Способ оценки прооксидантной и антиоксидантной активности биохимических и физических факторов

Способ оценки прооксидантной и антиоксидантной активности биохимических и физических факторов

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, токсикологии и фармакологии. Способ состоит в том, что от испытуемых животных, обработанных исследуемыми препаратами или факторами, получают жизнеспособные монослои клеток лейкоконцентрата венозной крови или бронхоальвеолярной лаважной жидкости, которые инкубируют с зимозановыми гранулами и раствором нитросинего тетразолия. На фиксированных и окрашенных кармином клетках монослоев при микроскопировании оценивают число и интенсивность окрашивания зимозановых гранул с отложениями диформазина. На основании этих исходных данных рассчитывают индекс продукции анион-радикалов и удельную продукцию анион-радикалов для конкретного типа клеток лейкоконцентрата венозной крови или бронхоальвеолярной лаважной жидкости и сравнивают их с контрольными. Под влиянием прооксидантов расчетные показатели увеличиваются, а под влиянием антоксидантов - уменьшаются относительно контроля. Способ позволяет упростить и обеспечить более адекватную оценку степени воздействия прооксидантных или антиоксидантных препаратов и факторов на продукцию анион-радикалов фагоцитирующими клетками. 2 з.п.ф-лы, 2 табл.

Настоящее изобретение относится к медицине, фармакологии и токсикологии и может быть использовано в медикобиологических исследованиях для определения про- и антиоксидантной активности различных факторов, в том числе лекарственных, токсических и экологических.

Известны способы оценки антиоксидантной активности лекарственных препаратов, ингибиторов активных форм кислорода и ферментативных антиоксидантов по определению уровня малонового диальдегида на спектрофотометре или по регистрации хемилюминесценции на хемолюминометре в гомогенатах тканей и других экспериментальных системах [1, 2].

Известен также спектрофотометрический способ оценки генерации анион-радикалов O₂ (АР) под влиянием антиоксидантов и низкой температуры с помощью восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) альвеолярными макрофагами (АМф). К суспензии альвеолярных макрофагов крыс добавляют частицы латекса и 0,4% раствор НСТ, затем инкубируют при 37^oC. После инкубации реакцию останавливают добавлением соляной кислоты, центрифугируют, удаляют супернатант, а к клеткам добавляют пиридин и ставят на кипящую баню для экстрагирования образовавшегося в ходе реакции диформазана. Затем проводят спектрофотометрирование при длине волны 515 нм. Количество супероксиданион-радикала выражают в относительных единицах оптической плотности [3].

Недостатками известных способов являются: 1) регистрация методом хемилюминесценции суммарного пула активных форм кислорода (анион-радикалов, синглетного кислорода, перекиси водорода и др.) всеми типами клеток в исследуемом образце и невозможность определения продукции каких-либо активных радикалов селективно, например, анион-радикалов, без применения специфических, дефицитных и дорогостоящих люминофоров (фолазина, люцигенина и аналогов люциферина) [1, 2]; 2) невозможность увидеть и оценить оксидантный потенциал какого-то одного типа клеток в неоднородной клеточной популяции (например, в гомогенате ткани, клетках крови, респираторном тракте, перитонеальной полости и т.д.) [1, 2, 3]; 3) необходимость разделения клеток на отдельные фракции с помощью градиента фиколла-верографина, состоящего из дефицитных и дорогостоящих компонентов, с последующим определением хемилюминесценции и экстинкции в каждой из отдельных клеточных фракций [1, 2, 3]; 4) необходимость использования очень токсичного и опасного вещества пиридина [3].

5) необходимость использования дорогостоящих приборов (хемолюминометра и спектрофотометра) [1, 2, 3].

Из известных способов оценки прооксидантного и антиоксидантного эффекта препаратов и факторов наиболее близким (прототипом) по технической сущности и достигаемому результату является способ определения антиоксидантной активности химических соединений, включающий воздействие препаратами на биологический объект (нейтрофилы человека), индукцию свободно-радикального окисления и оценку про- и антиоксидантной активности по разнице интенсивности хемолюминесценции нейтрофилов (Нф) крови в присутствии и в отсутствие исследуемого соединения [4].

