Способ получения эритропоэтина человека

Способ получения эритропоэтина человека

Реферат

 

Изобретение относится к генной инженерии и касается клонирования генов человеческого эритропоэтина. В подходящей среде культивируют клетки млекопитающих, трансформированных рекомбинантным вектором. Вектор включает последовательности ДНК, представленную в табл. 3 и 4. Последовательность ДНК может быть включена в вектор, содержащий ДНК вируса папилломы быка. Клетки млекопитающих представляют собой COS, СНО, С 127 или 3T3. Культуральная кислота может содержать фетальную сыворотку. Полученный эритропоэтин отделяют от клеток и от среды. Способ позволяет получать клонированные гены для человеческого эритропоэтина, которые обнаруживают чрезвычайно высокие уровни экспрессии. 5 з.п.ф-лы, 11 табл., 12 ил.

Изобретение касается клонирования генов человеческого эритропоэтина, которые обеспечивают необычайно высокие уровни экспрессии, экспрессии указанных генов и получения in vitro активного человеческого эритропоэтина.

Эритропоэтин /далее ЭПО/ представляет собой циркулирующий гликопротеид, который стимулирует образование эритроцита в высших организмах. См. Carnot и др. , Compt. Rend. 143:384 /1906/. Как таковой, ЭПО иногда упоминается как фактор, стимулирующий эритропоэз.

Продолжительность жизни человеческих эритроцитов составляет около 120 дней. Таким образом, около 1/120 общего числа эритроцитов разрушается ежедневно в ретикуло-эндотелиальной системе. Однако, относительно постоянное число эритроцитов продуцируется ежедневно для поддержания уровня эритроцитов все время /Guyton, Textbook of Medical Physiology стр. 56-60, W.B.Saunders Co., Филадельфия /1976//.

Эритроциты продуцируются путем созревания и дифференцировки эритробластов в костном мозге, и ЭПО является фактором, который воздействует на менее дифференцированные клетки и индуцирует их дифференцировку в эритроциты /Guyton, выше/.

ЭПО представляет собой многообещающее терапевтическое средство для клинического лечения анемии и, в частности, ренальной анемии. К сожалению, использование ЭПО еще не является общепринятым в практической терапии вследствие его малой доступности.

При использовании ЭПО в качестве терапевтического средства необходимо учитывать проблемы антигенности, и поэтому предпочтительно, чтобы ЭПО был получен из сырья человеческого происхождения. Например, можно использовать человеческую кровь или мочу от пациентов, страдающих апластической анемией или подобными болезнями, при которых выделяются большие количества ЭПО. Эти исходные материалы, однако, существуют в ограниченном количестве. См., например White и др., Rec.Progr. Horm. Res. 16-219 (1960); Espada и др., Biochem. Med. 3:475 (1970); Fischer, Phurm. Rev, 24:459 (1972) и Gordon, Vitam. Horm (N.Y.), 31:105 (1973).

Получение продуктов ЭПО, как правило, осуществляется через концентрирование и очистку мочи пациентов, обнаруживающих высокие уровни ЭПО, таких, как больные апластической анемией или подобными заболеваниями. См., например, патенты США NN 439780, 4303650 и 3865801, раскрытие которых введено сюда в качестве ссылки. Ограниченный запас такой мочи служит препятствием практическому использованию ЭПО, и поэтому чрезвычайно желательно получать ЭПО из мочи здоровых людей. Трудность в использовании мочи от здоровых людей заключается в низком содержании в ней ЭПО по сравнению с мочой пациентов, страдающих анемией. Кроме того, моча здоровых людей содержит в достаточно высокой концентрации определенные тормозящие факторы, которые действуют против эритропоэза, поэтому удовлетворительный терапевтический эффект от ЭПО может быть получен только после последующей значительной очистки.

ЭПО также может быть выделен из плазмы крови овцы; отделение ЭПО от такой плазмы крови обеспечивает создание достаточно сильнодействующих и устойчивых водорастворимых препаратов. См., Goldwasser, Control Cellular Dif.Develop. , Часть A, стр. 487-494, Alan Pziss, Inc., Нью-Йорк (1981), которая введена сюда в качестве ссылки. ЭПО овцы, однако, может быть антигенным для людей.

Таким образом, хотя ЭПО является желательным терапевтическим средством, традиционные методики выделения и очистки, используемые в работе с естественными источниками сырья, являются недостаточными для массового производства этого соединения.

Sugimoto и др. в патенте США N 4377513 описывают один способ для массового производства ЭПО, содержащий размножение in vivo лимфобластоидных клеток человека, включающих Nomalva, BALL-1, NALL-1, TALL-1 и JBL.

