Антигенная композиция для индуцирования ответа цитотоксических т-лимфоцитов, способ индуцирования и способ лечения болезни

Антигенная композиция для индуцирования ответа цитотоксических т-лимфоцитов, способ индуцирования и способ лечения болезни

Реферат

 

Изобретение относится к медицинской иммунологии. Сущность изобретения состоит в создании антегенной композиции, содержащей антиген, стабилизирующий детергент и дополнительные компоненты. Композиция обладает способностью при введении в организм индуцировать цитотоксический эффект Т-лимфоцитов. Описан также способ индуцирования такого ответа. Изобретение содержит также способы лечения инфекций вирусной и невирусной природы. Технический результат изобретения заключается в расширении арсенала средств и методов борьбы с инфекцией различного происхождения. 3 с. и 35 з.п.ф-лы, 5 табл., 9 ил.

Эта заявка является частичным продолжением заявки США, серийный номер 07/735069, поданной 25 июля 1991 г., озаглавленной "Индукция ответов цитотоксических Т-лимфоцитов", Syamal Raychaudhuri и William H. Rastetter. Это изобретение относится к методам и композициям, пригодным для индукцирования опосредованных цитотоксическими Т-лимфоцитами, ответов у людей и у домашних или сельскохозяйственных животных.

Цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), как считают, являются главным механизмом защиты хозяина при ответе на ряд вирусных инфекций и опухолевый или раковый рост. Эти клетки удаляют инфицированные или трансформированные клетки путем распознавания антигенных фрагментов в соединении с различными молекулами (названных МНС молекулами класса 1) на инфицированных или трансформированных клетках. ЦТЛ могут индуцироваться экспериментально путем цитоплазматической нагрузки определенными растворимыми антигенами в специфических клетках. Иммунизация одним растворимым антигеном обычно недостаточна для специфической индукции цитотоксических Т-лимфоцитов.

Один из методов, при помощи которого может индуцироваться ответ ЦТЛ, включает применение методик рекомбинантной инженерии для внедрения определяющих компонентов рассматриваемого антигена в геном слабого инфекционного агента. Целью такой стратегии является создание антиген-специфических ответов цитотоксических Т-лимфоцитов на желаемый эпитоп, путем вызова у хозяина легкой, самоограничивающей инфекции. Химерные векторы были описаны при использовании вирусов коровьей оспы, полно-, адено- и ретровирусов, так же, как и бактерий, таких как Listeria и БЦЖ. Например, Takahashi et al., 85 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1988, описывает рекокмбинантый вакцинный вирус, экспрессирующий оболочечный ген HIV др. 160, в качестве потенциального средства для индукции цитотоксических Т-лимфоцитов.

Второй метод, с помощью которого может индуцироваться клеточно опосредованный ответ, включает использование адъювантов. Поскольку эта область, как видно, изобилует спорами по применению адъювантов, неясно индуцировался ли клеточно опосредованный иммунитет при таком способе, и включал ли такой клеточно опосредованный иммунитет ответ цитотоксических Т-лимфоцитов. Следующие, однако, являются характерными публикациями в этой области знаний.

Stover et al., 351 Nature 456, 1991 (не признан прототипом по отношению к настоящей заявке) описывает ответ ЦТЛ на батагалактозидазу при использовании рекомбинантной БЦЖ, содержащей ген бетагалактозидазы. Никакого подобного ответа не обнаружено при использовании неполного адъюванта Фрейнда и бета-галактозидазы.

Mitchell et al. , 8 J. Clinical Oncology 856, 1990 (который не признан прототипом для настоящего изобретения) описывает лечение больных с метастатической меланомой адъювантом, названным "ДЕТОКС" и лизатами аллогенной меланомы, вводимыми пять раз за шестинедельный период. У небольшой части больных наблюдалось увеличение числа цитологических Т-клеток. Авторы описывают необходимость повышения уровня продукции цитотоксических Т-лимфоцитов и предлагают комбинированную терапию адъювантом с интерлейкином-2 также, как и предварительное лечение циклофосфамидом, чтобы снизить уровень специфических для опухоли Т-супрессорных клеток, которые могут присутствовать. ДЕТОКС включает детоксифицированный эндотоксин (монофосфорильный липид A) из Salmonella minnesota каркасы клеточных стенок Mycobactirium phlei скваленовое масло и эмульгатор.

Allison и Gregoriadis, 11 Immunlogy Today 427, 1990 (который не признан прототипом для настоящего изобретения) отмечает, что единственным адъювантом "разрешенным для применения" в человеческих вакцинах являются соли алюминия (алюм), которые не вызывают стойкого клеточно опосредованного иммунитета.