Однако способ-прототип имеет следующие недостатки: 1) регистрируется люминол-зависимая хемилюминесценция суммарного пула активных форм кислорода (анион-радикалов, перекиси водорода и др.) в исследуемом образце клеток и невозможно определить селективно продукцию анион-радикалов без применения высокоспецифических, дефицитных и дорогостоящих люминофоров (фолазина, люцигенина и аналогов люциферина); 2) при регистрации хемилюминесценции невозможно увидеть и оценить оксидантный потенциал какого-то одного типа клеток в неоднородной клеточной популяции (например, в гомогенате тканей, клетках крови, респираторном тракте, перитонеальной полости и т.д.); 3) необходимо применять длительную и трудоемкую процедуру выделения нейтрофилов крови (или других клеток) на градиенте фиколла-верографина, состоящего из дефицитных и дорогостоящих компонентов, а потом определять хемилюминесценцию в полученной фракции нейтрофилов (или других клеток); 4) необходимо использовать дорогостоящий прибор - хемолюминометр.

Задачей настоящего изобретения является упрощение способа и обеспечение более адекватной оценки степени воздействия прооксидантных или антиоксидантных препаратов и факторов на продукцию анион-радикалов фагоцитирующими клетками за счет повышения селективности способа и обеспечения возможности определения продукции анион-радикалов разными типами фагоцитирующих клеток одновременно в одном исследуемом образце, а также устранение необходимости использования дорогостоящих приборов и реактивов.

Осуществление поставленной задачи достигается тем, что в способе оценки прооксидантной и антиоксидантной активности биохимических и физических факторов путем воздействия указанными факторами на биологический объект, индукции свободно-радикального окисления и оценки про- и антиоксидантной активности по разнице между биофизическими показателями при воздействии и в отсутствие воздействия исследуемых факторов, согласно изобретению в качестве биологического объекта используют монослои клеток лейкоконцентрата крови и/или бронхоальвеолярной лаважной (БАЛ) жидкости, полученные от животных, на которых воздействуют исследуемыми факторами in vivo, т. е. на организм животного в целом, а в качестве биофизических показателей используют показатели продукции анион-радикалов клетками монослоев лейкоконцентрата крови и/или бронхоальвеолярной лаважной жидкости, причем после формирования монослоев клеток к ним добавляют зимозановые гранулы (ЗГ) и нитро синий тетразолий (НСТ) в концентрациях, достаточных для последующего микроскопического исследования полученных препаратов, на основании которого в условных единицах (у. е.) рассчитывают индекс продукции анион-радикалов (ИПАР) фагоцитирующими клетками по формулам для АМф ИПАР = Nд⁺ЗГ/100 АМф Ид⁺ЗГ/10 АМф (у. е.), для Нф крови ИПАР = Nд⁺ЗГ/100 Нф Ид⁺ЗГ/10 Нф (у. е.), и удельную продукцию анион-радикалов (УПАР) фагоцитирующими клетками по формулам: для АМф УПАР = ИПАР N АМф/г легких (у.е./г легких), для Нф крови УПАР = ИПАР N Нф/мм³ крови (у.е./мм³ крови), где N - число Nд⁺ЗГ - число диформазан-положительных ЗГ для 100 однотипных клеток в монослое (АМф, Нф): Ид⁺ЗГ - интенсивность окрашивания диформазан-положительных ЗГ для 10 однотипных клеток в монослое (АМф, Нф), и при понижении расчетных показателей ИПАР и УПАР относительно контрольных констатируют антиоксидантную активность, а при их повышении относительно контрольных - прооксидантную активность воздействующих факторов селективно по влиянию на продукцию анион-радикалов.

В качестве биохимических факторов используют полисахарид зимозан, полученный из дрожжевых клеток, вводимый однократно внутривенно в организм животных в дозе 100 мг/кг, и альфа-токоферол, вводимый внутрибрюшинно в организм животных в разовой суточной дозе 100 мг/кг в течение 8 суток, а в качестве физического фактора - содержание животных при -7^oC в течение 8 суток. Указанные дозы вводимых препаратов и параметры физических факторов обеспечивают изменение численности альвеолярных макрофагов, их фагоцитарной способности и продукции ими анион-радикалов.

К монослою клеток добавляют зимозановые гранулы в концентрации 50-100 частиц на клетку с последующей инкубацией с ними в течение 1-2 часов и удалением нефагоцитируемых гранул, а нитросиний тетразолий добавляют к монослою клеток в количестве 0,2 мл, в концентрации 0,02-0,04% в бесцветной среде Хенкса с последующей инкубацией в течение 30-45 мин. Указанные количественные данные позволяют в оптимальных условиях провести микроскопические исследования.

