Фрагмент днк, кодирующий иммуногенный поверхностный полипептид мерозоитов, иммуногенный полипептид (варианты) и способ его получения, рекомбинантная плазмидная днк и способ ее получения, способ получения рекомбинантного вируса вакцины, способ получения микроорганизма, вакцина против кокцидиоза птицы

Фрагмент днк, кодирующий иммуногенный поверхностный полипептид мерозоитов, иммуногенный полипептид (варианты) и способ его получения, рекомбинантная плазмидная днк и способ ее получения, способ получения рекомбинантного вируса вакцины, способ получения микроорганизма, вакцина против кокцидиоза птицы

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии и может быть использовано для защиты живых организмов от кокцидиоза. Фрагмент ДНК, кодирующий иммуногенный поверхностный полипептид мерозоитов Eimeria tenella молекулярной массы 33 кДа. При экспрессии этого фрагмента в клетках микроорганизмов образуется указанный иммуногенный полипептид. Фрагмент ДНК, кодирующий полипептид, встраивают в подходящий вектор. Вектором трансформируют клетки микроорганизмов. Выделяют целевую рекомбинантную ДНК из клеток, в которых произошла экспрессия полипептида. Целевой полипептид выделяют из культурной среды. Фрагмент ДНК, кодирующий данный полипептид, клонируют в подходящем векторе. Встраивают в плазмиду для рекомбинации, содержащую ген ТК вируса вакцины. Трансформируют культивируемые клетки полученной плазмидой рекомбинации температурочувствительным вирусом вакцины и вирусом вакцины дикого типа. Выращивают трансформированные клетки при повышенной температуре. Выделяют ТК-негативный вирус вакцины. Заражают им культивируемые клетки. Отбирают целевой рекомбинантный вирус вакцины по наличию гена мерозоитов. Вакцина содержит рекомбинантный вирус вакцины, содержащий фрагмент ДНК или иммуногенный поверхностный полипептид мерозоитов и физиологически приемлемый носитель. Изобретение позволяет получить важные вакцинные антигены, которые играют существенную роль в защите домашней птицы от кокцидиоза. 9 с.п. ф-лы, 1 табл. 15 ил.

Заявленное техническое решение относится к новому антигену паразитических простейших рода Eimeria. Этот антиген может быть различным образом использован для защиты домашней птицы от кокцидиоза.

Кокцидиоз - это заболевание домашней птицы, которое вызывается паразитическими простейшими рода Eimeria. Оно встречается в больших хозяйствах, интенсивно занимающихся разведением домашней птицы. Ежегодно для химиотерапии заболевания только в одних США используется более 100 млн.долл. Развитие устойчивости к известным антикокцидиальным препаратам требует постоянной разработки новых лекарств, в то время как стоимость этих работ становится очень дорогой и, кроме того, возникает необходимость в уменьшении содержания остатков лекарственных препаратов в животной пище.

Протективный иммунитет к естественной кокцидиальной инфекции хорошо изучен. Показано, что контролируемое ежедневное введение в течение нескольких недель небольшого количества жизнеспособных ооцист вызывает развитие полного иммунитета к инфекции, вызванной нормальной вирулентной дозой возбудителя /Rose et al., Parasitology 73 : 25, 1976; Rose et al., Parasitology 88 : 199, 1984/. Создание приобретенной устойчивости к инфекции делает возможным разработку вакцины для развития иммунитета у молодых цыплят, при этом отпадает необходимость в химических кокцидиостатиках. Действительно этот подход был применен фирмой Sterwin Labaratories, Opelika, AL, разработавшей препарат Кокцивак^TM.

Имея в виду создание вакцины против кокцидиоза, Murray et al., заявка на Европейский Патент N 167443, приготовили экстракты из спорозоитов или спорулированных ооцист Eimeria tenella, которые содержали по крайней мере 15 полипептидов, многие из которых были ассоциированы с поверхностными белками спорозоитов. Инъекция этих экстрактов цыплятам уменьшала повреждения слепой кишки при последующем оральном введении вирулентных спорулированных ооцист E.tenella.

Вслед за этим Schenkel et al., Патент США N 4650676, получили моноклональные антитела к мерозоитам E.tenella. С помощью этих антител Schenkel et al. идентифицировали определенное количество антигенов, к которым были направлены эти антитела. Предварительная инкубация спорозоитов E.tenella с полученными антителами при дальнейшем введении таких спорозоитов в слепую кишку цыплят уменьшала количество повреждений по сравнению с контролем, когда для инъекции использовались необработанные спорозоиты.

