Культура v.cholerae, способ получения делеционных мутантов

Культура v.cholerae, способ получения делеционных мутантов

Реферат

 

Принцип изобретения состоит в изоляции штамма вакцины Vibrio cholerae, специфическим образом измененного при помощи техники рекомбинатной ДНК, чтобы лишить его вирулентности без нарушения других компонент, необходимых для иммунитета. Такое ослабление осуществляют при помощи переваривания эндонуклеазами рестрикции плазмид, несущих соответствующие последовательности V. cholerae. В результате переноса соединенного гена таких переваренных плазмид и последующих процедур селекции in vivo рекомбинантов с вирулентными хозяевами V. cholerae получали штаммы без генов токсина и его частей. Вакцина, полученная из этого штамма, вызывает стойкий иммунитет против холеры. 2 с. и 5 з.п.ф-лы, 1 табл., 21 ил.

Настоящая патентная заявка является частичным продолжением патентной заявки Заявителя в США N 06/581406, поданной 17 февраля 1984 г., которая является частичным продолжением патентной заявки США N 06/472276, поданной 4 марта 1983 г., которые включены здесь в качестве ссылки. Настоящая патентная заявка является также частичным продолжением патентной заявки Заявителя в США N 07/363383, поданной 5 июня 1989 г., по которой выдан патент 12 декабря 1989 г. , которая является продолжением патентной заявки США N 06/867633, поданной 27 мая 1986 г., которая является продолжением патентной заявки США N 06/472276, поданной 4 марта 1983 г., которые включены здесь в качестве ссылки. Исследование, проведенное в соответствии с настоящей заявкой, было поддержано национальным институтом здоровья и, частично, Медицинским Центром Биотехнологии Института Биотехнологии штата Мэрилэнд.

Предпосылки настоящего изобретения Vibrio cholerae (V. cholerae) является нонинвазивным энтеропатогеном тонкой кишки, который не проникает через поверхность слизистой оболочки. Локальный иммунитет с участием SIgA на поверхности слизистой оболочки, таким образом, объясняется защитным механизмом. Патогенный V.cholerae 01 вырабатывает протеиновый энтеротоксин (известный также под названием энтеротоксин холеры или холераген или токсин холеры), который отвечает за индукцию обильного выделения, приводящего к водянистому поносу, клиническому следствию холерной инфекции. Генами, отвечающими за токсин холеры, являются гены ctx (известные также как tox-гены). Холерный понос может быть в высшей степени болезненным и может приводить к потере столь значительного количества воды и солей, что это приводит к обезвоживанию, ацидозису, шоку и гибели в конечном итоге, если не применять экстренной терапии. Заявитель установил, что V. cholerae продуцирует второй токсин, называемый токсином "zonula occludens" (блокировки малой зоны), описанный Fasano и др., Vibrio cholerae Produces a Second enterotoxin Which Affects Intestinal Tight Junctions, Nature (в печати, 1990 г. ). Кроме того, имеется область хромосомы, содержащая гены ctx, которая содержит несколько копий последовательности в 2700 пар оснований, называемой RSI (для повторяющейся последовательности), Mekalanos, Cell, т. 35, стр. 253-263 (1983).

Вакцины холеры, которые были разработаны, могут быть грубо разделены на две категории: вакцины, помогающие выработке антитоксичного иммунитета, и вакцины, предназначенные для того, чтобы индуцировать антибактериальный иммунитет. Эксперименты с животными моделями подтверждают защитную роль как антитоксичного, так и антибактериального иммунитета. Было предложено, что когда оба типа иммунитета работают одновременно, то можно добиться синергического эффекта [Holmgren, J. и др., J. Infect. Dis, Suppl, 136, стр. 105 - 1122 (1977); Peterson, J.W.Infect. Immun. т. 26, стр. 594 (1979); Resnick, I. G. и др., Infect. Immun. т. 13, стр. 375 (1980); Svennerholm A.-M. и др., Infect. Immun. т. 13, стр. 735 (1976)]. Однако оказалось, что защитный иммунитет у человека можно индуцировать без такого синергического эффекта, то есть при помощи либо антитоксического иммунитета, либо антибактериального иммунитета [Eubanks, E.R., и др., Infect. Immun, т. 15, стр. 533 (1977); Fujita, K. и др. Infect. Dis., т. 125, стр. 647 (1972); Holmgren, J. J.Infect. Dis., см. выше; Lange, S. и др., Acta Path. Microbiol. Scand Sect. C, т. 86, стр. 145 (1978); Peterson, J.W., см. выше (1979); Pierce, N.F. и др., Infect. Immun. т. 37, стр. 687 (1982); Pierce, N.F. и др., J. Infect. Immun., т. 21, стр. 185 (1978); Pierce. N.F. и др. J. Infect. Dis, т. 135, стр. 888 (1977); Resnick I.G. и др., см. выше; Svennerholm, A.-M. и др., см. выше].