В специальной литературе появилось описание получения ЭПО с использованием методов генетической инженерии другими авторами. Однако еще не опубликовано ни пригодного раскрытия, ни химической природы продукта. В противоположность этому, настоящая заявка представляет пригодное раскрытие массового производства белков, проявляющих биологические свойства человеческого ЭПО. С помощью этих методик возможно также получить белки, которые могут химически отличаться от аутентичного человеческого ЭПО и все же обнаруживать аналогичные /и в некоторых случаях улучшенные/ свойства. Для удобства все такие белки, проявляющие биологические свойства человеческого ЭПО, будут упоминаться далее как ЭПО, вне зависимости от того, являются ли они химически идентичными ему или нет.

Настоящее изобретение касается клонирования гена, который обеспечивает необычайно высокие уровни экспрессии человеческого ЭПО, и массовое производство in vitro активного человеческого эритропоэтина. Также описываются пригодные векторы экспрессии для получения ЭПО, системы экспрессии, схемы очистки и связанные с этим процессы.

Как описывается более подробно ниже, ЭПО был получен в частично очищенной форме, подвергнут дальнейшей очистке до гомогенности и переварен трипсином для образования специфических фрагментов. Эти фрагменты были очищены и подвергнуты определению последовательностей. На основе этих последовательностей были затем сконструированы олигонуклеотиды ЭПО. Эти олигонуклеотиды были использованы для скрининга человеческой геномной библиотеки, из которой был выделен ген ЭПО.

Ген ЭПО был проверен на основе его ДНК-последовательности, которая объединяла многие секвенированные фрагменты триптического белка. Фрагмента геномного клона был затем использован для демонстрации путем гибридизации того, что мРНК ЭПО обнаруживается в человеческой плодной /в возрасте 20 недель/ мРНК. Была получена и подвергнута скринингу кДНК-библиотека печени плода человека. Были получены три клона кДНК ЭПО /после скрининга >750000 рекомбинантов/. Два из этих трех клонов были определены путем оценки полной кодирующей последовательности и значительной 5' - 3' - нетранслируемой последовательности, как имеющие полную длину. Эти кДНК были экспрессированы как в трансформированных клетках вируса SV-40 обезьяны /клеточная линия COS-1; Gluzman, Cell 23:175-182 /1981//, так и в клетках яичника китайского хомячка /клеточная линия CHO; Urlaub, G. и Chasin, L.A.Proc. Natl. Acad. Sci. США 77:4216-4280 /1980//. ЭПО, полученный из клеток COS-1, является биологически активным ЭПО in vitro и in vivo. ЭПО, полученный из клеток CHO, также биологически активен in vitro и in vivo.

кДНК-клон ЭПО имеет интересную открытую рамку считывания из 14-15 аминокислот /АК/ с инициатором и терминатором из 20-30 нуклеотидов вверх по направлению кодирующей области. Типичный образец E.coli, трансформированной клонированным геном ЭПО, был депонирован American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, где он имеется в наличии под входящим номером ATCC 40153.

Таблица 1 представляет собой последовательность экзона из 87 пар оснований гена ЭПО человека; Фиг. 1 иллюстрирует обнаружение мРНК ЭПО в мРНК печени плода человека; таблица 2 представляет аминокислотную последовательность белка ЭПО, выведенную из нуклеотидной последовательности - HEPOF L13; таблица 3 представляет нуклеотидную последовательность кДНК ЭПО в - HEPOF L13 /показано схематически на фиг. 2/ и аминокислотную последовательность, выведенную из нее; фиг. 3 иллюстрирует относительные положения ДНК-вставок четырех независимых геномных клонов человеческого ЭПО; фиг. 4 представляет собой карту очевидной интронной и экзонной структуры гена ЭПО человека; таблица 4 иллюстрирует ДНК-последовательность гена ЭПО, показанную на фиг. 4B; фиг. 5A, 5B и 5C иллюстрируют конструирование вектора 91023/B/; фиг. 6 изображает SDS полиакриламидный гель-анализ ЭПО, полученного в клетках COS-1 в сравнении с нативным ЭПО; таблица 5 иллюстрирует нуклеотидную и аминокислотную последовательности клона ЭПО - HEPOF L6; таблица 6 иллюстрирует нуклеотидную и аминокислотную последовательности клона ЭПО - HEPOF L8; таблица 7 иллюстрирует нуклеотидную и аминокислотную последовательность клона ЭПО - HEPOF L13; фиг. 8 представляет собой схематическое изображение плазмиды pdBPY-MMTheo /342-12/. Все таблицы представлены в конце описания.

Настоящее изобретение касается клонирования генов ЭПО и получения ЭПО путем экспрессии in vitro этих генов.