Использованные дозы, схемы введения, сроки исследования влияния зимозана, альфа-токоферола и воздействия холода, возможные концентрации клеток, ЗГ и НСТ, а также длительность инкубации были подобраны в предварительно проведенных экспериментах.

Для сравниваемых значений продукции анион-радикалов в опыте и контроле необходимо соблюдать одинаковые условия инкубации клеток на каждом этапе.

Преимуществом предлагаемого способа по сравнению с прототипом является возможность селективного определения продукции анион-радикалов при воздействии исследуемых факторов на образцы клеток, а также возможность оценки оксидантного потенциала какого-то одного типа клеток в неоднородной клеточной популяции.

Совместно с другими параметрами данные о продукции анион-радикалов позволяют более объективно оценить прооксидантную и антиоксидантную активность биохимических и физических факторов.

Кроме того, предлагаемый способ позволяет наблюдать и оценивать под микроскопом функциональное состояние разных типов фагоцитирующих клеток лейкоцитов крови, не требует разделения лейкоконцентрата и БАЛ-жидкости на клеточные фракции, например, путем центрифугирования на градиенте фиколла-верографина, что упрощает и удешевляет технологический процесс.

Способ осуществляют следующим образом. Лабораторных животных подвергают in vivo воздействию биохимических или физических факторов. Лейкоконцентрат венозной крови из ретроорбитального синуса этих животных или БАЛ-жидкость получают в соответствии с описанными методами [5]. Не разделяя лейкоконцентрат или БАЛ-жидкость на клеточные фракции, добавляют питательную среду для культивирования, содержащую 10% сыворотки, доводят до концентрации 1 млн. кл./мл. Далее 0,5 мл суспензии клеток вводят в каждую камеру, приклеенную на предметном стекле, инкубируют при 37^oC в течение 1-2 час для осаждения клеток, прикрепления их к стеклу и получения жизнеспособных монослоев этих клеток.

Полученные монослои клеток инкубируют в течение 1-2 час с ЗГ (d=4 мкм, 50-100 частиц/кл.), а затем - в течение 30 мин с (0,02-0,04)% раствором НСТ в бесцветной среде Хенкса. В результате восстановления НСТ анион-радикалами в процессе фагоцитирования ЗГ клетками полученных монослоев происходит отложение сине-фиолетового диформазана на ЗГ. Камеры снимают, монослои высушивают, ядра клеток окрашивают кармином и после микроскопирования оценивают индекс продукции анион-радикалов в условных единицах на основании числа диформазан-положительных ЗГ на 100 однотипных клеток, а также площади и интенсивности отложений диформазана на ЗГ для 10 однотипных клеток. Это обосновано тем, что в результате контакта ЗГ с фагоцитирующими клетками в присутствии НСТ происходит неравномерное отложение сине-фиолетового диформазана на ЗГ. При этом интенсивность и площадь окрашивания ЗГ может быть разной в зависимости от силы индуцируемой генерации АР. В связи с этим, степень окрашивания ЗГ диформазаном оценивают в 3-х балльной системе: 1 - слабая степень окрашивания всей площади одной ЗГ; 2 - средняя степень окрашивания всей площади одной ЗГ; 3 - высокая степень окрашивания всей площади одной ЗГ.

Кроме того, для 10 однотипных клеток с окрашенными ЗГ определяют интенсивность отложений диформазана на ЗГ, т.е. вычисляют какая часть всей площади ЗГ занята диформазаном определенной степени окрашивания. Например: 1) если 0,5 площади одной ЗГ окрашено с интенсивностью 1, то Ид⁺ЗГ = 0,5 1 = 0,5; 2) если 0,75 площади одной ЗГ окрашено с интенсивностью 2, то Ид⁺ЗГ = 0,75 2 = 1,5; 3) если 0,25 площади одной ЗГ окрашено с интенсивностью 3, то Ид⁺ЗГ = 0,25 3 = 0,75 и т.д.

В результате микроскопирования получают следующие исходные показатели: Nд⁺ЗГ - число диформазан-положительных ЗГ для 100 однотипных клеток в монослое (АМф, Нф); Ид⁺ЗГ - интенсивность окрашивания диформазан-положительных ЗГ для 10 однотипных клеток в монослое (АМф, Нф).