Вакцины из убитых целых клеток 1. Парантеральные вакцины, содержащие целые клетки Вот уже в течение почти века убитые целые клетки V.choleral использовались в качестве парентеральных вакцин; эти вакцины до сих пор производятся промышленностью. Опыт работы с парентеральными вакцинами с целыми клетками обобщен в обзоре Joo, I "Cholera vaccines" в книге "Cholera". (Barua D. и Burrows W. , ред.), изд. Saunders, Philadelphia, стр. 333-355 (1974), и Feeley, J.D. и др. в книге "Cholera and Related Diarrheas", 43rd Nobel Symp., Stokholm 1978 г. (O.Oucherlong. J. Holmgren ред.), изд. Karger, Basel, стр. 204-210 (1980). Такие вакцины стимулируют высокие титры вибриоцидальных антител сыворотки. Они также стимулируют увеличение антител SIgA кишечника к соматическому антигену O V.cholerae, когда их вводят пакистанцу, но не шведу [Svennerholm, A. -M. и др. Infect. Immun. т. 30, стр. 427) (1980); Svennerholm A. -M. и др. Scan. J. Immun. т. 6, стр. 1345- (1977)]. Было предположено, что реципиенты вакцины из Пакистана реагируют таким образом из-за того, что они уже иммунологически подготовлены благодаря предварительному антигенному контакту, в то время как люди, живущие в неэндемических областях (например, в Швеции), к этому не подготовлены. Было установлено во время полевых испытаний, что парентеральные вакцины убитых целых клеток обеспечивают существенную защиту против гомологического серотипа V.cholerae, но в общем случае в течение периода меньше года (Joo, I, см. выше; Feeley, J.C., см. выше; Svennerholm A.-M. и др., см. выше (1980); Svennerholm A.-M. и др., см выше, (1977); Mosley, W.H. и др., Bull. Wld, Hlth. Org., т. 49, стр. 13 (1973); Phillipines Clolera Committee, Bull. Wld, Hlth, Org., т. 49, стр. 381 (1973)/. Имеются некоторые причины, чтобы предположить, что парентеральная вакцина целых клеток Инаба обеспечивает хорошую кратковременную защиту против Огава, а также против холеры Инаба, в то время как вакцина Огава только против Огава.

Если использовать добавки, то имеется возможность поддерживать эффективность вакцины приблизительно на уровне 70% в течение полутора лет, используя парентеральную вакцину (см., например, Saroso, J.S. и др., Bull. Wld. Helt. Org. , т. 56, стр. 619 (1978). Однако побочные реакции, имеющие место в месте прививки вакцин с добавками (которые включают стерильные абсцессы), происходят достаточно часто и болезненно, что препятствует стандартному использованию таких вакцин с добавками.

2. Стоматические вакцины целых клеток Убитые полные вибрины, применяемые стоматически, стимулируют появление локальных антител кишечного антивибриона [Freter, R.J.Infect. Dis., т. 111, стр. 37 (1972); Freter, R. и др., J. Immunol., т. 91, стр. 724 (1963); Ganguly, R и др. , Bull. Wld. Heth. Org. т. 52, стр. 323 (1975)]. Другие исследователи показали существенную эффективность вакцины, но большая доля вакцин приводила к поносу после последующего введения патогенных вибрионов [Cash, R.A. и др., J. Imfect. Dis., т. 130, стр. 325 (1974)].

Токсоиды Иммунизирующие агенты, предназначенные для предотвращения холеры при помощи стимуляции антитоксичного иммунитета, включают: 1) Токсоид холеры, обработанный формальдегидом; 2) Токсоид холеры, обработанный глютаральдегидом; 3) Очищенный субблок B; 4) Прохолерагеноид (обротанный формальдегидом или без такой обработки).

1. Токсоид холеры, обработанный формальдегидом Обработка очищенного токсина холеры ин витро формальдегидом уничтожает его токсичность, что приводит к образованию токсина, которая проявляет слабую токсичную биологическую активность, но стимулирует антитоксичные антитела после парентеральной иммунизации животных. Однако, когда первый токсоид такого типа применяли к обезьянам и человеку в форме парентеральной вакцины, то токсоид частично восстанавливал токсичность, что приводило к нежелательным локальным неблагоприятным реакциям в месте прививки [Northrup, R. S и др., J. Infect. Dis., т. 125, стр. 471 (1972)]. Токсоид холеры после обработки формалином с добавкой альбумина применяли парентерально добровольцам из Бангладеш, включая кормящих матерей, но полевых испытаний с этой вакциной не проводили [Merson, M. H. и др., Lancet, 1, стр. 931 (1980)]. Токсоид холеры, обработанный формалином, полученный в присутствии гликокола, также испытывали парентеральным способом, но такая вакцина не была эффективной [Ohtomo, N. In Proceedings of the 12th Joint Conference on Cholera, U.S. - Japan Cooperative Medical Science Program, Sapporo (Fukumi H., Zinnaka Y., ред. стр. 286-296 (1976); Noriki, H. In Proceedings of the 12th Joint Conference on Cholera, U. S. - Japan Cooperative Medical Science Program, Sapporo (Fukumi H., Zinnaka Y., ред. стр. 302-310 (1976)].