Патентная и научная литература изобилует способами, являющимися пригодными для получения рекомбинантных продуктов. В основном эти методики включают выделение или синтез требуемой генной последовательности и экспрессию этой последовательности либо в прокариотных, либо в эукариотных клетках, используя методики, в целом доступные для специалиста. Как только искомый ген изолирован, очищен и вставлен в вектор переноса /т.е. клонирован/, его доступность в достаточном количестве обеспечена. Вектор с клонированным в нем геном переносится к пригодному микроорганизму или линии клеток, например бактериям, дрожжам, клеткам млекопитающих, таких как COS-I /почка обезьяны/, CHO /яичник китайского хомячка/, линиям клеток насекомых и тому подобному, где вектор реплицируется, когда микроорганизм или линия клеток пролиферирует, и откуда вектор может быть выделен при помощи общепринятых средств. Таким образом обеспечивается непрерывно возобновляемый источник гена для дальнейших манипуляций, модификаций и переносов к другим векторам или другим локусам в пределах того же вектора.

Экспрессия часто может быть получена путем переноса клонированного гена в должной ориентации и рамке считывания в подходящий сайт в векторе переноса таким образом, чтобы трансляционное считывание с прокариотного или эукариотного гена завершалось синтезом белкового предшественника, содержащего аминокислотную последовательность, кодируемую клонированным геном, связанную с Met или амино-концевой последовательностью прокариотического или эукариотического гена. В других случаях сигналы для инициации транскрипции и трансляции могут подаваться пригодным геномным фрагментом клонированного гена. Множество специфических методик белкового расщепления может быть использовано для расщепления продуцированного белкового предшественника в требуемой точке с тем, чтобы высвободить желательную аминокислотную последовательность, которую затем можно очистить традиционными способами. В некоторых случаях белок, содержащий требуемую аминокислотную последовательность, продуцируется без необходимости применения специфических методик расщепления, а также может быть также высвобожден из клеток в экстрацеллюлярную питательную среду.

Выделение геномного клона человеческого ЭПО Человеческий ЭПО был очищен до гомогенности из мочи пациентов, страдающих апластической анемией, как описано ниже. Полное переваривание этого очищенного ЭПО трипсином дало фрагменты, которые были разделены высокоэффективной жидкостной хроматографией с обращенной фазой, восстановлены из градиентных фракций и подвергнуты микроанализу последовательностей. Последовательности триптических фрагментов подчеркнуты в таблицах 2 и 3 и обсуждены более подробно ниже. Две из аминокислотных последовательностей Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys и Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg, были выбраны для конструирования олигонуклеотидных зондов /с получением пула олигонуклеотидов из 17 оснований с 32-кратной вырожденностью и пула 18-членников с 128-кратной вырожденностью - из первого триптического фрагмента, а также двух пулов 14-членников с 48-кратной вырожденностью из второго триптического фрагмента, соответственно/. 32-кратный 17-членный пул был использован для скрининга человеческой геномной ДНК-библиотеки в векторе Ch4 A /22/ с использованием модификации метода амплификации in situ Woo и O'Malley /47/ для получения фильтров для скрининга.

Арабские числа в круглых скобках, (1) - (61), используются в настоящем описании для ссылок на публикации, которые приводятся в числовом порядке в конце описания настоящего изобретения.

Фаг, гибридизирующийся с 17-членником, был упакован, распределен на малые группы и опробован 14-членными и 18-членными пулами. Фаг, гибридизирующийся с 17-членником, 18-членником и 14-членником был очищен, а фрагменты были субклонированы в векторы M13 для секвенирования путем дидезокси-метода обрыва цепи, описанного Sanger и Coulson, /23/ /1977/. Последовательность области одного из клонов, гибридизирующаяся с 32-кратно вырожденным 17-членником, показана в таблице 1. Эта последовательность ДНК содержит внутри открытой рамки считывания нуклеотиды, которые могут точно кодировать триптический фрагмент, используемый для получения пула 17 членных олигонуклеотидов. Кроме того, анализ последовательности ДНК показывает, что 17-членная гибридизирующаяся область содержалась внутри экзона 87 п.о., соединенного с потенциальным акцептором и донором сплайсинга.

Положительное подтверждение того, что эти два клона /обозначены здесь - HEPO1 и - HEPO2/ являются геномными клонами ЭПО получено путем секвенирования дополнительных экзонов, содержащих другой триптический фрагмент, кодирующий информацию.

Выделение клонов кДНК ЭПО Northern-анализ /56/ в отношении человеческой фетальной /возраст 20 недель/ печеночной мРНК осуществляли с использованием однонитиевого зонда из 95 нуклеотидов, полученного из клона M13, содержащего участок экзона 87 п.о. ; описанного в таблице 1. Как показано на фиг. 1 в мРНК фетальной печени может быть обнаружен сильный сигнал. Точная идентификация этой полосы как мРНК ЭПО была достигнута с использованием того же зонда для скрининга - кДНК библиотеки мРНК фетальной печени /25/. Несколько гибридизирующихся клонов было получено с частотой приблизительно 1 положительный на 250000 подвергнутых скринингу рекомбинантов. Полная нуклеотидная и выведенная аминокислотная последовательности для этих клонов /- HEPOF L13 и - HEPOF L8/ представлены в таблицах 5 и 6. ЭПО-кодирующая информация содержится внутри 594 нуклеотидов в 5'-половине кДНК, включая очень гидрофобный 27 аминокислотный лидер и зрелый белок из 166 аминокислот.

