Способ катализа реакции ферментации субстрата, способ улучшения потребления пищевого рациона животным, плазмида pmog413, плазмида pmog429 и плазмида pmog227

Способ катализа реакции ферментации субстрата, способ улучшения потребления пищевого рациона животным, плазмида pmog413, плазмида pmog429 и плазмида pmog227

Реферат

 

Изобретение может быть использовано в генетической инженерии для получения ферментов и в кормопроизводстве. Получают трансгенные растения и их семена добавляют в реагирующую смесь субстрата и фермента. Непосредственная добавка семян преимущественно в размолотом виде существенно снижает затраты на производство фермента за счет увеличения скорости ферментации, упрощения экстракции и очистки продукта. Форма продукта позволяет его использовать для лечения в виде пищевого рациона. Для получения трансгенных растений используют плазмиды. 5 с. и 11 з.п. ф-лы, 13 ил., 4 табл.

Изобретение относится к приготовлению представляющих интерес ферментов в семенах трансгенных растений и применению подготовленных таким образом семян и производственных процессах при отсутствии необходимости экстракции или изоляции фермента.

Ферменты применяются в технологических процессах многих отраслей промышленности. Сюда входят изготовление поверхностно-активных веществ, тканей, молочных продуктов, еды и напитков, кормов, а также другие отрасли промышленности.

В настоящее время ферменты в промышленном масштабе приготавливаются посредством процессов ферментации или изолируются от растительных или животных источников. Ферменты, приготавливаемые с помощью бактерий, включают протеазы, амилазы, пектиназы, фитазы и др. Приготовление ферментов посредством процесса ферментации высокоэффективно, уровни производства могут достигать 10 г на 1 л культуральной среды.

Возможность применения трансгенных растений в качестве ценных белков уже предлагалась ранее. Примерами этого могут послужить приготовление интерферона в табаке (Goodman и др. , 1987), приготовление инкефалинов в табаке, "Brassica napus" и "Arabidopsis thaliana" (Vandekerckhove и др., 1989), приготовление антител в табаке (Hiatt и др., 1990) и приготовление сывороточного альбумина для человека в табаке и картофеле (Sijmons и др., 1990).

На практике, преобразование нарастающего количества видов растений, особенно - видов двудольных растений (например, табака, картофеля, помидоров, "Petunia", "Brassica") стало обычным делом для квалифицированных в данной области специалистов (Klee и др., 1987; Gasser и Fraley, 1989). Стратегии экспрессии инородных генов в растениях разработаны достаточно хорошо (Gasser и Fraley, 1989). Регулярные последовательности их генов растений идентифицировались по их применению в конструкции химерных генов, которые могут быть функционально выражены в растениях и растительных клетках.

Для введения генных структур в растения имеются различные технологии, например - преобразование с новообразованиями агробактерий или с ризогенами агробактерий. С помощью такой стратегии было использовано в рассматриваемых целях обширное множество тканей растений, причем выбор в значительной степени определялся видами растений и их податливостью в культуре клеток ткани. Удачными примерами являются преобразование протопластов, микроспор или пыльцы и таких эксплантатов, как листовые, стеблевые, корневые, гиподольные и дольные. Более того, применяется непосредственное введение ДНК в протопласты и растительные клетки или ткани - микроинжекция, электропорация, бомбардировка частицами и непосредственное поглощение ДНК (Gasser и Fraley, 1989).

Белки можно приготавливать в семенах растений с помощью множества систем экспрессии. К примеру, использование такого составного промотора, как промотор 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV) (Guilley и др., 1982) скажется в накоплении экспрессированного белка в семенах внутри трансгенного растения. И наоборот, можно применять промоторы из генов, кодируя запасные белки семян. Запасные белки семян экспрессируются способом задания весьма специфичных тканей и весьма специфичных стадий процесса (Higgins, 1984; Shotwell и Larkins, 1989), т.е. гены экспрессируются только в семенах и только на стадии развития семян.

Запасной белок семян (рассматривавшийся в работах Higgins, 1984, Shotwel и Larkins, 1989) определяется как любой белок, накапливающийся в значительных количествах (от 90% общего количества белка семян) в развивающихся семенах и гидролизующийся при прорастании, чтобы обеспечить питательную среду на ранних стадиях роста ростков. Белки помещаются во внутриклеточном участке между двумя перегородками, называемом телом белка или вакуолью запасной. Это тело белка содержит ингибиторы протеазы и создает свободную от протеазы окружающую среду. Протеазы, которые разлагают запасные белки семян, становятся активными через (3-6) дней после прорастания (Larkins, 1981).

