Рекомбинантная молекула днк, кодирующая молекулу iсам-3, молекула адгезии iсам-3, антитело, способное связываться с такой молекулой, фармацевтическая композиция

Рекомбинантная молекула днк, кодирующая молекулу iсам-3, молекула адгезии iсам-3, антитело, способное связываться с такой молекулой, фармацевтическая композиция

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины, точнее - медицинской генетики. Сущность изобретения заключается в создании рекомбинантной молекулы ДНК, кодирующей молекулу адгезии ICAM-3, а также в экспрессии с помощью ДНК, молекулы адгезии ICAM-3. Изобретение включает также создание антитела или его фрагмента, способного связываться рецептором в организме больного. Создана также фармацевтическая композиция на основе антител. Технический результат изобретения заключается в расширении арсенала иммунокомпетентных средств. 4 с. и 11 з.п. ф-лы, 18 ил., 4 табл.

Изобретение относится к открытию новой адгезионной молекулы, обозначенной ICAM-3, которая вовлечена в процесс, за счет которого популяция лейкоцитов распознает и прикрепляется к клеточному субстрату. ICAM-3 является посредником в клеточных взаимодействиях с другими лимфоцитами, макрофагами и нейтрофилами в участках воспалений и участках иммунных реакций.

Далее изобретение относится к использованию ICAM-3 отдельно или в сочетании с ICAM-1 и/или ICAM-2, для ингибирования межклеточной адгезии клеток гранулоцитов, лимфоцитов или макрофагов. Использование таких молекул обеспечивает способы лечения специфических и неспецифических воспалений.

Изобретение относится к терапевтическим и профилактическим способам супрессии инфицирования лейкоцитов HIV и, особенно, HIV-1 у индивидуумов, подверженных HIV или инфицированных HIV за счет введения ICAM-3 одной или в сочетании с ICAM-2. Оно предлагает лечение таких заболеваний, как AIDS (СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита), которые вызываются вирусом HIV.

Изобретение относится к терапевтическим способам супрессии миграции инфицированных HIV-1 клеток из циркуляторной системы за счет использования ICAM-3, одной или в сочетании с ICAM-1 и/или ICAM-2. Поэтому оно предлагает лечение таких заболеваний, как AIDS (СПИД-синдром приобретенного иммунодефицита), которое вызывается вирусом HIV.

Изобретение относится также к способам супрессии гибели Т-клеток и образования "синцитий" у индивидуумов, инфицированных HIV, за счет использования ICAM-3, одной или в сочетании с ICAM-1 и/или ICAM-2. Поэтому оно обеспечивает лечение таких заболеваний, как AIDS (СПИД-синдром приобретенного иммунодефицита), которое вызывается вирусом HIV.

Изобретение относится к использованию ICAM-3, одной или в сочетании с ICAM-1 и/или ICAM-2, при лечении астмы.

Изобретение дополнительно относится к молекулам, способным связывать ICAM-3 (здесь и далее анти-ICAM-3). Связывание анти-ICAM-3 молекул с ICAM-3 предназначено для модуляции биологических функций, связанных с ICAM-3. Связующие молекулы настоящего изобретения могут быть антителами, пептидами или углеводородами, которые способны связываться с ICAM-3. Такие связующие молекулы пригодны для модулирования биологических функций ICAM-3.

Изобретение относится также к использованию анти-ICAM-3, одной или в сочетании с анти-ICAM-1 и/или анти-ICAM-2, или ингибирования межклеточной адгезии клеток гранулоцитов, лимфоцитов или макрофагов. Использование таких молекул предлагает способ лечения специфических и неспецифических воспалений.

Изобретение относится также к терапевтическим и профилактическим способам супрессии инфицирования лейкоцитов HIV и, особенно, HIV-1 у индивидуумов, которые подвержены HIV или инфицированы HIV, за счет ведения анти-ICAM-3, одной или в сочетании с анти-ICAM-1 и/или анти-ICAM-2. Поэтому настоящее изобретение предлагает лечение таких заболеваний, как AIDS (СПИД-синдром приобретенного иммунодефицита), которые вызываются вирусом HIV.

Изобретение относится к терапевтическим способам супрессии миграции HIV-1 инфицированных клеток из циркуляторной системы, используя анти-ICAM-3 агент, один или в сочетании с анти-ICAM-1 и/или анти-ICAM-2 агентами. Поэтому оно предлагает лечение таких заболеваний, как AIDS (СПИД-синдром приобретенного иммунодефицита), который вызывается вирусом HIV-1.

Далее изобретение относится к использованию анти-ICAM-3 агента, одного или в сочетании с анти-ICAM-1 и/или анти-ICAM-2, при лечении астмы.