Allison и Gregoriadis утверждают, что "существует потребность в разработке адъювантов с эффективностью полного адъюванта Фрейнда, но без его различных побочных эффектов, таких, как гранулемы". Они далее утверждают, что существует три возможных стратегии, например, использование липосом; использование адъювантов, называемых имуностимлуирующими комплексами (ISCOM, которые включают сапонин или Quil A (тритерпеноид с двумя углеводными цепями), холестерол и фосфатидилхолин), которые разрешены для использования в противогриппозной вакцине для лошадей (Morein et al., Immunological Adjuvants and Vaccines, Plenum Press, 153); и использование эмульсии (SAF) сквалена или скважина (с или без плюрониевого агента) и мурамил-дипептида (MDP), SAF, как сказано, вызывает клеточно опосредованный иммунитет у мышей, хотя "долго считали, что субъеденичные антигены не могут вызвать ответов цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ); Takahashi et al., 344 Nature 873, 1990, описывают индукцию ограниченных классом II хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов путем использования ISOM при единственной подкожной иммунизации у мышей. Они сообщают, что адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда и физиологический раствор с фосфатным буфером не индуцируют активность цитотоксических Т-лимфоцитов против мишеней, в которых они заинтересованы. Они заявляют, что в противоположность результатам, полученным с другими формами экзогенных растворимых белковых антигенов, они показали, что возможно примировать антиген-специфические МНС классом 1 ограниченные, C 8⁺ 4^- ЦТЛ путем имунизации экзогенным интактным белком при использовании ISCOM. Они также сообщают, что описанные эксперименты наводят на мысль, сто возможно вызвать продукцию человеческих ЦТЛ путем использования белков HIV, содержащих ISCOM, и что вакцины на основе ISCOM могут достичь давно желанной цели индукции как ЦТЛ, так и антител с помощью очищенного белка.

Byars и Allison, 5 Vaccines 223, 1987 описывают использование SAF-1, который включает ТВИН 80, PLURONIC L12 и скален или сквален с мурамил-дипептидом или без него, и предполагают, что их данные показывают, что рецептура с мурамил-дипептидом будет пригодна для ветеринарных вакцин и вакцин для людей. Вторичные инъекции адъюванта давали без мурамил-дипептида. Мурамил-дипептид, как сказано, значительно увеличивает продукцию антител по сравнению с использованием одъюванта без мурамил-дипептида. Клеточно опосредованный иммунитет определялся как гиперчувствительность замедленного типа путем кожных проб, чтобы определить индукцию Т-хелперных клеток. Такая гиперчувствительновсть была сильнее и более длительна, когда адъювант снабжался мурамил-дипептидом. Аналогичные адъюванты описаны Allison et al., патент США 4770874 (где сообщается, что комбинация мурамил-дипептида и плюрониевого полиола необходима, чтобы вызвать сильный клеточно опосредованный или гуморальный ответ на яичный альбумин); Allison и др., патент США 4772466; Murphy - Cord и др., 246 Science 1293, 1989 (где сообщается, что использование комбинированных адъювантов с мурамил-дипептидом могло усиливать индукцию как гуморальной, так и клеточной ветвей иммунного ответа); Allison and Byars, 87 Vaccines 56, 1987 (где заявляется, что клеточно опосредованный иммунитет вызывается SAF (с мурамил-дипептидом), как показано по гиперчувствильности замедленного типа, пролиферативным ответам Т-клеток на антиген, по продукции интерлейкина-2 и по специфическому генетически ограниченному лизису мишеневых клеток, несущих иммунизирующий антиген); Allison and Byars, Immunophamacology of Infectious Diseases; Vaccine Adjuvants and Modulators of Non-Specific Resistance 191 - 201, 1987; Morgan et al., 29, J. Medical Virology 74, 1989; Kenney et al., 121 J. Immunological Methods 157, 1989; Allison and Byars, 95 J. Immunological Methods 157, 1986 (где показано, что соли алюминия и эмульсии минерального масла увеличивают образование антител, но не усиливает клеточно опосредованный иммунитет; и рецептуры с мурамил-дипептидом, как показано, вызывают клеточно опосредованный иммунитет); Byars et al. , 8 Vaccine 49, 1990 (не признано прототипом для настоящей заявки), где заявляется, что их рецептура адъюванта заметно увеличивает гуморальные ответы и, в меньшей степени, усиливает клеточно опосредованные ответы на гемаглютинин гриппа); Allison and Byars, 28 Molecular Immunology 279, 1991 (не признана прототипом для настоящей заявки; которая сообщает, что функция мурамил-дипептида состоит в индукции экспрессии цитокинов и усилении экспрессии основных генов гистосовместимости (МНС); и что получены лучшие антительyые и клеточные ответы, чем с другими адъювантами, и что предполагают установить эффективна ли подобная стратегия у людей); Allison and Byars, Technology Advances in Vaccine Development 401, 1988 (которая описывает клеточно опосредованный иммунитет при использовании SAF); Epstein et al., 4 Advance Drug Delivery Reviews 223, 1990 (которая представляет обзор по различным адъювантам, использованным при получении вакцин); Alison and Byars, 95 J. Immolological Methods 157, 1986 (которая устанавливает, что добавление мурамил-дипептида к адъюванту заметно усиливает клеточно опосредованные ответы на ряд антигенов, включая моноклональные иммуноглобулины и вирусные антигены); и Morgan et al., 29 J. Medical Virology 74, 1980 (которая описывает использование SAF-1 для приготовления вакцины из вирусов Эпштейна-Барра).