С помощью технологии рекомбинантных ДНК Newman et al. /Заявка на Европейский Патент N 164176/ клонировали ген, кодирующий антиген мол. массы 25 кДа, который обнаруживается у спорозоитов E.tenella. Сыворотка цыплят, неоднократно иммунизированных убитыми спорозоитами E.tenella, преципитировали этот антиген в мембранных препаратах спорозоитов и иодированных препаратах спороцист. Затем Jenkins /Nucleic Acids Res, 16 : 9863, 1988/ описал кДНК, кодирующую участок поверхностного белка /мол. масса 250 кДа/ мерозоитов Eimeria acervulina. Экспрессию продукта, кодируемого этой кДНК, определяли с помощью антисыворотки и E.acervulina.

Совершенствование технологии рекомбинантных ДНК позволило разработать другой подход к проблеме, а именно создание субъединичной вакцины. Примеры таких вакцин приведены в заявках на Европейский патент N 324648, 337589 и 344808.

Настоящее изобретение относится к иммуногенным полипептидам, имеющим аминокислотную последовательность (1) (SEQ ID NO:1) (см в конце описания). и которые могут быть использованы для генерации иммунного ответа на антигены Eimeria, например у цыплят. Описываемый здесь белок - предшественник поверхностного антигена мерозоитов Eimeria имеет аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности (1) (SEQ ID NO : 1).

Предпочтительным полипептидом согласно настоящему изобретению является иммуногенный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность (1) (SEQ ID NO : 1), но утративший на N-конце аминокислотную последовательность, соответствующую сигнальному пептиду. Изобретение, кроме того, охватывает функционально эквивалентный полипептид аминокислотной последовательности SEQ ID NO : 1, в которой определенные аминокислотные участки заменены на другие, делетированы или вставлены, причем без существенного изменения иммуногенных свойств первоначального пептида.

Далее, данное изобретение охватывает ДНК, кодирующую целиком или часть белка - предшественника поверхностного антигена мерозоитов Eimeria, например ДНК нуклеотидной последовательности (A) (SEQ ID NO : 2) (см. в конце описания) или ДНК, соответствующую частям этой нуклеотидной последовательности, например ДНК нуклеотидной последовательности (B). Последовательность B аналогична (A) (SEQ ID NO : 2), но не имеет нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнальный пептид. Кодон ATG предпочтительно добавляется к началу молекулы ДНК, входящей в состав более крупной молекулы, имеющей аминокислотную последовательность (A) (DEQ ID NO : 2). Эту операцию осуществляют хорошо известными методами. Кроме того, данное изобретение включает рекомбинантные векторы, содержащие указанные ДНК и обеспечивающие их экспрессию в совместимых организмах - хозяевах, и микроорганизмы, несущие такие векторы.

Далее, изобретение относится к способу получения указанных выше полипептидов, который предусматривает: а/ культивирование микроорганизма, содержащего рекомбинантный вектор, несущий ДНК нуклеотидной последовательности, которая кодирует указанный полипептид, например ДНК нуклеотидной последовательности (A) (SEQ ID NO : 2) или ее фрагмент, например нуклеотидную последовательность (B), в условиях, обеспечивающих экспрессию этой ДНК или ее фрагмента и б/ выделение рекомбинантного полипептида из культуры.

Кроме того, изобретение охватывает вакцину для защиты от кокцидиоза /например, человека или животных/, содержащую эффективное количество одного или более полипептидов, описанных выше, и физиологически подходящий носитель. Предпочтительно вакцина используется для защиты домашней птицы /например, цыплят и индюшат/. В других случаях это могут быть домашние животные, такие как кролики или овцы.

Изобретение включает и вакцины для защиты против кокцидиоза, которые содержат рекомбинантный вирус. В состав вируса входит последовательность ДНК, кодирующая указанный выше полипептид, и вирус способен обеспечить экспрессию этой последовательности. Кроме того, в состав вакцины входит подходящий физиологический носитель.

Далее, изобретение относится к способу защиты от кокцидиоза, заключающемуся в том, что эффективным количеством вакцины иммунизируют соответствующий организм, который чувствителен к кокцидиозу, например цыплят.

Полипептиды Eimeria, которые являются предметом настоящего изобретения, - это важные вакцинные антигены, поскольку они идентифицированы с помощью антител, содержащихся в сыворотке животных, иммунизированных против кокцидиоза и вследствие этого ставших иммунными. Поэтому, наиболее вероятно, что данные полипептиды сыграют существенную роль в защите домашней птицы от кокцидиоза.

Изобретение может быть понято более быстро с помощью рисунков, которые описаны ниже.