2. Токсоид холеры, обработанный глютаральдегидом Были разработаны способы для широкомасштабного получения токсоида холеры, обработанного глютаральдегидом, который по существу свободен от загрязняющего соматического антигена [Rappaport, E.S. и др., Infect Immun., т. 14, стр. 687 (1976)] . Можно было надеяться, что этот антиген можно будет использовать для анализа "чистым" способом защитной роли отдельно антитоксичного иммунитета. Широкомасштабные полевые испытания этого токсоида, применяемого в форме парентеральной вакцины, осуществляли в Бангладеш в 1974 г. [Curlin, G. и др., в Proceeding of the 11th Joint Conference on Cholera, U. S. - Japan Cooperative Medical Science Program стр. 314-329, New Orleans (1975)] . Этот токсоид стимулировал высокие титры циркулирующих антитоксинов у реципиентов из Бангладеш. Две волны холеры, Эль Тор Инаба, затем Эль Тор Огава, расширили область испытаний, что давало возможность получить хорошую оценку эффективности вакцины. Защитный эффект оказалось возможным подтвердить только в одной возрастной группе и он был ограничен на период эпидемии Инаба так, что токсоид холеры, обработанный глютаральдегидом, применяемый отдельно в форме парентеральной вакцины, обеспечивал слабую защиту и она была существенно ниже по сравнению с аналогичными полевыми испытаниями в той же группе населения с парентеральными вакцинами убитых целых клеток.

Применение токсоида холеры, обработанного глютаральдегидом, в форме стоматической вакцины было исследовано в предположении, что токсоид, введенный таким путем, является более эффективным при стимуляции кишечного антитоксина [Le Vine M.M и др., Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. т. 73, стр. 3 (1979)] . Две группы добровольцев были иммунизированы тремя 2,0 мг или тремя 7,0 мг дозами токсоида, введенного непосредственно в малую полость кишечника (через трубку, вставленную в кишечнике) с месячным интервалом. Вакцины и иммунизированных контрольных животных затем использовали в экспериментальных исследованиях с холерой. Ни в одном из исследований с симптомами холеры не было отмечено какого-либо существенного снижения степени или болезненности поноса как у носителей вакцины, так и у контрольных организмов. Отсутствие эффективности стоматического токсоида холеры, обработанного глютаральдегидом, может быть объяснено тем фактом, что способность субблоков B связываться с ганглиозидом GMI значительно снижается, как следствие токсоидизации с глютаральдегидом.

3. Очищенный субблок B Энтеротоксин холеры состоит из двух субблоков, обозначаемых через A и B. Субблок A индуцирует ферментативные изменения, которые приводят к выделению жидкости, в то время как нетоксичный субблок B является иммуногенной составляющей, которая связывается с рецептором для токсина (ганглиозида GMI) на клетках эпителия кишечника [Holmgren, J. Nature, т. 292, стр. 413 (1981)]. Было показано, что очищенный субблок B, введенный стоматически или парентерально бангладешцам, стимулирует появление антитоксина SJgA в жидкости кишечника, что приписывают иммунологической "затравке" в районах эпидемии холеры [Svennerholm, A.-M. и др., Lancet 1, стр. 305 (1982)].

Основные преимущества стоматической вакцины субблока B с тем, чтобы стимулировать антитоксиновый иммунитет, включают ее полную безопасность (отсутствует потенциальная опасность превращения в токсин, которая имеется с токсоидами) и сохранение ее способности "прилипать" к рецепторам токсинов на энтероцитах. Исследования на животных наводят на мысль, что она менее сильна, чем нативный голотоксин при стимуляции антитоксина [Pierce, N.F. см. выше, (1982)].

Должно быть ясно, что очищенный субблок B можно использовать, если он используется вместе, например, со стоматическими убитыми вибрионами в форме комбинации стоматической вакцины, предназначенной для стимулирования как антибактериальных, так и антитоксичных антител.

4. Прохолерагеноид Прохолерагеноид является токсоидом с большим молекулярным весом (приблизительно 1 000 000), который получают, когда энтеротоксин нагревают до 65^oC в течение по крайней мере пяти минут [Finkelstein, R.A. и др., J. Immunol. т. 107, стр. 1043 (1971)]. Он имммуногенен, при этом сохраняет менее 5% биологической токсичной активности "родительского" токсина. Нагревание на более продолжительное время (например, на 25 минут) дает меньшую биологическую токсичность Z [Germanier, R. и др., J. Infect. Dis., т. 13, стр. 1692 (1976)] , а последующая обработка формальдегидом полностью уничтожает остаточную биологическую токсичность. Полученный в результате обработанный формальдегидом прохолерагеноид является по крайней мере столь же эффективным, как и родительский токсин при стимулировании антитоксина сыворотки после иммунизации кроликов. У швейцарских добровольцев развивались быстрые реакции антитоксина сыворотки после парентегральной иммунизации дозами в 10, 30 или 100 микрограмм обработанного формальдегидом прохолерагеноида [Germanier, R. и др., J. Infect. Dis., т. 135, стр. 512 (1977)]. Никаких заметных неблагоприятных реакций не было отмечено.