На основании этих показателей рассчитывают ИПАР - индекс продукции анион-радикалов для данного типа клеток (АМф, Нф), который представляет собой произведение числа диформазан-положительных ЗГ, в среднем присущего одной клетке, и интенсивности окрашивания диформазан-положительных ЗГ, в среднем присущей одной клетке данного типа.

Для АМф ИПАР = Nд⁺ЗГ/100 АМф Ид⁺ЗГ/10 АМф (у.е.).

Для Нф крови ИПАР - Nд⁺ЗГ/100 Нф Ид⁺ЗГ/10 Нф (у.е.).

Полученные данные статистически сравнивают с контрольными.

При анализе прооксидантного и антиоксидантного эффекта биологических, химических и физических факторов по ИПАР для определенного типа клеток учитывают количество этих клеток в контрольных и опытных образцах БАЛ-жидкости и лейкоконцентрата крови, которое тоже может меняться под влиянием исследуемых факторов. В связи с этим, прооксидантная эффективность воздействующих факторов на уровне целого организма может быть значительно выше при высокой численности данного типа клеток в образцах БАЛ-жидкости и крови. Напротив, антиоксидантная эффективность воздействующих факторов может быть значительно выше при низкой численности данного типа клеток в образцах БАЛ-жидкости и крови. Это служит основанием для расчета УПАР - удельной продукции анион-радикалов для данного типа клеток (АМф, Нф), которая представляет собой произведение ИПАР и концентрации рассматриваемых клеток в образцах БАЛ-жидкости и крови.

Для АМф УПАР = ИПАР N АМф/г легких (у. е. /г легких).

Для Нф крови УПАР = ИПАР N Нф/мм³ крови (у.е./мм³ крови).

Если на препаратах БАЛ-жидкости наблюдается достаточное количество Нф, то одновременно можно рассчитать ИПАР и УПАР не только для АМф, но и для Нф БАЛ-жидкости.

Если на препаратах лейкоконцентрата крови наблюдается достаточное количество моноцитов, то одновременно можно рассчитать ИПАР и УПАР не только для Нф, но и для моноцитов лейкоконцентрата крови.

Оценку прооксидантной или антиоксидантной эффективности биологических, химических и физических факторов делают на основании сравнения ИПАР и УПАР с их контрольными значениями. Чем больше отклонения обоих показателей от контроля, тем выше прооксидантный или антиоксидантный эффект соответствующего фактора в соответствующей дозе.

Пример конкретного применения предлагаемого способа Крысам Вистар в первой группе в качестве биохимического фактора однократно внутривенно вводят дрожжевой полисахарид зимозан в дозе 100 мг/кг массы. Во второй группе в качестве химического фактора внутрибрюшинно в течение 8 сут вводят альфа-токоферол в суточной дозе 100 мг/кг. В третьей группе воздействие физического фактора моделируют содержанием крыс Вистар при -7^oC в течение 8 сут. Оценку прооксидантной эффективности зимозана проводят через 5 сут, прооксидантной эффективности содержания в холоде - через 8 сут и антиоксидантной эффективности альфа-токоферола - через 8 сут после начала эксперимента. Крыс забивают под эфирным наркозом декапитацией с одновременным пережатием трахеи. Перед забоем из ретроорбитального синуса пастеровской пипеткой в пробирки с гепарином берут венозную кровь, из которой получают лейкоконцентрат. Легкие промывают средой 199 с гепарином. После подсчета клеток в камере Горяева получают монослои клеток БАЛ-жидкости и лейкоконцентрата крови в специально смонтированных на предметном стекле микрокамерах при инкубации в течение часа 0,510⁶ клеток в среде 199 с 10% сыворотки. Затем полученные монослои инкубируют с ЗГ (50 частиц на клетку) в течение 2-х час. После этого монослои ополаскивают и добавляют 0,2 мл 0,02% раствора НСТ в бесцветной среде Хенкса и инкубируют еще 30 мин при 37^oC. Далее снимают камеры, монослои ополаскивают, высушивают, фиксируют и окрашивают кармином. После микроскопирования при увеличении 1000 получают исходные данные.

I. Оценку прооксидантной и антиоксидантной эффективности препаратов по ИПАР и УПАР для АМф в монослое БАЛ-жидкости осуществляют на основании исходных данных, приведенных в таблице 1 (отклонения от средних значений (m) в каждой группе из 4-5 животных меньше 5%).

