно выяснить из указанных в описании работ и особенно из примеров изобретения.

Промышленным применением протеинов настоящего изобретения является использование этих протеинов в фармацевтических композициях, содержащих протеин настоящего изобретения вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Подробности можно найти в разделе Применение описания.

Аллельные модификации, указанные ранее, включают изменения в последовательности нуклеотидов или аминокислот, изменения в генотипе или фенотипе. По крайней мере, один нуклеотид или аминокислота могут быть замещены, исключены или вставлены.

Большинство делеций, вставок и замещенний не должны приводить к радикальным изменениям характеристик протеина настоящего изобретения. Так как трудно предсказать точное действие замещений, делеций или вставок заранее, сравнение функций зрелого протеина с характеристическими функциями протеина настоящего изобретения может прояснить, имеет ли измененный протеин сравнимую активность.

Генетический код является вырожденным; то есть большинство аминокислот кодируется более чем одним кодоном из трех нуклеотидов. Соответственно, аллельные варианты в нуклеотидной последовательности могут изменять или не изменять аминокислотную последовательность. Поэтому аллельные вариации происходят первоначально на уровне ДНК и могут также существовать как вторичные на уровне аминокислотной последовательности.

ДНК последовательность, кодирующая протеин настоящего изобретения, может быть модифицирована обычными способами для получения вариаций в конечном протеине изобретения, который сохраняет практически ту же активность, что и протеин изобретения. Активность определяют по способу примера 1. Таким образом, одну или более из аминокислот, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.. . вплоть до 15 аминокислот, можно добавить, заменить или удалить, практически не влияя на активность протеина настоящего изобретения. Замещения обычно проводят в соответствии с таблицей 1, если нужно слегка изменить аминокислотную последовательность протеина настоящего изобретения.

Существенные изменения в функциях или иммунологической идентичности можно осуществить, выбирая замещения, которые менее консервативны, нежели приведенные в таблице 1, то есть, выбирая остатки, которые значительнее отличаются по своему действию на /a/ структуру полипептидной основной цепи в области таких изменений, как, например, плоская или спиральная конформа или гидрофобность молекулы, или /c/ объем боковых цепей.

Таблица 1.

Обычные замены аминокислот в протеине Исходные остатки - Примеры замен Ala - Gly, Ser Arg - Lys Asn - Gln, His Asp - Glu Cys - Ser Gln - Asn Glu - Asp Gly - Ala, Pro His - Asn, Gln lle - Leu, Val Leu - lle, Val Lys - Arg, Gln, Glu Met - Leu, Tyr, lle Phe - Met, Leu, Tyr Ser - Thr Thr - Ser Trp - Tyr Tyr - Trp, Phe Val - lle, Leu Мутации определяют по гомологии между двумя сравниваемыми протеинами. Экспрессионная гомология включает сходство аминокислот и разрывов в последовательностях для обоих сравниваемых последовательностей. Сходство аминокислот определяют, например, по таблице 1.

Предпочтительно, чтобы протеин имел аминокислотную последовательность с гомологией, по крайней мере, на 60%, более предпочтительно, по крайней мере, на 80%, и еще более предпочтительно, по крайней мере, на 90%, и наиболее предпочтительно, по крайней мере на 95% гомологии одной из последовательностей Id N 1-3.

Как указано ранее, настоящее изобретение включает варианты ДНК. Эти последовательности гибридизуются в жестких условиях с ДНК последовательностью, определенной в одной из последовательностей Id 4 - 6. Последовательно, чтобы кДНК и ДНК имели нуклеотидную последовательность с гомологией, по крайней мере, 60%, более предпочтительно, по крайней мере, 80%, гораздо более предпочтительно, по крайней мере, 90%, и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 95% соответствующей последовательности, представленной в одной из последовательностей Id N 4 - 6. Гомологию можно определить с помощью гибридизации, как указано у R.Knippers, Moleculare Genetic. 1982, 3ed., Georg Thееme Verlag Stuttgart, New York.

Под "пост-трансляционными вариантами", упомянутыми ранее, подразумевают вариации во время или после трансляции, такие как гликозилирование, образование дисульфидных мостиков и химические модификации аминокислот.