Таким образом, стоматический прохолерагеноид антигена является более иммуногенным, когда его применяют в форме без обработки формальдегидом. У собак необработанный прохолерагеноид переносился так же хорошо, как стоматическая вакцина; стоматические дозы (с NaHCO₃) до 500 микрограмм не вызывают понос. Пять доз в 500 микрограмм, распределенные на 42 дня, стимулируют существенную защиту у собак против соматического заражения патогенным V.cholerae. Дозы в 50 микрограмм и 200 микрограмм NaHCO₃ давали группам из шести и четырех взрослых добровольцев. Соответственно, без заметных неблагоприятных реакций.

Должно быть ясно, что прохолерагеноид может быть использован вместе с, например, убитыми вибрионами или другими близкими антигенами, чтобы стимулировать антибактериальный иммунитет так, что антитоксичный иммунитет, вызванный прохолерагеноидом, увеличивается.

Комбинированные вакцины Основная привлекательность неживой стоматической вакцины холеры заключается в ее безопасности. Стоматическая вакцина, состоящая из комбинации антигенов, предназначенная для стимулирования как антибактериального, так и антитоксичного иммунитета, была бы наиболее подходящей для достижения успеха по следующим причинам: токсоидные вакцины, которые стимулируют чисто антитоксичный иммунитет, не демонстрируют эффективность при защите человека от холеры, хотя они могут защищать животные модели. Кроме того, стоматические или парентеральные убитые целые клетки вакцины, которые не стимулируют антитоксичный иммунитет, обеспечивают существенную защиту против холеры у человека, хотя на короткий период времени. Кроме того, комбинации антигенов (таких, как неочищенный токсин холеры или токсин плюс липополисахарид), которые стимулируют как антитоксичный, так и антибактериальный иммунитет, обеспечивают синергическую защиту.

Два исследования до сих пор были осуществлены в основном с комбинациями вакцин. Во-первых, девяти добровольцам давали стоматическим способом обработанный глютаральдегидом токсоид холеры (2 мг еженедельно в течение четырех недель) плюс убитые вибрионы Эль Тор Инаба (1010 вибрионов дважды в неделю в течение четырех недель), а затем спустя один месяц заражали 106 патогенными вибрионами Эль Тор Инаба вместе с шестью иммунизированными контрольными организмами. Понос появлялся только у двух из девяти носителей вакцины против четырех из шести контрольных участников (эффективность вакцины 67%) и заболевание было очевидно более легким у двух носителей вакцины. Более уместным, видимо, является наблюдение, состоящее в том, что V.cholerae можно непосредственно культивировать из стула только двух из девяти носителей вакцины против шести из шести контрольных участников. Это подтверждает, что иммунологические механизмы препятствуют пролиферации вибрионов.

Совсем недавно, три дозы вакцины субблок B/убитые целые клетки вводили взрослым добровольцам, которые участвовали в исследовании эффективности вакцины. Комбинированную вакцину давали на 0, 14 и 28 день. Каждая из трех доз вакцины содержала 0,5 мг очищенного субблока B и 2 10¹¹ убиты V.cholerae (5 10¹⁰ классических Инаба, 5 10¹⁰ классических Огава и 1 10¹¹ Эль Тор Инаба).

Группу из одиннадцати добровольцев, иммунизированных этой комбинированной вакциной, заражали спустя один месяц после введения последней дозы 10⁶ патогенными V.cholerae Эль Тор Инаба, вместе с семью контрольными добровольцами. Понос появлялся у семи из семи контрольных участников, но только у четырех из одиннадцати носителей вакцины (p = 0,01). Состояние у четырех носителей вакцины было определенно лучше.

Таким образом, результаты со стоматическими комбинированными вакцинами токсоид/убитые целые клетки подтверждают измеренную степень эффективности. Защитная эффективность вакцин, однако, только средняя (55-65%) и необходимо несколько доз, чтобы вызвать защиту.

Ослабленные вакцины V.cholerae Как классическая, так клиническая холера Эль Тор стимулируют высокую степень защитного иммунитета на по крайней мере три года у добровольцев из Северной Америки [Cash, R.A. и др., см. выше (1974); Levine, M.M. и др., см. выше (1979); Levine M.M. и др. "Volunteers studies in development of vaccines against cholera and enterotoxigenic Escherichia coli: обзор в книге "Acute Enteric Infections in Children: New Prospects for Treatment and Prevention (T. Holm, J. Holmgren, M.Merson and R. Mollby, ред.), изд. Elsevier, Amsterdam, стр. 443-459 (1981); и Levine, M.M. и др. J. Infect. Dis. т. 143, стр. 818 (1981)]. На основе этих наблюдений на добровольцах, видимо, самый многообещающий подход в направлении иммунологического контроля холеры заключается в использовании ослабленных нетоксигенных штаммов V.cholerae в качестве стоматических вакцин.

1. Естественно встречающиеся штаммы Нетоксигенные штаммы V.cholerae 01, изолированные из окружающих источников в Индии и Бразилии, исследовали на добровольцах в качестве потенциальных кандидатов на вакцину с неутешительными результатами. Они либо не образовывали колонии в кишечнике человека, либо делали это минимально; реакции вибриоцидальных антител были слабыми и они не обеспечивали защиту в экспериментальном исследовании с заражением [Cash, R.A и др., Infect. Immun., т. 10, стр. 762 (1974); Levine M. M. и др., J. Infect. Dis., т. 145, стр. 296 (1982)]. Многие из этих штаммов не имели гена токсина, что устанавливали при помощи гибридизации с радиоактивным ДНК-зондом [Kaper, J.B. и др., Infect. Immun. т. 32, стр. 661 (1981)].