В контрольной группе: для АМф ИПАР = 0,4 2,8 = 1,12 у.е. (m=0,051) для АМф УПАР = 1,12 4,1 10⁶ = 4,592 10⁶ у.е./г легких (m=0,222) В группе оценки эффективности полисахарида зимозана: для АМф ИПАР = 0,48 4,5 = 2,16 у.е. (m=0,097) для АМф УПАР = 2,16 6,9 10⁶ = 14,9 10⁶ у.е./г легких (m=0,677) В группе оценки эффективности антиоксиданта альфа-токоферола: для АМф ИПАР = 0,29 2,2 = 0,638 у.е. (m=0,029) для АМф УПАР = 0,638 4,5 10⁶ = 2,871 10⁶ у.е./г легких (m=0,138) В группе оценки эффективности воздействия 8-ми сут холода: для АМф ИПАР = 0,56 3,9 = 2,184 у.е. (m=0,099) для АМф УПАР = 2,184 1,7 10⁶ = 3,713 10⁶ у.е./г легких (m=0,145) II. Оценку прооксидантной и антиоксидантной эффективности препаратов по ИПАР и УПАР для Нф в монослое лейкоконцентрата венозной крови осуществляют на основании исходных данных, приведенных в таблице 2 (отклонения от средних значений (m) в каждой группе из 4-5 животных меньше 5%).

В контрольной группе: для Нф ИПАР = 0,45 3,5 = 1,575 y.e. (m=0,069) для Нф УПАР = 1,575 3,8-10³ = 5,985 10³ у.е./мм³ крови (m=0,275) В группе оценки эффективности полисахарида зимозана: для Нф ИПАР = 0,60 5,6 = 3,36 y.e. (m=0,155) для Нф УПАР = 3,36 3,5 10³ = 11,76 10³ у.е./мм³ крови (m=0,531) В группе оценки эффективности антиоксиданта альфа-токоферола: для Нф ИПАР = 0,34 2,6 = 0,884 y.e. (m=0,039) для Нф УПАР = 0,884 4,1 10³ = 3,624 10³ у.е./мм³ крови (m=0,162) В группе оценки эффективности воздействия 8-ми сут холода: для Нф ИПАР = 0,63 4,9 = 3,09 у.е. (m= 0,099) для Нф УПАР = 3,09 4,0 10³ = 12,36 10³ у.е./мм³ крови (m=0,145) На основании сравнения полученных показателей ИПАР и УПАР с соответствующим контролем можно сделать вывод о высокой селективной эффективности зимозана как прооксиданта и высокой селективной эффективности альфа-токоферола как антиоксиданта в указанных дозах и способах введения, поскольку по всем расчетным показателям продукции АР наблюдается практически двукратное отличие от контроля. Содержание животных при -7^oC в течение 8-ми сут оказывает сильное прооксидантное воздействие. Однако на фоне уменьшения численности АМф, УПАР для этих клеток даже ниже контроля, что может отражаться на общем снижении сопротивляемости легких различным инфекционным микроорганизмам в условиях холода, несмотря на повышение прооксидантного потенциала отдельно взятого АМф. Однако это требует осмысления в сочетании с другими показателями воздействия холода.

Если бы на препаратах БАЛ-жидкости было больше Нф, чем наблюдалось в данных примерах, то одновременно можно было рассчитать ИПАР и УПАР не только для АМф, но и для Нф БАЛ-жидкости.

Если бы на препаратах лейкоконцентрата крови было больше моноцитов, чем наблюдалось в данных примерах, то одновременно можно было рассчитать ИПАР и УПАР не только для Нф, но и для моноцитов лейкоконцентрата крови.

Предложенное техническое решение обеспечивает по сравнению с известными следующие преимущества: - способ позволяет оценить прооксидантную или антиоксидантную эффективность препаратов и факторов на основании селективного определения продукции анион-радикалов клетками монослоев лейкоконцентрата крови или БАЛ-жидкости, что дает возможность получения более глубоких знаний о механизмах биологического и фармакологического действия исследуемых факторов и подбора наиболее оптимальных воздействующих доз; - способ упрощает процедуру и расширяет технические возможности одновременного определения продукции анион-радикалов разными типами фагоцитирующих клеток в одном образце лейкоконцентрата крови или БАЛ-жидкости без фракционирования их на градиенте фиколла-верографина; - способ позволяет адекватно оценить степень воздействия прооксидантных или антиоксидантных препаратов и факторов на продукцию анион-радикалов фагоцитирующими клетками без использования дорогостоящих приборов и реактивов.