Kwak et al., Idiotipe Networks in Biology and Medicine, Elsevier Science Publishers, p. 163, 1990 (не признана прототипом настоящей заявки) описывает использование SAF без мурамил-дипептида в качестве адъюванта для идиотипа B-клеточной лимфомы у людей. В частности, эмульсия плюрониевого L 121, скалана и 0.4% ТВИН-80 в физиологическом растворе с фосфатным буфером вводилась вместе с идиотипом. Они сообщают, что "добавление адъюванта должно, к тому же, усиливать гуморальные ответы и может также облегчить индукцию клеточных ответов.

Другие иммунологические препараты включают липосомы (Allison et al., патенты США 4053585 и 4117113); циклические пептиды (Dreesman et al., патент США 4778784); полный адъювант Фрейнда (Asherson et al., 22 Immunology 465, 1972; Berman et al., 2 International J. Canser 539, 1967; Allicon. 18 Immunopotentiation 73, 1973; и Allison, Non-Specific Factors Influencing Host Resistance 247, 1973); ISCOM (Letvin et al., 87 Vaccines 209, 1987); адъюванты, содержащие неионные блокирующие полимерные агенты, соединенные с минеральным маслом, поверхностно активным агентом и ТВИН-80 (Hunter and Bennett, 133 J. Immunology 3167, 1984; и Hunter etl al., 127 J. Immunology 1244, 1981); адъюванты, составленные из минерального масла и эмульгирующего средства с убитыми микобактериями или без них (Sancher - Percador et al., 141 J. Immunology 1720, 1988); и другие адъювант, такие как липофильное производное мурамил-трипептида и мурамил-дипептид, ковалентно связанный с рекомбинантным белком (id).

Кратное изложение изобретения Заявитель открыл безопасный и обладающий рядом преимуществ способ и композиции, с помощью которых ответы ЦТЛ могут индуцироваться у людей и домашних или сельскохозяйственных животных. Способ включает использование антигенной рецептуры, которая обладает слабой токсичностью для животных или вообще ее не имеет, и в которой отсутствует иммуностимулирующий пептид (например, мурамил-дипептид), присутствие которого снижало бы желаемый клеточный ответ. Кроме того, методология проста для использования и не требует объемной работы, для изменения существующих клеток при помощи методик рекомбинантной ДНК, чтобы сделать их иммуногенными. Это открытие удивительно, так как не ожидалось, что подобные ответ ЦТЛ мог бы вызываться при применении такой антигенной рецептуры с отсутствием иммуностимулирующих пептидов или их эквивалента. Данные, полученные заявителем, дают возможность использования таких антигенных рецептур при широком спектре болезненных состояний или в качестве профилактических средств. Например, введение таких антигенных рецептур может использоваться при лечении вирусных заболеваний, при которых важен ответ ЦТЛ, например при лечении HIV инфекции или группа; оно может быть также расширено, чтобы использоваться при лечении бактериальных инфекций, рака, паразитарных инфекций и тому подобного. В качестве профилактического средства антигенная рецептура с подходящим антигеном применена для предупреждения инфекции, вызываемой вирусами, ответственными за вышеупомянутые вирусные заболевания, особенно для профилактики HIV инфекции, а также для профилактики у больных с риском рака, например, после резекции первичной опухоли.

Таким образом, в первом аспекте, изобретение показывает способ индуцирования ответа ЦТЛ у людей или домашних (например, кошки или собаки) или важных для сельского хозяйства животных (например, лошади, коровы или свиньи) на антигены, кроме антигена B-клеточной лимфомы или яичного альбумина. Способ включает стадии получения антигена, по отношению к которому желателен ответ ЦТЛ и получение нетоксичной антигенной рецептуры (формы), которая включает, состоит или по существу состоит из стабилизирующего детергента, образующего мицеллы средства и биодеградируемого и биосовместного масла. В этой антигенной рецептуре предпочтительно отсутствует какой-либо иммуностимулирующий пептидный компонент или имеются достаточно низкие уровни такого компонента, которые не снижают желаемый клеточный ответ. Эта рецептура предпочтительно представляют собой стабильную эмульсию масло-в-воде. То есть каждый из различных компонентов выбирается так, чтобы эмульсия оставалась в эмульгированном состоянии в течение периода по крайней мере одного месяца и, предпочтительно, в течение более чем одного года без разделения фаз. При этом способе антиген и антигенная рецептура смешиваются вместе для образования смеси (предпочтительно путем микропсевдоожижения), и эта смесь вводится животному в количестве достаточном, чтобы индуцировать ответ ЦТЛ в животного. Необходимо лишь одно такое введение.