2. Мутагенизированные ослабленные штаммы Классический штамм Инаба 569B мутагенизировали с нитрозогуанидом (НТГ) и гипотоксигенный мутант выделяли [Finlekstein, R.A и др., J. Infect. Dis., т. 129, стр. 177 (1974); Holmes, R.K. и др. J. Clin. Invect., т. 55, стр. 551 (1975)] . Этот мутантный штамм M13 вводили добровольцам. Понос не появлялся ни у одного из участников, но штамм слабо образовывал колонии. Исследование с заражением подтверждало, что некоторая защитная эффективность имела место в результате иммунизации кратными дозами [Woodward, E. и др., Develop. Biol. Stand., т. 33, стр. 108 (1976)].

Эль Тор Огава 3083 также подвергали мутагенезу [Honda, T. и др., Proc. Nat. Acad. Sci. , т. 76, стр. 2052 (1979)]. Грубые селекция и анализ тысяч колоний дали один изолят, который продолжал продуцировать иммуногенные B-субблоки, в то время как не давал обнаруживаемых A-субблоков или голотоксина. Один изолят, Техас Стар-CR, удовлетворял этим критериям. Техас Стар-CR продуцирует стандартное или увеличенное количество субблоков B, но давал отрицательный результат при анализе на активность голотоксина или активность A-субблоков.

Техас Стар-CR широко исследовали на добровольцах [см., например, Levine, M.M. и др., в "Acute Enteric", см. выше (1981)]. Группы из пяти добровольцев получали две дозы по 10⁹ организмов через неделю и восемнадцать добровольцев получали две дозы из 2 10¹⁰ организмов через неделю. Некоторая степень поноса была отмечена у шестнадцати из шестидесяти восьми носителей вакцины (24%). У только одного участника был отмечен объем стула, превышающий 1,0 литр (1464 мл). В общем случае вызванный вакциной понос состоял из двух или трех небольших стулов, составляющих по объему меньше 400 мл. Организмы вакцины извлекали из сопрокультур приблизительно половины реципиентов вакцины. Там, где тонкокишечную жидкость культивировали (реципиенты доз в 10⁸ и более организмов в вакцине), культуры были положительными у тридцати пяти из сорока шести носителей вакцины (76%). Сотни колоний Техас Стар извлекали из сопрокультур и культуры тонкокишечных жидкостей анализировали на голотоксин холеры при помощи чувствительного анализа клеток надпочечника Y-I; ни один из анализов не был положительным.

Существенный рост антитоксина сыворотки обнаруживали только у 29% носителей вакцины; однако, у 93% был отмечен существенный подъем вибриоцидальных антител сыворотки, а титры существенно близки к титрам, обнаруженным после инфекции патогенным V.cholerae. При экспериментальном изучении заражения добровольцев было установлено, что Техас Стар-CP наделяет существенной защитой против заражения как вибрионами Эль Тор Огава, так и Эль Тор Инаба. Одна или две дозы ослабленной стоматической вакцины Техас Стар-CP обеспечивают хорошую защиту против холеры Эль Тор.

Очевидно, что использование ослабленных штаммов обладает специфическими преимуществами, так как такие штаммы наделяют полученным от инфекции mimie имунитетом к холере. Однако, штаммы Техас Стар-CP имеют некоторые недостатки. Во-первых, мугагенез (например, нитрозогуанидином) индуцирует многократные мутации, не все из которых обязательно узнаваемы. Кроме того, точное генетическое повреждение, которое, как предполагается, отвечает за ослабление Техас Стар-CP, не известно. Кроме того, Техас Стар-CP может вернуться к вирулентности подобно любому патогену, мутируемому нитрозогуанидином.

Заявитель настоящей патентной заявки выделил новым способом мутанты удаления вирулентного штамма Vibrio cholerae, о котором известно, что он одновременно наделяет иммунитетом и вызывает заболевание у добровольцев. Удаления являются фрагментами эндонуклеаз растрикции. Штаммы вакцины, являющейся предметом настоящего изобретения, специфическим образом изменяли через использование техники рекомбинантной ДНК, чтобы получить лишенный вирулентности штамм, не нарушая другие компоненты, необходимые для иммунитета. Это ослабление осуществляют при помощи использования эндонуклеаз рестрикции, которые расщепляют ДНК бактерии в специфических сайтах с целью специфического удаления генов, ответственных за токсин холеры (например, гена ctx). Плазмиды, несущие ген ctx, переваривали эндонуклеазами рестрикции, чтобы удалить ген ctx, но конструкцию осуществляли так, чтобы сохранить реальные длины боковой ДНК хромосомы V.cholerae. Перенос слитого гена плазмид в V.cholerae дает лишенный вирулентности штамм V.cholerae, несущий внехромосомные копии плазмид. Последующая конъюгация с клетками, содержащими другие плазмиды, процуцировала после соответствующей селекции селектируемых маркеров плазмид штаммы V. cholerae, содержащие удаления в областях ctx. Такие нетоксигенные мутанты удаления затем могут оказаться способными образовывать колонии в тонкой кишке и стимулировать локальный защитный иммунитет, направленный против бактериальной клетки. После переходного периода колонизации вакцина должна защищать против последующей инфекции вирулентными токсигенными штаммами V.cholerae.

