2130968 - Фрагмент рекомбинантной днк (варианты) и рекомбинантный бакуловирусный вектор для экспрессии нейропаралитического токсина (варианты)

Фрагмент рекомбинантной днк (варианты) и рекомбинантный бакуловирусный вектор для экспрессии нейропаралитического токсина (варианты)

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии. Предложены фрагменты рекомбинантной ДНК, в которых нейротоксинкодирующие последовательности помещены под управление гетерологических промоторов. Предложены также генетически модифицированные бакуловирусы. Изобретение позволяет разработать агенты по биологической борьбе с насекомыми, которые продуцируют токсичные для насекомых уровни нейротоксина и оказывают повышенное токсическое воздействие на насекомых. 6 c.п. ф-лы, 9 табл., 8 ил.

Данное изобретение было сделано частично на средства Национального института здоровья (субсидия N NS 26109). Правительство США может иметь определенные права на это изобретение.

Настоящее изобретение относится к методам и композициям для усовершенствованной биологической борьбы с насекомыми-вредителями. Более конкретно, настоящее изобретение относится к использованию и манипулированию генами, кодирующими специфические к насекомым паралитические нейротоксины, для разработки усовершенствованных агентов по биологической борьбе с насекомыми. Настоящее изобретение специально касается бакуловирусов, полученных методами генной инженерии для экспрессии гена, специфического к насекомому паралитического токсина, который получен из клеща, паразитического для насекомых.

Pyemotes tritici, клещ пузатый, является одним из тринадцати известных видов клещей рода Pyemotes, причем все они являются хищными и обладают ядами, вызывающими от умеренной до крайней токсичность у насекомых-мишеней. Тринадцать известных видов можно разделить на две морфологические группы, которые также отличаются по кругу хозяев, методам рассеивания и токсичности в отношении их хозяев, а также по эффектам, которые оказывают их токсины на насекомых и человека. Группы scolyti и ventricosus приведены в табл. 1. Большинство членов группы ventricosus обладает ядами, крайне токсичными для насекомых. Клещи группы scolyti являются все форетическими и обычно обнаруживаются на короедах; они могут вырабатывать паралитические токсины.

Жизненный цикл клещей продолжается только 7-14 суток, при этом 100-300 новорожденных сексуально зрелых клещей появляется из матери. Когда появляется самка, она немедленно спаривается и находит нового хозяина. Время паралича насекомого-хозяина варьирует, как полагают, в зависимости от вида, размера, стадии развития и количества нападающих клещей. Все стадии роста насекомого-хозяина могут привлекать клещей, однако взрослые, как правило, менее восприимчивы вследствие их более склеротизированных (то есть, утолщенных) оболочек, которые более трудно преодолеваются ротовыми частями клещей.

Сами яды клещей, по-видимому, не являются специфическими для определенных насекомых, поскольку яды токсичны для широкого круга хозяев и нехозяев насекомых видов. Токсин(ы) вызывает необратимый паралич, не разрушая респираторные механизмы (Weiser and Slama (1964), Ann. Ent. Soc. Am. 57:479).

Токсины, специфические к насекомым, которые присутствуют в яде P. tritici, очищены и охарактеризованы (Tomalski et al. (1988), Toxicon 26:127-132; Tomalski et al. (1989), Toxicon 27:1151-1167). Эти токсины продуцируются в самках клещей и инъецируются в тело жертвы в качестве компонентов яда, что приводит к параличу насекомого. Паралич позволяет самке клеща стать полностью беременной, что обеспечивает получение достаточных питательных веществ для воспроизводства. Компоненты токсина с низкой молекулярной массой вызывают быстрый паралич сокращающихся мышц, тогда как высокомолекулярная фракция токсина вызывает вялый паралич мышц.

Один компонент токсина, обозначенный ТхР-I, очищен до кажущейся гомогенности; он имеет кажущуюся молекулярную массу 27000, определенную электрофорезом в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия. Анализ аминокислотного состава ТхР-I представлен в работе Tomalski et al. (1989) supra. Относительно высокое содержание цистеина может привести к образованию ряда дисульфидных связей в молекуле токсина. N-концевая последовательность ТхР-I опубликована и имеет следующий вид: N-asp-asn-gly-asn-val-glu-ser-val-arg-ala-val-val-ile-asp-tyr-[X] -asp-ile-arg-his-pro-. Обнаружено, что N-концевая аминокислотная последовательность является гомологичной любой белковой последовательности (Ресурсы идентификации белков, выпуск Национального биомедицинского фонда, N 13 от 30 июня 1987 года).