A. Прикрепление лейкоцитов и функции.

Лейкоциты должны быть способы присоединяться к клеточному субстрату или соответствующей защиты хозяина против чужеродного вторжения бактерий или вирусов - см. Eisen. H.W. (в Microbiology, 3d Ed., Harper and Row, Philodelphia, PA. PA, 1980, pp. 290-295 и 381-418) для обзора этих функций. Лейкоциты должны быть способны прикрепляться к эндотелиальным клеткам таким образом, чтобы они могли мигрировать из циркуляторной системы к участкам воспаления. Более того, они должны прикрепляться к представляющим антиген клеткам таким образом, чтобы могла осуществляться нормальная специфическая иммунная реакция, и, наконец, они должны прикрепляться к соответствующим мишеневым клеткам таким образом, чтобы мог происходить лизис инфицированных вирусом или опухолевых клеток.

Недавно молекулы поверхности лейкоцитов, вовлеченные в вышеуказанные функции присоединения, были идентифицированы с использованием гибридомной технологии. Короче, моноклональные антитела, направленные против T-клеток человека (Davignon, D, et al. , Proc.Natt.Acad. Sci., USA, 78: 4535-5439 (1981) и клеток селезенки мышей (Springer, T.et al., Eur., J. Imunol. 9: 310-306 (1979) были идентифицированы, известно, что они связаны с лейкоцитными поверхностями и ингибируют присоединения описанных ранее родственных функций (Springer, T. et al., Fed. Proc., 44: 2660-2663 (1985)). Молекулы, идентицифированные такими антителами, были названы Mac-1 и Антигеном-1, связанным с лимфоцитной функцией (LFA-1). Mac-1 является гетеродимером, который найден на макрофагах, гранулоцитах и крупных гранулярных лимфоцитах. LFA-1 является гетеродимером, найденным на большинстве лимфоцитов (Springer, F.A. et al. , Immunol. Rev., 68: 111-135 (1982)). Эти две молекулы плюс третья молекула, p. 150-95 (которая имеет распределение ткани, аналогичное Mac-1) играют роль в клеточной адгезии (Keizer, G.D., et al., Eur. J. Immunol., 15: 1142-1147 (1985)).

Было обнаружено, что вышеуказанные молекулы лейкоцитов являются членами родственного семейства гликопротеинов (Sanches - Madrid, F. et al., J. Exper. Med. 158: 1785-1803; Keizer. G.D.et al., Eur. J. Immunol. 15: 1142-1147 (1985)), называемого "CD-18 семейством" гликопротеинов. Это семейство гликопротеинов состоит из гетеродимеров, содержащих одну альфа-цепь и одну бета-цепь. Хотя альфа-цепь каждого из антигенов отличается от другой, было обнаружено, что бета-цепи являются высококонсервативными (Sanches-Madrid. F., et al., J.Exper.Med, 15: 1785-1803 (1983)). Бета-цепь гликопротеинового семейства (иногда называемого как "CD-18"), как было найдено, имеет молекулярный вес 95 кд, тогда как альфа-цепи имеют молекулярный вес от 150 мд до 180 кд (Springer. T., Fed.Proc., 44: 2660-2663 (1985)). Хотя альфа-субъединицы протеинов мембраны не обладают высокой гомологичностью, присущей бета-субъединицам, тщательный анализ альфа-субъединиц гликопротеинов показал, что между ними имеется существенное сходство. Обзор аналогий между альфа- и бета-субъединицами LFA-1 родственных гликопротеинов представлен Sanches-Madrid, F, et al. (J. Exper. Med., 158: 586-602 (1983); J.Exper.Med., 158: 1785-1803 (1983)).

Была идентифицирована группа индивидуумов, которые оказались неспособными экспрессировать нормальные количества ни одного из адгезионных протеинов этого семейства на поверхности клеток их лейкоцитов (Anderson, D.C., et al., Fed. Proc.44: 2671-2677 (1985); Anderson, D.C., et al., J.Infect. Dis., 152: 668-689 (1985)). Эти индивидуумы страдают от "болезни дефицита адгезивности лейкоцитов ("LAD") (Anderson, D.C., et al., Fed.Proc., 44: 2671-2677 (1985); Anderson, D.C., et al., J.Infect.Dis., 152: 668-689 (1985)). Характерные особенности больных LAD включают язвы с некротическими мягкими тканями, недостаточное образование гноя и плохое заживление ран, а также ненормальные, зависящие от адгезии, функции лейкоцитов in vitro и подверженность хроническим и повторным бактериальным инфекциям. Гранулоциты таких LAD пациентов ведут себя несколько дефективно in vitro по сравнению с нормальными образцами в присутствии анти-CD18 моноклональных антител. То есть они не способы осуществлять такие функции, связанные с адгезией, как аггрегация или прикрепление к эндотелиальным клеткам. Однако более важным наблюдением является, то что эти пациенты не способны вырабатывать нормальную воспалительную реакцию из-за неспособности их гранулоцитов прикрепляться к клеточным субстратам. Наиболее значительным является тот факт, что гранулоциты этих LAD пациентов не способны достичь участков воспаления, таких как кожные инфекции, из-за их неспособности прикрепляться к эндотелиальным клеткам в кровеносных сосудах вблизи воспаленных участков. Такое прикрепление является необходимым шагом для транссудации.