Гены токсина V.cholerae клонировали [Pearson, G.D.N. и др., Proc. Nat. Acad. Sci. , т. 79, стр. 2976 (1982); Kaper, J.B. и др., Amer. Soc. Microbiol. Abstr. Annu. Merting, Atlanta, Georgia, 36 (1982); Kaper, J.B. и др. Symposium on Enteric Infections in Man and in Animals: Standardization of Immunological Procedurs, Dublin, Ireland. Реферат N 2.5 (1982)]. Мутанты удаления структурного гена токсина V.cholerae выделяли, но только при помощи инфекции мутагенными вибриофагами, способными интегрироваться в случайные сайты вдоль хромосомы [Mekalanos, J.J. и др. Proc. Nat. Acad. Sci., т. 79, стр. 151 (1982)]. Рекомбинация в Vibrio cholerae описана, но ее не использовали, чтобы выделить удаления фрагментов рестрикции в генах ctx для целей вакцинации [Parker, C. и др., J. Bact., т. 112, стр. 707 (1972); Johnson, S. R и др., Molec. Gen. Genet, т. 170, стр. 93 (1979); Sublett, R.D. и др., Infect. Immun. , т. 32, стр. 1132 (1981) и Thomson, J.A. и др., J. Bact. т. 148, стр. 374 (1981)].

Краткое описание настоящего изобретения Описана культура Vibrio cholerae, содержащая штамм Vibrio cholerae, с удаленным фрагментом эндонуклеазы рестрикции ДНК, чтобы сообщить авирулентность и сохранить способность колонизировать кишечник животного-хозяина. Удаленный ДНК-фрагмент может кодировать токсин V.cholerae или его части, такие как субблок A₁. Один выделенный мутант удаления заключает удаление в гене ctx, которое определено сайтами эндонуклеазы рестрикции ACC 1.

Способ выделения таких мутантов удаления Vibrio cholerae также описан и он содержит стадии: (a) построения первой плазмиды, содержащей боковые последовательности Vibrio cholerae одного или нескольких удаленных фрагментов эндонуклеазы рестрикции, и ген для первого селектируемого маркера чужеродного происхождения, подвергнутый лигации с вышеупомянутыми боковыми последовательностями, чтобы заместить и занять место вышеупомянутого удаленного фрагмента, причем вышеупомянутые последовательности имеют достаточную длину, чтобы промотировать обнаруживаемую ин виво рекомбинацию; (b) скрещивания вирулентного штамма Vibrio cholerae с первым микроорганизмом, несущим первую плазмиду; (c) селекции Vibrio cholerae, экспрессирующего первый селектируемый маркер; d) скрещивания продукта, выбранного на стадии (c), со вторым микроорганизмом, несущим вторую плазмиду со вторым селектируемым маркером, причем вышеупомянутая вторая плазмида не совместима с первой плазмидой; (e) селекции Vibrio cholerae, экспрессирующего как первый селектируемый маркер, так и второй селектируемый маркер.

Описана вторая культура Vibrio cholerae, содержащая штамм Vibrio cholerae с удаленным первым фрагментом эндонуклеазы рестрикции ДНК, чтобы лишить вирулентности и сохранить способность колонизировать кишечник животного хозяина, и удаленным вторым фрагментом эндонуклеазы рестрикции, кодирующим токсин блокатора малой зоны (ZOT) с тем, чтобы уменьшить остаточный понос у животного-хозяина. Первый удаленный ДНК-фрагмент может кодировать токсин V. cholerae или его части такие, как субблок A₁. Один выделенный мутант удаления содержит удаление в гене ctx, которое определено сайтами эндонуклеазы рестрикции Acc 1, и удаление в гене zot. Другой выделенный мутант удаления содержит удаление в гене ctx, которое определено сайтами эндонуклеаз рестрикции Xba и Cla 1, и удаление в гене zot, которое определено сайтами эндонуклеаз рестрикции stu 1 и Acc 1.

Описан также способ выделения таких мутантов удаления, содержащий стадии: (a) конструкции первой плазмиды, содержащей боковые последовательности Vibrio cholerae одного или нескольких удаленных фрагментов эндонуклеаз рестрикции, и ген обнаруживаемого маркера чужеродного происхождения, подвергнутый лигации с вышеупомянутыми боковыми последовательностями, чтобы заменить и занять место вышеупомянутого удаленного фрагмента, причем вышеупомянутые последовательности должны иметь достаточную длину, чтобы промотировать обнаруживаемую ин виво рекомбинацию; (b) скрещивания вирулентного штамма Vibrio cholerae с первым микроорганизмом, несущим первую плазмиду; (c) селекции Vibrio cholerae, экспрессирующего первый селектируемый маркер; (d) скрещивания выбранного продукта со стадии (c) со вторым микроорганизмом, несущим вторую плазмиду со вторым селектируемым маркером, причем вышеупомянутая вторая плазмида несовместима с первой плазмидой; (e) селекции на экспрессию Vibrio cholerae как первого селектируемого маркера, так и второго селектируемого маркера; (f) конструирования третьей плазмиды, несущей боковые последовательности Vibrio cholerae одного или нескольких удаленных фрагментов эндонуклеазы рестрикции, гомологичных тем, что были описаны на стадии (a), но отличающихся отсутствием селектируемого маркера чужеродного происхождения; (g) скрещивания выбранного продукта со стадии (e) с третьим микроорганизмом, несущим третью плазмиду, описанную на стадии (f); (h) селекции Vibrio cholerae, который уже не экспрессирует первый селектируемый маркер.

