Способ получения белка с активностью gm-csf приматов

Способ получения белка с активностью gm-csf приматов

Реферат

 

Изобретение относится к генной инженерии. Разработан способ получения белка с активностью гранулоцитмакрофагколониестимулирущего фактора (GМ - СSF) приматов. В процессе способа осуществляют культивирование дрожжевых или прокариотических клеток после их трансформации рекомбинантным вектором с геном, кодирующим полипептид с установленной аминокислотной последовательностью. Продуцируемый белок представляет собой указанный фактор человека (СSF - Th2 или СSF - Ile ) или гиббона (СSF - G). После культивирования белок выделяют и очищают. Полученный рекомбинантный белок имеет более высокие степень чистоты и уровень биологической активности. 6 з.п.ф-лы, 7 ил.

Изобретение относится к получению белка, обладающего способностью стимулировать рост и дифференциацию первичных кроветворных прогениторных клеток, в частности фактора стимуляции колонии (ФСК). В одном аспекте изобретение обеспечивает способ получения ФСК-белка путем технологии рекомбинантной ДHК, векторы, содержащие ген экспрессии указанного белка, микроорганизмы и клеточные линии, трансформированные указанными векторами, и ФСК-белок, полученный таким образом. Второй аспект изобретения обеспечивает способ выделения и очистки ФСК-белка из природных или рекомбинантных источников и очищенный таким образом ФСК-белок, имеющий степень чистоты и уровень активности выше тех, что были описаны ранее.

Найдено, что многие различные типы клеток крови происходят из многопотенциальных кроветворящих клеток спинного мозга. Клетки спинного мозга выполняют две функции: /1/ они репродуцируют сами себя, в результате чего поддерживается популяция клеток спинного мозга в организме и /2/ они обеспечивают потомство клеток, передающее различия в любых типах зрелых клеток крови. Клетка, которая передает различия по конкретному кроветворному пути, называется клеткой-предшественником. Клетки-предшественники для T-лимфоцитов, B-лимфоцитов, гранулоцитов, красных кровяных клеток, тромбоцитов и эозинофилов, так же как и более ранние предшественники, которые могут индивидуально приводить к увеличению некоторых типов зрелых клеток, были экспериментально изучены как in vivo, так и in vitro /Dexter, T.M., 1983, J. Patology 141, 415-433/. Уже было определено in vitro, что пролиферация и/или дифференциация предшественника каждого типа клеток зависит от определенных "факторов", которые происходили из различных источников. Например, последние предшественники красных кровяных клеток требуют фактора, называемого эритропоиэтином. Факторы, требующиеся для выживания, пролиферации и дифференциации миелоидных предшественников, переходящих в форму зрелых нейтрофильных гранулоцитов, моноцитов и зрелых макрофагов, называют факторами стимуляции колоний (ФСК).

ФСК активность экстенсивно изучалась на мышах. Большинство органов взрослых мышей продуцирует ФСК активность. Однако, композиции, содержащие ФСК активность, которые были получены из различных тканей и различными методами, различаются по своим биохимическим характеристикам. Так, структурное соотношение между различными факторами остается неизвестным. Кроме того, ФСК активность действует на более, чем одной стадии развития гранулоцита и макрофага, и снова точно не известно, единственный ли фактор является ответственным за все наблюдаемые активности или же различные факторы действуют на каждой стадии. / Burgess, A. и Metealf, D. 1980 Blood 56, 947-957/.

Человеческая ФСК активность была получена из плаценты некоторых плодных тканей, макрофагов и стимулированных T-клеток. Линия T-клеток (Mo), которая продуцирует одну или несколько мощных ФСК активностей, была установлена от пациента с вариантом T-клетки "волосатой" клетки лейкемии (лейкемический ретикулоэндотелиозис) /bolde et al, 1978, Blood, 52, 1068-1072).

Способность СК активности стимулировать продуцирование гранулоцитов и макрофагов указывает, что фармацевтические композиции, обладающие ФСК активностью, являются клинически полезными в ситуациях, когда требуется повышенное продуцирование таких типов /миелоидных/ клеток. Действительно, показано, что некоторые пациенты с крайне высокими уровнями по-видимому нормальных циркулирующих гранулоцитов имеют опухоли, которые свврх-продуцируют ФСК. В одном случае, при хирургическом удалении опухоли количество гранулоцитов быстро падает к нормальному уровню, четко подтверждая, что ФСК может быть полезным при регулировании количеств циркулирующих гранулоцитов. /Hockiug, W. Goodinau, J., и Golde, D., Blood, 61, 600 /1983//. В частности, ФСК композиции являются клинически полезными для лечения миело-супрессии, вызванной хемотерапевтическим лечением рака или его лечением с помощью облучения. Кроме того, ФСК композиции являются полезными при лечении сильных инфекций, потому что ФСК может увеличивать и/или активировать количество гранулоцитов и/или моноцитов.