Гликозилирование является одной из основных биосинтетических функций эндоплазматического ретикулума и/или комплекса Гольджи. Последовательность и разветвление олигосахаридов, которые образуются в ретикулуме, могут быть изменены в комплексе Гольджи, лизосомах или плазматической мембране. Олигосахариды могут быть N-связанными олигосахаридами /аспарагиновые связи/ или O-связанными олигосахаридами /сериновые, треониновые или гидроксилизиновые связи/. Гликозилирование зависит от типа продуцирующих клеток и видов, из которых эти клетки получены. Степень и тип гликозилирования могут зависеть от соединений, как описано в Европейской патентной заявке EP 0222313. Изменения в гликозилировании могут изменить функции протеина.

Обычно зрелый протеин настоящего изобретения гликозилирован.

Протеины часто образуют ковалентные межцепные связи. Эти дисульфидные связи образуются между SH-группами цистеинов в протеине с уложенной цепью или при укладке цепи протеина во время трансляции. Эти связи стабилизируют трехмерную структуру протеина. Такие дисульфидные связи редко образуются в молекулах протеина, которые еще находятся в цитозоле клетки, так как высокая внутриклеточная концентрация - SH восстанавливающего агента глутатиона разрушает большинство таких связей.

Поскольку протеины находятся вне цитоплазмы и секретируются или находятся на поверхности клеток, они часто образуют дополнительные ковалентные внутрицепные связи.

Кроме того, аминокислоты могут быть изменены способом, описанным в РСТ заявке WO 91/10684. Другие изменения боковых цепей аминокислот также возможны.

Предпочтительно, чтобы гомологичность составляла, по крайней мере, 90%, более предпочтительно, по крайней мере, 95%, гораздо более предпочтительно, по крайней мере, 98%, и наиболее предпочтительно, чтобы изменения касались одной или двух аминокислот.

Протеин изобретения имеет степень чистоты, по крайней мере 40%: предпочтительно, по крайней мере, 60%, более предпочтительно, по крайней мере 80%; и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 90%. Степень чистоты определяют по количеству протеина настоящего изобретения по отношению к полному количеству протеина. Используя очистку на двух стадиях, вначале гель-фильтрацией на Сефарозе /см. пример 2/, и затем с помощью HPEC /см. пример 15/, получают протеин настоящего изобретения, помимо которого никаких других протеинов не детектируется способами примера 15.

Далее, настоящее изобретения включает связывающие молекулы, отдельные цепи протеинов, антитела или их фрагменты, распознающие специфически домены на зрелом протеине изобретения.

Используя очищенный протеин изобретения /см. например, последовательности Id N 1 - 3/ продуцируют моноклональные антитела хорошо известным способом Koehler and Milstein, который, в частности, включает обычную иммунизацию мышей очищенным протеином изобретения в качестве иммуногена.

Лучшим вариантом настоящего изобретения является протеин, указанный как последовательность Id N 1, экспрессированный в трансфецированных клетках почки детеныша хомяка.

Кроме того, изобретение включает способ очистки протеина настоящего изобретения, включающий /a/ стадию гель-фильтрации на "Superose 12" /см. пример 2/, и /b/ стадию обработки в высокоэффективной системе электрофорез-хроматография /См. пример 15/.

Применение соединений.

Протеины настоящего изобретения демонстрируют фармакологическую активность и поэтому могут быть использованы в качестве лекарств. Их можно использовать в фармацевтических композициях, содержащих протеин настоящего изобретения вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Кроме того, настоящее изобретение включает фармацевтические композиции, содержащие фармацевтически активный протеин настоящего изобретения, и его фармацевтически приемлемые соли или фармацевтически приемлемые носители.

В частности, протеин настоящего изобретения демонстрирует ингибирование индуцированных коллагеном агрегаций, тромбоцитов и ингибирование адгезии опухолевых клеток, предпочтительно, клеток метастазов опухолей к коллагену.

Лекарства против агрегации тромбоцитов Протеины настоящего изобретения демонтируют ингибирование агрегации тромбоцитов. Тестовая система описана в примере 1. Протеины настоящего изобретения демонстрируют значительное ингибирование агрегации тромбоцитов в концентрации 0,5 - 50 мкг протеинов слюны в 0,5 мл или 0,5 - 250 мкг протеина в 0,7 мл очищенного протеина /только очистка по способу примера 2/.