Источники информации 1. Чайка Л. А., Поволоцкая В. А., Либина В. В. и др. Влияние парацетамола, его комбинаций с ацетилсалициловой и аскорбиновой кислотами на процессы перекисного окисления липидов в печени крыс //Экспериментальная и клиническая фармакология.-1996.-Т. 59, N1.-С. 43-46.

2. Зенков Н.К., Меньшикова Е.Б., Шергин С.М. Окислительный стресс. Диагностика, терапия, профилактика.-Новосибирск, 1993.-181 С.

3. Тнимов М.Х. Взаимосвязь активности макрофагов и перекисного окисления липидов биомембран легких при охлаждении. Диссертация на соискание уч. степ. канд. мед. наук. -Новосибирск, 1986.

4. Авторское свидетельство СССР N 1532869, МПК G 01 N 33/48, опубл. 1989., Бюл. N 48.

5. Е. Д. Гольдберг, А.М.Дыгай, В.П.Шахов. Методы культуры ткани в гематологии. -Томск, Издательство Томского Государственного университета, 1992. -С. 84-85.

Формула изобретения

1. Способ оценки прооксидантной и антиоксидантной активности биохимических и физических факторов путем воздействия указанными факторами на биологический объект, индукции свободно-радикального окисления и оценки про- и антиоксидантной активности по разнице между биофизическими показателями при воздействии и в отсутствие воздействия исследуемых факторов, отличающийся тем, что в качестве биологического объекта используют монослои клеток лейкоконцентрата крови и/или бронхоальвеолярной лаважной жидкости, полученные от животных, на которых воздействуют исследуемыми факторами in vivo, а в качестве биофизических показателей используют показатели продукции анион-радикалов клетками монослоев лейкоконцентрата крови и/или бронхоальвеолярной лаважной жидкости, причем после формирования монослоев клеток к ним добавляют зимозановые гранулы и нитросиний тетразолий в концентрациях, достаточных для последующего микроскопического исследования полученных препаратов, на основании которого в условных единицах (у.е.) рассчитывают индекс продукции анион-радикалов (ИПАР) фагоцитирующими клетками по формулам для АМФ ИПАР = Nд⁺ 3Г/100 АМФ Ид⁺ 3Г/10 АМФ (у.е.), для НФ крови ИПАР = Nд⁺ 3Г/100 НФ Ид⁺ 3Г/10 НФ (у.е.) и удельную продукцию анион-радикалов (УПАР) фагоцитирующими клетками по формулам для АМФ УПАР = ИПАР N АМФ/Г легких (у.е./г легких) для НФ крови УПАР = ИПАР N НФ/мм³ крови (у.е./мм³ крови), где N - число; АМФ - альвеолярные макрофаги; НФ - нейтрофилы; 3Г - зимозановые гранулы; Nд⁺ 3Г - число диформазан-положительных 3Г для 100 однотипных клеток в монослое (АМФ, НФ); Ид⁺ 3Г - интенсивность окрашивания диформазан-положительных 3Г для 10 однотипных клеток в монослое (АМФ, НФ), и при понижении расчетных показателей ИПАР и УПАР относительно контрольных констатируют антиоксидантную активность, а при их повышении относительно контрольных - прооксидантную активность воздействующих факторов селективно по влиянию на продукцию анион-радикалов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве биохимических факторов используют полисахарид зимозан, полученный из дрожжевых клеток, вводимый однократно внутривенно в организм животных в дозе 100 мг/кг, и альфа-токоферол, вводимый внутрибрюшинно в организм животных в разовой суточной дозе 100 мг/кг в течение 8 суток, а в качестве физического фактора - содержание животных при -7^oС в течение 8 суток.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что зимозановые гранулы добавляют к монослою клеток в концентрации 50 - 100 частиц на клетку с последующей инкубацией с ними в течение 1 - 2 ч и удалением нефагоцитируемых гранул, а нитросиний тетразолий добавляют к монослою клеток в количестве 0,2 мл в концентрации 0,02 - 0,04% на бесцветной среде Хенкса с последующей инкубацией в течение 30 мин.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2