Идентификация N-конца зрелого белка была основана на N-концевой последовательности белка, выделяемого в моче людей с апластической анемией, как проиллюстрировано в таблице 1 и как описано в работах Goldwasser /26/, Sue и Sytkowski /27/ и Yangawa /21/. В настоящее время неизвестно, представляет ли этот N-конец /Ala-Pro-Pro-Arg---/ фактический N-конец, обнаруживаемый у ЭПО при циркуляции, или происходит некоторое расщепление его в почке или моче.

Аминокислотные последовательности, которые подчеркнуты в таблице 2 и 3, обозначают те триптические фрагменты или участок N-конца, для которых получена информация о белковой последовательности. Выведенная аминокислотная последовательность точно согласовывается с триптическими фрагментами, которые были секвенированы, подтверждая, что выделенный ген кодирует человеческий ЭПО.

Структура и последовательность гена ЭПО человека Относительно положения ДНК вставок четырех независимых геномных клонов ЭПО человека показаны на фиг. 3. Гибридизационный анализ этих клонированных ДНК при помощи олигонуклеотидных зондов и различных зондов, полученных от двух классов клонов кДНК ЭПО, определил положение гена ЭПО внутри области приблизительно 3,3 т. п.о, показанной затемненной линией на фиг. 3. Полный анализ последовательности этой области /см. пример 4/ и сравнение с клонами кДНК привели к получению карты интронной и экзонной структуры гена ЭПО, показанной на фиг. 4. Ген ЭПО разделяют на 5 экзонов. Часть экзона I, полные экзоны II, III и IV, а также часть экзона V содержат белок-кодирующую информацию. Оставшиеся части экзонов I и V кодируют 5'- и 3'-нетранслируемые последовательности, соответственно.

Неустойчивая экспрессия ЭПО в клетках COS Для того чтобы наглядно показать, что биологически активный ЭПО может экспрессироваться в системе культуры клеток in vitro, осуществляли исследования экспрессии в клетках CO /58/. Вектор, используемый для промежуточных стадий, а именно, p91023/B/, описан в примере 5. Этот вектор содержит основной поздний промотор аденовируса, последовательность полиаденилирования SV40, SV40-инициатор репликации, энхансер SV40 и ген VA аденовируса. Вставка кДНК в - HEPOF L13 /см. таблицу 6/ была перенесена в вектор p91023/B/ ниже основного позднего промотора аденовируса. Этот новый вектор идентифицирован как pPTF-L13.

Через двадцать четыре часа после трансфекции этой конструкции в штамм M6 клеток COS-1 /Horowitz и др., J. Mol. Appl. Genet. 2:147-149 /1983/ клетки промыли, перевели в свободные от сыворотки среды, после чего клетки собрали через 48 часов. Затем с использованием количественного радиоиммунного анализа для ЭПО /55/ исследовали уровень высвобождения ЭПО в культуральную надосадочную жидкость. В отдельном эксперименте вектор, содержащий кДНК ЭПО из - HEPOF L13, был трансформирован в клетки COS-1, и среды собирали, как описано выше. ЭПО в средах был затем определен количественно любым из двух биологических анализов, проводимых in vitro, а именно, с ³H-тимидином и CFU-E /12, 29/, и любым из двух анализов in vivo, а именно "гипоксическая мышь" и "голодающая крыса" /30, 31/ /см. таблицу 9, пример 17/. Эти результаты показывают, что биологически активный ЭПО продуцируется в клетках COS-1. При помощи Western блоттинга с использованием поликлонального антитела анти-ЭПО, эритропоэтин, продуцируемый клетками COS, показал подвижность на SDS-полиакриламидных гелях, идентичную подвижности нативного ЭПО, полученного из человеческой мочи (пример 8). Таким образом, гликозилирование COS-1-продуцируемого ЭПО, может быть аналогичным тому, что происходит в случае нативного ЭПО.