Пептизированы два других компонента, которые проявляют молекулярную массу, равную 28000 и 29000; эти два компонента включают ТхР-II. На основе пептидного картирования и иммуноблоттинга постулировано, что белковые компоненты ТхР-I и ТхР-II являются изопротеинами (Tomalski et al. (1989) supra). Смесь ТхР-I и ТхР-II содержит TxP-III.

Препараты токсинов P. tritici фактически не являются токсичными для млекопитающих, что подтверждается в результате проверки на мышах с использованием и внутрибрюшинного, и интрацеребрального введения. Дозы, которые вызывают паралич у 50% испытуемых насекомых (ПД₅₀), для ТхР-I, ТхР-II и Тхр-III составляют 330, 550 и 500 мкг/кг соответственно при проверке на личинках моли большой восковой (Galleria mellonella). ТхР-I и ТхР-II вызывают быстрый мышцесокращательный паралич.

Получено поликлональное антитело с использованием очищенного ТхР-I в качестве антигена. Это антитело является реакционноспособным против и ТхР-I, и ТхР-II, и антитело нейтрализует паралитическую активность частично очищенных препаратов TxP-III (Tomalski et al. (1989) supra).

Специфические к насекомым белковые нейротоксины обнаружены в яде других членистоногих, включая скорпионов, ос и пауков (Zlotkin (1985) в работе Comprehensive Insect Prosiology, Biochemistry and Pharmacology. I. Insects, I. Kervut and L.I. Gilbert (eds.) Pergamon Press, Oxford, U.R., p. 499-546). Несколько пептидных токсинов от скорпионов оказывают специфические к насекомым нейротоксические эффекты, и они секвенированы. Эти токсины скорпионов имеют относительно низкую молекулярную массу, то есть от примерно 3000 до примерно 8000 дальтон, что существенно отличается от показателей токсинов клещей. Между токсинами клещей и скорпионов нет никакого видимого взаимоотношения в последовательности, однако и токсины клещей, и токсины скорпионов имеют высокое содержание цистеина. Компактные структуры белков токсинов стабилизированы дисульфидными связями.

Интерес к биологической борьбе с насекомыми-вредителями возник в результате неэффективности традиционных химических пестицидов. Химические пестициды, как правило, поражают и полезные, и вредные виды. Насекомые-вредители приобретают резистентность к таким химическим препаратам, так что новые популяции насекомых-вредителей могут получить быстрое развитие с приобретенной резистентностью к этим пестицидам. Кроме того, химические остатки представляют угрозу окружающей среде и возможную опасность для здоровья людей. Биологическая борьба представляет собой альтернативное средство уничтожения вредителей, которое может уменьшить зависимость от химических пестицидов.

Стратегии биологической борьбы включают вовлечение встречающихся в природе микроорганизмов, которые патогенны к насекомым (энтомопатогены), а также разработку сельскохозяйственных культур, которые более резистентны к насекомым- вредителям. Подходы включают идентификацию и определение характеристик генов или генных продуктов насекомых, которые могут служить в качестве пригодных мишеней для агентов по борьбе с насекомыми, идентификацию и использование ранее не нашедших применение микроорганизмов (включая модификацию встречающихся в природе непатогенных микроорганизмов с целью придания им патогенного характера в отношении насекомых), модификацию и переработку используемых в настоящее время энтомопатогенов, а также разработку на генетическом уровне сельскохозяйственных культур, которые проявляют бoлее высокую резистентность к насекомым-вредителям.

Среди энтомопатогенов, разработанных в качестве биологических пестицидов, находятся вирусы, вызывающие естественные эпизоотические заболевания. Энтомопатогенные вирусы включают бакуловирусы, энтомопоксивирусы, реовирусы (вирусы цитоплазматического полиэдроза), иридовирусы, парвовирусы, вирусы бешенства, пикорнавирусы, нодавирусы, асковирусы (все еще не классифицированные) и, вероятно, некоторые ретровирусы.