Тестирование наиболее предпочтительного протеина, протеина с последовательностью Id N 1, дает величину ИК₅₀ 50 нмолей/л протеина с высокой степенью очистки по способу примеров 2 и 15. Протеины настоящего изобретения демонстрируют ингибирование агрегации тромбоцитов в концентрациях от 5 нмолей/л до около 1000 нмолей/л Результаты, полученные для in vitro тестовых систем, указывают на то, что протеины настоящего изобретения можно использовать в качестве лекарств, или можно использовать для медицинского применения. Результаты тестов можно перенести из системы in vitro в системы in vitro, так как это принято в этой области знаний. R.J.Shebuski et al. /1990/ Thombosis and Haemostasis, 64:576 - 581 Протеины настоящего изобретения вводят внутрибрюшинными инъекциями, ежедневно или 2 - 3 раза в день. Если вводить животным ежедневно до достижения концентрации в крови 100 нмолей/л, у них происходит снижение агрегации тромбоцитов. В этих условиях не наблюдается серьезных побочных явлений.

Протеины настоящего изобретения демонстрируют такое ингибирование агрегации тромбоцитов у мышей при ежедневных дозах до достижения концентрации в крови от около 10 до 1000 нмолей/л.

Поэтому протеины настоящего изобретения можно использовать для лечения атеросклероза или тромботических поражений, или для предотвращения повторной окклюзии после лечения инфаркта миокарда. Другими словами: протеины настоящего изобретения можно использовать в качестве противоатеросклеротических и противотромботических агентов для млекопитающих, включая человека, например, для лечения атеросклеторических/тромботических поражений, например, связанных с разрушением атеросклеротических бляшек или связанных с нарушением или удалением эндотелия, например, в результате сепсиса или трансплантации, или для лечения нестабильной стенокардии. Его можно также использовать для предотвращения повторной окклюзии после лечения инфаркта миокарда фибринолизом или антиопластикой /PTCA/. Если для лечения инфаркта миокарда используют фибринолитическую терапию /стрептокиназой, т-РА или другими плазминогенными активаторами/, тогда протеины настоящего изобретения можно использовать в качестве вспомогательных агентов для предотвращения повторной окклюзии кровеносных сосудов. Лечение инфаркта миокарда катетер-баллоном /РТСА/ также приводит к поражению стенок кровеносных сосудов, что может привести к образованию новых тромбов. Это можно предотвратить, вводя протеины изобретения во время или после процедуры. Эти протеины нельзя использовать только при коронарной ангиопластике, но можно использовать в других вариантах ангиопластики.

Настоящее изобретение обеспечивает: a/ применение протеина настоящего изобретения для приготовления лекарств для лечения атеросклероза или тромбоза, или для предотвращения повторной окклюзии после лечения инфаркта миокарда; /эти протеины годятся для лекарств, принимаемых в целях профилактики/.

b/ способ лечения атеросклероза или тромбоза, или для предотвращения повторной окклюзии после лечения инфаркта миокарда, который включает введение эффективно подавляющего заболевание количества протеина настоящего изобретения пациенту, нуждающемуся в таком лечении; c/ фармацевтическую композицию для лечения атеросклероза или тромбоза, или для предохранения повторной окклюзии после лечения инфаркта миокарда, которая включает протеин настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

Соответствующие таким показаниям дозы, естественно, зависят от, например, используемого соединения настоящего изобретения хозяина, способа введения и природы и степени подлежащего лечению заболевания. Однако, вообще, показано, на животных, что удовлетворительные результаты достигаются при ежедневных дозах, обеспечивающих достижение концентрации в крови от 10 до 1000 нмоль/л, предпочтительно, при ежедневных дозах от 30 до 300 нмолей/л.

Протеины настоящего изобретения можно вводить любым обычным способом, в частности, энтерально, орально, например, в виде таблеток или капсул, или парэнтерально, например, в виде растворов или суспензий для инъекций.

Предпочтительным протеином является протеин с последовательностью Id N 1.

Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие соединения настоящего изобретения вместе с, по крайней мере, одним фармацевтическим носителем или разбавителем. Такие композиции соединения можно получить обычными способами. См. Remingtonis Pharmaceutical Science, 15 ed, Mack Publishing Company, Easton Pemsylwana /1980/.

Лекарства против метастатических опухолевых клеток.

Протеины настоящего изобретения демонстрируют ингибирование адгезии метастатических опухолевых клеток к коллагену. Тестовая система представлена на фиг. 14. Протеины настоящего изобретения демонстрируют существенно ингибирование адгезии метастатических опухолевых клеток к коллагену в концентрациях от 1 до 100 мкг протеина слюны в 0,5 мл или 1 - 500 мкг протеина в 0,5 мл очищенного протеина /очищенного только по способу примера 2/.

