Композиция и способ обработки неопластической клетки

Композиция и способ обработки неопластической клетки

Реферат

 

Изобретение относится к медицине и касается иммунотоксина, обладающего неопластическим действием, композиции, обладающей неопластической активностью, содержащей иммунотоксин, и способа обработки неопластической клетки. Задача изобретения заключается в разработке способа селективного направления химиотерапевтического агента в клетке. Сущность изобретения состоит в том, что иммунотоксин, обладающий неопластическим действием, представляет собой конъюгат гелонина и моноклонального антитела, проявляющего специфичность связывания в отношении антигенного домена с - erb В-2 и представляющего собой Tab 250. Композиция, обладающая неопластической активностью, представляет собой иммунотоксин и фармацевтически приемлемый носитель. Способ обработки неопластической клетки включает введение эффективной дозы иммунотоксина в эту клетку. Технический результат заключается в усилении селективности доставки химиотерапевтического агента к клетке. 3 с. и 7 з.п. ф-лы, 7 ил.

Данное изобретение касается в общих чертах области лечения неопластических (опухолевых) заболеваний. Более конкретно, данное изобретение касается новых иммуноконъюгатов и их применения в лечении неопластического заболевания.

Описание затрагиваемой проблемы Неопластическое заболевание является одной из основных причин смертности и распространенности болезней в Западном мире. Неопластические состояния, например, разные типы "рака", имеют по меньшей мере одну общую характеристику, а именно, нарушения в регуляторном процессе роста клеток.

Процесс, при помощи которого нормальные клетки превращаются в злокачественные клетки, был предметом интенсивного исследования в течение десятилетий. Более недавно исследование было сконцентрировано на роли онкогенов в процессе развития рака. Онкогены представляют собой гены, которые обладают способностью трансформировать эукариотические клетки таким образом, что они растут по типу роста опухолевых клеток.

Онкоген образуется при мутации, реаранжировке или амплификации нормального гена или прото-онкогена. Одним из таких онкогенов является прото-онкоген c-erbB-2 (HER -2/neu). В дальнейшем его называют c-erb B-2. Этот ген кодирует белок, похожий на рецептор эпидермального фактора роста. Амплификация этого прото-онкогена может приводить к каскаду клеточных событий, приводящих к неконтролируемому росту клеток.

Антитела представляют собой белки, продуцируемые иммунной системой животного, обычно в ответ на чужеродные антигены или антигенные детерминанты. Антитела связываются со специфическим антигеном, к которому они направлены. Получение специфических моноклональных антител обеспечило исследователей возможным инструментом для селективного направления терапевтических агентов к клеткам, экспрессирующим избыточное количество определенных антигенов.

Была предположена избыточная экспрессия прото-онкогена c-erb B-2 при неопластической (опухолевой) трансформации клеток. Некоторые типы рака человека, в том числе рак молочной железы и некоторые карциномы яичников, обнаруживают амплифицированный ген c-erb B-2. Кроме того, амплификация и последующая избыточная экспрессия гена c-erb B-2 коррелировали с плохим прогнозом заболевания. Поэтому в этой области исследований существует большая потребность и желание разработки способа селективного направления химиотерапевтического агента к клетке, обнаруживающей избыточную экспрессию онко-гена c-erb B-2 для модулирования роста клеток, усиленно экспрессирующих этот белок. Данное изобретение обеспечивает средства для достижения этой цели.

Краткое описание изобретения Данное изобретение обеспечивает новую композицию, содержащую конъюгат направляющей к клеткам части молекулы, например, антигенсвязывающего района, имеющего специфичность связывания в отношении белка c-erb В-2, и модулятора роста клеток, например, токсина или подавляющего рост реагента. Такая композиция может действовать как иммунотоксин для специфического направления модулятора роста клеток к опухолевым клеткам, усиленно экспрессируйщих белок c-erb В-2.

Так, в одном из вариантов данного изобретения обеспечена новая композиция, содержащая конъюгат направляющей части молекулы со специфичностью связывания в отношении белка c-erb В-2, например, TAb 250 моноклональнах антител, и цитотоксической части молекулы. Цитотоксической частью может быть токсин, вызывающее разрушение клеток лекарственное средство, цитостатическое средство или модулятор биологической ответной реакции. В одном из отдельных вариантов цитотоксической частью является гелонин.