Бакуловирусы представляют собой большую группу эволюционно родственных вирусов, которые заражают только членистоногих (Miller, L.K. (1981) в работе Genetic Engineering in the Plant Sciences N. Panopoulous (ed.), Praeger Publ. , New York, p. 203-224; Carstens (1980) Trends in Biochemical Science 52: 107-110; Harrap и Payne (1979) в Advances in Virus Research, vol. 25, Lawfer et al. (eds.), Academic Press, New York, p. 273-355, Granados, R.R. and Federici, B. A. eds. (1986) The Biology of Baciloviruses, vol. 1, Biological Properties and Molecular Biology, CRC Press Inc., Boca Raton, Florida). Некоторые бакуловирусы поражают только насекомых, которые являются вредителями коммерчески важных сельскохозяйственных и лесных культур. Известны другие бакуловирусы, которые заражают других насекомых-вредителей, например комаров и блох. Такие бакуловирусы потенциально ценны в качестве агентов по биологической борьбе. Потенциальным преимуществом бакуловирусов в качестве биологическиx пестицидов является их специфичность к хозяевам. Бакуловирусы как группа заражают только членистоногих, а отдельные штаммы бакуловирусов обычно заражают только один или несколько видов насекомых. Поэтому они оказывают незначительное или вовсе не оказывают отрицательное воздействие на человека или окружающую среду и могут быть использованы без какого бы то ни было риска поразить полезные виды насекомых.

Подгруппы бакуловирусов включают вирусы ядерного полиэдроза (NPV), вирусы гранулеза (GV) и "невкрапленные" бакуловирусы. Вo "вкрапленных" формах бакуловирусов вирионы (нуклеокапсиды в оболочке) погружены в кристаллическую белковую матрицу. Эта структура, упоминаемая как тело включения или выключения, представляет собой форму, обнаруживаемую вне организма в природе и отвечающую за распространение инфекции среди организмов. Отличительным признаком группы NPV является то, что многие вирионы погружены в каждое тело выключения, которое относительно крупное (до 5 мкм). Тела выключения группы GV меньше и содержат каждое единственный вирион. Кристаллическая белковая матрица тел выключения обеих форм состоит главным образом из одного полипептида c молекулярной массой 25000-38000 дальтон, который известен как полиэдрин или гранулин. Невкрапленные бакуловирусы не продуцируют белок полиэдрина и не образуют тела выключения (Groner et al. in The Biology of Baculoviruses, vol. 1, supra, и данная работа приведена в качестве отсылки, в главе 9, табл. 2 и 7 приводят обширный перечень хозяев NPV и хозяев GV в качестве примера).

В природе заражение начинается тогда, когда насекомое проглатывает пищу, зараженную бакуловирусными частицами, обычно в форме тел выключения. Тела выключения диссоциируются в щелочных условиях средней кишки насекомого, высвобождая виpионы, которые затем вторгаются в эпителиальные клетки, обкладывая кишку. В пределах клетки-хозяина бакуловирус мигрирует к ядру, где происходит репликация. Первоначально специфические вирусные белки продуцируются в пределах зараженной клетки посредством транскрипции и трансляции так называемых "ранних генов". Среди других функций эти белки требуются для репликации вирусной ДНК, которая начинается через 4-6 ч, после того как вирус вошел в клетку. Репликация вирусной ДНК продолжается приблизительно в течение 24 ч после заражения (пз). Примерно через 8-24 ч пз инфецированные клетки экспрессируют "поздние гены" на высоких уровнях. Они включают компоненты нуклеокапсида, который окружает вирусную ДНК во время образования потомства вирусных частиц. Производство потомства вирусных частиц начинается примерно через 12 ч пз. Вначале потомок вируса мигрирует к клеточной мембране, где он приобретает оболочку, как только он отпочковывается от поверхности клетки. Невкрапленные вирусные частицы могут затем заразить другие клетки внутри насекомого. Синтез полиэдрина начинается приблизительно через 18 ч после заражения и достигает очень высоких уровней за 24-48 ч пз. Примерно за 24 ч пз наблюдается снижение в скорости производства невкрапленного вируса, и большинство потомков вирусных частиц затем погружается в тела выключения. Образование тел выключения продолжается вплоть до смерти или лизиса клеток. Некоторые бакуловирусы заражают фактически каждую ткань в насекомом-хозяине так, что к концу процесса заражения насекомое полностью разжижается, высвобождая чрезвычайно большие количества тел выключения, которые затем могут распространить заражение на другие насекомые (The Biology of Baculoviruses, vol. I and II, Granados and Federici (eds.), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1986).