На фиг. 1 показана нуклеотидная последовательность молекулы к ДНК /1,2 кв/, которая кодирует белок - предшественник Eimeria распознаваемый с помощью специфических антител из иммунной сыворотки кроликов или цыплят. Как видно из фиг. 1, нуклеотидная последовательность указанного белка начинается с кодона ATG /A соответствует 68 нуклеотиду/ и заканчивается стоп - кодоном TAA /T соответствует 1013 нуклеотиду/, кодируя 315 аминокислот. Кроме того, на фиг. 1 показана аминокислотная последовательность белка - предшественника Eimeria, которая была предсказана на основе данной нуклеотидной последовательности. Для обозначения нуклеотидов и аминокислот используются стандартные буквенные коды, которые можно расшифровать с помощью обычного биохимического учебника; например см. Lehninger, Principles of Biochemistry, 1984, Worth Punlishers, Inc., New York, pp. 96, 798.

На фиг. 2 приведены результаты электрофоретического разделения различных белков мерозоитов Eimeria в полиакриламидном геле, содержащем додецилсульфат натрия /SDS/. На фиг. 2A показаны результаты иммуноблоттинга, т.е. взаимодействия препарата тотальных белков мерозоитов с контролем /а/ или специфическими антителами /б/. Стрелкой отмечена полоса, содержащая белок мол. массы около 23 кДа. Фиг. 2 B - это авторадиограмма, показывающая иммунопреципитацию поверхностных белков мерозоитов, меченных ¹²⁵J, с контролем /a/ и специфическими антителами /b/. На фиг. 2 C показано разделение полной смеси белков, образовавшихся в результате трансляции in vitro poly /A/ РНК мерозоитов /c/, а также: результаты иммунопреципитации этих продуктов с антителами, отобранными с помощью клона 5-7 фага лямбда /b/; антителами, выделенными с помощью другого фагового клона, который продуцирует белки, взаимодействие с сывороткой к мерозоитам /a/; и с контрольными антителами, выделенными из сыворотки к мерозоитам с помощью нерекомбинантных фагов /d/. Полосы проявляли путем флуорографии. Положение маркеров мол. массы, /которая выражена в килодальтонах, кДа/, отмечено на рисунках справа.

На фиг. 3 показаны результаты Саузерн - блоттинга геномной ДНК спорулированных ооцист Eimeria tenella, которая была расщеплена рестриктазами Pvu II /линия 1/, Hinc II /линия 2/, Pst I /линия 3/, Sph I /линия 4/ или Sac I /линия 5/, с EcoR I - Фрагментом клона 5-7 в качестве пробы. Положения стандартных ДНК, имеющих известные размеры в кв. показаны справа.

На фиг. 4 приведено схематическое изображение плазмиды pDS56/RBSII /без указания масштаба/. Здесь и далее на фиг. 6, 8 и 10 символы B, E, H, P, D, X, и Xb обозначают сайты расщепления для рестриктаз BamH I, EcoR I, Hid III, Pst I, Sal I, Xho I и Xba I соответственно. обозначает регулируемый элемент промотор/опиратор N 250PS N 250P29; обозначает сайты связывания рибосом RBS II, RBSI (-1) или RBS II (-2); __ обозначает кодирующие участки, находящиеся под контролем этих сайтов связывания рибосом; обозначает терминаторы t_o или T₁, как показано; обозначен участок, необходимый для репликации плазмиды в E. coli /repl/; обозначены кодирующие области для хлорамфениколацетилтрансферазы /cat/ и - лактамазы /bla/.

На фиг. 5 приведена полная нуклеотидная последовательность плазмиды pDS56/RBSII. На этой последовательности отмечены сайты расщепления, распознаваемые соответствующими рестриктазами, перечисленными в описании к фиг. 4. Аминокислотная последовательность представляет собой открытую рамку считывания, находящуюся под контролем сайта связывания рибосом RBSII.

На фиг. 6 схематически изображена плазмида pDS56/RBSII (-1) (без указания масштаба).

На фиг. 7 приведена полная нуклеотидная последовательность плазмиды pDS56/RBSII (-1). На этой последовательности отмечены сайты расщепления, распознаваемые рестриктазами, приведенными на фиг. 6. Аминокислотная последовательность представляет собой открытую рамку считывания, находящуюся под контролем сайта связывания рибосом RBSII (-1).

На фиг. 8 схематически изображена плазмида pDS56/RBSII (-2) /без указания масштаба/.

На фиг. 9 приведена полная нуклеотидная последовательность плазмида pDS56/RBSII (-2). На последовательности отмечены сайты расщепления, распознаваемые рестриктазами, приведенными на фиг. 8. Аминокислотная последовательность представляет с обой открытую рамку считывания, находящуюся под контролем сайта связывания рибосом RBSII (-2).

На фиг. 10 схематически изображена плазмида pDMI /без указания масштаба/. Символы и обозначения точно такие же, как на фиг. 4, только обозначает области, кодирующие Lac -репрессор /lac I/ и неомицинфосфотрансферазу /neo/.