Лимфоциты этих пациентов демонстрируют in vitro дефекты, аналогичные нормальным лимфоцитам, у которых CD-18 семейство молекул было антагонизировано антителами. Более того, эти индивидуумы не способны вырабатывать нормальную иммунную реакцию из-за неспособности их клеток прикрепляться к клеточным субстратам (Anderson, D.C., Fed.Proc., 44: 2671-2677 (1985); Anderson. D.C., et al., J.Infect. Dis., 152: 668-689 (1986)). Эти данные показывают, что иммунные реакции ослабляются, если лимфоциты не способны нормальным образом прикрепляться из-за недостаточной функции адгезионных молекул CD-18 семейства.

Таким образом, способность лейкоцитов поддерживать здоровье и жизнеспособность животных требует, чтобы они были способны прикрепляться к другим клеткам (например, эндотелиальным клеткам). Как было показано, такое прикрепление требует контакта клетка-клетка, который включает специфические рецепторы молекул, имеющиеся на клеточной поверхности лейкоцитов. Эти рецепторы дают возможность лейкоцитам прикрепляться к другим лейкоцитам к эндотелиальным клеткам и к другим несосудистым клеткам. Было найдено, что клеточные поверхности рецепторных молекул, LFA-1, Mac-1 и p15095 очень похожи друг на друга. У тех людей, лейкоциты которых не имеют на поверхности клеток рецепторных молекул, наблюдаются хронические и повторные инфекции, а также другие клинические симптомы, включая дефектные реакции антител.

Кроме того, так как адгезия лейкоцитов включена в процесс, в результате которого идентифицируются и отторгаются чужеродные ткани, понимание этого процесса имеет существенное значение в области трансплантации таких твердых органов, как почка, трансплантации таких нетвердых органов, как костный мозг, при трансплантации тканей, при аллергии и в онкологии.

B. Инфицированные HIV HIV инфекция является причиной AIDS. Описаны множество вариантов HIV: двумя основными являются HIV-1 и HIV-2. В Северной Америке и Европе приобладает HIV-1, а HIV-2 преобладает только в Африке. Эти вирусы имеют аналогичные структуры и кодируют протеины с аналогичными функциями. Предполагают, что инфекция происходит в результате связывания протеина вируса (именуемого "gp120") с рецепторной молекулой (именуемой "CD4"), присутствующей на поверхности Т4 ("Т хелпер") лимфоцитов (Schnittman, S.M., et. al., J. Immunol. 141: 4181-4186 (1988), включено сюда по ссылке). После связывания с этим рецептором вирус проникает в клетку и реплицируется, и в этом процессе убивает Т клетки. Таким образом, разрушение Т4 популяции у индивидуумов и является прямым результатом HIV инфекции.

Разрушение Т клеток приводит к ослаблению способности инфицированного пациента бороться против инфекций. Хотя у индивидуумов, пораженных AIDS, часто развиваются раковые заболевания, связь между этими раковыми заболевания и HIV инфекцией в большинстве случае неопределена.

Хотя сам факт репликации вируса HIV является летальным для инфицированных клеток, обычно такая репликация детектируется лишь в небольшой части Т4 клеток инфицированного индивидуума. Полученные недавно результаты позволяют предположить, что наблюдается гораздо большая виремия, нежели предполагавшаяся ранее, и что инфицирование Т-клеток часто достигает 1%.

Некоторые направления исследований разрабатывают другие механизма, за счет которых HIV вирус осуществляет деструкцию Т4 популяции.

Помимо HIV репликации, HIV инфицированные клетки могут быть разрушены за счет действия цитотоксичных, киллерных клеток. Киллерные клетки обычно присутствуют у людей и служат для контроля за хозяином и разрушения любых чужеродных клеток (как, например, при переливании неподходящей крови или при трансплантации органов и т.д.) при их проявлении. После инфицирования HIV клетки Т4 выдвигают молекулы gp120 на свою клеточную поверхность. Киллерные клетки распознают такие Т4 клетки как чужеродные (а не нативные) и соответственно осуществляют их разрушение.

HIV инфекция может также привести к разрушению неинфицированных, здоровых клеток. Инфицированные клетки могут секретировать gp 120 протеины в кровеносную систему. Свободные gp 120 молекулы могут затем связаться с CD4 рецепторами здоровых, неинфицированных клеток. Такое связывание заставляет эти клетки принимать вид HIV инфицированных клеток. Цитотоксичные, киллерные клетки распознают gp 120, связанные с неинфицированными Т4 клетками, принимают их за чужеродные и осуществляют деструкцию клеток.

Дополнительным механизмом и одним из наиболее интересных для настоящего изобретения, по которому HIV является причиной гибели Т4 клеток, является механизм, осуществляемый за счет образования "синцитий". "Синцитий" является гигантской многоядерной клеткой, образующейся при слиянии такого количества, как несколько сотен Т4 клеток. Инфицирование HIV вызывает у инфицированных клеток способность сливаться с другими Т4 клетками, независимо от того, являются ли они инфицированными HIV или здоровыми клетками. Такие синцитии не могут функционировать и вскоре гибнут. Эта гибель сопровождается деструкцией как HIV инфицированных, так и HIV неинфицированных Т клеток. Этот процесс представляет собой интерес для настоящего изобретения, так как включает непосредственный контакт клетка-клетка Т4 клеток. Способность HIV инфицированных клеток образовывать синцитии указывает на то, что такие клетки приобретают средства для слияния со здоровыми клетками.