Тестирование наиболее предпочтительного протеина, протеина с последовательностью Id N 1, дает значение ИК₅₀ 100 нмоль/л протеина с высокой степенью очистки по способам примеров 2 и 15. Протеины настоящего изобретения демонстрируют ингибирование адгезии опухолевых клеток к коллагену при концентрациях от 10 до 2000 нмоль/л.

Результаты, полученные в тестовой системе in vitro, показывают, что протеины настоящего изобретения можно использовать в качестве лекарств или для медицинского лечения. Тестовые результаты, полученные in vitro, можно перенести в систему так, как это принято в этой области медицины. Chan et al. /1990/ Science 2:1600 - 1602.

Протеины настоящего изобретения можно вводить во время или после хирургической операции первичных опухолей для предотвращения образования метастазов за счет отделившихся опухолевых клеток, которые могут попасть в поток крови во время операции. Такие антиметастатические эффекты можно исследовать на "экспериментальных" и "спонтанных" животных моделях, как описано Chan et al., Science 2:1600 - 1602. Протеины изобретения вводят внутрибрюшинными инъекциями ежедневно или 2-3 раза в неделю. Если животным вводят ежедневно дозу до достижения концентрации в крови 200 нмоль/л, у них проявляется пониженная адгезия метастатических опухолевых клеток, по данным определения количества центров осевших метастатических клеток. В таких условиях не наблюдается серьезных побочных эффектов.

Протеины настоящего изобретения демонстрируют такую ингибирующую адгезию эффективность по ингибированию метастатических опухолевых клеток к коллагену у мышей при дневных дозах, обеспечивающих достижение концентрации в крови от 20 до 2000 нмоль/л, предпочтительно, концентраций от 60 до 600 нмоль/л.

Поэтому протеины настоящего изобретения пригодны для лечения рака, предпочтительно, рака с метастатическими опухолевыми клетками, и наиболее предпочтительно, рака с большим количеством метастатических опухолевых клеток.

Настоящее изобретение обеспечивает a/ применение протеина настоящего изобретения для получения лекарства для лечения рака с метастатическими опухолевыми клетками. /Такие протеины пригодны для профилактических лекарств, вводимых, например, до хирургического удаления опухолей/.

b/ способ лечения рака с метастатическими опухолевыми клетками, который включает протеин настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

При таких показаниях соответствующие дозы будут, естественно, зависеть, например, от используемых соединений изобретения, пациента, способа введения и природы и степени заболевания, подлежащего лечению. Однако вообще, удовлетворительных результатов в опытах на животных удается достичь при ежедневных дозах, обеспечивающих достижение концентрации в крови от 20 до 2000 нмоль/л, предпочтительно, при ежедневных дозах от 60 до 600 нмоль/л.

Протеины настоящего изобретения можно вводить любым удобным способом, в частности, энтерально, орально, например, в форме таблеток или капсул, или парэнтерально, например, в форме растворов или суспензий для инъекций.

Предпочтительным соединением является протеин с последовательностью ID N 1.

Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие соединение изобретения вместе с, по крайней мере, одним фармацевтическим носителем или разбавителем. Такие композиции можно приготовить обычными способами. См. Pemington Pharmaceutical Science, 15 ed, Mack Publishing Company, Easton Pennsylvania /1980/.

Краткое содержание изобретения В настоящем изобретении предложен ингибитор вызываемой коллагеном агрегации тромбоцитов человека. Новый специфический ингибитор представляет собой природный протеин /то есть не олигопептид/, который также ингибирует взаимодействие опухолевых клеток с коллагеном. Такой ингибитор присутствует в слюне кровососущих насекомых Triatoma pallidipennis. См. пример 1.