Под "стабилизирующим детергентом" подразумевается детергент, который позволяет компонентам эмульсии сохраняться в виде стабильной эмульсии. Такие детергенты включают полисорбат, 80 (ТВИН) (сорбитан-моно-9-октадеценоат-поли-(окси-1,2-этандиил); производимый ICI Americas, Wilmington, DE), ТВИН 40, ТВИН 20, ТВИН 60, Zwittergent 3-12, TEEPOL HB7, и SPAN 85. Эти детергенты даются обычно в количестве примерно 0.05 до 0.5%, предпочтительно, в количестве примерно 0.2%.

Под "образующим мицеллы веществом" подразумевается вещество, способное стабилизировать эмульсию, образованную с другими компонентами, так что образуется мицеллоподобная структура. Такие средства предпочтительно вызывают некоторое раздражение в месте инъекции, чтобы побудить макрофаги вызвать клеточный ответ. Примеры таких средств включают полимерные сурфактанты, описанные в BASF Wyandotte publications, например, Schmolka, 54 J. Am. Oil. Chem. Soc. 110, 1977, и Hanter et al., 129 J. Immunol 1244, 1981, обе включены здесь в виде ссылки, PLURONIC L 62 LF, L 101, и L 64, L 121, PEG 1000, и TETRONIC 1501, 150R1, 701, 901, 1301, и 130R1. Химические структуры таких агентов хорошо известны в данной области. Предпочтительно агент выбирается так, чтобы иметь гидрофильоно-липофильное соотношение (HLB) между 0 и 2, как определено у Hunter И Bennet, 133 Journal of Immunology 3167, 1984. Вещество предпочтительно дается в количестве между 0.001 и 10%, наиболее предпочтительно в количестве между 0.001 и 5%.

Масло выбирается так, чтобы способствовать сохранению антигена в эмульсии масло-в-воде, то есть обеспечивать носитель для желаемого антигена, и предпочтительно, имеет температуру плавления меньше, чем 65^oC, такую, что эмульсия образуется или при комнатной температуре (примерно от 20 до 25^oC), или как только температура эмульсии снижается до комнатной температуры. Примеры таких масел включают сквален, сквалан, EICOSANE, тетратетраконтан, глицерол и арахисовое масло или другие растительные масла. Масло предпочтительно дается в количестве между 1 и 10%, наиболее предпочтительно между 2.5 и 5%. Важно, чтобы масло было биодеградируемым и биосовместимым так, чтобы организм мог разрушить масло через некоторое время и так, чтобы не появлялось никаких побочных эффектов, таких, как гранулемы, при использовании масла.

Важно, чтобы в вышеупомянутой рецептуре пептидный компонент, в частности, мурамил-дипептид (MDP) отсутствовал. Такой пептид будет влиять на индукцию ответа ЦТЛ, если он дается в количестве больше, чем примерно 20 микрограмм на нормальную человеческую дозу введения препарата. Предпочтительно, чтобы такие пептиды полностью отсутствовали в антигенном препарате, несмотря на явную стимуляцию ими гуморального отдела иммунной системы. То есть заявитель обнаружил, что, хотя такие пептиды могут усиливать гуморальный ответ, они неблагоприятны, когда желателен ответ цитотоксических Т-лимфоцитов.

В других связанных аспектах, антигенная рецептура (препарат) создается из только двух из вышеназванных трех компонентов и используется с любым желаемым антигеном (термин, который включает белки, полипептиды и их фрагменты, которые являются иммуногенными), за исключением яичного альбумина (или других альбуминов, например, HSA, BSA и овальбумин), чтобы индуцировать ответ ЦТЛ у вышеназванных животных или людей.

Заявитель полагает, что вышеприведенные препараты обладают значительными преимуществами над предшествующими препаратами (включая ISCOMS, DETOX и SAF) для применения у людей. В отличие от таких препаратов, настоящий препарат включает образующее мицеллы вещество и, в то же время, не имеет в составе пептидов, остовов клеточных стенок или компонентов бактериальных клеток. Настоящий препарат также индуцирует ответ ЦТЛ, который или не наблюдался при применении предшествующих препаратов, или значительно выше по сравнению с этими препаратами.

Под "нетоксичный" подразумевается, что наблюдается небольшое побочное действие или его отсутствие у лечившегося животного или человека. Специалисты в области медицины или ветеринарии поймут, что этот термин имеет широкое значение. Например, по существу здорового животного или человека может допускаться только легкая токсичность, тогда как у человека, страдающего заболеванием в терминальной стадии (с предполагаемой продолжительностью жизни меньше, чем, примерно, три года) может допускаться существенно большая токсичность.

В предпочтительных примерах осуществления антигенный препарат состоит по существу из двух из трех этих детергента, вещества и масла; способ состоит по существу в единственном введении смеси (антиген плюс антигенная рецептура) человеку или животному; человек или животное инфицированы вирусом и испытывают один или более симптомов (которые в основном определяются врачами - специалистами в соответствующей области) инфекции, вызванной вирусом; и антигенный препарат является нетоксичным для людей и животных.