Бакуловирусы, являющиеся производными AcMNPV, которые пригодны в качестве экспрессирующих векторов, описаны в заявке на патент США N 07/353847, зарегистрированной 17 мая 1989 года; международной патентной заявке PCT/US 90/02814, зарегистрированной 17 мая 1990 года; в работе Rankin et al. (1988) Gene 70: 39-49; в работе Ooi et al. (1989), J.Mol. Biol. 210:221-736, в работе Thiem and Miller (1990), Gene 91:87-95, причем все эти работы приведены в качестве отсылок. Чрезвычайно сильные поздние и очень поздние промоторы описаны в литературе, и они включают модифицированный промотор полиэдрина LSXIV, гибридный Cap/Polh промотор и синтетический промотор Syn.

Описаны бакуловирусы, которые проявляют улучшенные инсектицидные свойства. Например, AcMNPV, в котором ген egt (экдизон-глюкозилтрансферазы) инактивирован, вызывает раннее прекращение питания и более раннюю смерть личинок по сравнению с личинками, зараженными AcMNPV дикого типа (O'Reilly and Miller (1989) Science 245:1110-1112; O'Reilly and Miller (1990) J. Virol. 64: 1321- 1328; заявка на патент США N 07/373952, зарегистрированная 29 июня 1989 года).

Egt AcMBPV, который вдобавок изменен генетически с целью экспрессии белка, поражающего линьку, может привести к получению дополнительных улучшений инсектицидных свойств (международная заявка на патент PCT/US 90/03758, зарегистрированная 29 июня 1990 года, введена в данное описание в качестве отсылки). Производные Egt AcMNPV, которые экспрессируют эстеразу ювенильного гормона, гормон вылупления или проторацикотропный гормон, также сконструированы в данной области знания. Время кормления зараженных личинок уменьшено, и смерть происходит раньше, чем у личинок, зараженных AcMNPV дикого типа или egt AcMNPV.

Maeda (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 165:1177-1183 также описал полученный методами рекомбинантных ДНК бакуловирус с улучшенными пестицидными свойствами. BmNPV, который заражает тутовый шелкопряд Bombyx mori, модифицирован с целью экспрессии синтетического гена, кодирующего диуретический гормон бражника Manduca sexta. Жидкостный баланс зараженных насекомых был нарушен, и умерщвление происходило приблизительно на 20% быстрее, нежели при использовании вируса дикого типа.

Dee и соавторы (1990), Bio/Technology 8:339-342 клонировали и экспрессировали инсектицидный токсин от скорпиона Androctonus australis в фибробластные клетки мыши. Кодирующую последовательность сплавляли с сигнальной пептидной последовательностью человеческого интерлейкина-2, и синтез управлялся промоторными последовательностями в длинном концевом повторе вируса мышиной саркомы Молони. Рекомбинантный белок, который был секрецирован в экстрацеллюлярную среду, как отмечается, токсичен для личинок комара, но не для мышиных клеток в культуре или для мышей.

Ген, кодирующий токсин насекомых от Buthus eupeus (среднеазиатских подвидов скорпионов), синтезирован, клонирован в геном AcMNPV (вирус ядерного полиэдроза от Autographa californica) и экспрессирован под управлением промотора полиэдрина. Также осуществлены конструкции, в которых токсин скорпиона экспрессирован из синтетического гена, включающего токсин-кодирующую последовательность, сплавленную с последовательностью, кодирующей сигнальный пептид, или в виде пептидилированного белка с 58 аминокислотами полиэдрина у N-конца. Во всех случаях отмечается определенная экспрессия, на что указывают [³⁵S] -метионин-радиоактивное мучение, гель-электрофорез в полиакриламиде с использованием додецилсульфата натрия и авторадиография, однако не отмечается никакой паралитической активности в отношении насекомых в результате наблюдения за продуктами экспрессии. Полагают, что это частично обусловлено нестабильностью белка, однако невозможность обнаружить биологическую активность может быть результатом недостаточной чувствительности в системе анализов или вследствие неспособности рекомбинантного белка образовывать функциональную трехмерную структуру (Carbonell et al. (1988), Gene 73:409-418).