Имеются различные дифференцированные типы известных ФСК активностей, включая гранулоциты. ФСК /G-ФСК/, макрофаг-ФСК/M-ФСК/, гранулоцит-макрофаг ФСК /GM-ФСК/ и мульти-ФСК. Настоящее изобретение в частности относится к GM-ФСК. ФСК-белки являются известными из различных животных источников. Однако настоящее изобретение в частности относится к приметному ФСК, более конкретно к человеческому ФСК и к обезьяньему ФСК.

Биологическая и биохимическая характеристика композиций, обладающих ФСК активностью, и изучение этих композиций в клинических условиях было затруднено до настоящего времени недостаточным количеством и примесями ФСК-композиций человека и/или других приматов. Следует учитывать, что должно быть желательным идентифицировать белок или белки, ответственные за ФСК активность. Кроме того, желательно иметь приматный, в частности человеческий источник такого ФСК, который может легко снабжать такими белками в таких количествах и такой чистоты, которые достаточны для биологической и биохимической характеристики и для использования их в качестве терапевтических агентов.

Разработанные ранее методики молекулярного клонирования делают возможным клонирование нуклеотидной последовательности, которая кодирует белок, и получение такого белка в достаточном количестве, используя подходящую систему хозяин-вектор, /Т. Маниатис "Молекулярное клонирование - Лабораторное руководство", Колд Спринг Харбор Лаборатору, Колд Сиринг Харбор, 1982 г./. Затем белок может быть извлечен по известным методикам выделения и очистки. Методы клонирования, используемые до настоящего времени, могут быть сгруппированы в три основные категории: /1/ способы, основанные на знании структуры белка, например, его аминокислотной последовательности, /2/ способы, основанные на идентификации белка, экспрессированного клонированным геном, с использованием специфического к такому белку антителу; и /3/ способы, основанные на идентификации видов РНК, которые могут быть транслированы для получения белка или активности, кодируемых интересующим геном.

Каждый из этих классов способов становится трудным для применения, когда интересующий белок, такой как ФСК-белок, доступен в очень малом количестве. Следовательно, если трудно получить адекватное количество очищенного белка, то трудно и определить аминокислотную последовательность или даже частичные последовательности белка. Подобным образом, идентификацию экспрессированного белка связывающим антителом предпочтительно проводят при использовании поликлональной антисыворотки с высоким титром. Такая антисыворотка не может быть получена при отсутствии достаточных количеств чистого белка (антигена). Моноклональное антитело предполагает альтернативную попытку, но требуемое антитело также может быть получено с большим трудом при отсутствии подходящего антигена и такое моноклональное антитело не может взаимодействовать с белком в том виде, в каком белок экспрессирован доступной рекомбинантной системой хозяин-вектор. Наконец, трансляция видов РНК для получения идентифицируемого белка или активности требует, чтобы искомая РНК находилась в источнике РНК в достаточном избытке, чтобы получить достоверный белок или сигнальную активность. Относительный избыток РНК, кодирующей конкретный белок, обычно параллелен избытку белка, так что редкий белок обычно кодируется редкой РНК.

Моноклеточную линию использовали как в качестве исходного материала для очистки человеческих ФСК, так и для идентификации соответствующих матричных РНК. Однако даже при таком относительно хорошем источнике ФСК активности оказалось очень трудно выделить белок даже для структурных исследований.

Для того, чтобы решить проблемы, присущие клонированию нуклеотидной последовательности, кодирующей редкий белок, такой как ФСК, с помощью описанных выше способов, разработан новый способ. Этот способ требует только, чтобы генный продукт или его активность могли быть достоверно измерены. Подходящие способы определения ФСК описаны в примере 2 ниже. Во втором аспекте, разработан способ очистки, который пригоден для выделения и очистки белка ФСК как из рекомбинантных, так и природных источников при уровне очистки и активности намного более высоком, чем был ранее возможен.