Таким образом, настоящее изобретение относится к очищенному и выделенному протеину, который ингибирует индуцируемую коллагеном агрегацию тромбоцитов человека. Этот протеин можно выделить из Triatoma pallidipenis. Оно также относится к фармацевтическим композициям, содержащим протеин, и к способам применения последнего для лечения тромботических поражений, или для предотвращения повторной окклюзии после лечения инфарктов миокарда, а также для лечения, наряду с другими, развития метастазов.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает ценное фармакологически активное вещество, например новый протеин, который специфически ингибирует вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов, с высокой степенью специфической активности; новый протеин, который специфически противодействует взаимодействию тромбоцит-коллаген, не вызывая высвобождения внутритромбоцитных составляющих, например АТГ, который обладает нежелательным побочным эффектом сам по себе; новый протеин для фармацевтического использования при лечении атеросклероза и тромбоза или для предотвращения повторной окклюзии после лечения инфаркта миокарда; новый протеин, который противодействует взаимодействию опухолевая клетка-коллаген и который можно использовать, например, для предотвращения метастазов опухолевых клеток.

Исследования характеристик и свойств ингибитора привели к следующим результатам: 1/ Ингибитор не является антагонистом рецепторов фибриногена, так как эксперименты с возрастающими концентрациями фибриногена не выявили какого-либо влияния на ингибирующую активность. См. Пример 3.

2/ Он не является антагонистом тромбоксана, так как предотвращает вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов, предварительно обработанных аспирином, а не агрегацию, вызванную U 46619 /имитатор тромбоксана/. См. пример 4.

3/ По-видимому, он не является ингибитором направления трансдукции сигнала, осуществляемого за счет протеинкиназы C, так как агрегация, индуцируемая форболестера /форбол-12-миристал-13-ацетат/ не ингибируется. См. пример 4.

4/ Он ингибирует реакцию высвобождения обработанных коллагеном тромбоцитов. См. пример 5.

5/ Он не ингибирует агрегацию тромбоцитов, вызываемую тромбином или АДР. См. пример 6.

6/ Ингибитор не реагирует с коллагеном. Хотя предварительное инкубирование ингибитора с коллагеном и не приводит к повышению ингибирующей активности, пролонгированное инкубирование тромбоцитов с ингибитором приводит к более высокой потенции ингибиторов. См. пример 7.

7/ Ингибирование агрегации тромбоцитов становится обратимым при добавлении больших количеств коллагена. См. пример 7.

8/ Ингибиторы протеазы не обладают заметным влиянием на активность. Пример 8.

9/ Ингибирующая активность возрастает в присутствии ионов Mg²⁺. См. пример 9.

10/ Ингибитор предотвращает адгезию тромбоцитов к коллагеновой матрице зависимым от дозы способом. См. пример 10.

Эти результаты дают возможность предположить, что этот ингибитор является антагонистом коллагенового рецептора с высокой специфической активностью, например, ИК₅₀ = 2,5 мкг/мл сборной фракции "Superose", описываемой далее /на основании частично очищенного ингибитора/, и ИК₅₀=50 нмоль/л для высокой степени очистки протеина /очищенного на последовательных стадиях, описанных в примерах 2 и 15/.

11/ Ингибитор инкубировали с трипсином, связанным на сефарозной матрице. Ингибитор полностью терял активность за счет протеолитического расщепления. См. пример 11, в котором показано, что ингибитор является протеином.

12/ Ингибитор не расщепляется коллагеназой. См. пример 12.

13/ По данным гель-фильтрационной хроматографии в присутствии 150 мМ NaCl ингибитор имеет молекулярный вес 20 мДа5 кД, то есть, около 20 кД. См. пример 13. Значение для негликолизированного протеина /см. последовательность Id N 1/, рассчитанное для кДНК последовательности, составляет 18923 Дальтон.

14/ Ингибитор предотвращает адгезию высоко метастатических опухолевых клеток /MT Zn 3/ к коллагену зависимым от дозы образом /См. пример 14/.

Ингибитор настоящего изобретения не связывается с /или не реагирует с/ коллагеном, не связывается с тромбоцитами и не вызывает флоккуляции коллагена.

Ингибитор коллаген настоящего изобретения можно обычным способом выделить из слюны кровососущих насекомых Triatoma pallidipennis, например, как описано в примерах. Обычные способы сбора слюны вполне применимы для получения исходного материала слюны. Насекомые Triatoma pallidipennis преимущественно распространены, и поэтому легко доступны, в центральной и северной Америке. Они известны как вектор для Trypanosoma Cryi.

В другом аспекте настоящего изобретения предложена ДНК последовательность, векторы, содержащие эту последовательность клетки, содержащие эти векторы, способы рекомбинантного получения протеинов и антител к протеинам настоящего изобретения. Также предложены выделенные и/или рекомбинантные ДНК последовательности /например, геномная или кДНК/, кодирующие протеин /например, природный/, которые ингибируют вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов человека. Еще в одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает рекомбинантно полученные протеины изобретения, например, имеющие раскрытые в изобретении последовательности.