На фиг. 11 /11a, b и c/ показана полная нуклеотидная последовательность плазмиды pDMI. 1. На этой последовательности отмечены сайты расщепления, распознаваемые рестриктазами, приведенными на фиг. 10. Показанная нуклеотидная последовательность включает открытые рамки считывания, кодирующие неомицинфосфотрансферазу (от Met до Phe) и lac-репрессор /от Met до Gln/. Пожалуйста, обратите внимание на обратную ориентацию этого гена.

На фиг. 12 схематически изображена плазмида pV C8 - TK - 7.5K. На этой схеме и на фиг. 13 и 15 аббревиатура ТК обозначает ген тимидинкиназы в вирусе вакцины; 7,5К обозначает промотор 7,5 К вируса вакцины, lac Z содержит регуляторные последовательности и кодируемую информацию для части N-концевого участка гена - галактозидазы; ori обозначает область, необходимую для репликации ДНК в клетках E. coli, и AmpR обозначат ген - лактамазы.

На фиг. 13 схематически изображена рекомбинантная плазмида pR3.

На фиг. 14 показаны полная нуклеотидная последовательность рекомбинантной плазмиды pR3. Приведенная нуклеотидная последовательность представляет собой открытую рамку считывания, находящуюся под контролем промотора 7.5 К вируса вакцины.

На фиг. 15 схематически изображена плазмида pR4. ML обозначает лидерную последовательность малярийного антигена.

Все процитированные работы полностью приведены в списке литературы.

Используемые в описании термины имеют следующее значение.

"Поверхностный антиген Eimeria - это белок с мол. массой около 23 кДа/ по данным электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем SDS, SDS-PAGE/, который обнаруживается у Eimeria tenella на стадии мерозоитов. Этот белок образует in vivo в результате посттрансляционного процессинга продукта, который кодируется последовательностью кДНК, приведенной на фиг. 1.

"Белок - предшественник" - это протеин с мол. массой около 33 кДа /по данным SDS - PAGE/. Полагают, что in vivo в результате протеолитического расщепления этого белка образуется поверхностный антиген Eimeria. Нуклеотидная последовательность кДНК, колирующей белок - предшественник, и предсказанная на ее основе аминокислотная последовательность, приведены на фиг. 1.

"Иммуногенные полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность (1) и способные индуцировать иммунный ответ против паразитических простейших рода Eimeria" - это полипептиды, обеспечивающие B - и/или T-клеточный протективный иммунитет по отношению к Eimeria, мерозоиты которых содержат описанный выше поверхностный антиген, соответствующий последовательностям иммуногенных полипептидов. Иммуногенные полипептиды могут быть самим по себе поверхностным антигеном зрелых мерозоитов Eimeria, свободным от других белков Eimeria, или фрагментами данного поверхностного антигена, способными специфическим связываться с антителами, которые обнаруживаются в сыворотке животных, инфицированных паразитическими Eimeria. Эти полипептиды соответствуют эпитопам описанного выше поверхностного антигена Eimeria, которые распознаются T- и B-клетками. Полипептиды, которые охватывает настоящее изобретение, кроме того, могут быть и функциональными эквивалентами данного поверхностного антигена мерозоитов Eimeria, и иметь аминокислотную последовательность, полученную на основе последовательности, приведенной на фиг. 1, путем замены определенных аминокислот, причем такого рода замены не оказывают значительного влияния на иммунологическую активность /другими словами, существенно не изменяют иммунореактивность и/или структуру антигенных детерминант/.

Примером фрагмента иммуногенного полипептида может служит полипептид, который имеет аминокислотную последовательность (1) /SEQ ID NO:1/ за исключением того, что эта последовательность утратила первые 20 - 100 аминокислотных остатков, представляющих собой последовательность сигнального пептида. Другой пример - это иммуногенный полипептид, который по данным электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS имеет мол. массу около 23 кДа. К предпочтительным фрагментам относятся следующие: SNNQQTSV (2)(SEQ ID NO:3) CGDEEDADEGTSQQASRRRRKPDTPAADK (3)(SEQ ID NO:4) PNV (4)(SEQ ID NO:5) RNKQIF (5)(SEQ ID NO:6) NPWTGQEE (6)(SEQ ID NO:7) RQSEE (7)(SEQ ID NO:8) TRQTLE (8)(SEQ ID NO:9) QDGKTAKEEVEGGKTHRRYKVKSSDPGYG (9)(SEQ ID NO:10) TDEDG (10)(SEQ ID NO:11) TGPHG (11)(SEQ ID NO:12) ASQGK (12)(SEQ ID NO:13) DDGKGNLVDGQGRK (13)(SEQ ID NO:14) and TQPDTEFRSGPGDDEDDE (14)(SEQ ID NO:15).