Другой вариант данного изобретения обеспечивает способ лечения неопластического состояния, например, заболевания, характеризующегося амплификацией или избыточной экспрессией онкогена c-erb B-2, предусматривающий введение эффективной для разрушения клеток дозы иммунотоксина данного изобретения индивидууму, нуждающемуся в таком лечении.

Другой вариант обеспечивает способ убивания опухолевых клеток in vitro с последующим обратным введением их хозяину. Например, при лечении неопластического состояния костного мозга его удаляют из индивидуума, имеющего неопластическое заболевание, и обрабатывают композицией данного изобретения.

В другом варианте данного изобретения обеспечен способ предотвращения рецидива неопластического заболевания. Рецидив предотвращают введением эффективного для разрушения клеток количества направленного токсина, например, такого иммунотоксина, как TAb 250 антитела-гелонин.

Еще в одном варианте данного изобретения обеспечены новые композиции, содержащие слитые конструкции направляющих частей молекул со связывающей аффинностью в отношении белка c-erb B-2 и цитотоксической части молекулы. Предпочтительно, направляющей частью является антитело, узнающее внеклеточный эпитоп c-erb В-2, например, TAb 250, и цитотоксическая часть относительно инертна при введении ее отдельно от направляющей части, например, гелонин. В других вариантах данного изобретения обеспечены способы продления времени жизни имеющего опухоль млекопитающего путем введения направленных токсинов данного изобретения этому млекопитающему, а также способ замедления скорости роста опухолей путем введения направленных токсинов данного изобретения. В типичном случае токсины могут быть направлены к опухолевым клеткам при помощи иммунологического района связывания, например, связывающего антитела сегмента. Кроме того, обеспечена фармацевтическая композиция, содержащая иммунотоксин, состоящий из цитотоксический части, конъюгированной с моноклональным антителом. Наиболее предпочтительно, антитело представляет собой TAb 250, а цитотоксическая часть представляет собой гелонин.

Фиг. 1 демонстрирует измеренные при помощи ELISA действия антител ZME, антител TAb 250 или иммуноконъюгатов TAb 250 и гелонина на клетки SKOV-3.

Фиг. 2 демонстрирует цитотоксичность конструкции TAb 250-гелонин на клетках SKOV-3.

Фиг. 3 демонстрирует конкуренцию специфического (в противоположность неспецифическому) антитела с конъюгатом на клетках SKOV-3.

Фиг. 4 демонстрирует зависимость ответной реакции от дозы и эффекты конъюгата TAb 250-гелонин на клетках SKOV-3.

Фиг. 5 демонстрирует цитотоксичность TAb 250 и конъюгата TAb 250-гелонин на клетках SKOV-3.

Фиг. 6 демонстрирует способность антител TAb 250 к интернализации в различные клеточные линии.

Фиг. 7 демонстрирует цитотоксичность иммуноконъюгата TAb 250-гелонин в МТТ-тесте.

Детальное описание изобретения Как описано здесь, направляющая к клеткам часть молекулы способна селективно связываться с белком c-erb B-2, экспрессирующимся на клетке, обычно на ее поверхности. Направляющая часть содержит как лиганд, специфически связывающийся с белком c-erb B-2, так и антигенсвязывающий район, например, интактные антитела или их эпитопсвязывающие фрагменты. Это могут быть как классические молекулы антител, химерные разновидности, одиночная цепь, так и модифицированные фрагменты антител, сохраняющие эпитопсвязывающую специфичность и аффинность.

Термином "иммуноглобулин" или "пептид (пептиды) антител" называют целый иммуноглобулин или целое антитело или любой функциональный связывающий фрагмент молекулы иммуноглобулина. Примерами таких пептидов являются полные молекулы антител, фрагментны антител, такие как Fab, F(ab')₂, CDR, V_L, V_H и любая другая часть антитела, в частности, часть антитела, обнаруживающая антигенсвязызающую специфичность и аффинность. Например, молекула антитела IgG состоит из двух легких цепей, каждая из которых соединена дисульфидными связями с двумя тяжелыми цепями. Тяжелые цепи, в свою очередь, соединены одна с другой дисульфидными связями в зоне, известной как шарнирная область антитела. Отдельная молекула IgG обычно имеет мол.массу приблизительно 150-160 кД и содержит два антигенсвязывающих сайта. Фрагменты этих молекул, например, тяжелая или легкая цепь отдельно, иногда могут связывать антиген. Антитела, фрагменты антител и индивидуальные цепи могут быть функционально эквивалентны иммуноглобулинам.