Hammock et al. (1990), Nature 344:458-461 описывают бакуловирус-опосредованную экспрессию насекомого гена, кодирующего эстеразу ювенильного гормона (JHE), фермент, который инактивирует эволюционный гормон.

Merryweather et al. (1990), J. Gen. Virology 71:1535-1544 приводят построение бакуловируса, содержащего дельта-эндотоксин HD-73 подвида kurstaki вида Bacillus thuringiensis. Ген эндотоксина HD-73 BTk помещали под управление полиэдрин-промотора.

Целью настоящего изобретения является получение генов, кодирующих нейротоксины, вызывающие паралич у насекомых, например, от клещей, паразитических для насекомых, таких, которые относятся к роду Pyemotes, в частности тех, которые принадлежат к группе ventricoccus рода Pyemotes. В специфическом варианте ген нейротоксина, паралитического в отношении насекомых, представляет собой ген Тох34 Pyemotes tritici, который идентифицирован по нуклеотидной последовательности, приведенной в табл. 2; второй специфический вариант паралитического для насекомых нейротоксина и гена, кодирующего его, показан в нуклеотидной и аминокислотной последовательностях Тох21а также вида Pyemotes tritici, которые приведены в табл. 4. Следует понять, что можно выделить и идентифицировать по гомологии нуклеотидных последовательностей и другие гены специфических к насекомым паралитических нейротокоинов, как обнаружено в экспериментах по гибридизации (см., например, Hanes и Higgins (1985), Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Washington, D.C.), используя для этой цели приведенную здесь информацию о последовательностях.

Гены специфических к насекомым паралитических нейротоксинов, имеющие по крайней мере около 70 нуклеиновокислотной гомологии относительно кодирующих Тох34 или Тох21а последовательностей, можно легко выделить с использованием хорошо известных гибридизационных анализов или скрининга. Такие методики особенно пригодны для выделения таких генов нейротоксинов из клещей, паразитических для насекомых, и наиболее пригодны для выделения из клещей рода Pyemotes. Функциональные эквиваленты специфических для насекомых паралитических нейротоксинов в соответствии с настоящим изобретением, например Тох34 и Тох21а, составляют белки, имеющие биологическую активность Тох34 и/или Тох21а, и которые в основном сходны по структуре, то есть аминокислотной последовательности, с Тох34 и/или Тох21а, как указано в табл. 2 и 4 соответственно.

В соответствии с этим настоящее изобретение включает специфический к насекомым паралитический нейротоксин, имеющий по крайней мере 70% последовательности, идентичной аминокислотной последовательности в табл. 4.

Настоящее изобретение также предлагает специфический к насекомым паралитический нейротоксин, имеющий по крайней мере 70% последовательности, идентичной аминокислотной последовательности в табл. 4, причем указанный нейротоксин имеет в основном такую же аминокислотную последовательность, которая приведена в табл. 4.

Нейротоксины, в основном аналогичные Тох34 и Тох21а, включают те, которые по крайней мере примерно на 70% идентичны по аминокислотной последовательности Тох34 и/или Тох21а. В основном аналогичные нейротоксины также включают те, которые имеют по крайней мере окoло 70% аминокислотной последовательности, аналогичной последовательности Тох34 или Тох21а, что позволяет осуществлять замещения консервативными аминокислотами аминокислоты Тох34 и Тох21а. Специалист в данной области поймет, что функция белка может быть не задета в результате незначительных структурных модификаций, особенно если эти структурные модификации представляют собой замещения аминокислот, являющихся сходными по химическим и физическим свойствам. Структурные модификации, включая аминокислотные делеции и инсерции, могут быть дозволены, если они не оказывают влияния на функциональность.