Фрагменты, охватываемые данным изобретением, как и иммуногенный полипептид последовательности (1) (SEQ ID NO:1), способны индуцировать иммунный ответ различных организмов против кокцидиоза. Предпочтительно с этой целью используется домашняя птица, например цыплята. Известно, что в белках могут происходить аминокислотные замены, которые не оказывают существенного влияния на биологические и иммунологические свойства данных белков. Это явление, например, описано Neurath et al. в книге "Белки", Academic Press, New York /197/, в частности на стр. 14, где приведен фиг. 6. Наиболее частые замены аминокислот наблюдаются в случаях Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly /причем в обоих направлениях, т. е. например Ala замещается на Ser и наоборот/. Поскольку генетический код является вырожденным, могут существовать различные потенциально возможные нуклеотидные последовательности /функциональные эквиваленты/, которые способны кодировтаь аминокислотную последовательность (1) (SEQ ID NO:1). Кроме того, следует понимать, что заявляемые здесь нуклеотидные последовательности молекул ДНК и их фрагментов, встроенные в векторы, могут включать нуклеотиды, которые не являются частью действительно структурных генов, так же как и то, что рекомбинантные векторы, содержащие такие последовательности или фрагменты, способны направлять продукцию заявленных полипептидов в соответствующем организме - хозяине.

Последовательности ДНК, кодирующие пролипептиды, которые представляют собой функциональные эквиваленты поверхностного антигена мерозоитов Eimeria, могут быть получены без особых затруднений с помощью подходящих синтетических олигонуклеотидов путем сайт-специфического мутагенеза, направляемого затравкой, как это сделано на примере заявленной кДНК. Данный метод описан Morinaga et al. /Biotechnology, 2 : 636, 1984/.

Фрагменты или части поверхностного белкового антигена мерозоитов Eimeria или кодирующие их последовательности ДНК могут быть получены путем энзиматического расщепления более крупных молекул с помощью рестрикционных эндонуклеаз в случае ДНК и протеиназ в случае белков. Однако охватываемые настоящим изобретением фрагменты, не ограничиваются продуктами, которые получены в результате какого-либо энзиматического расщепления, но и включают в себя субпоследовательности, концевые участки которых не соответствуют каким-либо точкам энзиматического расщепления. Такие фрагменты могут, например, быть получены путем химического синтеза с помощью описанной здесь последовательности. ДНК - фрагменты могут быть получены и в результате синтеза неполностью комплементарных ДНК /кДНК/ на основе изолированных матричных РНК /мРНК/. Кроме того, фрагменты белка могут быть получены и в результате экспрессии соответствующих фрагментов ДНК, кодирующих эти белки. Такие белковые фрагменты могут использоваться согласно настоящему изобретению, если содержат достаточное число аминокислотных остатков, чтобы образовать антигенную детерминанту и/или обеспечить иммунореактивность. В целом, для этого нужно по крайней мере около 7-8 аминокислотных остатков. Как объяснено ниже, может возникнуть необходимость в соединении таких фрагментов с молекулой иммуногенного носителя для придания им иммунологической реактивности.

Под иммунологической реактивностью понимают как способность генерировать образование антител B-клетками /гуморальный иммунитет/, так и способность активировать T-клетки /клеточный иммунитет/. Заявленные полипептиды содержат B-клеточные и T-клеточные антигенные детерминанты /эпитопы/. Гуморальный иммунитет может быть продемонстрирован путем индукции образования антител B-клетками in vivo или in vitro. О клеточно-опосредованном иммунитете можно судить по активации T-клеток, например, увеличению синтеза T-клеточных белков или стимуляции B-клеток активированными T-клетками. Методы исследования обоих типов иммунитета хорошо известны.

Полипептиды, представляемые к защите в пределах материалов данной заявки, могут быть получены известными способами, например, с помощью технологии рекомбинантных ДНК, путем химического синтеза или выделены из тотальных препаратов белков Eimeria. При этом полипептид последовательности 1 /SEQ ID NO: 1/ и соответствующие фрагменты в значительной степени свободны от других белков, образуемых паразитическими простейшими рода Eimeria.

ДНК, необходимая для получения заявляемых белков, может быть химически синтезирована с помощью нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:2 /кроме того, информация об этом приведена и на рисунках/. Такой метод химического синтеза может быть выбран из большого числа широкоизвестных методов, и например, представляет собой синтез ДНК на твердой подложке из фосфорамидита /Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103 : 3185, 1981/.