Тяжелая или легкая цепь нормального антитела имеет N-концевую (NH₂) вариабельную (V) область и C-концевую (-COOH) константную (C) область. Вариабельную область тяжелой цепи называют V_H (в том числе, например, V), а вариабельную область легкой цепи называют V_L (в том числе V или V). Вариабельная область является частью молекулы, которая связывается с родственным антителу антигеном, тогда как Fc район (второй или третий домены C-области) определяет эффекторную функцию антитела (например фиксацию комплемента, опсонизацию). "Легкие цепи" иммуноглобулина или антитела полной длины (в основном приблизительно 25 кД, приблизительно 214 аминокислот) кодируются геном вариабельной области на N-конце (приблизительно 110 аминокислот) и геном (каппа) или (лямбда) константной области на COOH-конце. "Тяжелые цепи" иммуноглобулина или антитела полной длины (в основном приблизительно 50 кД, приблизительно 446 аминокислот) подобным образом кодируются геном вариабельной области (кодирующим приблизительно 116 аминокислот) и одним из генов константной области, например, гамма (кодирующим 330 аминокислот). Обычно "V_L" содержит часть легкой цепи, кодируемой сегментами гена V_L и/или J_L, (J - или соединительного района), а "V_H" содержит часть тяжелой цепи, кодируемую сегментами гена V_H и (или) D_H (D - или diversity района) и J_H. См. Roitt et al., Immunology, Chapter 6 (2d. ed. 1989) и Paul, Fundamental Immunology. Raven Press (2d ed. 1989), на которые здесь ссылаются.

Вариабельная область легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина состоит из "каркасной" области, прерываемой тремя гипервариабельными участками, также называемыми участками, определяющими комплементарность, или CDR. Степень каркасной области и CDR была определена (см., "Seguences of Profeins of Immunological Interest", E. Kabat, et al., US Department of Health and Human Services (1987), включены здесь в виде ссылки). Последовательности каркасных областей различных легких и тяжелых цепей относительно консервативны внутри вида. Каркасные области антитела, представляющие собой объединенные каркасные области легких и тяжелых цепей, служат для расположения и построения CDR в трехмерном пространстве. CDR в первую очередь ответственны за связывание с эпитопом антигена. Их обычно называют, CDR1, CDR2 и CRD3 при последовательной нумерации от N-конца.

Два типа легких цепей, к и , называют изотипами. Изотипические детерминанты обычно находятся в константной области легкой цепи, называемой в общем C_L, а в частности, C_K или C. Константная область молекулы тяжелой цепи, известная также как C_H, определяет изотип антитела. Антитела классифицируются как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE в зависимости от изотипа тяжелой цепи. Эти изотипы кодируются сегментами гена константной области тяжелой цепи мю (), дельта (), гамма (), альфа () и эпсилон (), соответственно. Кроме того, имеется несколько субтипов . Изотип тяжелой цепи определяет различные эффекторные функции антитела, такие как опсонизацию или фиксацию комплемента. Кроме того, изотип тяжелой цепи определяет секретированную форму антитела. Секретированные изотипы IgG, IgD и IgE обычно обнаруживают в состоящей из одной единицы или мономерной форме. Секретированный изотип IgM обнаружен в пентамерной форме, а секретированный IgA можно обнаружить как в мономерной, так и в димерной форме.

Фрагмент F(ab')₂ не содержит C-концевой части константной области тяжелой цепи и обычно имеет мол.массу приблизительно 110 кД. Он сохраняет два антигенсвязывающих сайта и дисульфидные связи между цепями в шарнирной области, но не имеет эффекторных функций интактной молекулы IgG. Фрагмент F(ab')₂ может быть получен из молекулы IgG протеолитическим перевариванием пепсином при pH 3,0-3,5 при помощи стандартных способов, например, описанных в Harlow and Zane, infra.

Фрагмент "Fab" содержит легкую цепь и N-концевую часть тяжелой цепи, которые соединены дисульфидными связями. Обычно он имеет мол.массу приблизительно 50 кД и содержит один антигенсвязывающий сайт. Фрагменты Fab могут быть получены из фрагментов F(ab')₂ ограниченным восстановлением или из целого антитела перевариванием папаином в присутствии восстанавливающих агентов (См., Harlow and Lane infra). В некоторых случаях концентрация восстанавливающего агента, необходимая для поддержания активности папаина в присутствии атмосферного кислорода, достаточна для полного восстановления дисульфидных связей между цепями антитела. Это может привести к потере узнавания антигена. Для снятия этой проблемы папаин можно активировать и затем ввести в буфер с концентрацией восстанавливающего агента, совместимой с поддержанием антигенсвязывающей активности. Переваривание антител обычно проводят в атмосфере инертного газа для предотвращения дезактивации папаина.