В других предпочтительных примерах осуществления антиген выбирается из HIV антигенов: gp 160, gag, pol, Nef, Tat и Rev; малярных антигенов; белка CS и спорозонтного поверхностного белка 2; поверхностных антигенов гепатита B: Pre - S1, Pre - S2, HBc Ag, и HBc Ag; антигенов вируса гриппа: HA, NP и NA; поверхностных антигенов гепатита A; антигенов вируса герпеса: EBV gp 340, EBV gp 85, HSV gB, HSV gD, HSV gH, раннего белкового продукта HSV, цитомегаловирусного gB, цитомегаловирусного gH и IE белка gP72; антигенов респираторно-синцитиального вируса: белка F, белка G и белка N; и опухолевых антигенов CEA карциномы, карциномного муцина, P21 карциномы, P53 карциномы, MPG меланомы, p97 меланомы и онкогенного продукта Neu карциномы, продукта гена p53 карциномы, антигена меланомы, называемого MAGE, и мутированного белка p21 ras, присутствующего в ряде злокачественных опухолей.

В смежном аспекте изобретение описывает композицию, включающую, состоящую или, по существу, состоящую из антигена, смешанного с антигенной рецептурой, описанной выше, и антиген выбирается из этих антигенных частей, перечисленных выше.

В других смежных аспектах изобретение описывает способы лечения больного, инфицированного вирусом HIV, страдающих малярией, гриппом, гепатитом, больных раком, инфицированных вирусом герпеса, инфицированных респираторным синцитиальным вирусом, путем введения композиции, включающей соответствующий антиген (например, выбранный из перечисленных выше), смешанный с одной из вышеназванных антигенных рецептур.

Другие характерные черты и преимущества изобретения будут очевидны из последующего описания предпочтительных его воплощений и из формулы изобретения.

Описание предпочтительных примеров осуществления Фиг. 1A и 1C являются графическим представлением данных сравнения индукции ЦТЛ различными овальбуминовыми препаратами; E : T представляет отношение клеток эффекторов к клеткам-мишеням на всех фигурах.

Фиг. 2A и 2B являются графическим представлением данных сравнения индукции ЦТЛ различными -алактозидазными препаратами.

Фиг. 3 являются графическим представлением данных сравнения индукции ЦТЛ овальбумином в липосомах и в антигенном препарате.

Фиг. 4 и 5 являются графическим представлением данных, показывающих действие CD4 и CD8 клеточного истощения на индукцию ЦТЛ.

Фиг. 6 являются графическим представлением данных, показывающих индукцию ЦТЛ смесью плюронцевого агента и ТВИН и антигена.

Фиг. 7 являются графическим представлением данных, показывающих индукцию ЦТЛ смесью сквалана и ТВИН и антигена.

Фиг. 8 являются графическим представлением данных, показывающих индукцию ЦТЛ смесью скавалана и плюрониевого агента и антигена.

Фиг. 9 являются графическим представлением индукции анти- gp 120111b антител у обезьян при помощи различных антигенных рецептур; и Фиг. 10A - 10B являются графическим представлением данных сравнения gp 120-специфического ответа ЦТЛ у обезьян, иммунизированных вирусом коровьей оспы - gp 120 и gp 120-AF.

Антигенная рецептура Антигенные рецептуры, применяемые в этом изобретении, в основном описаны выше. Специалисты в этой области поймут, что легко приготовить эквивалентные рецептуры и можно ожидать, то они будут иметь эквивалентные свойства в индукции ответа ЦТЛ. Такие рецептуры легко испытываются на их свойства с использованием методик, эквивалентных описанным в примерах ниже.

Далее следуют примеры изобретения с использованием антигенной рецептуры (AF), составленной из примерно 15% сквалана (0.6 ТВИН 80) и (0.0045 - 3.75% плюрониевого) в фосфатно-буферном физрастворе (Imed STP). В частности, эмульсия AF включала: 150 мг сквалана, 0.045 - 37.5 мг полоксамера 401 (PLURONIC L 121), 6 мг полисорбата 80 (TWEEN 80), 0.184 мг хлорида калия, 0.552 мг моноосновного фосфата калия, 7.36 мг хлорида натрия, 3.3 мг диосновного фосфата натрия (безводного) на 1 мл воды, pH 7.4. Эта эмульсия микропсевдоожижалась с использованием стандартной методики (Microfluidies Model M110F) в модуле обратного давления при 11 - 14000 psi (фунтов на квадратный дюйм) с постепенным возвратом к атмосферному давлению, с охлаждением и сохранением в тающем льду.