Альтернативный путь - это синтез кДНК на мРНК Eimeria. Матричную РНК можно изолировать из мерозоитов Eimeria обычными методами. Затем образцы мРНК могут быть использованы для образования двухцепочечной кДНК, как описано в кн. Maniatis et al. /Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spting Harbor, NY/. Далее кДНК можно встроить в подходящий клонирующий вектор, который затем используют для трансформации соответствующего организма - хозяина /например E. coli/, чтобы получить библиотеку кДНК.

После этого проводят скрининг библиотеки кДНК, используя заявляемый клонированный ген или его фрагменты в качестве пробы. Такой ген или фрагменты с этой целью могут быть помечены, например путем ник-трансляции с помощью ДНК - полимеразы 1 в присутствии четырех дезоксирибонуклеотидов, один из которых содержит ³²P в - положении /Maniatis et al., см. предыдущую ссылку, стр. 109/. Кроме того, пробы могут быть получены путем олигонуклеотидного синтеза на основе известной последовательности кДНК поверхностного антигена Eimeria.

Несмотря на то, что для выделения мРНК в приведенных ниже примерах использовались простейшие Eimeria tenella, клонированные гены простейших этого вида могут быть использованы в качестве проб для выделения генов других видов Eimeria из-за гомологии последовательностей ДНК различных видов Eimeria.

ДНК Eimeria, которые выделены и идентифицированы согласно настоящему изобретению, встраивают в соответствующий вектор экспрессии, содержащий элементы, необходимые для транскрипции и трансляции встроенных генных последовательностей. Полезные клонирующие векторы могут содержать фрагменты хромосомальных, нехромосомальных и синтетических последовательностей ДНК, например широко известные бактериальные плазмиды, вирусные ДНК /например фаговые ДНК/, комбинированные ДНК плазмид и вирусов или фагов /например плазмиды, которые модифицированы для использования фаговой ДНК или других последовательностей контроля экспрессии/, а также плазмиды дрожжей. Специфические клонирующие векторы, которые могут быть использованы, включают, но не ограничиваются, pEV - vrf-плазмидами /pEV-vrf1, - 2 и 3, которые описаны Growl et al. , Gene 38 : 31, 1985/; SV 40; аденовирусами; векторами дрожжей; векторами лямбда - gt - WES-лямбда B; Charon 4A и 28, лямбда - gt-2; векторами на основе M 13, например pVC8, 9, 18 и 19, pBR313, 322 и 325; pAC105; pVA51; pACY177; pKH47; pACYC184; pUB110; pMB9; colE1; pSC101; pML21; RSF2124; pCR1 или RP4; векторами на основе вирусов куриной оспы, вирусов вакцины или других видов герпесвирусов.

Встраивание генов Eimeria в клонирующий вектор легко осуществляется, когда гены и соответствующий клонирующий вектор разрезаются одним и тем же /одними и теми же/ фрагментом /ферментами/ таким образом, что образуются комплементарные концы ДНК. Если это не может произойти, то необходимо модифицировать концы таким образом, чтобы образовались тупые концы ДНК /путем переваривания одноцепочечной ДНК/. Этого же результата достигают, надстраивая одноцепочечные концы с помощью подходящей ДНК - полимеразы. Далее осуществляют лигирование тупых концов с помощью фермента T4 ДНК-лигазы. Альтернативно, любой нужный участок ДНК можно получить, связывая нуклеотидные последовательности /линкеры/ с концами ДНК. Такие линкеры могут содержать специфические олигонуклеотидные последовательности, которые содержат сайты рестрикции. Расщепленный вектор и гены или фрагменты генов Eimeria могут быть модифицированы и в результате присоединения гомополимерных "хвостов", как описано Morrow /Methods in Enzymology, 68 : 3, 1979/.

Многие из клонирующих векторов, которые могут быть использованы в данном изобретении, содержат один или более маркеров, служащих для отбора нужных трансформантов, например гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину в pBR322, ген устойчивости к ампициллину и ген - галактозидазы в pUC8 ген устойчивости к ампициллину в pEV-vrf плазмидах. Селекция клеток - хозяев, трансформированных такими векторами, существенно облегчается в том случае, если клетки лишены активности, которая обеспечивается вектором.