Гены, кодирующие нейротоксины, являющиеся функционально эквивалентными Тох34 и/или Тох21а, могут быть выделены и идентифицированы либо иным образом получены с использованием любых способов, известных специалистам в данной области, особенно опираясь на представленную здесь информацию о последовательностях. Например, аминокислотную гомологию и/или нуклеотиднокислотную гомологию, измеренную методами гибридизации, можно соединить с методиками, описываемыми в данной работе в отношении оценки нейротоксичности для насекомых, с целью выделения функциональных нейротоксинов для насекомых. Методы PCR (полимеразно-цепьевой реакции), например, в сочетании с другими хорошо известными методиками, приведенными в данной работе, можно использовать для выделения генов, кодирующих нейротоксины, которые функционально эквивалентны тем, которые приводятся в настоящем изобретении. Информация, представленная в данном описании, в сочетании с известной методологией, касающейся синтеза белков и ДНК, консервации свойств между аминокислотами и использования кодонов, позволяет специалисту в данной области техники без труда сконструировать и синтезировать нейротоксины насекомых и гены нейротоксинов насекомых, которые функционально эквивалентны Тох34 и Тох21а.

Соответственно изобретение включает молекулу рекомбинантной ДНК, включающую ген, кодирующий специфический для насекомых паралитический нейротоксин.

Настоящее изобретение также включает молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, причем указанный кодируемый специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 70% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенной в табл. 2.

Настоящее изобретение также включает молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, причем указанный кодируемый специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 83% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенной в табл. 2.

Настоящее изобретение также включает молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, причем указанный кодируемый специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 88% сходства аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенной в табл. 2.

Настоящее изобретение также включает молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, причем указанный ген включает нуклеотидную последовательность, кодирующую специфический к насекомым паралитический нейротоксин, как показано в табл. 2, примерно от 118 нуклеотида до 873 нуклеотида.

Настоящее изобретение также включает молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, причем указанный ген имеет по крайней мере около 70% гомологии нуклеотидной последовательности с нуклеотидной последовательностью, кодирующей специфический к насекомым паралитический нейротоксин, как показано в табл. 2.

Настоящее изобретение также включает молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, причем указанный кодируемый специфический к насекомым паралитический нейротоксин содержит аминокислотную последовательность, приведенную в табл. 2, от аспартата, кодируемого приблизительно у 120 нуклеотида до цистеина, кодируемого приблизительно у 873 нуклеотида.

Настоящее изобретение также включает молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, причем указанный специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 70% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенной в табл. 4.

Настоящее изобретение также включает молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, причем указанный специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 83% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенной в табл. 4.

Настоящее изобретение также включает молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, причем указанный специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 88% сходства аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенной в табл. 4.

Настоящее изобретение также включает молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, причем указанный ген имеет по крайней мере около 70% гомологии нуклеотидной последовательности с нуклеотидной последовательностью, кодирующей специфический к насекомым паралитический нейротоксин, как показано в табл. 4.

Настоящее изобретение также включает молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, причем указанный ген кодирует специфический к насекомым паралитический нейротоксин клеща рода Pyemotes, при этом данный клещ принадлежит к виду Pyemotes tritici.

Настоящее изобретение также включает молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, причем указанный ген имеет нуклеотидную последовательность, кодирующую специфический к насекомым паралитический нейротоксин, как показано в табл. 4.

Настоящее изобретение также включает молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, причем указанный ген кодирует специфический к насекомым паралитический нейротоксин, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в табл. 4.

Другой целью настоящего изобретения является получение агента по борьбе с насекомыми, экспрессирующего ген специфического к насекомым паралитического нейротоксина такого, как бакуловирус, например AcMNPV, построенного методами рекомбинантных ДНК с целью экспрессии гена нейротоксина, например ген нейротоксина от клеща, паразитического для насекомых. В таких агентах специфический к насекомым ген нейротоксина помещают под регуляторный контроль соответствующих регуляторных последовательностей гена, таких как промотор, с тем чтобы получить количество нейротоксина, эффективное для создания токсического эффекта такого, как паралич, в искомом насекомом. Специфические варианты генетически модифицированного AcMNPV включают VETL-Тох34, vCap/Polh-Tox34, vEV-Тох34 и vSp-Тох34, где ген Тох34 экспрессируют под управлением раннего промотора, сильного позднего и/или очень позднего промотора; причем особенно предпочтительные варианты генетически модифицированного вкрапленного AcMNPV включают vSp-Tox34, представляющего собой вкрапленный вирус, и vCap/Polh-Tox34, который является невкрапленным, но обеспечивает улучшенную борьбу с насекомыми раньше, чем другие примеры. Специалист поймет, как следует конструировать аналогичные вкрапленные формы вируса. Специалист также поймет, что вирус может быть вкраплен путем совместного заражения клеток вирусным хелпером, который несет в себе функцию гена полиэдрина.