Этот способ может быть использован только для штаммов ZOT минус или для получения производного ZOT минус, из которого уже удалены гены токсина холеры.

Предложена третья культура Vibrio cholerae, содержащая штамм Vibrio cholerae, с удаленной областью хромосомной ДНК, кодирующей токсин холеры и токсин блокатора малой зоны (ZOT). Предложен также способ выделения таких мутантов удаления Vibrio cholerae, содержащий стадии: (a) конструирования плазмиды, содержащей последовательности Vibrio cholerae, кодирующие токсин холеры и токсин блокатора малой зоны, и ген селектируемого маркера чужеродного происхождения, причем вышеупомянутая плазмида не способна к репликации вне хромосом в Vibrio cholerae; (b) скрещивания микроорганизма, несущего вышеупомянутую плазмиду, с вирулентным штаммом Vibrio cholerae, содержащим вышеупомянутые последовательности, вставленные между боковыми идентичными копиями второй последовательности, такой как RSI-элементы достаточной длины, чтобы промотировать обнаруживаемую ин виво рекомбинацию; (c) селекции Vibrio cholerae, экспрессирующего вышеупомянутый селектируемый маркер; (d) выращивания выбранного продукта со стадии (c) без селективного агента; (e) селекции Vibrio cholerae, который уже не экспрессирует селективный маркер и, следовательно, содержит удаленную область хромосомной ДНК, кодирующей токсин холеры и токсин блокатора малой зоны.

Предложена четвертая культура Vibrio cholerae, содержащая штамм Vibrio cholerae с удаленной областью хромосомной ДНК, кодирующей токсин холеры и токсин блокатора малой зоны, и содержащий вставленный ген стойкости к ртути и ДНК, кодирующую субблок B токсина Vibrio cholerae. Предложен также способ выделения таких мутантов удаления, содержащий стадии: (a) конструирования плазмиды, содержащей последовательности Vibrio cholerae, кодирующие токсин холеры и токсин блокатора малой зоны, и ген селектируемого маркера чужеродной природы, причем вышеупомянутая плазмида не способна к репликации вне хромосом в Vibrio cholerae; (b) скрещивания микроорганизма, несущего вышеупомянутую плазмиду, с вирулентным штаммом Vibrio cholerae, содержащим вышеупомянутые последовательности, кодирующие токсин холеры и токсин блокатора малой зоны, вставленные между боковыми идентичными копиями второй последовательности достаточной длины, чтобы промотировать обнаруживаемую ин виво рекомбинацию; (c) селекции Vibrio cholerae, экспрессирующего вышеупомянутый селектируемый маркер; (d) выращивания выбранного продукта со стадии (c) без селективного агента; (e) селекции Vibrio cholerae, который уже не экспрессирует селективный маркер и, таким образом, уже не имеет области хромосомной ДНК, кодирующей токсин холеры и токсин блокатора малой зоны; (f) конструирования второй плазмиды, содержащей ген стойкости к ртути и ДНК, кодирующую субблок B токсина Vibrio cholerae, и ген второго селектируемого маркера чужеродной природы, причем вышеупомянутая плазмида не способна к репликации вне хромосом в Vibrio cholerae, и в которой последовательности имеют достаточную длину, чтобы промотировать обнаруживаемую ин виво рекомбинацию, примыкающую к вышеупомянутому гену стойкости к ртути, и ДНК, кодирующей субблок B токсина Vibrio cholerae; (g) скрещивания микроорганизма, несущего вышеупомянутую вторую плазмиду с вышеупомянутым Vibrio cholerae, описанным на стадии (e), содержащим последовательности, гомологические вышеупомянутым последовательностям достаточной длины, чтобы промотировать обнаруживаемую ин виво рекомбинацию; (h) селекции Vibrio cholerae, экспрессирующего вышеупомянутый второй селектируемый маркер; (i) выращивания выбранного продукта со стадии (h) без второго селективного агента; (j) селекции Vibrio cholerae, который уже не экспрессирует второй селективный маркер; (k) просеивания вышеупомянутого Vibrio cholerae, описанного на стадии (j), чтобы выделить Vibrio cholerae, которые содержат ген стойкости к ртути и ДНК, кодирующую субблок B токсина Vibrio cholerae, но у которых удалена область хромосомной ДНК, кодирующая токсин холеры и токсин блокатора малой зоны.

Мутанты удаления Vibrio cholerae, являющиеся предметом настоящего изобретения, являются полезными при вакцинации против холеры.