В его первом аспекте настоящее изобретение решает проблемы известного уровня техники и обеспечивает источник белка, обладающего ФСК активностью, при использовании технологии с рекомбинантной ДНК. В соответствии с настоящим изобретением используется новая методика клонирования, которая требует только пробу для ФСК активности, чтобы клонировать кДНК, кодирующую белок, обладающий ФСК активностью. Итак, настоящее изобретение обеспечивает кДНК, кодирующую белок, обладающий ФСК активностью /т.е. ФСК/кДНК/, микроорганизм или клеточную линию, трансформированную рекомбинантным вектором, содержащим такой ФСК/кДНК, и способ получения ФСК белка путем экспрессии указанной ФСК/кДНК при культивировании микроорганизма или клеточной линии. Поскольку ФСК белок продуцируется из клона в соответствии с настоящим изобретением, мы может быть уверены, что это белок, который обладает ФСК активностью. Далее изобретение заключается в способе получения и изоляции вектора трансформации, содержащего ФСК/кДНК, указанный способ состоит из получения РНК из клетки, продуцирующей ФСК; получения полиаденилированной матричной РНК из указанной РНК; получения однониточной кДНК из указанной матричной РНК; превращения однониточной кДНК в двуниточную кДНК; вставки двуничтоной кДНК в векторы трансформации и трансформирование бактерий указанным вектором для образования колоний; отбора пулов из 200-500 колоний каждый и изоляции плазмиды ДНК из каждого пула; трансфекции плазмиды ДНК в подходящую клетку-хозяина для, экспрессии ФСК белка; культивирования трансфецированных клеток и испытания надосадочного слоя на ФСК активность; отбора ФСК положительных пулов и скринирования колоний, использованных для образования пула, чтобы идентифицировать колонии, обладающие ФСК активностью.

ФСК-белки настоящего изобретения обеспечивают рост и дифференциацию гормонов для клеток миелоидной системы. Например, указывалось на их клиническое использование при лечении миелосупрессии, особенно (симптоматической) гранулоцитопении после хемотерапевтического лечения рака или после его лечения облучением.

На фиг.1 представлены последовательности ДНК, которые кодируют ФСК-белок в соответствии с настоящим изобретением. Последовательность ДНК, представленная полностью, кодирует один вариант человеческого ФСК, упоминаемый как ФСК-Thr. Другой аллель кодирует идентичный продукт с тем исключением, что Thr в положении 100 заменен Ile /ФСК-Ile/. Изменения, показанные выше для человеческой последовательности, представляют собой различия в последовательности ДНК, кодирующей ФСК гиббона /ФСК обезьяны гиббона/ /ФСК-G/. Также показаны уменьшенные последовательности аминокислот.

На фиг. 2 схематически представлено получение плазмиды pTP из плазмиды pAd D26 SV pA /3/.

На фиг. 3 схематически представлено продолжение фиг. 2 и иллюстрируется получение плазмиды p91023 из плазмиды pTPL.

На фиг. 4 схематически представлено продолжение фиг. 3 и показана плазмида p91023 /B/.

На фиг. 6 схематически представлен вектор pTALC-185P.

На фиг. 7 схематически представлен вектор AJ-14.

Следующие определения приведены для облегчения понимания настоящей заявки. По мере того, как определения меняются в зависимости от значений, применяемых на данном уровне техники, приведенные ниже определения даны для контроля.

Амплификация означает процесс, при котором клетки продуцируют копии генов внутри их хромосомальной ДНК.

ФСК представляет собой биологическую активность, определенную путем анализа, описанного здесь.

ФСК-белок представляет собой белок из приматного источника, который проявляет ФСК активность. Для целей настоящего изобретения термин ФСК-белок, включает модифицированный ФСК-белок, аллальные вариации ФСК-белка и ФСК-белок, предшествующий MET-остатку.

Направление вниз означает направление к 3'-концу нуклеотидной последовательности.

Усилитель представляет собой нуклеотидную последовательность, которая может сделать возможной транскрипцию гена независимо от положения усилителя по отношению к гену или от ориентации последовательности.

Ген представляет собой деоксирибонуклеотидную последовательность, кодирующую данный белок. Для целей настоящей заявки ген не должен включать нетранслируемые боковые области, такие как сигналы начала транскрипции РНК, сайты полиаденильного присоединения, промоторы и усилители.

Связывание представляет собой процесс образования фосфоди/сложно/эфирной связи между 5'- и 3'-концами двух нитей ДНК. Оно может быть осуществлено несколькими хорошо известными ферментативными методами, включая связывание тупого конца T4 лигазой.