Были изолированы и характеризованы многие гены в запасных белках семян, а также области их 5'- и 3'- экспозиции (рассмотрены Casey и Domoney, 1987). Примерами глобулинов и альбуминов являются гены глицинина и конглицинина сои культурной (Ficher и Goldberg, 1982; Harada и др., 1989), гены легумина и винилина из гороха (Lycett и др., 1984); Higgins и др., 1988), ген фасоли полевой 11S (Baumlein и др., 1986), ген фазолина 7S из "Phaseolus" (Doyle и др. , 1986), гены круциферина и напина из "Brassica" (Ryan и др., 1989; Scofield и Crough, 1987; Radke и др., 1988), ген гелиантина из подсолнуха (Vonder Haar и др., 1988; Jordano и др., 1989) и гены альбумина 2S и круциферина из "Arabidopsis thaliana" (Vandekerckhove и др., 1989; Pang и др., 1988). Другие примеры можно обнаружить среди генов, кодирующих проламины и глютерины (Casey и Domoney, 1987). Вообще говоря, запасные белки кодируются многогенными семействами.

Гены запасного белка семян передавались семенам табака, петунии и рапса (Okamura и др., 1986; Beachy и др., 1984; Sengupta-Gopalan и др., 1985; Higgins и др. , 1988; Ellis и др., 1988; Barker и др., 1988; Vandekerckhove и др. , 1989; Altenbach и др., 1989). Последовательная восходящая область 5'-бета фазолина из гороха применялась для непосредственной экспрессии бета-глюкуронидазы (Bustos и др., 1989), фитогемаглютинина (Voelker и др., 1989), люциферазы (Riggs и др. , 1989) и зеина (Hoffman и др., 1987) в табаке. Промотор гена альбумина 2S "Arabidopsis thaliana" применили для непосредственной экспрессии модифицированного альбумина 2S тех же самых видов табака, "Brassica napus" и "Arabidopsis thaliana" (Vandekerckhove и др., (1989). Упомянутые выше гены были экспрессированы способом задания весьма специфичных тканей и последовательного проведения, т.е. - в семенах во время развития семян. Во всех рассмотренных работах уровни экспрессии варьировались, но достигнутые уровни соответствовали 1,7% общего содержания белков в семенах (Voelker и др. , 1989). Было обнаружено, что комплементарная ДНК (кДНК) может заменять геномную ДНК, содержащую интроны как базис получения функционирующей и стабильной матричной РНК (мРНК) при гетерологичной экспрессии (Chee и др. , 1986). Эти результаты демонстрируют, что специалист, квалифицированный в области молекулярной биологии тканей, может разработать стратегии создания специфической экспрессии в семенах требуемого гена заданных видов растений, которые поддаются технологии преобразования.

Во время развития семян двудольных растений, значительная часть общего количества синтезированного белка направлена в вакуоли или в белковые тела клеток запасной паренхимы. Чтобы управлять этим процессом, белки, вообще говоря, синтезируются как предшественники. Белки-предшественники снабжаются гидрофобными сигнальными пептидами, обычно - с амино-концами (N-концами), которые дробятся на заданных этапах процесса. Значительное количество сигнальных пептидов запасного белка уже описано (Doyle и др., 1986; Pang и др., 1988; Vonder Haar и др., 1988; Iturriaga и др., 1989; Dorel и др., 1989; Voelker и др., 1989; Hattori и др., 1985; Lycett и др., 1983; Smith и Raikhel, 1989).

Вообще, кажется, что применимость сигнальных пептидов в системах гетерологичной экспрессии (например, Sijmons и др., 1990; Vitale и Bollini, 1986; Slightom и др., 1986; Della-Cioppa и др., 1987) подтверждает идею, что слияние сигнального пептида с гетерологичным "пассажирским белком" может быть применена для переноса и обработки пассажирского белка. Труды различных авторов подтверждают, что множество потенциальных "пассажирских белков" являются кандидатами в такую систему экспрессии.

Тем не менее, несмотря на притягивательность и значимость применения растений как биореакторов, системы рассматриваемого типа не избавлены от трудностей. В описанных выше примерах растение используется как биореактор, а представляющий интерес белок после этого изолируется от материала трансгенного растения, т. е. - от тканей, содержащих наиболее высокие уровни представляющего интерес белка. Изоляция белка, представляющего интерес, из семян, в которых он приготавливается, прямо приводит к таким осложнениям, как дополнительные затраты (Krebbers и Vandekerckhove, 1990).