Следующий ниже протокол является примером этого способа: A) Активация папаина: папаин, полученный в виде 10 мг/мл (NH₄)₂SO₄ суспензии, растворяют в 10 мМ ЭДТА, 20 мМ цистеине, pH 8,0, до конечной концентрации 2 мг/мл. Раствор дегазируют и инкубируют 2 часа при комнатной температуре под азотом.

B) Активированный папаин переносят в 20 мМ Na₃PO₄, pH 7,0, содержащий 150 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 30 мкМ ДТТ.

C) Переваривание антител: 1 мг активированного папаина добавляют к каждым 100 мг антител и раствор диализуют против большого избытка 20 мМ NaPO₄, pH 7,0, содержащего 150 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 30 мкМ ДТТ при непрерывном барботировании гелием. Диализ применяют для поддержания молярного избытка восстанавливающего агента в процессе переваривания.

D) После 2-4 часов при комнатной температуре переваривание останавливают добавлением иодацетамида.

E) Фрагменты Fab отделяют от непереваренных или частично переваренных антител стандартными хроматографическими способами.

Термин "Fab" или любые другие фрагменты антител имеют классификации при применении в данном изобретении, сходные с классификациями, примененными для основных терминов "антитела" или "иммуноглобулины". Так, Fab белок "млекопитающих", "химерный Fab" и т.п. применяют аналогично соответствующим определениям общего использования, как изложено в последующих параграфах.

Терминами "химерные антитела" или "химерные пептиды" называют здесь такие антитела или пептиды антител, в которых одна часть пептида имеет аминокислотную последовательность, происходящую из соответствующей последовательности или гомологичную соответствующей последовательности в антителе или пептиде, происходящих из первого источника генов, тогда как оставшийся сегмент этой цепи (цепей) гомологичен соответствующим последовательностям другого источника генов. Например, химерный пептид тяжелой цепи антител мажет содержать мышиную вариабельную область и человеческую константную область. Два источника генов в типичном случае являются двумя разными видами, но иногда могут быть представителями одного вида.

Химерные антитела или пептиды обычно получают при помощи рекомбинантных молекулярных и(или) клеточных способов. Во многих случаях химерные антитела имеют вариабельные области как легких, так и тяжелых цепей, которые имитируют вариабельные области антител, происходящих из одного вида млекопитающего, тогда как константные и (или) каркасные части гомологичны последовательностям в антителах, происходящих из второго, отличающегося вида млекопитающих.

Однако применяемое здесь определение химерного антитела не ограничивается этим примером. Химерным является любое антитело, в котором одна или обе тяжелые или легкие цепи составлены из сочетаний последовательностей, имитирующих последовательности в антителах из различных источников, независимо от того, относятся ли эти источники к различным классам, отличающимся ответной реакцией на антиген, или к различным видам, а также от того, находится ли точка слияния в месте связи между вариабельной и константной областями или вне этого сайта. Например, химерные антитела могут быть антителами, в которых каркасная область и определяющие комплементарность области (CDR) происходят из разных источников. К примеру, нечеловеческие CDR могут быть интегрированы в человеческие каркасные области, соединенные с человеческой константной областью с образованием "очеловеченных" (humanised") антител. См., например, PCT Application Publication N WO 87/02671; US Patent N 4816567; EP Patent Application 0173494; Jones, et al., Nature, 321:522-525 (1986) и Verhoeyen, et al., Science, 239: 1534-1536 (1988), на все эти источники здесь ссылаются.

Применяемый здесь термин "подобная человеческой каркасная область" обозначает каркасную область каждой цепи антител, которая обычно содержит по меньшей мере 70 аминокислотных остатков, в типичном случае 75-85 или более остатков. Аминокислотные остатки подобной человеческой каркасной области по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 80-85% и наиболее предпочтительно более чем на 85% гомологичны аминокислотным остаткам человеческого иммуноглобулина. Эта общая черта с другими эндогенными антителами применима для создания направляющей части молекулы, которая дает лишь небольшую иммунную реакцию, например, механизм, который сводит к минимуму ответную реакцию на аутоантигенные маркеры.