Различные векторы, содержащие другие промоторы, также могут быть использованы в клетках COS или в клетках других млекопитающих или эукариот. Примеры этих иных промоторов, пригодных в практике настоящего изобретения, включают ранние и поздние промоторы SV40, генный промотор металлотионеина мыши, промотор, обнаруживаемый в длинных концевых повторах ретровирусов птиц или млекопитающих, полиэдральный генный промотор бакуловируса и другие. Примерами других типов клеток, а также клетки млекопитающих, такие как CHO /яичник китайского хомячка/, C127 /эпителий обезьяны/, ЗТЗ /мышиный фибробласт/, CU-1 /почка африканской зеленой мартышки/ и клетки насекомых, такие как клетки от Spodoptera frugiperda и Drosophila melanogaster. Эти дополнительные промоторы и/или типы клеток могут обеспечить возможность регулирования тайминга или уровня экспрессии ЭПО, продукцию специфичного для данных клеток типа ЭПО, наращивание больших количеств ЭПО-продуцирующих клеток в менее дорогостоящих, более легко контролируемых условиях.

Систему экспрессии, которая сохраняет преимущества экспрессии в млекопитающих, однако, требует меньше времени для продуцирования клеточной линии с высоким уровнем экспрессии, образуют линии клеток насекомых и ДНК-вируса, который репродуцируется в этой клеточной линии. Вирус представляет собой вирус ядерного полиэдроза. Он имеет геном в виде двунитевой кольцевой ДНК размером 128 т.п.о. Нуклеокапсид имеет палочковидную форму и упакован в двух формах, а именно, неокклюдированной форме (мембранный почкующийся вирус), и окклюдированной форме (упакован в белковый кристалл в зараженном клеточном ядре). Эти вирусы могут быть обычным путем размножены in vitro в культуре клеток насекомых и применены для всех обычных методов вирусологии животных. Культуральные среды клеток - это обычно питательный солевой раствор и 10%-ная фетальная телячья сыворотка.

In vitro вирусный рост инициируется, когда неокклюдированный вирус /НОВ/ входит в клетку и продвигается к ядру, где он реплицируется. Репликация является ядерной. В течение начальной фазы /8-18 часов постинфекции/ вирусной аппликации нуклеокапсиды собираются в ядре и впоследствии проходят через плазменную мембрану как НОВы, распространяя инфекцию по культуре клеток. Кроме того, некоторые нуклеокапсиды впоследствии /еще 18 часов постинфекции/ остаются в ядре и закупориваются в белковой матрице, известной как полиэдральное внутриклеточное включение /ПВВ/. Эта форма не является инфекционной в культуре клеток. Матрица состоит из белка, известного как полиэдрин, молекулярный вес 33 кд. Каждое ПВВ имеет приблизительно 1 мм в диаметре, и в ядре могут быть до 100 ПВВ. Ясно, что позже, в цикле заражения продуцируется большое количество полиэдрина, оно составляет до 25% общего количества клеточного белка.

Так как ПВВ не играет роли в цикле репликации in vitro полиэдриновый ген может быть убран из вирусной хромосомы без какого бы то ни было влияния на жизнеспособность in vitro. При использовании вируса в качестве вектора экспрессии заявитель заменил область, кодирующую полиэдриновый ген, инородной ДНК, подлежащей экспрессии, поместив ее под контроль полиэдринового промотора. Это привело к вирусному фенотипу, не образующему ПВВ.

Эта система использовалась несколькими исследователями, наиболее известными из которых являются Pennock и др. и Smith и др. Pennock и др. /Cregory D. Pennock, Cnarles Shoemaker u Lois K.Miller, Molecular and Cell Biology 3:84, стр. 399-406/ сделали сообщение о высокоэффективной экспрессии бактериального белка - галактозидазы, когда тот помещен под контроль полиэдринового промотора.

Другой вектор экспрессии на основе вируса ядерного полиэдроза представлен Smith и др. /Gale E. Smith Max D. Summers и M.J.Fraser, Molecular and Cell Biology, 16 мая 1983, стр. 2156-2165). Авторы продемонстрировали эффективность их вектора посредством экспрессии человеческого - -интерферона. Синтезированный продукт, как и следовало ожидать, был обнаружен гликозилированным и выделенным из клеток насекомых. В примере 14 описаны модификации плазмиды, содержащей полиэдр-ген вируса ядерного полиэдроза Antographa Californica /AcNPY/, которые позволяют осуществить легкую вставку гена ЭПО в плазмиду так, что он может находится под транскрипционным контролем полиэдринового промотора. Полученную ДНК контрансфецируют с ДНК интактной хромосомы из AcNPY дикого типа в клетки насекомых. Событие генетической рекомбинации приводит к замещению области полиэдринового гена AcNPY с дезоксирибонуклеиновой кислотой из плазмиды. Полученный рекомбинантный вирус может быть идентифицирован среди вирусного потомства по наличию последовательностей ДНК гена ЭПО. Этот рекомбинантный вирус при реинфекции клеток насекомых, как и ожидалось, продуцирует ЭПО.

Примеры экспрессии ЭПО в CHO, C127 и ЗТЗ, а также в клетках насекомых представлены в примерах 10 и 11 /CHO/, 13 /C127 и ЗТЗ/ и 14 /клетки насекомых/.