Следует понимать, что нуклеотидные последовательности генов Eimeria, которые встраиваются в селективные сайты клонирующего вектора, могут включать нуклеотиды, не являющиеся частью действительно структурных генов. С другой стороны, гены могут содержать только какую-нибудь одну часть полного гена дикого типа. Все, что требуется в данном случае, это, чтобы фрагменты генов после введения в клонирующий вектор были способны направлять синтез в соответствующем организме - хозяине полипептида или белка, имеющего по крайней мере одну иммунореактивную и/или антигенную детерминанту поверхностного антигена Eimeria. Так, рекомбинантные векторы, содержащие ДНК с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует белок, заявляемый в настоящем изобретении, могут быть получены следующим образом: а/ ДНК нуклеотидной последовательности, кодирующей указанный белок, встраивают в вектор; б/ данный вектор реплицируют в микроорганизмах и в/ изолируют рекомбинантный вектор из микроорганизмов Селекцию соответствующих клеток - хозяев осуществляют различными, хорошо известными методами, например основанными на совместимости клеток и выделяемого вектора, токсичности белков, кодируемых гибридной плазмидой, легкости определения нужного белка, характеристиках экспрессии, безопасности клеток - хозяев и их стоимости. Необходимо учитывать соотношение этих факторов и следует понимать, что не все клетки - хозяева одинаково эффективны для экспрессии определенной рекомбинантной молекулы ДНК.

Подходящие клетки - хозяева, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают клетки растений, млекопитающих, дрожжей или бактерий, но не ограничены ими. Среди бактерий могут быть использованы Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus sterothermophilus и Actinomyces. В частности, можно применить штамм MC 1061 E. coli, описанный Casadabanetal. /J. Mol. Biol, 138 : 179, 1980/ или любой другой штамм E. coli K 12, содержащий плазмиду pRK248clta. Плазмида pRK248clts для использования в других штаммах E. coli K 12 описана Bernhard et al. /Meth. of Enzymol, 68 : 482, 1979/ и, кроме того, может быть получена из Американской коллекции типовых культур под каталожным номером АТСС 33766. Штамм MC 1061 E. coli можно приобрести коммерческим путем, например в лаборатории CLONTECH Inc., Palo Alto, СА, США, а также в Американской коллекции типовых культур под каталожным номером АТСС 53338. Плазмиды pDMI.1, pDS56/RBSII, - 1 или - 2 для использования в E. coli штамма M 15 описаны ниже.

Перенос рекомбинантного клонирующего вектора в клетки - хозяева осуществляют различными методами. В зависимости от выбранной системы вектор/клетка-хозяин такой перенос может произойти в результате трансформации, трансдукции, трансфекции, или электропорации. Затем модифицированные клетки - хозяева культивируют и белковый продукт экспрессии выделяют из культуры.

Трансформированные клоны, в которых образуется белок - предшественник поверхностного антигена Eimeria, идентифицируют путем скрининга при использовании сыворотки животных, иммунизированных препаратами спорозоитов или мерозоитов E. tenella, фиксированных глутаральдегидом. В примерах, описанных ниже, для отбора и характеристики генных продуктов используют кроличью сыворотку к мерозоитам E. tenella. Параллельно для независимо кДНК белка - предшественника поверхностного антигена мерозоитов применяют иммунологический скрининг с иммунной сывороткой цыплят.

Специфичность антисывороток, используемых для иммунологического скрининга или иммунопреципитации, можно увеличить с помощью модифицированного метода селекции антител, описанного Hall et al. /Nature 311 : 379, 1984/. Согласно данному методу, который более подробно раскрыт ниже, антитела, специфичные к белкам Eimeria, полученным при отборе соответствующих клонов, адсорбируют на фильтрах.

Выявление клонов, продуцирующих антигены Eimeria, можно осуществить каким-либо хорошо известным стандартным методом, например иммунопреципитацией, твердофазным иммуноферментным анализом /ELISA/ и радиоиммунологическим методом, которые описаны в литературе /см. например Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, под редакцией Kennet et al., Plenum Press, New York, pp. 376 - 384, 1980 Рекомбинантные векторы, содержащие ДНК, которые кодируют вариантные полипептиды поверхностного антигена Eimeria, заявленного в объеме данного изобретения, могут быть получены с помощью хорошо известных методов, например путем сайт - специфического мутагенеза.

Большие количества рекомбинантных полипептидов Eimeria, охватываемых настоящим изобретением, могут быть получены при культивировании трансформированных микроорганизмов в ферментационном бульоне, содержащем необходимые питательные вещества, и подборе условий, обеспечивающих экспрессию рекомбинантной ДНК. Получаемые с помощью E. coli рекомбинантные полипептиды Eimeria обычно содержатся в цитоплазме бактериальных клеток или в бактериальных тельцах включения. Таким образом, для высвобождения белков необходимо разрушить внешнюю оболочку бактерий. Это достигается при ультразвуковой обработке клеток или при механической гомогенизации, например с помощью пресса Френча или гомогенизатора Голена /см. Charm et al., Meth. Enzymol. 22, 476 - 556, 1971/.

Разрушение клеток можно осуществить химическими или энзиматическими методами. Так, для интеграции мембран часто необходимы двухвалентные катионы, поэтому обработка клеток соответствующими хелатирующими агентами, например ЭДТА или ЭГДА, в достаточной степени обеспечивает их разрушение и высвобождение внутриклеточных белков. С этой же целью могут быть использованы ферменты, например лизоцим, который гидролизует пептидогликаны клеточной стенки.