Ориентация относится к порядку нуклеотидов в последовательности ДНК. Обратная ориентация последовательности ДНК представляет собой последовательность, у которой порядок последовательности 5' к 3' по отношению к другой последовательности является обратным при сравнении указанного места в ДНК, из которой последовательность была получена. Такие указанные точки (места) могут включать направление транскрипции других определенных последовательностей ДНК в источнике ДНК или в источнике репликации реплицируемых векторов, содержащих последовательность.

Транскрипция означает изменение генотипа клеток путем клеточного поглощения экзогенной ДНК. Трансформация может быть детектирована в некоторых случаях путем изменения фенотипа клетки. Трансформированные клетки называются трансформантами. Пре-трансформация клеток указывается в отношении родительских клеток.

Трансляция означает синтез полипептида из матричной РНК.

Активность фактора стимуляции колоний (ФСК) может происходить из ряда клеточных источников, включая кондиционированную среду из периферических моноядерных клеток крови, ткани легких и плаценты, и костного мозга, мочи от анемичных пациентов, сыворотки, и нормальных и неопластичных клеток T-лимфоцита и моноядерного фагоцита. Одна клеточная линия, которая продуцирует ФСК, представляет собой Mo клеточную линию, депонированную и доступную публике из ATCC под кодовым номером CP 8066. ФСК, продуцированный этой клеточной линией, известен как гранулоцитный макрофаг ФСК (или GM-ФСК), и, разумеется, как человеческий ФСК. Одним источником ФСК гиббона является линия Т-клеток, обозначенных ИСД M A-144 и депонированных и доступных для публики из ATCC под кодовым номером HB 9370, депонированы 29 сентября 1983 г.

Для того, чтобы изолировать ФСК клон в соответствии с настоящим изобретением, была использована новая процедура, которая требует только техники определения ФСК-активности. Сначала идентифицируют клетку, которая продуцирует ФСК активность, такую как T-лимфоцитные клетки (или другие источники, такие как представлены выше). Затем собирают мРНК клетки. Предпочтительно используют Т-лиффоцитные клетки. В таком случае отделяют связанную с мембраной мРНК, которая содержит мРНК для лимфокина, от свободной мРНК в клетках. Это отделение, как полагают, обогащает собранную мРНК в 5-10 раз последовательностями для лимфокина и таким образом сокращает усилия, вкладываемые в идентификацию целевого ФСК клона. Затем получают полиаденилированную матричную РНК хроматографией на олиго-dT - целлюлозе.

Готовят банк кДНК из мРНК, используя вектор, подходящий для трансфекции в хозяина для экспрессии целевого белка, обладающего ФСК активностью. Сначала получают нить кДНК с использованием стандартных методик, применяя полученную выше мРНК. Затем превращают гибрид РНК/кДНК в двуниточную форму кДНК. Затем кДНК может быть вставлена в подходящий вектор.

Предпочтительная систем хозяин-вектор для изоляции клона ФСК основана на экспрессии ФСК кДНК в подходящем векторе трансформации. Подходящий вектор трансформации может обеспечить случайное введение ДНК в клетки млекопитающих. /Mellon, P., V. Parker, Y. Gluzman T. Maniatis, 1981 Cell, 27, 279-288/. Для изоляции целевых ФСК-трансформантов не требуется, чтобы все клетки популяции стабильно содержали экзогенные гены, которые экспрессируют целевой ФСК-продукт. Возможно временное вхождение экзогенных генов в субпопуляцию клеток, так что субпопуляция будет экспрессировать целевой продукт в течение нескольких дней. Поскольку нет нужды в отбираемом маркере в векторе трансформации для трансфекции ДНК и системы экспрессии в соответствии с настоящим изобретением, экзогенная ДНК может быть потеряна при росте клеток в течение 1-2 недель. Однако через 2-3 дня после трансфекции подходящих клеток млекопитающих, как было обнаружено, целевые продукты могут быть синтезированы и могут быть детектированы.