Применяемым здесь термином "очеловеченный" ("humanised") или "подобный человеческому иммуноглобулин" называют иммуноглобулин, содержащий подобную человеческой каркасную область и константную область, в основном гомологичную константной области человеческого иммуноглобулина, например, имеющую по меньшей мере 80% или более предпочтительно 85-90% или более и наиболее предпочтительно приблизительно 95% или более гомологии. Таким образом, большинство частей иммуноглобулина, подобного человеческому иммуноглобулину, за исключением, возможно, CDR, в основном гомологичны соответствующим частям одной или нескольких нативных последовательностей человеческого иммуноглобулина.

Применяемым здесь термином "гибридное антитело" называют антитело, в котором каждая цепь отдельно гомологична цепи антитела млекопитающего, но их сочетание представляет собой новый ансамбль, так что это антитело может узнавать два различных антигена. В гибридных антителах одна пара тяжелой и легкой цепей гомологична паре, обнаруженной в антителе, выработанном против одного признака узнавания антигена, тогда как другая пара тяжелой и легкой цепей гомологична паре, обнаруженной в антителе, выработанном против другого эпитопа. Это приводит к свойству мультифункциональной валентности, т.е. способности связывать по меньшей мере два различных эпитопа одновременно. Такие гибриды можно, конечно, получать также при помощи химерных цепей.

Термин "моноклональные антитела" обозначает здесь композицию антител, узнающую отдельную антигенную детерминанту. Термин применяют без ограничения в отношении источника антитела или способа, которым оно получено.

При помощи стандартных способов, хорошо известных в данной области исследований, вариабельные области и CDR могут быть получены из гибридомы, продуцирующей специфические для c-erb В-2 антитела. Последовательности нуклеиновых кислот данного изобретения, способные в конечном счете экспрессировать желаемые химерные антитела, могут быть образованы из множества различных нуклеотидных последовательностей (геномной или кДНК, РНК, синтетических олигонуклеотидов и т.д.) и компонентов (например, V-, J-, D- и C-районов), а также множеством различных способов. Соединение подходящих геномных последовательностей является в настоящее время одним из обычных способов, но можно применять также кДНК (см., European Patent Publication N 0239400 и Reichmann, Z., et al., Nature, 332:323-327 (1988), на которые дается ссылка).

Последовательности ДНК константной области человека предпочтительно выделяют из иммортализованных В-клеток, см., например, Heiter, et al., Cell, 22: 197-207 (1980), но могут быть выделены или синтезированы из множества других источников. Нуклеотидная последовательность гена C_I человеческого иммуноглобулина описана в Ellison et al., Nucl. Acids Res., 10:4071 (1982); Beidler, et al., J Immunol., 141:4053 (1988); Ziu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439 (1987) (все включены здесь ссылкой).

CDR для получения иммуноглобулинов данного изобретения предпочтительно получают из моноклональных антител, способных связываться с целевым антигеном, c-erb В-2, и продуцируют в любом удобном источнике (млекопитающем), в том числе, в клетках мышей, крыс, кроликов, хомяков или других позвоночных, способных продуцировать антитела, хорошо известными способами. Подходящие клетки для выделения ДНК и хозяйские клетки для экспрессии и секреции иммуноглобулина могут быть получены из разных источников, таких как American Type Culture Collection (АТСС) "Catalogue of Cell Lines and Hybridomas", Fifth Edition, (1985) Rpckville, Maryland, USA, включен в ссылки.

Кроме химерных пептидов антител, описанных здесь, можно легко спроектировать и приготовить иммуноглобулины, в основном гомологичные, при помощи различных способов рекомбинантных ДНК, известных специалистам в этой области. Модификации этих генов можно легко получить множеством хорошо известных способов, таких как сайт-направленный мутагенез (см. Jillman and Smifh, Jene, 8: 81-97 (1979) и Roberts, S., et al., Nature, 328:731-734 (1987), на которых здесь даны ссылки). Такими модификациями могут быть добавления аминокислот, делеции, замены, предпочтительно консервативные, и другие изменения в последовательности полипептида с сохранением однако необходимых свойств или биологической активности. Альтернативно, могут быть получены полипептидные фрагменты, содержащие только часть первичной структуры антител и обладающие связывающей и(или) эффекторной активностями. Поскольку относящиеся к иммуноглобулинам гены, подобно многим генам, содержат отдельные функциональные районы, каждый из которых имеет одну или несколько особых активностей, эти гены могут быть слиты с функциональными районами из других генов для получения слитых белков (например, иммунотоксинов), имеющих новые свойства или новые сочетания свойств.