Возможным решением этой проблемы может быть исключение необходимости экстракции экспрессированного белка из материала растения. В патенте ГДР N DD 275704 раскрывается сущность конструкции для экспрессии термоустойчивой бета-глюканазы в непроросших семенах преобразованных ячменных растений и применения этих семян в процессах сбраживания. Тем не менее, остававшаяся проблема обработки посевов злаков с малыми зернами состояла не только в преобразовании протопластов хлебных злаков, но и в регенерации преобразованных растений, что не раскрывается в описании указанного патента. Таким образом, с помощью процесса, описанного в рассмотренном патенте, нельзя получить ферментосодержащие семена.

Согласно данному изобретению обеспечиваются семена, содержащие по крайней мере один представляющий интерес фермент, которые могут быть использованы в промышленных процессах или в производстве еды или кормов в качестве катализаторов реакций пищеварения при отсутствии необходимости первичной экстракции и/или изоляции ферментов.

Обеспечиваются конструкции ДНК для преобразования растений, которые в свою очередь способны к экспрессии множества представляющих интерес ферментов в семенах. В указанных конструкциях применяются сигнальные последовательности, оперативно соединенные с последовательностью ДНК и кодирующие желаемый для экспрессии фермент. Такие конструкции управляются регулярными последовательностями, которые способны направлять экспрессию ферментов в семенах.

Данное изобретение предназначено также для обеспечения применения семян трансгенных растений в качестве стабильной и управляемой формы запасов ферментов. Ферменты поддерживаются в осушенной среде с низкой активностью протеазы и, таким образом, защищены от разложения.

Кроме того, применение семян для хранения ферментов обеспечивает устойчивое средство транспортирования, которое легко пакуется и перевозится, а также легко обрабатывается в ходе применения.

Кроме этого, данное изобретение обеспечивает жизнеспособный раствор для проведения дорогостоящего и трудно реализуемого процесса экстракции ферментов, представляющих интерес, из семян, в которых они приготовлены. Ферменты остаются устойчивыми внутри семян и, таким образом, могут быть использованы в качестве замены чистого фермента. Это преимущество, вместе с дешевизной выращивания семяпроизводящих растений, обеспечивает экономическую основу применения таких ферментов. Таким образом, данное изобретение позволяет снизить затраты, связанные с приготовлением, хранением и применением множества ферментов.

На фиг. 1 изображена стратегия клонирования фитазы кДНК.

На фиг. 2 изображен бинарный вектор pMOG23.

На фиг. 3 изображена геномная последовательность запасенного в семенах гена круциферина из "Brassica napus".

На фиг. 4 изображены дуплексы синтетических олигонуклеотидов, используемых для различных конструкций.

На фиг. 5 изображена плазмида pMOG429. Бинарный вектор pMOG23, содержащий часть кДНК фитазы, кодирующую нисходящие созревшие ферменты последовательности ДНК, кодирующей сигнальный пептид круциферина.

На фиг. 6 изображены эффекты добавления семян из грунта, содержащих фитазу, на высвобождение неорганического фосфора из фитата.

На фиг. 7 изображена геномная последовательность гена альфа-амилазы "Bacillus licheniformis" как присутствующая в векторе pPROM54.

На фиг. 8 изображена плазмида pMOG29. Плазмида pUC18, содержащая кассету экспрессии для неуправляемой экспрессии в растениях и последовательность, кодирующую сигнальный пептид табака.

На фиг. 9 изображена плазмида pMOG227. Бинарный вектор, содержащий часть гена альфа-амилазы, кодирующую нисходящие созревшие ферменты последовательности табака, кодирующей сигнальный пептид табака в кассете экспрессии для неуправляемой экспрессии.

На фиг. 10 изображено связанное с дозой соотношение фитазы "Aspergillus" в лабораторной модели гидролитического разложения.

На фиг. 11 изображено связанное с дозой соотношение фитазы "Aspergillus" и фитазы, содержащейся в семенах табака, в лабораторной модели гидролитического разложения.

На фиг. 12 проведено сравнение образцов олигосахаридов, полученных при гидролизе картофельного крахмала с применением: A) семян табака, преобразованных геном, кодирующим альфа-амилазу "Bacillus licheniformis"; B) альфа-амилазы "Bacillus licheniformis" и C) альфа-амилазы "Bacillus amyloliquefaciens".