Выбор системы хозяин-вектор основан на развитии клеточных линий CV-1 обезьян, трансформированных молекулой ДНК репликация-происхождение-дефектных SV 40/Glusman, Y., Cell, 23, 175-182, 1981/. Трансформированные CV-1 клетки обезьян, содержащие дефектную SV 40 ДНК, обозначенные COS /CV-1, дефектное происхождение, SV 40/, не содержат полной копии генома SV 40, но продуцируют высокие уровни широкого T антигена и разрешают репликацию ДНК 40. Они также эффективно поддерживают репликацию SV 40, содержащих делеции в ранней области, и бактериальных плазмид, которые содержат 40 источник репликации /Myers, R. M. and Tjian, R. 1980, PNA 77, 6491-6495/. Следовательно, такая система обеспечивает средство амплификации трансфецированной экзогенной ДНК через репликацию ДНК медиированных SV 40, чтобы повысить уровень мРНК и белка, экспрессированного из экзогенной ДНК. Однако также являются полезными другие подобные системы.

Векторы, использованные для ФСК экспрессии, обычно содержат различные элементы, такие как усилители, промоторы, интроны, сайты полиаденилирования, 3'-некодирующие области и активаторы трансляции, как будет описано ниже.

Здесь векторы могут включать усилители. Усилители функционально отличаются от промоторов, но очевидно работают совместно с промоторами. Их функция на клеточном уровне еще недостаточно понятна, но их уникальной характерной чертой является способность активировать или делать возможной транскрипцию независимо от положения или ориентации. Промоторы должны быть расположены вверх от гена, тогда как усилители могут находиться вверх или 5' от промотора, внутри гена как интрона, или вниз от гена между геном и сайтом полиаденилирования. Вставленные промоторы не являются функциональными, а вставленные усилители являются. Усилители являются цис-активными, а именно они действуют на промоторы, только если они находятся в одной и той же нити ДНК. Общую дискуссию об усилителях смотри у Khoury et al., Cell, 33, 313-314 /1983/.

Предпочтительные усилители для использования в клетках млекопитающих получают из вирусов животных, таких как обезьяний вирус 40, вирус полиомы, вирус бычьей папилломы, ретровирус и аденовирус. Идеально, усилитель должен быть из вируса, для которого клетка-хозяин является рекомендованной, т.е. который обычно заражает клетки хозяина. Вирусные усилители могут быть легко получены из публично доступных вирусов. Усиливающие области для некоторых вирусов, а именно вируса саркомы Рауса и обезьяньего вируса 40, хорошо известны. Смотри Lueiu et al., Cell 33, 705-716 (1983). Из традиционной молекулярной биологии известно расположение этих областей на основе опубликованных карт рестрикции для указанных вирусов и, в случае необходимости, можно модифицировать сайты, чтобы сделать возможной сращивание усилителя с вектором, как желательно. Например, смотри Кауфман и др., J. Mol. Biol., 159, 601 - 621 /1982/ и Mol. Cell Biol. 2 /II/, 1304-1319 /1982/. Альтернативно усилитель может быть синтезирован из данных последовательностей; размеры вирусных усилителей (обычно менее примерно 150 пар оснований/ являются достаточно маленькими, чтобы это могло быть осуществлено на практике.

Другим элементом, который должен присутствовать в векторе, является сайт полиаденилированного сращивания /или присоединения/. Он представляет собой последовательность ДНК, расположенную вниз от транслируемых областей гена, вскоре вниз от которого в свою очередь добавляются ринонуклеотиды остановки транскрипции и аденина для образования полиаденинового нуклеотидного хвоста на 3' конце матричной РНК. Полиаденилирование является важным при стабилизации матричной РНК против разложения в клетке, ситуация, при которой снижается уровень матричной РНК и, следовательно, уровень белкового продукта.

Эукариотные сайты полиаденилирования хорошо известны. Consensus-последовательность существует среди эукариотных генов: гексануклеотид 5'-AAUAAA-3' найден 11-30 нуклеотидов от точки, в которой начинается полиаденилирование. Последовательности ДНК, содержащие сайты полиаденилирования, могут быть получены из вирусов в соответствии с опубликованными сообщениями. Типичные последовательности полиаденилирования могут быть получены из бета-глобина мыши и поздней или ранней областей генов обезьяньего вируса 40, но предпочтительными являются вирусные сайты полиаденилирования. Поскольку эти последовательности являются известными, они могут быть синтезированы in vitro и связаны в вектор традиционным способом.

Последовательность, которая отделяет сайт полиаденилирования от трансляционного стор-кодона, является предпочтительно нетранслируемой последовательностью ДНК, такой как непромотированный эукариотический ген. Поскольку такие последовательности и гены не обеспечены промотором, они не будут экспрессироваться. Последовательность должна простираться на значительное расстояние, порядка примерно 1000 оснований, от стоп-кодона до сайта полиаденилирования. Такая 3'-нетранслируемая последовательность обычно в результате приводит к повышению выхода продукта. Вектор может заканчиваться примерно за 30 пар оснований вниз от consensus-последовательности полиаденилирования, но предпочтительно сохранить 3'-последовательности, найденные вниз по ходу от сайта полиаденилирования, в окружении их дикого типа. Эти последовательности обычно протягиваются примерно на 200-600 пар оснований вниз от сайта полиаденилирования.