HIV инфекция и особенно HIV-1 инфекция, по-видимому, влияют на экспрессию клеточной поверхности интегринов лейкоцитов и реакции клеточной адгезии, осуществляемые этими гетеродимерами (Pitit, A.J., et. al., J. Clin. Jnvest, 79: 188 (1987); Hildreth, G.E.K., et al., Sciense, 244: 1075 (1989); Valentin, A., et al., G. Immunology, 144: 934-937 (1990); Rossen, P.D., et al. , Trans Assoc. American. Physicians, 102: 117-130 (1989), причем все ссылки включены сюда по ссылке). После инфицирования возрастает гомотипическая аггрегация U937 клеток, а также экспрессия клеточной поверхностью CD18 и CD11b (Petit, A.J., et al., J. Chin, Jnvest., 79: 188 (1987)). Инфицированные HIV клетки U937 прикрепляются к IL-1 стимулированному эндотелию гораздо чаще, нежели неинфицированные U937 клетки; такое поведение можно подавить, обрабатывая инфицированные клетки анти-CD18 и/или анти-CD11а моноклональными антителами или обрабатывая эндотелиальные субстраты анти-ICAM-1 антителами (Rossen. P. D. , et al. , Trans Assoc. American Physicians, 102: 117-130 (1989)). Моноклональные антитела к CD18 или CD11, как было обнаружено, также способны ингибировать образование синцитий, включающих фитогемагглютинином (PHA)-стимулированные лимфобластоидные клетки и конструктивно инфицированные CD4-негативные Т клетки (Hildreth, I. E. K. , et al., Sciense, 224: 1075 (1989)). Как было показано, обработка инфицированных вирусом клеток только анти-CD18 или анти-CD11а моноклональными антителами оказывает слабое воздействие на образование синцитий, что предполагает, что эти антитела принципиально защищают неинфицированные мишеневые клетки от инфекции (Hildreth, I. E.K. et al., Science, 244: 1075 (1989); Valent, H.A., et al. J. Immunology, 144: 934-937 (1990)). Valentin et al., (Valent H.A., et al., J. Immunology, 144: 934-937 (1990) недавно подтвердил эти наблюдения, продемонстрировав то, что моноклональные антитела, специфические для CD18, ингибируют синцитии, образующиеся в случае, когда непрерывные Т-клеточные линии культивируют совместно с HIV-1 инфицированными U937 клетками.

Хотя механизм, за счет которого моноклональные антитела, специфические для CD18 или CD11а, защищают подверженные клетки от слияния с HIV инфицированными клетками, остается неизвестным и это исследование вовсе не обязательно для целей настоящего изобретения, исследования с радиомеченными gp 120 позволяют предположить, что гетеродимеры, содержащие CD18, не предоставляют сайтов связывания для вируса (Valentin, A., et al., J. Immunology, 144: 934-937 (1990)). Таким образом, HIV инфекция включает взаимодействие клетка-клетка и/или взаимодействие вирус-клетка, которые имитируют такие взаимодействия, как клетка-клетка. Взаимодействие типа клетка-клета могут привести к транспорту клеток, не содержащих вируса, или инфицированных вирусом клеток через эндотелиальные барьеры. Взаимодействия типа вирус-клетка, которые имитируют взаимодействия клетка-клетка, могут облегчить или обеспечить присоединение свободного вируса к здоровым клеткам и/или инфицировать здоровые клетки.

Таким образом, настоящее изобретение возникло, частично из наблюдения того, что HIV инфекция, и особенно HIV-1 инфекция, приводит к повышению экспрессии CD11а/CD18 гетеродимера и связывающего его лиганда. Такое повышение экспрессии отличается тем, что оно повышает способность HIV-инфицированных Т-клеток прикрепляться или аггрегироваться друг с другом (то есть претерпевают "гомотипическую аггрегацию"). Так как такая гомотипическая аггрегация не наблюдается между покоящимися нормальными лейкоцитами, это означает, что экспрессия CD11/CD18 рецепторов и/или лигандов, таких как ICAM-1, необходима для такой аггрегации. LFA-1 должен связаться с ICAM-1 для того, чтобы могла произойти гомотипическая аггрегация. Как здесь было указано, ICAM-1 является единственным членом семейства CAM молекул, которые с высокой степенью экспрессируются на покоящихся Т-клетках. Только анти-ICAM-3 антитела способны блокировать адгезию Т-клеток к LFA-1, если Т-клетки не "активированы". Поэтому анти-ICAM-3 антитела можно использовать для супрессии аггрегации Т-клеток.