В других примерах антиген смешивался с мкропсевдоожиженной смесью сквалана (S), плюрониевого (P) и ТВИНа 80 (Т), чтобы достичь конечной концентрации в 5% сквалана, 0.2% ТВИН 80 и 0.0015 - 1.25% плюрониевого, соответственно. Чтобы определить суб-компоненты, необходимые для индукции специфического иммунного ответа, сквален-ТВИН 80, плюрониевый-ТВИН 80 или сквалан-плюрониевый готовили в тех же самых концентрациях, что и для трехкомпонентной смеси. Плюрониевый, сквалан или ТВИН 80 готовили также отдельно, чтобы определить действие отдельного компонента на индукцию ЦТЛ. Производились также замещения ТВИН 20, ТВИН 40 или Zwittergent вместо ТВИНИ 80, чтобы определить действие различных производных ТВИН на индукцию ЦТЛ в ova системе. Замены Сквалана на Eicosone или Triacontone в трехкомпонентной рецептуре и замены вместо плюрониевого сополимера на PEG 1000, Pleuronic L 62 LF и Tetronocs 1501 и 150 RL также производились в той же самой трехкомпонентной рецептуре. В качестве двухкомпонентных рецептур, смешивали различные аналоги в разных сочетаниях и испытывали на ova специфическую индукцию ЦТЛ. Ими были смесь холестерола - ТВИН 80, Сквален - ТВИН 20, Pristane - ТВИН 80 или оливковое масло - ТВИН 80. Для изучения стабилизации смесь Сквалана - ТВИН 80 после микропсевдоожижения смешивали с декстрозой до конечной концентрации в 5%. Во всех случаях комбинации наполнителей смешивали в приборе для микропсевдоожижения для получения стабильной эмульсии. В некоторых экспериментах двухкомпонентные рецептуры смешивали с разными концентрациями MDP для индукции гуморального ответа и ответа ЦТЛ. Таблица 1 представляет полный список различных рецептур, использованных при этом исследовании (см. в конце описания).

В качестве контроля адъюванта использовалась синтексная рецептура адъюванта (микропсевдооожиженная; SAFm) и состояла из двух частей. Часть I состоит из фосфатно-буферного физраствора, содержащего конечную концентрацию сквалана в 5%, 1.25% плюрониевого и 0.2% ТВИН 80 (носителя или 1-SAF). Часть II состоит из N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглютамина (Thr - MDP), производного компонента клеточной стенки микобактерий. Для целей иммунизации антиген смешивают с микропсевдоожиженным носителем (часть I), чтобы получить гомогенную эмульсию. MDP добавляется, чтобы приготовить SAFm и недолго интенсивно перемешивается. Концентрацию MDP в смеси изменяли, чтобы определить существует ли оптимум концентрации для индукции ЦТЛ. В качестве контроля для адъюванта мышей иммунизировали растворимыми антигенами, смешанными с алюминиевыми солями в соответствии с руководством производителя (Pierce Chemical, Rockford, IL) или с полным адъювантом Фрейнда (CFA).

Антигенная рецептура STP используется для индукции ответов цитотоксических лейкоцитов у мышей. Специалистам будет ясно, что такая мышиная модель является показателем того, что в эквивалентных экспериментах или при лечении будут подобным же образом вызываться ответы цитотоксических Т-лимфоцитов у людей, домашних животных и сельскохозяйственных животных. Количество антигенной рецептуры и антигена, пригодное для того, чтобы вызвать желаемый клеточный ответ, может быть определено эмпирически стандартными методами, хорошо известными специалистам в этой области, без ненужного экспериментирования. Таким образом, если желательно минимизировать побочные эффекты лечения такой смесью, специалисты могут определить минимальный уровень такой смеси, необходимый для введения человеку, домашнему или сельскохозяйственному животному, чтобы вызвать ответ ЦТЛ и тем самым вызвать иммунитет к желаемому антигену. При нормальном использовании такая смесь будет вводиться с помощью любой из ряда стандартных процедур, но особенно предпочтительна внутримышечная инъекция в месте, которое позволит эмульсии оставаться в стабильной форме в течение периода в несколько дней или несколько недель.

Следующие материалы и методы использовались в примерах, представленных ниже, если нет других указаний: Мыши Мыши-самки C57BL/6 (H-2^b) и BALB/c (H-2) были куплены в Harlen Sprague (Can Diego, California).

Антигены Овальбумин (ova, сорт Vii; Sigma Chimical Co., St. Louis, MO) использовался в нативной форме. -галактозидаза ( -gal, сорт VIII; BRL) использовалась в нативной форме и после кипячения в 1 М NaOH в течение 2 мин, чтобы получить щелочной перевар. Рекомбинантный gp120 был куплен у American Biotechnology.

Опухолевые клетки и трансфектанты Использовали опухолевые клетки 1a линий EL4 (C57BL/6, H-2^b тимома) и P815 (DBA/2, H-2^d мастоцитома). Получение ovа-продуцирующего трансфектанта EL4, EG7-ova, описано ранее Moore et al, 54 CeJJ 777, 1988. Трансфектант, продуцирующий -gel, P13.1, был получен путем электропорации 10⁷ P815 клеток в 1 мл фосфатно-буферного физраствора (PBS) с 10 мг Pst I нормализованном pCH110 (Pharmacia LKB Biotechnology Inc. , Pisсataway., NJ) и 1 мг Pvu I нормализованном pSV 2 neo (Southern et al., 1 J. Mol. Appl. Genet 327, 1982) с последующей селекцией в среде с 400 мкг/мл антибиотика G418. Трансфетакт C3-4 получали из BALB/c гибридомы Igm 662 путем трансфекции плазмидой, кодирующей ген -gal лигированные с третьим и четвертым экзоном тяжелой цепи Igm (Rammensee et al. , 30 Immunogenetics 296, 1989). Экспрессирующие p160111b фибробласты 3Т3, 15 - 12 были предоставлены доктором Germain из NIH (Bethesda, MD). K^b трансфицированная линия L-клеток была предоставлена доктором Carbone, Monash University, Australia. D^b и L^d трансфицированные линии L-клеток были предоставлены доктором Ted Hensen, Washington University, St. Louis.