Наличие интронов в нетранслируемом транскрибируемом участке вектора может увеличить выход продукта. Такие интроны могут быть получены из других источников, чем клетки хозяина или источники генов. Например, гибридный интрон, состоящий из 5'-сайта сращивания от второго интрона трехчастного лидера аденовируса и 3'-сайта сращивания от гена иммуноглобулина, вставленного вниз от сайта старта транскрипции в основной последний промотор аденовируса, приводит в результате к увеличению выхода продукта.

В предпочтительном варианте вектора клонирования ФСК и экспрессии имеется ген активатора трансляции. Активаторы трансляции являются генами, которые кодируют или белок иди продукты РНК, которые влияют на трансляцию целевой мРНК. Лучшим примером является аденовирус-ассоциированный /VA/ ген /VAI/, который считывается в коротких типах РНК, которые взаимодействуют с последовательностями в 5' нетранслируемой области основных поздних мРНК аденовируса /Thimmuappaya et al., 1982, Ce, 3, 543/. Необходимые последовательности трансляционной активации с помощью VA РНК лежат внутри трехчастного лидера последней мРНК аденовируса. Трехчастный лидер аденовируса сращивают вместе с несоприкасающимися областями генома аденовируса и находится на 5'-конце основных последних транскриптов аденовируса. VA РНК может взаимодействовать для активации трансляции мРНК, которые содержат последовательность трехчастного лидера. Итак, предпочтительный вектор клонирования кДНК и экспрессии содержит соединенную форму трехчастного лидера и гены VA аденовируса.

Эти векторы могут быть синтезированы по методикам, хорошо известным специалистам в данной области. Компоненты векторов, такие как усилители, промоторы и т. п., могут быть получены из природных источников или синтезированы, как описано выше. В основном, если найдено, что компоненты в ДНК доступны в большом количестве, а именно, такие компоненты, как вирусные функции, или если они могут быть синтезированы, например, сайты полиаденилирования, тогда при соответствующем использовании рестрикционных ферментов могут быть получены большие количества вектора при простом культивировании организма-источника, переваривании его ДНК соответствующей эндонуклеазой, отделении фрагментов ДНК, идентификации ДНК, содержащей интересующий элемент, и его извлечении. Обычно вектор трансформации должен быть введен в малом количестве и затем связан в подходящий автономно реплицирующийся синтетический вектор, такой как прокариотная плазмида или фаг. В большинстве случаев может быть использована плазмида pBP322. Смотри Кауфман и др., выше.

Синтетический вектор используют для клонирования связанных векторов трансформации обычным образом, а именно путем трансфекции возможного прокариотного организма, репликации синтетического вектора с большим числом копий и извлечения синтетического вектора при лизисе клеток и отделения синтетического вектора от клеточного дебриса.

Векторы, содержащие кДНК, приготовленную из клетки, которая продуцирует ФСК активность, затем трансфецируют в E.coli и помещают на чашки Петри приблизительно 2000 колоний на чашку. Колонии вынимают на нитроцеллюлозный фильтр и фильтр переносят на новую пластину, которую хранят как первый оригинал. После выращивания этих колоний делают реплики и сравнивают с оригиналом, тщательно отмечая, чтобы секции фильтров реплик могли быть идентифицированы с соответствующим участком пластины оригинала.

Каждый фильтр реприку разрезают на секции, содержащие заранее определенное число колоний на секцию, предпочтительно 200-500 колоний на секцию. Колонии с каждой секции соскабливают в среду, такую как L-бульон, бактерии собирают центрифугирование и отделяют плазмиду ДНК. Плазмиду ДНК каждой секции трансфецируют в подходящего хозяина для экспрессии белка. Предпочтительный синтетический вектор здесь является мутантом E.coli плазмиды pBP 322, в которой были делецированы последовательности, которые являются вредными для эукариотных клеток. Смотри Кауфман и др., выше. Использование этого мутанта устраняет необходимость в делении остатка плазмиды перед трансфекцией. После выращивания трансфецированных клеток среды проверяют на ФСК активность. Положительная проба показывает, что колония, содержащая ФСК/кДНК, находится на конкретной секции на фильтре.