На фиг. 13 проведено сравнение образцов олигосахаридов, полученных при гидролизе крахмала злаков с применением: A) семян табака, преобразованных геном, кодирующим альфа-амилазу "Bacillus licheniformis"; B) альфа-амилазы "Bacillus licheniformis" и C) альфа-амилазы "Bacillus amyloliquefaciens".

Подробное описание предпочтительных примеров осуществления данного изобретения Представляющие интерес ферменты, которые могут быть получены по данному изобретению, включают любые ферменты, применяемые в производственных процессах.

Представляющие интерес ферменты включают ферменты, которые гетерологичны растению (т.е. не присущи конкретным видам растений), в котором они приготавливаются. Сюда также входят ферменты, гомологичные растениям (т.е. присущие конкретным видам растений), в которых они приготавливаются, и с избытком экспрессированные посредством методов применения рекомбинатной ДНК.

Такие ферменты выбираются из таких гидролаз, как протеазы, целлюлазы, гемицеллюлазы, фосфатазы, липазы, пектиназы, амидазы, лизоцимы, пуллулуназы и хитаназы, таких лиаз, как пектинлиаза, и таких изомераз, как изомераза глюкозы.

Предпочтительными ферментами являются фитаза, альфа-амилаза, целлобиогидролаза, эндоглюканаза, эндоксиланаза, эндогалактаназа, альфа-галактозидаза, арабинаназа, серинпротеазы, химозин, папаин, гастролипазы, пектинлиаза и глюкозоизомераза.

Промышленными считаются процессы, в которых экстрагированные и/или изолированные ферменты обычно включаются в смесь реактивов при реакции в естественных или искусственных условиях, содержащую по меньшей мере один субстрат, в котором ферменты способы катализировать такую реакцию субстрата (субстратов) таким образом, чтобы производить желаемые эффекты или продукты.

В число примеров таких промышленных процессов входят (но не исчерпывают их число) лабораторные процессы типа применения фитаз при обработке сои или осуществлении таких производственных процессов, как влажное перемалывание с целью изготовления инозитола или инозитолфосфатов из фитата. Гемицеллюлазы и целлюлазы можно также применять, вообще говоря, в качестве разлагаемых ферментов с ячеистой стенкой. Аналогично, альфа-амилазы можно использовать в хлебопекарной промышленности, чтобы улучшать качество выпечки и ее консистенцию; альфа-амилаза, амидоглюкозидаза, ксиланазы и/или глюкозоизомераза могут использоваться при разжижении крахмала; лигниназы и/или ксиланазы могут быть использованы в производстве бумаги; глюканазы, пектиназы и/или целлюлазы могут применяться в производстве еды и напитков, например - в процессах ферментации или сбраживания.

Помимо упомянутого выше воздействия ферментов в искусственных процессах, запасенные в семенах ферменты могут быть использованы для катализа реакций разложения в естественных процессах. В этом случае ферменты облегчают выделение питательных веществ из пищевых продуктов, которые не смогли бы попасть в пищу животного другим способом.

Ферменты, используемые в таких естественных процессах, включают (но этим их число не ограничивается) фитазы, целлюлазы, гемицеллюлазы, пектиназы и амилазы. Ферменты приведут к улучшению переваривания пищевых продуктов. Ферменты как пищеварительные добавки могут также использоваться и для нужд человека, например, в таких случаях заболеваний, как муковисцидоз или в других случаях панкреатического заболевания. Липазы, протеазы и целлюлазы, содержащиеся в семенах, могут быть использованы в терапевтических добавках, облегчающих трудности пищеварения, связанные с указанными заболеваниями.

Согласно данному изобретению желаемый фермент приготавливается в семенах трансгенных растений. Подготовленные таким образом семена используются в промышленном процессе, требующем применения фермента при отсутствии необходимости первичной экстракции и/или изоляции фермента.

Теми, кто сведущ в данной области, будет по достоинству оценено, что семена, содержащие ферменты и предназначенные для применения в промышленности, могут быть использованы в таких процессах непосредственно, или могут сначала быть подготовлены к такому применению посредством помола их до заданной консистенции. В любом случае все или перемолотые семена могут быть введены в такой желаемый процесс при отсутствии необходимости дальнейшей экстракции и/или изоляции фермента, а также без потерь активности фермента.

Как определено в контексте данного изобретения, трансгенные растения включают растения и их потомство, которое генетически модифицировано с целью создания или увеличения приготовления по меньшей мере одного представляющего интерес фермента в их семенах. Таким образом, приготовление представляющих интерес ферментов увеличивается по сравнению с уровнем, обнаруживаемым в дикорастущих растениях.