Дополнительно анти-CAM-3 антитела можно использовать для блокирования процессов адгезии инфицированных Т-клеток, которые позволяют осуществлять передачу HIV-1 с инфицированных клеток на здоровые клетки индивидуума и также обеспечивают или облегчают инфицирование здоровых клеток свободным вирусом C.

Миграция клеток, инфицированных HIV.

Миграция и распространение лейкоцитов является важным фактором для защиты индивидуумов от последствий болезней. Однако эти процессы являются также ответственными за миграцию и распространение инфицированных вирусом лейкоцитов. Наибольший интерес представляет миграция и распространение лейкоцитов, инфицированных HIV. Миграция таких клеток приводит к образованию экстраваскулярного фокуса и может вызвать опухоли и другие нарушения.

Гистологические исследования поврежденных органов выявляют фокальные экстраваскулярные мононуклеарные клеточные инфильтраты. Попытки идентифицировать инфицированные вирусом клетки в таких инфильтратах в центральной нервной системе выявили наличие HIV-1 инфицированных клеток. Эти исследования показали, что вирус HIV-1 находится преимущественно в моноцитах и микрофагах и других клетках этого направления (R.T. Johnson, et al., FASEB, 2: 2970 (1988); M. H. Stoler et al., J. Amer. Med. Assn., 256: 2370 (1986): S Jartner et al., Science, 233: 215 (1986)).

Механизмы, которые стимулируют образование эстраваскулярных инфильтратов HIV-1 инфицированных моноцитоидных клеток, ранее не были определены. Эти механизмы могут включать либо транспорт клеток, свободных от вируса, либо транспорт вируса через эндотелиальные барьеры внутри цитоплазмы инфицированных моноядерных клеток.

Так как инфицирование HIV-1 стимулирует экспрессию клеточной поверхностью молекул, которые облегчают прикрепление лейкоцитов к эндотелиальным клеткам сосудов и трансляцию лейкоцитов из крови к участкам экстраваскулярных тканей (C.W. Smith et al., J. Clin. Invect., 82: 1746 (1988), включено по ссылке), было предложено использовать антитела, которые ингибируют клеточную миграцию, для предотвращения распространения HIV-инфицированных клеток (WO 90/13316).

Д. Астма: Клинические характеристики.

Астма является гетерогенными семейством заболеваний. Она характеризуется гипер-реактивностью трахеобронхов на стимулы (Kay, A.B. Allergy and Inflammation, Academic Pess. N. Y. (1987), которая включена сюда по ссылке). Клинически астма проявляется сильным сужением трахеобронхов, густыми выделениями, спазмами, одышкой (dyspnea), кашлем и насморком. Хотя относительный вклад каждого из этих состояний неизвестен, общим результатом является возрастание сопротивления воздушных путей, гиперинфляция легких и грудной клетки и ненормальное распределение вентиляции и попытка крови в легких. Заболевание выражается в эпизодических периодах острых симптомов, прерывающих спокойные периоды. Острые приступы приводят к гипоксии и могут быть фатальными. Приблизительно 3% всего населения мира страдает от астмы.

Были описаны два типа астмы: аллергическая астма и идеосинкразическая астма. Аллергическая астма обычно связана с наследственными аллергическими заболеваниями, такими как риниты, крапивница, экзема и т.д. Эти условия характеризуются положительными реакциями покраснения и появления волдырей на подкожные инъекции витающих в воздухе антигенов (таких как пыльца, загрязнители окружающей среды или среды обитания и т.д.) и повышением уровней Ig в сыворотке. Развитие аллергической астмы, по-видимому, тесно связано с наличием IgH антител у многих пациентов. Больные астмой, у которых не обнаруживаются вышеуказанные признаки, рассматриваются как больные идиосинкразической астмой.

Считают, что аллергическая астма зависит от IgH реакции, контролируемой T и B лимфоцитами и активируется взаимодействием существующих в воздухе антигенов со связанными с мастоцитами заранее образовавшиеся IgE молекулами. Отпор антигенов должен происходить при концентрациях, достаточных для доведения IgE продуцирования в течение достаточно продолжительного промежутка времени для сенсибилизации индивидуумов. Будучи однажды сенсибилизированным, больным астмой может демонстрировать симптомы в ответ на чрезвычайно низкие уровни антигена.

Симптомы астмы могут усиливаться за счет присутствия и количества антигенов-триггеров, факторов окружающей среды, мест обитания, физических выделений и эмоциональных стрессов.

Астму можно лечить метилксантинами (такими как теофиллин), бета-адренергическими агонистами (такими как катехоламины, резорцинолы, салигенины и эфедрин), глюкокортикоидами (такими как гидрокортизон), ингибиторами дегрануляции мастоцитов (например, такими хромонами, как хромолиннатрий) и анти-холинэргиками (например, атропином).

Считают, что астма включает приток эозинофилов ("эозинофилия") в ткани легких (Frigas, E. J. Allergy Clin. Immunol., 77: 527-537 (1986), включено по ссылке).