Для определения, какой из клонов на секции исходного первого оригинала фильтра содержит ФСК/кДНК, каждый клон на секции фильтра пересаживают и выращивают. Затем культуры помещают на матрицу Пулы получают от каждого горизонтального ряда и вертикальной колонки матрицы. Готовят образцы ДНК из каждого пула культуры и трансфецируют в клетку-хозяина для экспрессии. Надосадочные слои для каждого пула проверяют на ФСК активность. Одна вертикальная колонка пула и горизонтальный ряд пула должны продуцировать ФСК активность. Клон, общий для этих пулов, будет содержать ФСК/кДНК. Если матрица, содержит больше одного положительного клона, больше чем одна колонка и ряд должны быть положительными. В таком случае может быть необходимым дальнейший скрининг малого количества клонов.

Вырезают ФСК/кДНК из клонов рестрикционными ферментами и можно провести определение аминокислотной последовательности обычными методами. Можно легко оценить что описанная здесь процедура может быть использована для получения ФСК/кДНК из любого источника. Полная последовательность ФСК/кДНК в соответствии с изобретением представлена на фиг. 1 вместе с предсказанной аминокислотной последовательностью транслированного ФСК белка.

Последовательность ДНК, кодирующая белок, проявляющий ФСК активность, в соответствии с настоящим изобретением, такая как представлена на фиг. 1, может быть модифицирована с помощью традиционных методик для получения вариантов в конечном ФСК белке, который еще обладает ФСК активностью в описанных здесь ниже пробах. Так, например, одна, две, три, четыре или пять аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами. В бельгийском патенте N 898016, приведенном здесь в качестве уровня техники, описана одна такая типичная методика для замены цистеина, например, серином.

В соответствии с настоящим изобретением ФСК/кДНК включает природный ФСК/кДНК ген, предшествующий АТС кодону, и ФСК/кДНК, кодирующей аллельные вариации ФСК-белка. Один аллель представлен на фиг. 1. Другой аллель, который мы обнаружили, имеет тимидиновый остаток в положении 365 вместо цитозинового остатка, показанного на фиг. 1. ФСК-белок настоящего изобретения включает 1-метиониновое производное ФСК-белка/Met-ФСК/ и аллельные вариации ФСК-белка. Зрелый ФСК-белок, представленный последовательностью на фиг. 1 начинается с последовательности Ala. Pro. Ala Arg ..., начало которой обозначено стрелкой после нуклеотида номер 59 на фиг. 1. Met-ФСК - будет начинаться с последовательности Met. Ala. Pro. Ala. Arg ... Аллельная вариация, представленная на фиг. 1, имеет Thr у аминокислотного остатка номер 100 (начиная от Ala после стрелки) и может быть упомянута как ФСК/Thr/. Другая вариация имеет Ile остаток у положения 100 и может быть упомянута как ФСК/Ile/. Очищенный ФСК-белок настоящего изобретения проявляет удельную активность по крайней мере 10⁷ единиц/мг белка и предпочтительно по крайней мере 410⁷ единиц/мг при пробе с человеческими клетками костного мозга.

Системы вектор-хозяин для экспрессии ФСК могут быть прокариотическими или эукариотическими, но сложность ФСК может сделать предпочтительной систему экспрессии млекопитающих. Экспрессия легко осуществляется при трансформации прокариотических или эукариотических клеток подходящим вектором ФСК. Последовательность ДНК, полученная по описанной выше процедуре, может быть экспрессирована. непосредственно в клетках млекопитающих под контролем подходящего промотора. Гетерологические промоторы, хорошо известные специалистам в данной области, могут быть использованы. Для экспрессии ФСК в прокариотических или дрожжевых клетках должна быть удалена лидерная последовательность /или секреторная последовательность/. Положение кодона для N-терминала зрелого ФСК белка показано на фиг. 1. Это может быть сделано с использованием стандартных методик, известных специалистам в данной области. Как только получают целевой ФСК/кДНК клон, используют известные и подходящие средства для экспрессии ФСК белка, а именно, вставку в подходящий вектор и трансфекцию вектора в подходящую клетку-хозяин, отбор трансформированных клеток и культивирование этих трансформантов для экспрессии ФСК активности. Подходящими клетками-хозяевами являются бактерии, например, E.coli, дрожжи, клетки млекопитающих, например CHO, и насекомых. Полученный таким образом ФСК белок может иметь метиониновую группу у N-терминала белка /здесь называемого Met-ФСК/. Зрелый белок, полученный из прокариотических или эукариотических клеток, иначе, должен быть идентичным по аминокислотной последовательности, но эукариотический продукт может быть гликозилированным в той же самой степени или в другой, чем природный продукт. Различные методы получения ФСК-белка в соответствии с соглашением показаны в приведенных ниже примерах. Другие способы или материалы, например, векторы, будут легко оценены специалистами в данной области на основе примеров и последующего описания.