Клонированные вариабельные и константные области можно выделить из плазмид и лигировать вместе в экспрессирующий вектор млекопитающих, например, pSV2-neo или pRSV-gpt для образования функциональной транскрипционной единицы. Предпочтительным хозяином являются мышиные миеломные клетки, такие как SP 2/0 или РЗХ, поскольку они не секретируют белок эндогенного иммуноглобулина и содержат все компоненты, необходимые для экспрессии иммуноглобулина. Миеломные клетки могут быть трансфицированы при помощи подходящих способов, как описано выше.

В этой области известны другие типы промоторов и усилителей (энхансеров), специфические для других клеток-хозяев. См., Kameyoma, K., et al., Supra.

Например, последовательность ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность химерного антитела, может быть соединена с промоторами и энхансерами дрожжей и трансфицирована в дрожжи известными в этой области способами. См. Krigler, supra.

Тот же самый подход может быть применен для выделения c-erb В-2 специфических CDR из одного источника, такого как один вид млекопитающего, и каркасных областей другого источника, например, другого вида млекопитающего. Затем эти CDR могут быть лигированы с каркасными областями и константными областями с образованием химерного антитела. См., PCT N GB 88/00731 (1989) и U. S.S. N 07/808 462, filed Decemder 12, 1991, на которые даются ссылки. Эти CDR можно клонировать в экспрессирующем векторе, содержащем, например, человеческие каркасные и константные области.

Другим примером является рекомбинантная последовательность ДНК, кодирующая CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой и(или) легкой цепи одного вида, например, мыши, и каркасные области тяжелой цепи человека, для получения антитела, специфического для c-erb В-2. Другие возможности предусматривают применение CDR, специфических для c-erb В-2; применение вариабельной области, охватывающей CDR1 и CDR2 из одного вида млекопитающих, и затем лигирование этой последовательности с другой, кодирующей каркасные области млекопитающего второго вида, с CDR3 первого; или трансфекцию линии клеток хозяина рекомбинантной последовательностью ДНК, кодирующей специфические для c-erb В-2 CDR тяжелой цепи, происходящей из первого вида млекопитающего, перемешанной внутри каркасной области второго вида с последовательностью ДНК легкой цепи, содержащей ДНК вариабельной области, полученную из первого вида, и ДНК константной области, полученную из второго вида.

Экспрессирующие векторы рекомбинантной ДНК, содержащие последовательности антител, могут быть трансфицированы путем электропорации в клетки хозяина. Для выделения клонов, продуцирующих специфические для c-erb B-2 химерные антитела, применяют стандартные способы отбора.

Антитела могут быть экспрессированы с удобной степенью складчатости молекулы, в том числе в виде одноцепочечных антител, из бактерий, таких как E. coli. См. , Pluckthun, Biotechnology, 9:545 (1991), Huse, et al., Science 246: 1275 (1989) и Ward, et al., 341:544 (1989), на которых даются ссылки.

Последовательности ДЕК пептидных антител могут быть амплифицированы клонированием с применением полимеразной цепной реакции (PCR), способа, применяемого для амплификации целевой ДНК при помощи термостабильной ДНК-полимеразы, например Tag полимеразы, и олигонуклеотидных праймеров, как описано в PCR Protocols, ed. Innis, et al., Academic Press, Inc. (1990). См. также Orlandi, supra и Larrick, et al., Biotechnology, 7:934 (1989), включенные в ссылки.

Белок c-erb B-2 (называемый здесь просто c-erb В-2) представляет собой мембранный гликопротеин с мол. массой 185 кД, имеющий тирозинкиназную активность и родственный рецептору эпидермального фактора роста (EGFR), но отличающийся от него. Подобно белку FGFR, белок c-erb B-2 имеет внеклеточный домен, содержащий два богатых цистеином повторяющихся кластера, трансмембранный домен и внутриклеточный киназный домен. Кроме того, аминокислотная последовательность c-erb В-2 белка, а также соответствующая нуклеотидная последовательность описаны Coussens, et al., Science, 230:1132 (1985), включенным в ссылки.