В контексте данного изобретения фраза "семена, содержащие увеличенное количество фермента" относится, в основном, к статистически значимому количеству семян, которые, в среднем, содержат статистически значимое большее количество фермента по сравнению со средним количеством фермента в равном количестве немодифицированных семян.

Роды растений, способные к производству представляющего интерес фермента в своих семенах и подходящие для реализации данного изобретения, включают (но этим их число не исчерпывается) такие, как "Nicotiana" (например, "tabacum"), "Brassica" (например, "napus" и "oleracea"), "Arabidopsis, Glycine" (например, "max"), "Zea" (например, "mays"), "Amaranthus, Hordeum" (например, "vulgarum") и "Pisum" (например, "sativum"), "Juglans" (например, "regia"), "Arachis" (например, "hypogeae"), "Medicago" (например, "sativa"), "Phaseolus" (например, "vulgaris"), "Pisum" (например, "sativum"), "Triticum" (например, "aestivum"), "Panicum L. , Helianthus" (например, "annus"), "Avena" (например, "sativa") и "Oryza" (например, "sativa").

Предпочтительно, чтобы выбираемые виды растений могли давать большую производительность семени на растение за год и чтобы химические и физические свойства семян были совместимы с промышленным процессом, для которого приготавливается фермент. Например, в некоторых случаях, когда эти семена (после преобразования родительского растения) включаются в пищевые продукты, можно выбрать виды растений, которые производят семена с низким содержанием таннинов или других антипищевых особенностей. В других случаях способность трансгенных семян к помолу до желаемой консистенции может служить критерием выбора, когда семена применяются в качестве добавок, например - в муку. В еще одном примере осуществления данного изобретения семена, содержащие представляющие интерес ферменты, могут быть введены в желаемый процесс непосредственно (например - при производстве пищевых продуктов), чему может предшествовать очистка и/или осушение по завершении сбора семян.

Выбор наиболее подходящих видов растений может быть основан на экспериментах по воспроизведению. Представляющий интерес фермент может быть добавлен вместе с широко распространенными семенами в смесь реактивов промышленного процесса, для которого в конечном счете будут подготовлены трансгенные семена.

Генетическая модификация вышеописанных семяпроизводящих растений подразумевает, что конструкция экспрессии, включающей ген, кодирующий представляющий интерес фермент, вводится в целевое растение. Эта конструкция экспрессии может включать ген, гетерологичный растению, который находится под управлением промотора, и терминирующие области, способные регулировать экспрессию гена, кодирующего представляющий интерес фермент в семенах растения. Также вводится ген, гомологичный растению, который находится под управлением регулируемой области, способной воздействовать на перепроизводство представляющего интерес фермента. Посредством перепроизводтва вводится производство представляющего интерес фермента на уровнях, которые превышают обнаруживаемые у множества дикорастущих растений.

Имеется несколько способов введения конструкции экспрессии, содержащей последовательность ДНК, кодирующую представляющий интерес фермент, в целевые растения. Такие способы включают (но этим их число не ограничивается) преобразование протопластов с помощью метода применения кальция/полиэтиленгликоля, электропорацию и микроинжекцию или бомбардировку (покрытыми) частицами (Potrykus, 1990).

Кроме этих так называемых методов непосредственного преобразования ДНК, широко распространены системы преобразования, включающие векторы, например векторы вирусов (начиная, к примеру, с вируса мозаики цветной капусты (CaMV)), и векторы бактериальные (например, из рода "Agrobacterium") (Potrykus, 1990). После отбора и/или поиска в мутантных средах, протопласты, клетки или части растений, которые претерпели преобразование, могут быть регенерированы в целые растения с помощью известных в рассматриваемой области методов (Horsh R.B. и др., 1985). Выбор способов преобразования и/или регенерации не критичен для данного изобретения.

Для двудольных растений, в предпочтительном примере осуществления данного изобретения используется принцип системы бинарного вектора (Hoekema и др. , 1983; Schilperoort и др., 1984), в которой используются штаммы "Agrobacterium", содержащие vir-плазмиду с вирулентными генами и совместимую плазмиду, содержащую конструкцию гена, подлежащую преобразованию. Этот вектор может воспроизводиться как в спирали фермента, так и в "Agrobacterium" и выводится из бинарного вектора Bin19 (Bevan, 1984), который изменяется в деталях, не относящихся к данному изобретению. Используемые в этом примере бинарные векторы содержат между левой и правой граничными последовательностями Т-ДНК тот же ген NPTII, кодирующий устойчивость к канамицину (Bevan, 1984) и место клонирования, чтобы клонировать требуемые конструкции генов.