Один штамм Vibrio cholerae, являющийся предметом настоящего изобретения, именуемый CVD 101, как ожидается, обеспечивает по существу 100% эффективность для человека против последующего заражения штаммом аналогичного серотипа. Другие штаммы Vibrio cholerae, являющиеся предметом настоящего изобретения, именуемые второй культурой и третьей культурой, такие как CVD 109, как ожидается, обеспечивают по существу 100% эффективную защиту человека против последующего инфицирования штаммом аналогичного серотипа и позволяют избежать нежелательных побочных эффектов, таких как понос и тошнота, а также судороги. Еще один штамм Vibrio cholerae, являющийся предметом настоящего изобретения, CVD 110, именуется четвертой культурой.

Краткое описание фигур Фиг. 1. V.cholerae N 16961 (pJBK55) (Ap^r).

Фиг. 2. Процедура переноса скрещенного и присоединенного гена при построении V.cholerae JBK56.

Фиг. 3. V.cholerae JBK56.

Фиг. 4. Схема конструкции JBK21.

Фиг. 5. Схема конструкции JBK54.

Фиг. 6. Схема конструкции V.cholerae JBK56.

Фиг. 7. Рекомбинация ин виво при помощи переноса и исключения гена ctx.

Фиг. 8. Схема конструкции pJBK51.

Фиг. 9. Схема конструкции для pCVD14 и pCVD15.

Фиг. 10. Схема конструкции pJBK108.

Фиг. 11. Схема конструкции pJBK107.

Фиг. 12. ДНК-последовательность (вверху) сайтов Xba 1 и CIa 1, которые определяют концы удаленного фрагмента Хва 1 - CIa 1 в 550 пар оснований (по) A-субблока в Огава 395, и (внизу) соединение с CVD 101 после удаления этого фрагмента и вставки Xba 1-линкера.

Фиг. 13A и 13B. Эффект верхнего слоя культуры V. cholerae на ток подвзвдошного короткого контура (Isc) и ионную проводимость ткани (Gt). Приведены средние значения для 6 животных в каждый момент времени; прямые скобки содержат 1 стандартную ошибку а, эффект верхних слоев V.cholerae 395 на Isc (сплошные линии) и Gt (штриховые линии), в, Эффект V.cholerae 395 (сплошная линия), CVD 101 (линия с длинными штрихами) и 395NI (точечная линия) на Gt. Контрольный эксперимент со средней (линия из коротких штрихов) состоял из непривитой культурной среды.

Фиг. 14, A - D. Анализ на проницаемость агглютинина пшеничного зерна-пероксидазы хрена обыкновенного (WGA - HRP) подвздошной ткани кролика под действием верхних слоев культур различных штаммов V.cholerae, а, контрольный для среды; b, V.cholerae 395; c, V.cholerae 395N1; d, V.cholerae CVD101.

Фиг. 15, A и B. Исследование замораживанием-изломом подвздошной ткани кролика под действием верхних слоев культур V.cholerae a, Интактный ZO с многочисленными пересечениями (острые стрелки) между примыкающими нитями M, микроворсинки. b, Нарушенный ZO из подвздошной ткани под действием V.cholerae 395; ретикулюм имеет упрощенный вид из-за значительного снижения сферы действия пересечений нитей. c, Квантование сложности ZO в тканях под действием верхних слоев культур или контрольного бульона.

Фиг. 16. Обратимость вариаций Gt, индуцированных верхним слоем V.cholerae 395. Добавляли верхние слои культур V.cholerae (треугольники) и непривитую среду (квадраты) и удаляли в моменты времени, указанные стрелками.

Фиг. 17. Схема конструкции CVD109. Гены zot и ctx примыкают друг к другу на хромосоме V. cholerae и находятся в области хромосомы, которая содержит несколько копий последовательности 2 700, именуемой RSI (повторяющейся последовательности). Элементы RSI находятся по обе стороны генов zot и ctx в вирулентном штамме V. cholerae E7946 (биотип Эль Тор, серотип Огава). Гены zot и ctx показаны большой незаштрихованной или заштрихованной стрелкой. RSI-последовательности изображены меньшей сплошной стрелкой.

Фиг. 18Аи 18В. ДНК-последовательность гена zot токсина блокатора малой зоны из нуклеотидов с номерами с 1 по 1428. Буквы над ДНК-последовательностью указывают на предсказанную аминокислотную последовательность ZOT-протеина, кодируемого геном zot.

Фиг. 19. Схема конструкции плазмиды pCVD621.

Фиг. 20А - 20С. Схема конструкции плазмиды pCVD622.2B.

Фиг. 21А - 20G. ДНК-последовательность гена ctx B и гена mer, вставленных в ген hlyA.

Сокращения для сайтов эндонуклеаз рестрикции на фигурах: A = сайт эндонуклеазы рестрикции Acc I B = сайт эндонуклеазы рестрикции Bgl II C = сайт эндонуклеазы рестрикции CIa I E = сайт эндонуклеазы рестрикции Eco RI H = сайт эндонуклеазы рестрикции Hind III P = сайт эндонуклеазы рестрикции Pst I S = сайт эндонуклеа