Белок c-erb B-2 кодируется c-erb В-2 онкогеном, описанным в 1985 г. тремя разными группами исследователей: Semba, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 6497 (ген назван c-erb B-2); Coussens, et al., supra (ген назван HER-2); и King, et al., Science, 229:1132 (ген назван v-erb В). Таким образом, последовательность гена c-erb В-2 и соответствующая последовательность белка хорошо известны и описаны. Белок c-erb В-2 имеет определенную внутриклеточную часть, трансмембранный район и внеклеточный район. В типичном случае направляющие части молекул данного изобретения связываются с внеклеточным районом, который находится на наружной поверхности неопластической клетки. Направляющая часть молекулы, как правило, узнает обнаруживаемые здесь признак или признаки, в том числе лигандсвязывающий район или сайты узнавания антигена, например, эпитопы. Эпитопами могут быть чистые полипептидные эпитопы, детерминанты с линейной пептидной последовательностью или конформационные детерминанты, но также и эпитопы, имеющие углеводные компоненты. Эпитопы могут также представлять собой объединенные белок/углеводные компоненты или только углеводные компоненты. Другие модификации данного белка, нормальные или аномальные, могут представлять собой также важные эпитопные детерминанты.

Обнаружение белка c-erb В-2 может быть выполнено при помощи хорошо известных иммунотестов с применением антител, специфических для c-erb B-2 белка, например, описанных здесь. Такие антитела коммерчески доступны, например, из Chemical International, Inc., Temecula, CA, или могут быть получены стандартными иммунологическими способами. См., например, Harlow and Lane, Antibodies; A Laboratory Manual, Cold spring Harbor Publication, N.Y. (1988), включено в ссылки.

Определение c-erb В-2 белка будет здесь относиться также к белкам, происходящим из других систем хозяев, например, к белкам, которые иммунологически близки к человеческому c-erb В-2. Например, близкий крысиный ген (обозначенный neu) был сообщен Schecter, et al., Science, 229:976 (1985).

Удобными эпитопами, к которым можно легко получить антитела, являются внеклеточные эпитопы, обнаруженные на целевых клетках. Эти эпитопы в основном представляют собой белковые эпитопы, например, линейные или конформационные эпитопы белка, обнаруженные на неопластических (опухолевых) клетках. Другими применимыми эпитопами являются углеводные или иные модификации, обычно посттрансляционные, обнаруженные на c-erb В-2 белке. Антитела и другие связывающие участки, обладающие специфичностью в отношении избыточно экспрессируемого c-erb В-2, могут быть выработаны против фрагментов этого белка.

Были получены мышиные моноклональные антитела против внеклеточной части c-erb В-2. Одним из примеров таких антител является TAb 250, депонированный в АТСС Rockville, Maryland под N НВ10646.

Альтернативно, направляющая часть молекулы может быть получена любым другим способом, обеспечивающим аффинность и специфичность в отношении экспрессирующей c-erb В-2 клетки. Например, в качестве направляющей части молекулы мог бы применяться лиганд, узнаваемый и связываемый c-erb В-2 белком. См. , например, Ciccodicola, et al., (1989) Embo J. 3:1987-1991; Ciardiello, et al., (1991) Cancer Research 51:1051-1054; и Ciardiello, et al., (1991) P. N. A. S. USA 88:7792-7796, которые описывают CRIPTO, молекулу, которая, по-видимому, служит в качестве лиганда для рецептора EGF, а также связывается специфически с c-erb В-2 белком.

Что касается описываемых здесь последовательностей, следует понимать, что к ним относятся также такие их разновидности, как мутации в виде замены, добавления и(или) делеции, или любая другая последовательность, обладающая связывающей активностью, сходной с активностью последовательности, из которой она получена или которой она подобна.

Для этого изобретения антитело или другой пептид является специфическим для c-erb B-2 белка, если антитело или пептид связывают или способны связывать c-erb В-2, что измеряют или определяют стандартными тестами антиген-антитело или лиганд-рецептор, например, конкурентными тестами, тестами насыщения или стандартными иммуноанализами, такими как ELISA или RIA. Это определение специфичности применимо к одиночным тяжелым и(или) легким цепям, CDR, слитым белкам или фрагментам тяжелой и(или) легкой цепи, которые также специфичны в отношении белка c-erb В-2, если они связывают белок c-erb В-2 в отдельности или они способны специфически связывать белок c-erb В-2 после включения в конформацию иммуноглобулина с комплементарными вариабельными областями и константными областями.