Рекомбинантный ЭПО, полученный в клетках CHO, как в примере 11, был очищен традиционными методами колоночной хроматографии. Относительные количества сахаров, присутствующих в гликопротеиде, анализировали двумя самостоятельными методами: (I) Reinhold, Methods in Enzymol. 50:244-249 /Метанолиз/ и (II) Takemoto, H. и др. Anal. Biochem. 145:245, 1985 пиридил-аминирование, совместно с самостоятельным определением сиаловой кислоты. Результаты, полученные каждым из этих способов, были в превосходном согласии. Таким образом было проделано несколько определений, что дало средние значения, где N-ацетилглюкозамин для сравнительных целей дан как значение 1: Сахар - Относительный молярный уровень N-Ацетилглюкозамин - 1 Гексозы: - 1,4 Галактоза - 0,9 Манноза - 0,5 N-Ацетилнейраминовая кислота - 1 Фукоза - 0,2 N-Ацетилгалактозамин - 0,1 Примечательно, что значительные уровни содержания фукозы и N-ацетилгалактозамина воспроизводимо наблюдались при использовании обоих самостоятельных методов анализа на сахар. Присутствие N-ацетилгалактозамина указывает на наличие O-сцепленного гликозилирования белка. Наличие O-сцепленного гликозилирования далее отмечалось анализом гликопротеида в SDS-PAGE после его переваривания различными сочетаниями гликозидных ферментов. В частности, вслед за ферментативным отщеплением всего N-сцепленного углевода гликопротеида с использованием пептид-эндо F N-гликозидазы молекулярная масса белка как определено анализом SDS-PAGE, еще более снижалась после последовательного переваривания нейраминидазой.

Биологическая активность in vitro очищенного рекомбинантного ЭПО была опробована методом C.Krystal, Exp.Hematol., 11:649, 1983 /биопроба на пролиферацию клеток селезенки/ с определениями белка, рассчитанными на основе данных по аминокислотному составу. После многократных определений удельная активность in vitro очищенного рекомбинантного ЭПО была найдена составляющей более, чем 200000 единиц/мг белка. Среднее значение находилось в интервале 275000-30000 единиц/мг белка. Кроме того, также наблюдались значение выше, чем 300000. Отношения активности in vivo /анализ полицитемических мышей, Kazal и Ersleu, Am. Clinical Lab., Sci., Том B, стр. 91 /1975// к активности in vitro, исследованные для рекомбинантного материала, находились в интервале 0,7 - 1,3.

Интересно сравнить представленную выше характеристику гликопротеида с характеристикой рекомбинантного CHO-продуцируемого ЭПО, ранее изложенной в Международной заявке на патент N WO 85/02810 /опубликована 20 июня 1985 года/. Аналогичный сравнительный анализ, показывает, что значение для фукозы и N-ацетилгалактозамина равны 0, тогда как отношение гексозы: N-ацетилгалактозамин равно 15,09:1. Отсутствие N-ацетилгалактозамина указывает на отсутствие O-сцепленного гликозилирования в ранее приведенном гликопротеиде. В противоположность этому материалу охарактеризованный выше рекомбинантный CHO-продуцируемый ЭПО настоящего изобретения содержит значительные и воспроизводимо обнаруживаемые количества как фукозы, так и N-ацетилгалактозамина, содержит менее 1/10 относительного количества гексоз и отличается наличием O-сцепленного гликозилирования. Более того, высокая удельная активность вышеописанного рекомбинантного ЭПО на основе CHO может быть непосредственно связана именно с особенностями гликозилирования.

Биологически активный ЭПО, полученный эукариотической экспрессией клонированных генов ЭПО настоящего изобретения, может быть использован для лечения in vivo млекопитающих врачами и/или ветеринарами. Количество активного компонента, безусловно, будет зависеть от жесткости режима, выбранного пути введения и удельной активности активного ЭПО, и в конечном счете, будет определено лечащим врачом или ветеринаром. Такое количество активного ЭПО, определенное лечащим врачом, упоминается здесь как "эффективное для лечения количество ЭПО".

Например, при лечении индуцированной у овцы гипопролиферативной анемии, ассоциированной с хронической почечной недостаточностью, эффективное суточное количество ЭПО найдено равным 10 единицам/кг в течение 15-40 дней. См. Eschbach и др., J.Clin. Invest. 73:434 /1984/.

Активный ЭПО может вводиться любым путем, подходящим для используемых условий. Предпочтительна инъекция ЭПО в кровоток млекопитающего. Специалисту станет ясно, что предпочтительный путь введения изменяется с выбранным режимом.

В то время как активный ЭПО можно вводить как чистое или в основном чистое соединение, предпочтительно иметь его в виде фармацевтической композиции или препарата.