ФСК-белок, экспрессированный в соответствующих прокариотных или эукариотных клетках, может быть извлечен с помощью методик очистки и разделения, известных специалистам в данной области. Однако, как указано, настоящее изобретение также обеспечивает способ очистки, пригодный для ФСК белка как из рекомбинантного, так и природного источников, с помощью которого ФСК-белок может быть получен с высокой степенью чистоты и активности.

Настоящее изобретение разрешает проблемы известного уровня техники и обеспечивает способ очистки белка, обладающего ФСК-активностью. ФСК-белок в соответствии с настоящим изобретением обладает удельной активностью по крайней мере 110⁷ единиц/мг белка, предпочтительно по крайней мере 210⁷ единиц/мг белка и более предпочтительно по крайней мере примерно 410⁷ единиц/мг белка при пробе с человеческим костным мозгом.

В соответствии с настоящим изобретением способ очистки ФСК-белка состоит из: осаждения белка сульфатом аммония при 80% насыщении для образования шарика, содержащего ФСК-белок; повторного суспендирования шарика в буферном растворе при pH в интервале от примерно 6 до примерно 8; нанесения буферного раствора, содержащего ФСК, на хроматографическую колонку, элюирования буферным раствором, содержащим хлористый натрий, и сбора фракций, обладающих ФСК активностью; объединения активных фракций, нанесения их на колонку с C4 обратимой фазой и элюирования 0 - 50% градиентом ацетонитрила для сбора активной фракции.

Рис. 5 иллюстрирует СДС-ПАГЭ-анализ очищенного ФСК-белка.

ФСК-белок, очищаемый в соответствии со способом изобретения, может происходить из любого природного источника, описанного выше в качестве исходного источника для рекомбинантного способа ДНК, например, Mo клеточной линии или UCD MLA-144 гиббоновой клеточной линии.

Альтернативно ФСК-белок может быть получен с использованием методик рекомбинантной ДНК изобретения.

ФСК из любого источника может быть очищен по способу настоящего изобретения. Кондиционированную среду из любого источника ФСК белка предпочтительно концентрируют ультрафильтрацией до концентрации белка по крайней мере около 0,1 мг белка/мл. Затем белок осаждают при добавлении сульфата аммония до 80% насыщения. Полученный шарик повторно суспендируют в водном растворе, забуферированном при pH в интервале от примерно 6 до примерно 8. Примерами подходящих буферов являются Трис-HCl, HEPES, цитрат натрия и т.п.

Буферный раствор фракционируют хроматографией на колонке. Подходящими материалами для использования при колоночной хроматографии являются октилсефароза, DEAE-ультрогель, AcA44-ультрогель, AcA-54 ультрогель и т.п. Один или несколько из этих материалов могут быть использованы последовательно для получения более высокой чистоты.

Фракции от каждой колонки собирают и проверяют на ФСК активность. Активные фракции объединяют и разбавляют трифторуксусной кислотой (ТФУК), гептафтормасляной кислотой (ГФМК) или т.п. и наносят на колонку с C4 обратимой фазой. ФСК активность затем элюируют, используя 0-90% ацетонитрильный градиент в ТФУК или ГФМК, предпочтительно при концентрации от 0,10% или 0,15% (объем/объем), соответственно, в зависимости от того, какая кисло та была использована при нанесении объединенных фракций на колонку.

Фракции, имеющие ФСК активность, анализируют СДС-электрофорезом на полиакриламидном геле (13,5% гель, как описано Лэммли, wature 227, 6810/1970/. Дополнительные обработки с использованием указанных выше материалов для хроматографических колонок могут дополнительно очистить ФСК белок для гомогенности.

Очищенный ФСК белок, фракционированный на СДС-ПАГЗ, показывает гетерогенный ФСК белок, имеющий кажущуюся молекулярную массу в интервале от примерно 15000 до примерно 26000 дальтон. Такой кажущийся размер гетерогенности имеется благ