В конкурентных тестах способность антитела или пептидного фрагмента связывать антиген может быть определена обнаружением способности пептида конкурировать со связыванием соединения, антигенсвязывающая способность которого известна. Известны многочисленные типы конкурентных тестов, которые здесь обсуждаются. Альтернативно, можно также применять тесты, в которых измеряют связывание тест-соединения в отсутствие ингибитора. Например, способность молекулы или другого соединения связывать белок c-erb В-2 можно детектировать мечением непосредственно целевой молекулы или целевая молекула может быть немеченой и детектироваться косвенно с применением "сэндвич"- тестов. Известны многочисленные типы тестов связывания, таких как тесты конкурентного связывания. (См. , например, U.S. Patent NN 3376110 и 4016043, Harlow and Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, N. Y. (1988) и Coligan, et al., /eds/, Current Protocol in Immunolory, Wiley and Sons, N.Y., на которые здесь ссылаются). Пригодны также тесты измерения связывания тест-соединения с одним компонентом без конкуренции. Например, можно применять иммуноглобулины для идентификации присутствия белка c-erb В-2. Можно применять стандартные способы для тестирования моноклональных антител, такие как ELISA (см., Harlow and Lane, supra). Для обозрения различных продуцирующих сигнал систем, которые могут быть использованы, см. U.S. Patent N 4391904, включенный в ссылки.

Далее, специфичность связывающих частей молекул в отношении c-erb В-2 может быть определена по их аффинности. Такая специфичность существует, если константа диссоциации (K_D=1/К, где К - константа аффинности) части молекулы менее 1 мкМ, предпочтительно менее 100 нМ и наиболее предпочтительно менее 1 нМ. Молекулы антител обычно имеют K_D в более низких диапазонах. К = [R-L] /[R] [L] , где [R], [L] и [R-L] - концентрации при равновесии рецептора или c-erb В-2 (R), лиганда, антитела или пептида (L) и рецептор-лигандного комплекса (R-L), соответственно. В типичном случае связывающими взаимодействиями между лигандом или пептидом и рецептором или антигеном являются обратимые нековалентные связи, такие как электростатическое притяжение, ван-дер-вальсовы силы и водородные связи.

Другие тесты могут предусматривать детектирование присутствия или отсутствия различных физиологических или химических изменений, которые могут быть результатом взаимодействия, таких как отрицательная модуляция, интернализация или увеличение фосфорилирования, как описано в U.S. Patent Application N 07/644361 filed 1/18/91. См. также Receptor-Effector Coupling - a Practical approach, ed. Hulme, IRL Press, Oxford (1990).

Предпочтительный пептид, специфический для белка c-erb В-2, индуцирует увеличение фосфорилирования этого белка при помещении в контакт с опухолевыми клетками, экспрессирующими белок c-erb В-2. Молекула, индуцирующая увеличение фосфорилирования белка c-erb В-2, вызывает детектируемое увеличение во включении фосфата в белок по сравнению с включением в отсутствие этой молекулы. Обычно наблюдают двукратное или большее увеличение в фосфорилировании, предпочтительно более чем трехкратное увеличение над контролем. Фосфорилирование можно измерять способами, известными в этой области, применяемыми для детектирования фосфорилирования рецепторов. См., например, Cooper et al., Methods in Engymology, 99:387-402 (1983); Antoniades and Pantajis, Methods in Engymology, 147:36-40 (1987); и Lesniak, et al., Methods in Engymology, 150:717-723 (1987), на которые даны ссылки.

В типичном случае фосфорилирование можно измерять путем in vivo фосфорилирования интактных клеток (Lesniak, supra) или путем in vitro аутофосфорилирования (Antoniadis, supra). Для измерения in vivo фосфорилирования, например, тесты можно проводить помещением несущих белок c-erb В-2 клеток в контакт с радиоактивно меченым фосфатом. Для детектирования фосфорилирования рецептора белка c-erb В-2 в тесте ni vivo предпочтительно инкубировать тестируемые клетки в течение 12-18 часов с меченым фосфатом. Клетки делят на две или более экспериментальных серий и некоторые экспонируют с молекулами, которые предпочтительно должны увеличивать фосфорилирование, а другие являются контролями. Затем аликвоты иммунопреципитируют, рецептор детектируют, например, при помощи электрофореза в ПААГ с DDC Na или способом радиоавтографии, и статистически значимым увеличением в фосфорилировании считается двукратное или большее увеличение в пробе, экспонированной с тестируемой молекулой, по сравнению с контролями.

Для измерения in vitro аутофосфорилирования, например, клетки или клеточные экстракты можно инкубировать в присутствии или в отсутствие пептида, специфического для c-erb B-2. После иммунопреципитации антителами против c-erb B-2 иммунный комплекс можно инкубировать с ³² Р-АТФ и анализировать при помощ