Иммунизация Мышей иммунизировали внутривенно 200 мкл суспензии 25 10⁶ спленоцитов после цитоплазматической нагрузки, как описано Moore et al., выше, и Carbone et al, J. Exp. Med. 169:603, 1989). Для иммунизации ova-антигенной рецептурой или -gal-антигенной рецептурой, 30 мкг каждого белкового антигена на мышь вводилось в подушечку лапы и основание хвоста, подкожно. Каждая инъекция содержала 67 мкл микропседоожиженной антигенной рецептуры (изготовленной по стандартным процедурам) и 30 мкг белкового антигена в конечном объеме 200 мкл. До конечного объема доводили с помощью HBSS, смотрите Whittaker manual (Welkersville, MD). MDP давали в концентрациях между 0 и 300 мкг. Где указано, мышей иммунизировали растворимыми антигенами в CFA или в алюм в общем объеме 200 мкл.

Стимуляция in vitro популяций эффекторов Клетки селезенки (30 10⁶) от нормальных или иммунизированных мышей, которые были примированы по крайней мере 14 дней ранее, инкубировали с 1.5 10⁶ EG7-ova (облученных 20 000 рад) для получения ответов на ova, или с 1.5 10⁶ клеток С3-4 (облученных 20 000 рад) для получения ответа на -gal в 24 ячеистых платах при 37^oC в атмосфере с 7% CO₂ воздухе. Все культуры тканей получали в полной среде, состоящей из среды IMDM, смотрите Whittaker Manual (Welkersville, MD), дополненной 10% плодной телячьей сыворотки (FCS), 2 мМ глютамина, гентамицинов и 2 10^-5 М 2-меркаптоэтанола. Для экспериментов истощения in vitro примированные in vivo или стимулированные in vitro клетки селезенки обрабатывали моноклональными антителами (mAbs) RL. 172 (анти-CD 4) или mAbs 3.168 (анти-CD8) для удаления CD4⁺ или CD8⁺T-клеток (Sarmiento et al., 125 J. Immunol. 2665, 1980, и Ceredig et al., 314 Nature 98, 1985). mAb RL, 172 и mAb 3.168 были получены от Dr. Jonathan Sprent из Scripps Clinic and Research Foundation. La Jolla, CA.

Клетки селезенки (230 10⁶) от нормальных и иммунизированных мышей были примированы по крайней мере за 21 день ранее и инкубировались с 1.5 10⁶ клеток 15 - 12 (обработанных 200 мкг митомицина C в течение 45 минут на 10⁸ клеток) или с 500 мкг пептида 18111b, содержащего доминантный эпитоп ЦТЛ Balb/c мышей в полной среде IMDM (Irvine Scientific, Santa Ana, CA), содержащей 10% заранее отобранной FCS (ICN Flow; ICN Biochemicals, Inc., Costa Mesa, CA), 2 мМ глютамина, гентамицин и 2 10^-5 М 2-меркаптоэтанола. Для стимуляции пептидами in vitro клетки селезенки культивировали в полной IMDM, содержащей 5% ConA супернатанта.

Для экспериментов истощения примированные in vivo или стимулированные in vitro клетки селезенки обрабатывали mAbs RL.172 (анти-CD4) или mAbs 3.168 (анти-CD8) в присутствии низкотоксичного кроличьего комплемента (Cederlane Laboratories, Ltd. , Hornby Ontario, Canada) для удаления CD4⁺ или CD8⁺ T-клеток (22, 23). mAb RL. 172 и mAb 3.168 были даром от Dr. Jonatham Sprent из Scripps Clinic and Research Founsation, La Jolla, CA.

Исследование цитотоксичности Клетки-мишени (1 10⁶) метили 10 мк Ci (⁵¹Cr) хромата натрия в течение 60 минут. Для получения пептидных импульсных мишений 50 мкл раствора пептида 1 мг/мл в HBSS добавляли во время мечения мишений ⁵¹Cr. После отмывания, 10⁴ меченных мишеней и серийные разведения эффекторных клеток инкубировали в 200 мкл RP10 в течение 4 часов при 37^oC. 100 мкл супернатанта собирали и определяли специфический лизис как: процент специфического лизиса = 100 ((выделение при действии ЦТЛ - спонтанное выделение) / (максимальное выделение - спонтанное выделение)). Спонтанное выделение в отсутствие цитотоксических T-лимфоцитов (ЦТЛ) было < 25% максимального выделения с помощью детергента во всех экспериментах.

