Биопрепарат для устранения и профилактики вторичного иммунодефицита и способ его получения

Биопрепарат для устранения и профилактики вторичного иммунодефицита и способ его получения

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины, в частности иммунологии, и может быть использовано для профилактики и лечения иммунодефицитных состояний. Сущность изобретения состоит в том, что новый биопрепарат содержит на одну вес. ч. "Тактивина" 20 - 40 вес.ч. NaPHK. Описан также способ получения биопрепарата, который заключается в том, что проводят смешивание вышеназванных компонентов в твердой фазе при комнатной температуре в указанных частях, смесь растворяют в апирогенном растворе, стерилизуют, ампулируют или флаконируют. Изобретение расширяет арсенал средств борьбы с иммунодефицитным состоянием. 2 с. и 1 з.п.ф-лы, 5 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно иммунологии, и может быть использовано для устранения и профилактики у человека и животных иммунодефицитных состояний (ИДС), развивающихся под воздействием неблагоприятных факторов (инфекции, опухоли, стрессы и другие заболевания).

Известны иммунотропные средства, неспецифически влияющие на иммунную систему (стимулирующие или ингибирующие иммунные процессы), например, цикофосфан, актиномицин-D, меркаптопурин, БЦЖ, левамизол и др. (Л.Н. Лазарева и др. : "Стимуляторы иммунитета". Москва, Медицина, 1985; А.Т. Иванова и др. "Иммунотерапия онкологических больных", Москва, "Печатное дело" 1995) Упомянутые иммунотропные вещества неспецифичны по отношению к иммунной системе. Часто они дают нежелательные побочные эффекты, аллергию.

Известны также фармацевтические средства природного происхождения: интерферон, тимозин, тактивин, миелопид, тималин и др. (А.Т. Иванова и др. "Иммунотерапия онкологических больных", Москва, "Печатное дело" 1995: V. Ya. Arion: "Thymic peptides as immunoregulators " Published by Harwood Academic Publishers, UK, New York, London, Melbourne).

Недостатком известных средств является ограниченность их спектра действия.

Хорошо известен способ профилактики НДС, возникающих в результате инфекционных заболеваний, путем введения в организм прививочного материала (продуктов химического разрушения микробов, вакцин, анатоксинов). Прививочный материал вводят внутрикожно, на кожу, внутривенно практически здоровым людям или животным с целью профилактики. Такую процедуру проводят однократно, 2-3 раза с интервалами от 7 до 10 дней и от 3 до 4 недель. ("Популярная медицинская энциклопедия", Москва, изд. "Советская энциклопедия", 1990, стр. 856).

Недостатком этого подхода к профилактики вторичных иммунодефицитов, вызываемых инфекционным агентом, является наличие специальных противопоказаний. Прививки можно делать только практически здоровым людям и животным, причем на протяжении длительного времени (от 6-7 дней до 2-3-х недель). Кроме того, прививки дают профилактический эффект только на определенные инфекционные антигены. Таким образом, такой подход не может быть использован при наличии иммунодефицитного состояния.

Достижения иммунологии указывают на то, что нормально функционирующая иммунная система реагирует не только на микробные антигены, но также и на любые вещества, генетически чуждые данному конкретному организму. В процессе жизнедеятельности организма возможно возникновение нарушения в работе иммунной системы, особенно при неблагоприятной экологии. При этом необходимы вещества, которые бы устраняли "поломки" в иммунной системе.

Тактивин (Taktivinum) истинный иммунокорректор, нормализующий нарушенные показатели T-звена иммунитета и опосредованно влияет на B-звено иммунной системы. Тактивин влияет на все этапы созревания, дифференцировки, становления и развития T-лимфоцитов, восстанавливает нарушенный синтез Jg,a также усиливает продукцию специфических антител на пике вторичного иммунного ответа. При иммунодефицитных состояниях не только нормализует количественные показатели лимфоцитов, но и усиливает их функциональные возможности.

Тактивин широко используется для устранения иммунодефецитных состояний при различных заболеваниях: инфекциях, опухолях различной природы, в офтальмологии, используют для профилактики гриппа у беременных ( SU N 1419706, опуб. 30.08.88г.), для лечения глаукомы (а.с. SU N 1482694, опубл. 30.05.89), при инфекциях дыхательных путей (SU 1629063, опубл. 23.02.91) и ряде других заболеваний ( SU 1517966, SU 1634282 и т.д.) Наиболее близким к предлагаемому препарату для устранения дефектов иммунной системы и профилактики ИДС является препарат Тактивин, который, в основном, исправляет дефекты T-и B-звеньев иммунной системы. (Арион.В.Я. Tактивин и его биологическая активность. Иммунобиология гормонов тимуса. Киев "Здоровья", 1989, глава 7, с. 103-125). Тактивин вводят при ИДС под кожу 5 дней подряд из расчета 40 мкг на 1м² поверхности тела.