Преобразование и регенерация однодольных культур не является стандартной процедурой. Тем не менее, достигнутый за последние годы прогресс в науке показывает, что в принципе однодольные культуры поддаются преобразованию и что из преобразованных клеток могут быть регенерированы плодоносящие трансгенные растения. Разработка систем, воспроизводящих культурные ткани для этих культур, наряду с разработкой мощных методов введения генетического материала в клетки растений, облегчила преобразование. В настоящее время среди методов, выбираемых для осуществления преобразования однодольных культур, имеются бомбардировка эксплантатов микрочастицами или бомбардировка клеток суспензии микрочастицами, а также непосредственное поглощение ДНК или электропорация протопластов. Например, трансгенные растения риса были успешно получены с помощью бактериального гена hph кодирующего устойчивость к гидромицину, в качестве маркера селекции. Этот ген был введен посредством электропорации (Shim и др. , 1989). Трансгенные растения кукурузы были получены введением гена "Streptomyces hygroscopicus bar", кодирующего ацетилентрансферазу, фосфинотрицина (фермент, дезактивирующий гербицид фосфинотрицин), в эмбриогенные клетки культуры кукурузной суспензии методом бомбардировки микрочастицами (Gordon-Kamm и др., 1990). Введение генетического материала в протопласты алейрона таких других однодольных культур, как пшеница и ячмень, тоже отражено в научных работах (Lee и др., 1989). Растения пшеницы регенерировались из культуры эмбриогенной суспензии путем выбора только состарившейся плотной части культуры и тканей клубенькового эмбриогенного каллюса для установления культур эмбриогенной суспензии (Vasil и др., 1990). Сочетание этих культур с системами преобразования обусловливает возможность применения данного изобретения к преобразованию монодольных растений. Эти методы могут применяться и для преобразования и регенерации двудольных растений.

Экспрессия рекомбинантных генов в растениях включает такие детали, как транскрипцию гена полимеразами растения, трансляцию матричной РНК (мРНК) и т. д., что хорошо известно специалистам, квалифицированным в области методов применения рекомбинантной ДНК. Ниже обсуждаются только те подробности рассмотренных процессов, которые относятся к способствующим лучшему пониманию данного изобретения.

Регуляторные последовательности, которые известны или находятся путем вызывания достаточно высокой экспрессии (в целях особых приложений, как обсуждается ниже) рекомбинантной ДНК в семенах, могут быть применены в данном изобретении. Такие регулярные последовательности можно получить из растений или от вирусов растений, или синтезировать химическим путем. Такие регуляторные последовательности являются промоторами, действуют во время непосредственной транскрипции в семенах. В их число входят (но не исчерпывают его) промоторы из генов особых семян, особенно - генов запасных белков, типа cruA-промотора "Brassica napus" (Ryan и др., 1989) или промоторов генов составной экспрессии типа промотора 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV) (Guilley и др. , 1982). Другими регуляторными последовательностями являются терминирующие последовательности и сигналы полиаденилирования, включающие каждую последовательность, функционирующую в растениях в качестве указанных выше последовательностей; примерами являются область экспозиции 3' гена нопалинсинтазы "Agrobacterium tumefaciens" или область экспозиции 3' cruA-гена "Brassica napus". Регуляторные последовательности могут также включать такие последовательности энхансера, как обнаруженные в промоторе 35S в CaMV и такие стабилизирующие мРНК последовательности, как лидерная последовательность мономерных остатков вируса мозаики люцерны (AlMV) RNA4 (Brederode и др., 1980) или любые другие последовательности, функционирующие как указанные.

Представляющий интерес белок должен быть в окружающей среде, которая обеспечивает оптимальную устойчивость белка во время созревания семян. Выбор таких составных частей клетки, как цитозоль, эндоплазматический ретикулум, вакуоль, белковое тело или периплазматическое пространство может быть использован в данном изобретении для создания указанной стабильной окружающей среды, в зависимости от биофизических параметров, в которые входят (но не исчерпывают его) оптимальное значение pH, чувствительность к протеазам или чувствительность к молярности предварительно заданной составной части. Хотя предпочтительнее гомологичные сигнальные последовательности, могут применяться и гетерологичные сигнальные последовательности. Особо предпочтительными являются сигнальные последовательности, полученные из запасных белков семян.