Взгляд на иммунологические основы астмы был брошен в результате исследования бронхеоальвеолярного лаважа (Godard. P, et al., J. Allergy Clin. Immunol. , 70: 88 (1982)) и исследования тканей гладкой респираторной мускулатуры со снятым эпителием (Flavaham, N.A. et al., J. Appl. Physiol., 58: 834 (1985); Barnes, P. I. et al., Br. J. Pharmacol., 86: 685 (1985)). Хотя эти исследования и не привели к выяснению механизма, лежащего в основе иммунологии астмы, они привели к развитию общепринятой гипотезы, относящейся к иммунологической этиологии заболевания (см. Frigas. E. et al., J. Allergy Clin. Immunol., 77: 527-537 (1986).

Критериями патологии астмы являются массивная инфильтрация легочной паренхимы эозинофилами и разрушение функций мерцательного эпителия.

"Эозинофильная гипотеза" предполагает, что эозинофиты прикреплены к бронхам для нейтрализации вредных медиаторов, высвобождаемых тучными клетками легких (мастоцитами). В соответствии с этой гипотезой эозинофилы притягиваются к бронхам, где они дегранулируют с высвобождением цитотоксических молекул. После дегрануляции эозинофилы высвобождают такие энзимы, как гистамин, арилсульфатазу и фосфолипазу D, которые энзиматически нейтрализуют вредные медиаторы мастоцитов. Однако эти молекулы промотируют также деструкцию мерцательного аппарата, что предотвращает очищение от бронхиальной секции и вносит вклад в повреждения легких, характерные для астмы.

Так как астма включает миграцию клеток, было предложено использовать антитела, которые ингибируют такую миграцию для уменьшения действия аллергенов на субъектах (WO 90/10453).

Изобретение основано на открытии новой клеточной адгезионной молекулы, названной Межклеточной адгезионной молекулой-3 (ICAM-3). Настоящее изобретение дополнительно относится к функциональным производным ICAM-3, анти-ICAM-3 антителам, фрагментам указанных антител, гуманизированным анти-ICAM-3 антителам и к другим молекулам, способным связываться с ICAM-3 и ингибировать биологические функции ICAM-3.

Кроме того, настоящее изобретение включает диагностическое и терапевтическое использование для всех вышеуказанных молекул.

Более конкретно, настоящее изобретение включает ICAM-3 или его функциональное производное, практически не содержащие природных примесей.

В настоящем изобретении предложен способ получения рекомбинантных или синтетических ДНК молекул, способных кодировать или экспрессировать ICAM-3 или его функциональные производные.

Дополнительно настоящее изобретение предлагает антитела и особенно моноклональные антитела, способные связываться с молекулами, выбранными из группы, состоящей из ICAM-3 и функциональных производных ICAM-3.

Изобретение включает способы получения целевых гибридомных клеток, которые продуцируют антитела, которые способны связываться с ICAM-3 или их функциональными производными, включающие стадии: (a) иммунизации животного иммуногеном, выбранным из группы, состоящей из: практически чистых ICAM-3; клеток, экспрессирующих ICAM-3; мембраны клеток, экспрессирующих ICAM-3; ICAM-3, связанных с носителем; пептидных фрагментов ICAM-3; или пептидных фрагментов ICAM-3, связанных с носителем; (b) слияния клеток селезенки, выделенных из указанного животного, с миеломной клеточной линией; (c) предоставления возможности слитым селезеночным и миеломным клеткам образовывать антитела, способные секретировать гибридомные клетки, (d) скринирования гибридомных клеток на предмет гибридомных клеток, способных продуцировать анти-ICAM-3 антитела.

В изобретении предложен также способ модулирования осуществляемых ICAM-3 биологических функций клеток, причем указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества ICAM-3 модулирующего агента, причем указанным ICAM-3 модулирующий агент выбирают из группы, состоящей из антитела, способного связываться с ICAM-3; фрагмента указанного антитела; причем указанный фрагмент способен связываться с ICAM-3; ICAM-3; функционального производного ICAM-3; и неиммуноглобулинового антагониста ICAM-3, отличного от ICAM-1, ICAM-2 или членов CD-18 семейства молекул.

В настоящем способе предложен также способ лечения специфических воспалений у людей и других млекопитающих, отличающийся тем, что указанный способ включает введение нуждающемуся в лечении субъекту такого количества противовоспалительного агента, которого достаточно для подавления воспаления, где противовоспалительный агент выбирают из группы, состоящей из антител, способных связываться с ICAM-3; фрагмента указанного антитела; причем указанный фрагмент способен связываться с ICAM-3; практически чистого ICAM-3; функционального производного ICAM-3; или неиммуноглобулинового антагониста ICAM-3, причем указанное воспаление является результатом трансплантации твердого органа (например, почки), трансплантации нетвердого органа (например, костного мозга) или пересадки тканей.