Недостатком известного препарата является ограниченность его действия только на T- и B-звенья иммунной системы, тогда как для полноценного иммунного ответа требуется взаимодействие этих двух звеньев с макрофагальным звеном иммунной системы.

Задачей предлагаемого изобретения является устранение дефектов иммунной системы, возникающих при различных заболеваниях, а также предупреждение возникновения вторичной иммунологической недостаточности путем одновременного воздействия на T-, B- и M (макрофагальное)-звенья иммунитета.

Поставленная задача решается с помощью создания биологического препарата, содержащего не только Тактивин, но также натриевую соль низкополимерной РНК (NaPHK) в определенных (оптимальных) соотношениях, а также способа получения этого биопрепарата.

Тактивин получают путем экстракции пептидов из тимуса телят крупного рогатого скота. Иммунологическое действие препарата связано с пептидами с молекулярной массой от 0,3 до 6 кДа. (В. Я. Арион и др. "Способ получения полипетидов из тимуса крупного рогатого скота". SU 1600047 A 1.) NaPHK-препарат нуклеиновой природы получают из пекарских дрожжей, а также тимуса, низших грибков. Основной компонент - низкополимерные фрагменты РНК от 4S и ниже стимулирует метаболизм в макрофагах: увеличивается число лизосом, полирибосом, усиливается ферментативная активность и фагоцитарная функция. (В. М. Земсков и др. "Иммуномодуляторы в лечении легочной патологии". Москва, 1995).

Препараты нуклеиновой природы используются для лечения вторичных иммунодефицитных состояний, например при ВИЧ-инфекции, (пат. US 5063209, опуб. 05.11.91. ) Иммуномодуляцию в этом случае проводят с помощью двухцепочечной РНК. Однако зарубежные препараты получены на основе иных, дорогостоящих методов и для производства отечественных иммунотропных препаратов не могут быть использованы.

На основе двух отечественных препаратов нами создан новый биологически активный препарат, который содержит Тактивин, и дополнительно NaPHK при следующем соотношении компонентов, вес.ч.: Тактивин - 1 NaPHK - 20-40 Способ получения биопрепарата заключается в том, что компоненты смешивают при следующих условиях: 1 вес. ч. лиофилизированого Тактивина, тщательно перемешивают при комнатной температуре с 20-40 вес.ч. лиофилизированной NaРНК, растворяют в апирогенном физиологическом растворе, стерилизуют, затем ампулируют или флаконируют.

Например, берут 50 мкг лиофилизированного Тактивина и 1-2 мг лиофилизированной NaРНК, растворяют в 1 мл апирогенного физиологического раствора, стерилизуют, ампулируют.

Действие нового биопрепарата проверено в экспериментальных условиях. В частности, проверена возможность восстановления чувствительности фоновых розеткообразующих клеток селезенки (табл. 1), изучен эффект стимуляции антителообразования (табл. 2), показано усиление устойчивости макрофагов мышей к цитопатическому действию сальмонелл, (табл. 3), изучено влияние препарата на репродукцию вируса гриппа (табл. 4), кроме того, выявлено положительное влияние препарата на неспецифическую резистентность мышей линии СВА к S. typhimurium 415 при внутрибрюшинной аппликации (табл. 5).

Как видно из данных, приведенных в табл. 1 Тактивин в концентрации 5 и 10 мкг/мл оказывает действие в этом тесте, что доказывает его влияние на восстановление функции T-лимфоцитов у мышей с удаленным тимусом.

При этом NaPHK не проявляет должной активности. Новое средство, при соотношении Тактивин/NaPHK 1: 20 и 1:40 соответственно, проявляет довольно высокий уровень активности в этом тесте.

Следующие эксперименты были поставлены с целью выяснения действия нового препарата на В-звено иммунитета.

Для этого мы воспользовались известным методом Epне, позволяющим определить степень стимуляции антителообразования. Эффект стимуляции антителообразования приведен в табл. 2.

Из данных, приведенных в табл. 2, видно, что новое средство стимулирует антителообразование (B-звено) более интенсивно, чем "Тактивин" и NaPHK, взятые в отдельности.

Как уже указывалось, полноценный иммунный ответ развивается при взаимодействии T-, B-звеньев и макрофагов.

Другими словами, полноценная иммунологическая защита организма может быть осуществлена только при полноценной функции всех трех составляющих.