Композиции настоящего изобретения, как для ветеринарного, так и для медицинского применения, содержат белок активного ЭПО, как описано выше, вместе с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями его и, по выбору, другими терапевтическими средствами. Носитель /носители/ может быть "приемлемым" в смысле его совместимости с другими компонентами композиции и не вредным для его реципиента. Желательно, чтобы композиция не включала окислитель и другие вещества, с которыми, как известно, несовместимы пептиды. Композиции могут быть представлены в единичной лекарственной форме и могут быть получены любым из способов, хорошо известных в области фармацевтики. Все способы включают стадию связывания активного компонента с носителем, который включает один или более вспомогательных компонентов. В основном, рецептуры приготавливают путем однородного и тщательного смешения активного компонента с жидкими носителями или тонкоизмельченными твердыми носителями, или с обоими, после чего, если необходимо, осуществляют формование продукта.

Композиции, пригодные для парэнтерального введения, включают стерильные водные растворы активного компонента с растворами, предпочтительно изотоническими по отношению к крови реципиента. Такие композиции можно приготавливать путем растворения твердого активного компонента в воде для получения водного раствора, а придание стерильности указанному раствору может достигаться в одноразовых или многодозовых контейнерах, например, запаянных ампулах или пробирках.

ЭПО/кДНК, как используется здесь, включает зрелый ЭПО/кДНК ген, которому предшествует кодон ATG, и ЭПО/кДНК, кодирующую аллельные варианты белка ЭПО. Один аллель проиллюстрирован в таблицах 2 и 3. Белок ЭПО включает 1-метионин-производное белка ЭПО /Met-ЭПО/ и аллельные варианты белка ЭПО. Созревший белок ЭПО показан последовательностью в таблице 2 и начинается с последовательности Ala, Pro, Pro. Arg ..., начало которой изображено цифрой "1". Met-ЭПО должен начинаться с последовательности Met, Ala, Pro.Pro. Arg....

Следующие примеры даны для содействия в понимании настоящего изобретения, действительный объем которого изложен в прилагаемой формуле изобретения. Понятно, что в предлагаемых методах могут быть выполнены модификации в пределах сущности настоящего изобретения. Все температуры выражены в градусах по Цельсию и не откорректированы. Знаком для микрона или микро, например микролитра, микромоля и т.д., служит "мк", например, мкл, мкм и т.д.