Специалист в данной области также поймет, как следует конструировать рекомбинантные вирусы, в которых токсин-ген инсерцирован в другие положения генома AcMNPV. Такие вирусы имели бы токсин-ген, синтезированный с соответствующим промотором, инсерцированным в несущественную область генома AcMNPV. Несущественные области включают область гена р10 (Adang and Miller (1982), J. Virology 44: 782-793; Kuzio et al. (1984), Virology 139: 414-418), область гена DA26 (O'Reilly et al. (1990), J. Gen. Virology, 71:1029-1037), область ETL (Grawford and Miller (1988) J. Virology, 62:2773-2781), область egt (O'Reilly and Miller (1990), J. Virology 64:1321-1328), область открытой рамки считывания (orf) (Gearing and Possee (1990) J. Gen. Virology 71:251-262), область orf p94 (Friesen and Miller (1987), J. Virology 61:2264-2272) или другие области, которые специалист может легко определить. Поскольку существует значительная гомология среди этих генов различных бакуловирусов, специалист также поймет, как следует инсерцировать тонксин-ген, синтезированный с соответствующим промотором, в геномы других бакуловирусов в аналогичных несущественных местах.

Поэтому настоящее изобретение включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин.

Настоящее изобретение также включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 70% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенной в табл. 2, от аспартата, кодируемого приблизительно у 120 нуклеотида до цистеина, кодируемого приблизительно у 873 нуклеотида.

Настоящее изобретение также включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 83% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенной в табл. 2, от аспартата, кодируемого приблизительно у 120 нуклеотида до цистеина, кодируемого приблизительно у 873 нуклеотида.

Настоящее изобретение также включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 88% сходства аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенной в табл. 2, от аспартата, кодируемого приблизительно у 120 нуклеотида до цистеина, кодируемого приблизительно у 873 нуклеотида.

Настоящее изобретение также включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный ген имеет по крайней мере около 70% гомологии нуклеотидной последовательности с нуклеотидной последовательностью, кодирующей специфический к насекомым паралитический нейротоксин, как показано в табл. 2, приблизительно от 118 нуклеотида до 873 нуклеотида.

Настоящее изобретение также включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован о тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный кодируемый специфический к насекомым паралитический нейротоксин содержит аминокислотную последовательность, приведенную в табл. 2, от аспартата, кодируемого приблизительно у 120 нуклеотида до цистеина, кодируемого приблизительно у 873 нуклеотида.

Настоящее изобретение также включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный агент по борьбе с насекомыми представляет собой вирус насекомых, являющийся производным бакуловируса, причем это производное бакуловируса является бакуловирусом NPV, который в свою очередь является производным AcMNPV.

Настоящее изобретение также включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный агент по борьбе с насекомыми представляет собой вирус насекомых, являющийся производным бакуловируса, причем это производное бакуловируса является бакуловирусом NPV, который в свою очередь является производным AcMNPV, при этом последний экспрессирует ген специфического к насекомым паралитического нейротоксина под регуляторным контролем промотора, действующего очень поздно во время заражения.

Настоящее изобретение также включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный агент по борьбе с насекомыми представляет собой вирус насекомых, являющийся производным бакуловируса, причем это производное бакуловируса является бакуловирусом NPV, который в свою очередь является производным AcMNPV, при этом последний экспрессирует ген специфического к насекомым п

Фрагмент рекомбинантной днк (варианты) и рекомбинантный бакуловирусный вектор для экспрессии нейропаралитического токсина (варианты)

Патент 2130968