Под термином "выделенный" подразумевают, что ингибитор настоящего изобретения или другой агент присутствует в форме, выделенной из /очищенной от/ компонентов, с которыми он природно объединен, или с которым он получен рекомбинантно или синтетически.

Вообще включены все степени такого выделения или очистки. Предпочтительны такие степени выделения или очистки, после которых ингибитор может быть использован для фармацевтических целей. Так, например, такие степени выделения /например, активности или чистоты/ можно получить в результате таких хроматографических методик, которые описаны в примерах. Дальнейшей очистки, например, до гомогенности, можно удобно достичь, используя обычные методики, например, раскрытые в следующих литературных источниках: Methods of Enzymology, Volume 182, Guide to Protein Purification, ed.

Murray P. DEUTSCHER, Academic Press 1999; Protein Purification Applications - A Practical Approach, ed. E.L.V. Harris и S.ANGEl, IRL-Press 1990; Prorin Purification, Principles and Practice, Robert SCOPES, Springer-Verlag 1982; и Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications, ed. J.-C. JANSON and L. RYDEN, VCH publishers 1989.

Степень чистоты можно определить любым из ряда известных способов, например, SDS - электрофорезом на полиакриламидном геле, аналитической ВЖХ и т. д. Очищенный ингибитор можно использовать для определения аминокислотной последовательности протеина по способу полностью хорошо известному специалистам. Hewick, R.m. et al. /1981/, J. Biol. Chem 256. 7990-7997.

Протеины настоящего изобретения включают не только протеины, выделенные из приведенных в примере видов насекомых, но также из любых других организмов, которые могут содержать такой ингибитор. Кроме того, ингибитор настоящего изобретения включает ингибиторы родственной структуры, например, ингибитор, вызываемой коллагеном агрегации тромбоцитов, выделенный из другого организма, который имеет практически аналогичную аминокислотную последовательность.

Так как этот протеин выделен из жалящих насекомых, и его природное предназначение состоит в том, чтобы предотвратить закупорку кровью раны, образующейся после укуса, на достаточно длительный промежуток времени, чтобы насекомое могло отсосать кровь, совершенно очевидно, что другие подобные ингибиторы агрегации тромбоцитов под действием коллагена, можно обнаружить в слюне других кровососущих организмов, особенно насекомых, например, у других Reduviit bugs с конусными носами подсемейства. Triatominaе, таких как Triatoma infestans, T, dimidiata, T.maculata, Rhodmius prolixus, Panstrongylus megistus and P.infestans.

Протеины настоящего изобретения включают мономерные одноцепочечные молекулы, то есть такие, которые ковалентно или нековалентно не связаны с другими полипептидными цепями. Настоящее изобретение охватывает также другие формы молекул протеина, например, димеры или другие олигомеры, третичные структуры, образованные с другими полипептидами, фрагментами протеина и т.д. Включены как гликозилированные, так и негликозилированные формы, причем обе формы можно получить обычными способами экспрессией из, например, млекопитающих /гликозилированных/ или бактериальных клеток /негликозилированных/, соответственно.

Аминокислотную последовательность ингибитора настоящего изобретения можно использовать для определения последовательности подходящего ДНК зонда, который можно использовать для нахождения новых ингибиторов, например, в других видах. Такие зонды можно синтезировать обычным способом, например, используя автоматические ДНК синтезаторы и скринируя геномную или к ДНК библиотеки аналогично способам известным специалистам /см. международную публикацию WO 90/07861 от 26 июля 1990 г./ Так, например, настоящее изобретение относится к ДНК последовательности как раскрыто в фиг. 12a-c, 13 a и b и 22-24. Кроме того, настоящее изобретение относится к ДНК последовательности, кодирующей мутации, как указано ранее. Последовательность для -18 до +5 участка на фиг. 18, 21 и 24 получают из соответствующих полной длины кДНК последовательностей ингибиторов 1 и 2.

Поэтому настоящее изобретение включает также ДНК последовательность /кодирующую/ как природную ДНК последовательность /ген/ ингибитора, когда ее выделяют из природного окружения, например, в растворе или на векторе, а также их мутанты, так и встречающуюся в природе, например, в других видах, в