Кроме того, применяют метод осмотического шока. Вначале клетки помещают в гипертонический раствор, где они теряют воду и сморщиваются. Последующий перенос клеток в гипотонический "шоковый" раствор вызывает быстрый приток воды в клетки и выброс из них нужных белков.

Высвобожденные из клеток белки Eimeria могут быть сконцентрированы преципитацией солями, например сульфатом аммония, ультрафильтрацией и другими хорошо известными методами. Дальнейшую очистку проводят с помощью традиционных способов очистки белков, которые включают гель-фильтрацию, ион-обменную хроматографию, препаративный диск - гель - электрофорез или электрофорез на бумаге /мембране/, изоэлектрофокусирование, фракционирование в органических растворителях при низкой температуре или встречное распределение, но не ограничиваются ими. Кроме того, белки очищают путем иммуноаффинной хроматографии.

Специальные методы очистки белков Eimeria, полученных в различных организмах, известны /см. например, Newman et al., заявка на Европейский патент N 164176/.

Заявленные в соответствии с настоящим изобретением белки и их фрагменты могут быть синтезированы каким-либо подходящим химическим методом, например ограниченным синтезом на твердой фазе, частичным синтезом на твердой фазе, конденсацией фрагментов или классическим синтезом в растворе. Твердофазный синтез, описанный Merrifield /J.Am. Chem, 85 : 2149, 1963/ предпочтителен.

Твердофазный синтез основан на использовании аминокислот, у которых защищены терминальные - аминогруппы. Трифункциональные аминокислоты, имеющие подвижные боковые группы, тоже защищают соответствующим образом, чтобы предотвратить химическую реакцию в нежелательном участке в процессе сборки пептида. Защитные - аминогруппы селективно удаляют, чтобы могла идти дальнейшая реакция на соответствующих концевых участках аминокислот. Условия удаления таких защитных групп подбирают таким образом, чтобы боковые цепи остались защищенными.

Известны многочисленные - аминозащитные группы, которые используются при одноступенчатом синтезе пептидов. Они включают ацилзащитные группы /например формил, трифторацетил, ацетил/, ароматические уретановые группы [например бензилоксикарбонил /Cbz/ и замещенный бензилоксикарбонил], алифатические уретановые защитные группы [например t-бутилоксикарбонил /Вoc/, изопропилоксикарбонил, циклогексилоксикарбонил] и алкильные защитные группы /например, бензил, трифенилметил/. Предпочтительно использование Boc. Защитные группы боковых цепей, в частности для тирозина /Tyr/, включают тетрагидропиранил, трет-бутил, тритил, бензил, Cbz, 4-Br-Cbz и 2,6-дихлорбензил. Для защиты боковых цепей тирозина предпочтительно используется 2,6-дихлорбензил. Защитные группы боковых цепей, в частности для аспарагина /Asp/ включают бензил, 2,6-дихлорбензил, метил, этил и циклогексил. Предпочтительно использовать циклогексил. Защитные группы боковых цепей триптофана /Thr/ и серина /Ser/ включают ацетил, бензоил, тритил, тетрагидропиранил, бензил, 2,6-дихлорбензил и Cbz. Для защиты аминогрупп боковых цепей Thr и Ser предпочтительно использование бензила. Защитные группы боковых цепей аргинина /Arg/ включают нитрогруппы, Tos, Cbz, адамантилоксикарбонил или Boc. Предпочтительно использовать Tos. Аминогруппы боковых цепей лизина защищают с помощью Cbz, 2-Cl-Cbz, Tos или Boc. Предпочтительно использовать 2-Cl-Cbz. Выбор защитных групп боковых цепей основан на следующем. Эти защитные группы в процессе синтеза пептида остаются интактными и не расщепляются при удалении защитных групп концевых участков аминокислот. Защитные группы боковых цепей должны быть удалены после завершения синтеза всего пептида при подборе таких условий, которые не нарушают его целостности.

Обычно твердофазный синтез проводят, начиная с карбоксильных остатков аминокислот, присоединяя аминокислоты с защищенными - аминогруппами /защищенными боковыми цепями/ к подходящей твердой подложке. При соединении с хлорметилированной или гидрометилированной смолой образуется эфирный мостик и образовавшийся пептид имеет свободную карбоксильную группу на C-концевом участке. В противоположность этому, при использовании бензилгидроаминной или n-метилбензгидриламинной смолы образуется амидная связь и полученный пептид имеет карбоксиамидную группу на C-концевом участке. Смолы коммерчески до