В изобретении предложен также способ лечения неспецифических воспалений у людей и других млекопитающих, отличающийся тем, что указанный способ включает введение нуждающемуся в лечении субъекту такого количества противовоспалительного агента, которого достаточно для подавления воспаления; причем противовоспалительный агент выбирают из группы, состоящей из: антител, способных связываться с ICAM-3; фрагментов указанных антител, причем указанный фрагмент способен связываться с ICAM-3; практически чистого ICAM-3; функциональных производных ICAM-3, или неиммуноглобулинового антагониста ICAM-3.

Далее изобретение включает способ лечения воспалений, где воспаление связано с болезненными состояниями, выбранными из группы, состоящей из синдрома расстройства дыхательной системы у взрослых, синдрома множественного поражения органов вторичного после сепсиса, кровотечения или травмы; поражений при переливании тканей миокарда или других тканей: острых гломерулонефритов; реактивных артритов; дерматозов с острыми воспалительными компонентами; острых пурулентных менингитов или других воспалительных заболеваний центральной нервной системы, например ударов, ожогов, гемодиализа, лейкафереза, язвенных колитов, болезни Крона, некротирующих энтероколитов, синдромов, связанных с трансфузией гранулоцитов, и токсичности, вызванной цитокинами.

Изобретение включает также способ подавления метастазов кроветворных опухолевых клеток, клеток, использующих члены CD-18 (особенно LFA-1) для миграции, где указанный способ включает введение пациенту, нуждающемуся в лечении, такого количества агента, которого достаточно для подавления метастазов; причем указанный агент выбирают из группы, состоящей из антител, способных связываться с ICAM-3; токсин-производных указанных антител; фрагментов указанного антитела, причем указанный фрагмент способен связываться с ICAM-3; токсин-производного указанного фрагмента; практически чистого ICAM-3; токсин-производного ICAM-3; функционального производного ICAM-3, токсин-производного ICAM-3; или неиммуноглобулинового антагониста ICAM-3, отличного от члена CD-18 семейства молекул.

Изобретение включает также способ подавления роста ICAM-3 экспрессирующих опухолевых клеток, причем способ включает введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, такого количества агента, которого достаточно для подавления роста, причем указанный агент выбирают из группы, состоящей из антител, способных связываться с ICAM-3; токсин-производного указанного антитела; фрагментов указанного антитела, причем указанный фрагмент способен связываться с ICAM-3; токсин-производного указанного фрагмента; токсин-производного члена семейства CD-18 молекул; или токсин-производного функционального производного членов семейства молекул CD-18.

В изобретении предложен также способ детектирования наличия клеток, экспрессирующих ICAM-3, причем указанный способ включает: (a) инкубирование клеток или экстракта клеток в присутствии молекул нуклеиновой кислоты, причем молекулы нуклеиновой кислоты способны гибридизоваться в ICAM-3 MRNA; и (b) определение наличия гибридизации молекул нуклеиновой кислоты с комплементарными нуклеиновой кислоте молекулами, присутствующими в указанных клетках или в указанном экстракте указанных клеток.

В изобретении предложен способ определения наличия ICAM-3 в образцах биологических жидкостей, причем указанный способ включает: (a) инкубирование указанного образца с антителами или их фрагментами, которые способны связываться с ICAM-3; и (b) детектирование наличия или отсутствия связывания антитела указанным образом.

В изобретении предложена также фармацевтическая композиция, содержащая: (a) агент, выбранный из группы, состоящей из: антитела, способного связываться с ICAM-3; фрагмента указанного антитела, причем указанный фрагмент способен связываться с ICAM-3; практически чистого ICAM-3; функционального производного ICAM-3 или неиммуноглобулинового антагониста ICAM-3, отличного от членов CD-18 семейства молекул иммуносуппрессивного агента.

Фиг. 1. Адгезия клеточных линий к очищенным LFA-1.

Адгезия клеточной линии (A) и лимфоцитов (B) к очищенным LFA-1 объясняется ICAM-1, ICAM-2 и ICAM-3. Связывание BCECF меченых клеток на LFA-1 - покрытых микротитровальных ячейках в присутствии блокирующих MAb специфических для LFA-1, ICAM-1, ICAM-2 и ICAM-3. Контрольные ячейки были покрыты без LFA-1.

Фиг. 2. Цитометрический анализ в потоке клеточной экспрессии ICAM-1, ICAM-2 и ICAM-3.

(A) Лимфобластоидные клеточные линии были мечены насыщающими количествами либо MAb RR1 (1) анти-ICAM-1, MAb CB-IC2/1 (анти-ICAM-2), MAb CBR-IC3/1 (анти-ICAM-3), либо несвязывающим контролем MAb X63 (тонкие линии), и затем с последующим FITC-антимышиным иммуноглобулином.

(B) Покоящиеся человеческие лейкоциты и трехдневные PHA-активированные лимфоциты анализировали на предмет ICAM экспрессий, как указано ранее.

Фиг. 3. Иммуноосаждение ICAM-3.

(A) Лизаты ¹²⁵I-меченых клеток имммуноосажденные любым из несвязывающихся контрольных X63 MAb CB-IC3/1 (анти-ICAM-3).