Запасные белки семян можно разделить на четыре основных класса, основанных на характеристиках растворимости.

1. Альбумины. Растворимы воде и подразделяются на два основных класса (12S и 2S). Класс 12S включает лектины, изолированные из гороха и различных бобовых культур, например альбумины 2S из "Brassica napus", "Arabidopsis thaliana", "Ricinus communis" (касторовые бобы), "Bertholletia exelsa" (бразильский орех), фасоли, редиса и подсолнечника.

2. Глобулины. Растворимы в растворах солей и могут быть класса 7S или класса 8S, например - фазолины из "Phaseolus", вицилины из фасоли, конглицинины из соевых бобов, вицилины из овса и глобулины класса 7S из других культур, или такие представители классов 11S-14S, как легумины из фасоли, глицинины из соевых бобов, гелиантины из подсолнечника, круциферины из рапса или белки классов 11S-14S из таких других видов, как "Arabidopsis" и бобовые культуры.

3. Проламины. Растворимы в разведенном в воде спирте. Например - зеины из злаков, гордеины из ячменя, глиадины, изолированные из пшеницы и кафирины из сорго.

4. Глутелины. Растворимы в кислотных или щелочных растворах и могут быть изолированы из пшеницы.

Хотя существуют исключения, основные запасные белки в семенах двудольных растений - это глобулины, а для однодольных растений - проламины и глутелины.

Все составные части, относящиеся к конструкциям ДНК (промоторы; регуляторные, стабилизирующие, сигнальные или терминирующие последовательности) и соответствующие данному изобретению, могут быть по желанию модифицированы, чтобы изменить их управляющие характеристики, с помощью методов, известных специалистам в данной области. Количество рекомбинантного белка ("уровень экспрессии"), необходимое в семени, должно быть очень высоким, чтобы использовать трансгенное семя как незначительную добавку (рассчитываемую на основе объемных, весовых или стоимостных характеристик) для всех предпочтительных случаев осуществления данного изобретения.

С целью получения трансгенных растений, семена которых содержат более одного представляющего интерес фермента, можно использовать целый ряд методов. В их число входят (но не исчерпывают его): a) перекрестная подкормка трансгенных растений, экспрессирующих один или более представляющих интерес ферментов; b) преобразование растений фрагментами ДНК или плазмидами, содержащими многочисленные гены, кодирующие представляющие интерес ферменты с помощью необходимых регуляторных последовательностей; c) преобразование растений различными фрагментами ДНК или плазмидами одновременно, причем каждый из фрагментов или каждая плазмида содержат ген представляющих интереса фермента, с помощью необходимых регуляторных последовательностей; d) последовательное преобразование тканей с использованием на каждой стадии фрагмента ДНК или плазмиды, кодирующих различные ферменты, представляющие интерес, под управлением необходимых регуляторных последовательностей; e) сочетание указанных выше методов.

Метод, который фактически применяется для получения семян, содержащих один или более представляющих интерес ферментов, не критичен применительно к цели данного изобретения.

Подчеркиваем, что семена, содержащие увеличенные количества ферментов, могут быть получены с помощью процессов, известных специалистам в данной области и отличающихся от упоминавшихся выше рекомбинантных процессов тем, что они обеспечивают получение семян с увеличенными содержаниями ферментов по сравнению с семенами дикорастущих растений. Например, было бы возможно получать такие семена с помощью методов обеспечения сомаклональных изменений. Далее такие методы могли бы быть использованы непосредственно или в сочетании с методами отбора, в которых используется концепция цитоплазматической мужской стерильности (CmS), или ядерной мужской стерильности (NmS) (Mariani и др., 1990). Такие способы, как сомаклональная вариация или перекрестное скрещивание с помощью CmS или NmS могли бы быть использованы в сочетаниях с упоминавшимися выше рекомбинантными способами, чтобы еще больше увеличить количества имеющихся внутри семян ферментов. Что касается нерекомбинантных методов, которые могли бы быть использованы для увеличения количества ферментов в семенах, то можно сослаться на патент США N 4378655, изданный 07.04.83; в данном описании ссылка на этот патент приводится с целью раскрытия содержания таких способов. Подчеркнем, что существуют многочисленные публикации, в которых описаны способы селекции, включающие цитоплазматическую мужскую стерильность, открытую в 1968 г., и с применением соответствующих доминантных генов, восстанавливающих фертильность (Rf) (M.L. Kinmar и др., 1970). В последние годы было описано применение концепции ядерной мужской стерильности (Mariani и др., 1990). Более обобщенные описания, касающиеся скрещивания растений, обсуждаются в работе James R. Welsh "Основы генетики растений и скрещивание", 1981, а также в работе J.M. Poehlman. "Скрещиваемые полевые культуры", 1959.