В ряде экспериментов было изучено влияние препаратов на устойчивость макрофагов мышей к цитопатическому действию сальмонелл в системе in vitro. Оказалось, что обработка иммуномодуляторами макрофагов за 18 часов до заражения усиливает их резистентность и эта способность у биопрепарата выше, чем у Тактивина"и NaPHK, взятых по отдельности ( табл. 3 ).

Таким образом, можно заключить, что новое средство положительно влияет на T-, B- и M-звенья иммунной системы, проявляя более высокую активность по сравнению с Тактивином и NaPHK, взятых по отдельности.

Следовательно, новый биопрепарат можно рассматривать как перспективное фармацевтическое средство для устранения иммунодефицитов, связанных с нарушением функции иммунитета на уровне Т-В-лимфоцитов и макрофагов.

В ряде экспериментов была исследована профилактическая возможность нового биопрепарата.

Особый интерес представляет вирус гриппа, который, как известно, в процессе репродукции в зараженном организме приводит к развитию вирусемии и трансплацентарным путем легко проникает в ткани плода.

В наших экспериментах были использованы мыши линии C 57BL/6, которых на 16-й день беременности заражали вирусом гриппа A(HINI), штам WSN. Через три дня животных декапитировали (под наркозом), извлекали различные органы и готовили 10% суспензии клеток и в 10-кратных разведениях вводили в аллантоисную полость 9-дневных куриных эмбрионов и через 48 часов инкубации с помощью реакции гемагглютинации определяли наличие вируса гриппа. Результаты приведены в табл. 4. Иммуномодуляторы мышам вводили в разные сроки до и после заражения.

Таким образом, с помощью предлагаемого биопрепарата можно не только усилить резистентность организма к инфекции, но и применить эту композицию с целью профилактики заболевания, например, при угрозе распространения инфекции.

Убедительные данные получены при изучении действия биопрепарата на резистентность к бактериям мышей линии СВА (табл. 5). Видно, что индекс защиты у него намного выше, чем у Тактивина или NaPHK. В эксперименте использовались бактерии Solmonella typhimurium 415 при внутрибрюшинной аппликации.

Приведенные данные экспериментальных исследований позволяют заключить, что при осуществлении данного изобретения достигнут положительный результат, выражающийся в создании нового средства - иммунотропного препарата, который устраняет вторичные ИДС и предотвращает (профилактика) возникновение нарушений в иммунной системе. Данный результат достигнут путем одновременного воздействия на все три звена иммунной системы (T-, B- и M-).

Новая композиция нетоксична, не вызывает аллергических реакций.

Источники информации 1. Л.Н. Лазарева и др.: "Стимуляторы иммунитета". Москва, Медицина, 1985 г.

2. А. Т. Иванова и др. "Иммунотерапия онкологических больных "Москва, "Печатное дело" 1995 г.

3. V. Ya. Arion: " Thymic peptides as immunoregulators " Published by Harwood Academic Publishers, UK, New York, London, Melbourne.

4. SU 1419706, опуб. 30.08.88 г.

5. SU 1482694, опуб. 30.05.89 г.

6. SU 1629063, опуб. 23.02.91 г.

7. "Популярная медицинская энциклопедия, Москва, изд. "Советская энциклопедия, 1990, стр. 856.

8. В.Я. Арион "Tактивин и его биологическая активность". Иммунобиология гормонов тимуса. Киев "Здоровья", 1989, глава 7, с. 103-125.

9. В. Я. Арион и др. "Способ получения полипетидов из тимуса крупного рогатого скота". Изобретение SU 1600047 А 1.

10. В.М. Земсков и др. "Иммуномодуляторы в терапии легочной патологии". Москва, 1995 г.

11. Пат. US 5063209 (HES Rereareh, Inc.), опубл. 05.11.91.

Формула изобретения

1. Биопрепарат для устранения и профилактики вторичного иммунодефицита, содержащий "Тактивин", отличающийся тем, что он дополнительно содержит натриевую соль низкополимерной рибонуклеиновой кислоты (NaPHK) при следующем соотношении компонентов, вес.ч.: Тактивин - 1 NaPHK - 20 - 40 2. Биопрепарат по п.1, отличающийся тем, что содержит NaРНК, выделенной из тимуса телят, пекарских дрожжей или низших грибков.

3. Способ получения биопрепарата по пп.1 и 2, включающий смешивание компонентов, отличающийся тем, что смешивание проверяют в твердой фазе при комнатной температуре, при этом на 1 вес.ч. "Тактивина" берут 20-40 вес.ч. NaРНК, смесь растворяют в апирогенном физиологическом растворе, стерилизуют, ампулируют или флаконируют.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3