Примеры Пример 1. Выделение геномного клона ЭПО ЭПО очищают от мочи пациентов, страдающих апластической анемией, в основном, как описано ранее /Miyake и др., J. Biol. Chem., 252:5558 /1977//, за исключением того, что опускают фенольную обработку и заменяют термообработкой при температуре 80^o в течение 5 минут для инактивации нейраминидазы. Конечной стадией очистки является фракционирование на колонке C-4 Vydak высокоэффективной жидкостной хроматографии /Группа Сепараций/ с использованием 0 - 95% ацетонитрильного градиента с 0,1% трифторуксусной кислотой /ТФК/ в течение 100 минут. Положение ЭПО в градиенте определяют электрофорезом в геле и анализом 11-концевой последовательности /21, 26, 27/ основных пиков. ЭПО элюирует при 53% ацетонитрила и обнаруживают приблизительно 40% белка, подвергаемого высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой. Фракции, содержащие ЭПО, выпаривают до 100 мкл, доводят до pH 7,0 бикарбонатом аммония, переваренного до готовности 2%-ным, ТРСК-обработанным трипсином /Worthington/ в течение 18 часов при температуре 37^o. Триптический перевар затем подвергают ВЭЖХ с обращенной фазой, как описано выше. Записывают оптическую плотность при 280 и 214 нм. Хорошо отделенные пики выпаривают почти до сухости и подвергают непосредственно анализу N-концевой аминокислотной последовательности /59/, используя газофазный секвенатор Модели 480A Applied Biosystems. Полученные последовательности приведены в таблицах 2 и 3. Как описано здесь выше, два из этих триптических фрагментов отбирают для синтеза олигонуклеотидных зондов. Из последовательности, Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys /аминокислоты 46-52 в таблицах 2 и 3), получают 17-членник с 32-кратной вырожденностью: A A A TTCCANGGGTAGAAGTT и 18-членник с 128-кратной вырожденностью A A A CCANGCGTAGAAGTTNAC Из последовательности Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg /аминокислоты 144 - 150 в таблицах 2 и 3/, получают два пула 14-меров, с 32-кратной вырожденностью каждый TTGN T T TTGN T T TACACTAACTTCCT и TACACTAACTTCTT которые отличаются в первом положении лейцинового кодона. Олигонуклеотиды помечают на 5'-конце ³²P, используя полинуклеотидкиназу /New England Biolacs/ и гамма ³²P-ATP /New England Nuclear/. Удельная активность олигонуклеотидов варьирует между 1000 и 3000 дюйм³/ммол олигонуклеотида. Геномную ДНК-библиотеку человека в бактериофаге лямбда /Lawn и др., 22/ подвергают скринингу с использованием модификации методики амплификации in situ, первоначально описанной Woo и др. /47/ /1978/. Приблизительно 3,5 10⁵ фага высевают с плотностью 6000 на 150 мм чашку Петри /среда NZCYM/ и инкубируют при температуре 37^o до тех пор, пока бляшки не станут видимыми, однако маленькими /приблизительно 0,5 мм/. После охлаждения при температуре 4^o в течение 1 часа дупликатные реплики полученных картин переносят на найлоновые мембраны /New England Nuclear/ и инкубируют в течение ночи при температуре 37^o на чашках со свежими средами NZCYM. Затем фильтры денатурируют и нейтрализуют флотированием каждого в течение 10 минут на тонкой пленке 0,5Н NaOH - 1М NaCl и 0,5М Tris /pH 8/ - 1М NaCl, соответственно. Вслед за вакуумной сушкой при температуре 80^o в течение 2 часов фильтры промывают в 5 х SSC, 0,5% SDS в течение 1 часа, и клеточные остатки на поверхности фильтров удаляют путем осторожного соскоба сухой тканью. Это соскабливание снижает фоновое связывание зонда с фильтрами. Фильтры затем промывают водой и предварительно гибридизируют от 4 до 8 часов при температуре 48^o в 3М растворе тетраметиламмонийхлорида, 10 мМ NaPO₄ /pH 6,8/, 5 x Denhardt's, 0,5% SDS и 10 мМ ЭДТА, 17-членник, меченый ³²P, затем прибавляют при концентрации 0,1 пмол/мл и гибридизацию осуществляют при температуре 48^o в течение 72 часов. Вслед за гибридизацией фильтры промывают в 2 х SSC /0,3М NaCl - 0,03М нитрат натрия, pH 7/ при комнатной температуре и затем в течение 1 часа в 3М TMACl - 10 мМ NaPO₄ /pH 6,8/ при комнатной температуре и от 5 до 15 минут при температуре гибридизации. Приблизительно 120 сильных дупликатных сигналов обнаруживают вслед за 2-х дневной авторадиографией усиливающим экраном. Положительные сигналы отбирают, группируют в пулы из 8, пересевают и вновь подвергают скринингу в трипликате с использованием 1/2 пула 14-членников на каждом из двух фильтров и 127-членник - на третьем фильтре. Условия и 17-членник для высевания и гибридизации такие, как описано выше, за исключением того, что гибридизацию для 14-мера осуществляют при температуре 37^o. Вслед за авторадиографией зонд из 17 нуклеотидов удаляют с фильтра в 50%-ном формамиде в течение 20 минут при комнатной температуре, и фильтр повторно гибридизируют при температуре 52^o с 18-членным зондом. Два независимых фага гибридизируются со всеми тремя зондами. ДНК одного из этих фагов /обозначена здесь - HEPO1/ переваривают полностью с помощью Sau3A и субклонируют в M13 для анализа ДНК-последовательности с использованием дидезокси-метода обрыва цепи, предложенного Sanger и Consol /23/ /1977/. Нуклеотидная последовательность и выведенная аминокислотная последовательность открытой рамки считывания, кодирующей триптический фрагмент ЭПО /подчеркнутая область/, описаны здесь. Интронные последовательности даны в строчных буквах, экзонные последовательности /87 нуклеотидов/ даны в прописных буквах. Последовательности, которые соответствуют сайтам акцептора /a/ и донора /d/ сплайсинга, подчеркнуты. /См. таблицу 4/.

Пример 2. Northern анализ мРНК печени плода человека.

5 мкг мРНК человеческой фетальной печени /получена из 20-недельной фетальной печени/ и мРНК печени взрослого подвергают электрофорезу в 0,8%-ном агарозном формальдегидном геле и переносят на нитроцеллюлозу, используя метод Derman и др., Cell, 23:731 /1981/. Однонитевой зонд затем получают из матрицы M13, содержащей вставку, показанную в таблице 1. Праймером является 20-членник, происходящий из того же триптического фрагмента, что и первоначальный 17-членный mer зонд. Зонд получают, как ранее описано Anderson и др. , PNAS /50/ /1984/, за исключением того, что вслед за расщеплением SmaI /которое продуцирует нужный фрагмент длиной 95 нуклеотидов, содержащий 74 нуклеотида кодирующей последовательности/ малый фрагмент очищают от матрицы M13 хроматографией на колонке с Сефарозой C14B в 0,1 N NaOH - 0,2М NaCl. Фильтр гибридизиру