В одном из примеров осуществления данного изобретения двуцепочечная ДНК, кодирующая фитазу, приготавливается из мРНК, изолированной из "Aspergillus ficuum" (van Gorcom и др., 1991). Конструкция ДНК находится под управлением регуляторных последовательностей, состоящих из запасного белка класса 12S-круциферина из "Brassica napus". Затем эта конструкция ДНК субклонируется в бинарный вектор типа pMOG23 (в штамме DH5 E.coli K-12, депонированном в Центральном бюро культур штаммов в Берне, Нидерланды, с 29.01.90 под номером CBS 102.90). Этот вектор вводится в "Agrobacterium tumefaciens", где содержится обезвреженная плазмида, индуцирующая образование галлов у растений. Клетки бактерий, содержащие эту конструкцию, сокультивируются с тканями из табака или растений вида "Brassica", а клетки преобразованного растения отбираются с помощью питательной среды, содержащей антибиотики и индуцируемой в различные растения, чтобы регенерировать на базе такой среды нужные клетки. Получаемые в результате растения дают семена, которые содержат и экспрессируют конструкцию ДНК.

В другом примере осуществления данного изобретения кодирующая фитазу конструкция ДНК находится под управлением регуляторных последовательностей из промотора вируса мозаики цветной капусты (CaMV). Далее эта конструкция субклонируется в бинарный вектор. Затем этот вектор вводится в "Agrobacterium tumefaciens", где содержится обезвреженная плазмида, индуцирующая образование галлов у растений. Клетки бактерий, содержащие эту конструкцию, сокультивируются с тканями из табака или растений вида "Brassica", а клетки преобразованных растений отбираются с помощью питательной среды, содержащей антибиотики и индуцируемой в различные растения, чтобы регенерировать на базе такой среды нужные клетки. Получаемые в результате растения дают семена, которые содержат и экспрессируют составную конструкцию ДНК.

Деятельность фермента фитазы трансгенных семян может быть описана многочисленными методами (причем конкретный метод не критичен применительно к данному изобретению) типа ферментного иммуносорбентного анализа, вестерн-блотирования или прямых ферментативных методов анализа с использованием приемов калориметрии или приемов анализа природного геля.

Семена, содержащие подготовленную таким образом фитазу, могут быть использованы в промышленных процессах в качестве кормовых добавок для животных, не относящихся к жвачным, при обработке сои или в производстве инозитола или инозитолфосфатов из фитата. При необходимости или при желании можно сначала перемолоть семена до нужной консистенции (в зависимости от природы промышленного процесса) при отсутствии необходимости последующей экстракции и/или изоляции фитазы. В этом случае любой специалист в данной области сможет определить, нужны ли такие подготовительные стадии.

Произведенная в семенах фитаза может быть использована и в процессе замачивания зерен злаков или сорго. Семена могут быть перемолоты перед добавкой в замоченные зерна злаков. Освобожденная от семян фитаза может воздействовать на фитин, который присутствует во многих препаратах злаков. Разложение фитина в замоченном зерне злаков выгодно для получения дополнительного коммерческого объема кукурузного экстракта, который применяется в качестве корма для животных или в качестве питательной среды в реакциях бактериальной ферментации. Более того, разложение фитина поможет избежать проблем, связанных с накоплением остатков в фильтрах, трубах, емкостях реакторов и т.д. при сгущении, транспортировании и хранении кукурузного экстракта (Vaara и др. , 1989). Действие фитазы может также ускорить процесс замачивания и процессы разделения, входящие в технологию перемалывания влажных зерен.

В еще одном примере осуществления данного изобретения фрагмент геномной ДНК, кодирующий альфа-амилазу из "Bacillus licheniformiis", находится под управлением промотора 35S CaMV и последовательностей энхансера. Сюда входят как стабилизирующая мРНК лидерная последовательность многомерных остатков RNA4 из AlMV, так и терминирующие и сигнальные последовательности полиаденилирования гена нопалинсинтазы "Agrobacterium tumefaciens". Далее вся конструкция субклонируется в бинарный вектор. Этот вектор вводится в "Agrobacterium tumefaciens", где содержится обезвреженная пл