(B) ¹²⁵I-меченые SKW3 клеточные лизаты, обработанные (+) или (-)N-гликаназой и иммуноосажденные любым из несвязывающихся контрольных MAb X63, MAb W6/32 (анти-HLA-A, B, C), MAb RR1/1 (анти-CAM-1), MAb CBR-IC2/1 (анти-CAM-2), либо MAb CB-ICB (анти-ICAM-3).

Фиг. 4. Иммуноосаждение ICAM-3 из различных источников.

CAM-3 иммуноосаждают из ¹²⁵I-меченых лимфоцитных и нейтрофильных лизатов, используя MAb-соединенную сефарозу. Иммуноосаждение ICAM-3 разрешают, используя электрофорез на полиакриламидном геле. Остальные MAb используют для иммуноосаждения других молекул клеточной поверхности. Человеческий Ig сефаразы (контрольные полоски), CBR-IC2/1 (ICAM-2), CBR-IC3/1 (ICAM-3), TS 2/4 (LFA-1), LM2/1 (MAC-1).

Фиг. 5. Влияние PMA на SKW3, связывание с ICAM-1 и CAM-3.

Способность SKW3 клеток связываться с очищенными ICAM-1 и ICAM-3 и влияние PMA стимуляции этого связывания тестируют описанным ранее способом (Dustin et al. , Nature, 341:619 91989); Marlin et al., Cell, 51: 813-819 1987)). Один из представительных экспериментов представлен, а прямоугольники ошибок показывают стандартное отклонение (SD).

Фиг. 6. Антитела, блокирующие PMA стимулированную SKW-3 клеточную адгезию.

Были тестированы различные антитела по их способности блокировать PMA стимулированные SKW-3 клетки связывания с очищенными ICAM-1 или ICAM-3, как было указано ранее (Dustin et al., Nature, 341:619 (1989); Marlin et al., Cell, 51: 813-819 (1987). Один представительный эксперимент представлен, а прямоугольники ошибок показывают SD.

Фиг. 7. Связывание COS клеточных трансфектантов с очищенными ICAM.

COS клетки трансфектируют LFA-1 вектором экспрессии, как было указано ранее (de Fougerolles et al., J.Exp.Med., 175: 185-190 (1992)). Эти трансфектированные клетки тестируют на предмет их способности связываться с иммобилизованными ICAM-1 и ICAM-3 в присутствии (или без) анти-LFA-1 антител (TS1/22). Представлен один представительный пример, а прямоугольники ошибок указывают SD.

Фиг. 8. Температурная зависимость PMA стимулированного SKW-3 связывания с ICAM.

PMA стимулированную SKW3 клеточную способность связываться с очищенным ICAM-1 и ICAM-3 тестируют при 4, 16, 22 и 37^oC, как указано ранее (Marlin et al. , Cell, 51: 813-819 (1987). Анализ проведен в присутствии или без LFA-1 MAb (TS1/22). Представлен один представительный пример, а прямоугольник ошибок указывает SD.

Фиг. 9. Блокирование антителами PHA-стимулированного деления T клеток.

Тестировали различные антитела по их способности блокировать PHA стимулированное деление T клеток, как указано ранее (Krensky et al., J. Immunol., 131:616 (1983)).

Фиг. 10. Влияние анти-ICAM антител на смешанные лимфоцитные реакции.

Различные антитела тестировали по их способности блокировать смешанные лимфоцитные реакции, как указано ранее (Krensky et al., J. Immunol., 131: 611-616 (1983)).

Фиг. 11. Газохроматографический анализ пептидных фрагментов ICAM-3.

ICAM-3 очищают и переваривают Lys-C. Пептидные фрагменты разделяют, используя высокоэффективную жидкостную хроматографию.

Фиг. 12. Диаграммное представление клона 11.2.

Схематическое представление клона 11.2. Показаны положения NK-10 и NK-17 пептидов, различные ДНК-последовательности, полученные таким образом, и трансмембранные участки.

Фиг. 13. Последовательное сравнение NK-IT примированной последовательности с ICAM-1 человека.

GAP программу использовали для идентификации гомологичности последовательности NK-10 примированной последовательности и протеина ICAM-1 человека.

Фиг. 14. Сравнение последовательности RM13 примированной последовательности с ICAM-1 человека.

GAP программа была использована для идентификации гомологичности последовательности для RM13 примированной последовательности и ICAM-1 человека.

Фиг. 15. Сравнение последовательностей RM13 примированной последовательности с ICAM-2 человека.

GAP программу используют для идентификации гомологичности последовательности для RM13 примированной последовательности и ICAM-2 человека.

Фиг. 16. Сравнение последовательностей Т7 примированной последовательности с ICAM-1 человека.

GAP программу использовали для идентификации гомологичности последовательности T7 примированной последовательности и ICAM-1 человека.

Фиг. 17. Сравнение последовательностей T7 примированной последовательности с ICAM-2 человека.

GAP программу использовали для идентификации гомологичности последовательностей T7 примированной последовательности и ICAM-2 человека.

Фиг. 18. Частичная пос