Определение антительных ответов у мышей и обезьян Каждую ячейку 96-ячеечных плат с U-образным дном (Costar, Cambridge, MA) покрывали 150 нг ova или gp 120 в 50 мкл HBSS и инкубировали в течение ночи при 4^oC. Для определения анти-gp120 и анти-ova антительных ответов у мышей платы блокировали 1% BSA в течение 1 час. Добавляли серийно разведенную сыворотку в объеме 25 мкл на ячеку и инкубировали в течение 2 часов. Платы отмывали и добавляли 50 мкл на ячейку разведения 1:1000 козьего противомышеного IgG, конъюгированного с HRPO (Alabama), в 1% BSA. После 1 часа инкубации платы отмывали и добавляли 100 мкл субстрата на ячейку. Через 10 - 15 минут определялась OD₄₀₅ (оптическая плотность при 405 нм). Для определения анти-gp120 антительного ответа у обезьян все стадии были такими же, за исключением того, что как блокирование плат, так и разведение сыворотки выполнялись с 5% нормальной козьей сывороткой в сбалансированном солевом растворе Хэнкса.

Пептидный синтез Синтетические пептиды, соответствующие аминокислотным последовательностям 253-276 (Перечисление последовательностей No. 1: EQLESIINFEKLTEWTSSNVMEER; где используется стандартный однобуквенный код для представления каждой аминокислоты) овальбумина (ova 253 - 276), аминокислотных последовательностей 84 - 102 основного белка миелина (МВР 84 - 102) (Перечисление последовательностей No. 2: DENPVVHFFKNIVTPRTPP), и синтетические пептиды, соответствующие аминокислотным последовательностям 308 - 322 (18111b последовательность) gp120111b собирали путем твердофазного пептидного синтеза с использованием синтезатора Applied Biosystems 430A. Аминокислоты соединялись посредством заранее образованных симметричных ангидридов, за исключением аспарагина, глютамина и аргинина, которые соединялись в виде гидроксибензотриазольных эфиров. Эффективность соединения контролировалась с помощью нингидриновой реакции по методу Kaiser et al. 34 Anal. Biochem. 595, 1970. Пептиды освобождались от носителя с помощью HF, в соответствии с процедурой "низкий-высокий", описанной Tam, et. al., 21 J. Am. Chem. Soc. 6442, 1983, и пептиды экстрагировали из смолы 10% уксусной кислотой. После лиофилизации пептиды обессоливались на Sephadex G-25-колонке, и образцы пептидов затем очищали ВЭЖХ с обращением фазы на Vydac препаративной C-18 колонке. Очищенные пептиды (98%) растворяли в HBSS при колоночной концентрации 10 мг/мл и разводили до желаемой концентрации полной средой.

Расширение CNBr Образцы белка (например, в-галактозидазы) обрабатывали 100-кратным молярным избытком бромида циана в растворе 100 мМ трифторуксусной кислоты. Давали пройти реакции в течение 18 часов при комнатной температуре (примерно 20^oC) с ротацией. После предписанного времени реакции пептидные фрагменты отделяли от реагентов, применяя аппарат SEP-PAR (C-18 (Waters), элюировали 95% ацетонитрилом и лиофилизировали.

Щелочное расщепление Образцы белка (например, -галактозидазы) обрабатывали 1N NaOH и кипятили в течение 2 минут, и полученные в результате пептидные фрагменты отделяли от реагентов, используя аппарат C-18 SEP-PAK (Waters), и элюировали 95% ацетонитрилом и лиофилизировали.

Пример 1 Примирование ограниченных ЦТЛ класса 1 Moore et al. , 113 UCLA Symp. Mol. Cell. Biol. 1989 и Carbone и Bevan, 171 J. Exp. Medicine 377, 1991, показали, что мыши, иммунизированные клетками селезенки, цитоплазматически нагруженными растворимым ova, примировали для ova специфического ответа ЦТЛ, ограниченных классом 1. Экспрессирующий ova трансфектант EL4, EG7-ova, использовался для стимуляции in vitro примированных in vivo селезеночных лимфоцитов и также использовали в качестве мишени для ova специфического, опосредованного ЦТЛ, разрушения клеток. Это исследование также показало, что CD8⁺ эффекторы, индуцированные EG7-ova трансфектантом или клетками селезенки, цитоплазматически нагруженными ova, распознают детерминанту, картированную пептидом ova 258 - 273 в контексте H-2K^b, лизируют EG7-ova и также умерщвляет клетки EL4, покрытые оva 258 - 276. Таким образом, чтобы оценить, может ли индуцироваться растворимым антигеном эндогенный метаболизм ограниченных классом 1 CD8⁺ Т-клеток, использовались вышеописанная система, чтобы определить можно ли использовать определенные антигенные рецептуры, чтобы включить растворимый антиген в ограниченный метаболизм класса 1.

a) ova Мышей C57 BL/6 иммунизировали однократно различными количествами ova (30 мкг - 1 мг на мышь) с антигенной рецептурой или без нее. Мыши получали подкожную инъекцию и в основание хвоста. Клетки селезенки брали от иммуниз