Рекомбинантный вектор на основе вируса оспы птиц, рекомбинантный вектор для вакцинации домашней птицы

Рекомбинантный вектор на основе вируса оспы птиц, рекомбинантный вектор для вакцинации домашней птицы

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения вакцин. Рекомбинантный вектор конструируют на основе аттенуированного вируса оспы птиц путем интеграции нуклеотидной последовательности, определяющей синтез гетерологичного белка микроорганизма, патогенного для домашней птицы, в некодирующую межгенную область, расположенную в концевых инвертированных поворотах (TIR). Межгенная область ₁ и ₂ расположена между нуклеотидами 1675 и 2165 TIR и 2672 и 3605 TIR соответственно. Клетки, трансформированные конструированным вектором, способны экспрессировать гетерологический протеин. Протеин может быть антигеном патогенных для птиц агентов: вирус болезни Гумборо, вирус инфекционного бронхита, вирус болезни Марека, паразитического простейшего, вызывающего кокцидиоз. Изобретение позволяет создать новые рекомбинантные вакцины против болезней птиц. 2 с. и 6 з.п. ф-лы, 13 ил., 9 табл.

Изобретение относится к рекомбинантным вирусам, производным от вируса Avipox и, в частности, от вируса, ответственного за оспу у птиц, обычно называемую Fowlpox. Изобретение относится также к способу получения этих вирусов в результате культивирования клеток, к применению этих вирусов для получения вакцин и к вакцинам, содержащим эти вирусы. Изобретение относится также к последовательностям переноса для включения в геном этого рекомбинантного вируса, а также к плазмидам, которые несут эти последовательности.

Вирус, ответственный за оспу у птиц, или Fowlpox вирус (FPV), принадлежит к роду Avipox семейства Poxviridae.

Вирус Fowlpox имеет характеристики, типичные для Pox. Эти вирусы большого размера, геном которых представляет собой ДНК в виде линейной двойной спирали величиной 300 ко, у которой концевые части простой цепи связаны ковалентным образом. Примерно 20 ко этого генома были собраны в виде последовательности, в частности последовательность обратных терминальных повторений (TIR для Terminal Inverted Repeats) (Campbell et al. 1989; Tomley et al. 1988). Обратные терминальные повторения представляют собой две длинные идентичные последовательности, находящиеся на каждом конце генома, с противоположной ориентацией.

Вирус коровьей оспы или Vaccinia был первым из Pox, который был выведен в качестве живущего рекомбинантного вируса, способного выражать чужеродные протеины. Перечень выраженных протеинов является очень длинным. В частности, экспрессия многочисленных чужеродных антигенов позволила получить иммунизацию против различных болезней.

В заявке на европейский патент 0 314 569 было предложено применение вируса Fowlpox в качестве вектора экспрессии гетерологичных протеинов с целью получения вакцины, т. е. применение рекомбинантного вируса, который интегрировал в некодирующую внутригенную область своего генома последовательность ДНК, кодирующую гетерологичный протеин; эта область представляет собой короткую последовательность из 32 нуклеотидов, расположенную между открытыми фазами для считывания (ORF для Open Reading Frame) ORF 7 и ORF 9, причем эта область была преобразована генетическим путем в неосновной сайт включения. В таких коротких внутригенных областях велик риск того, что включение отделит сигнал транскрипции от гена и тем самым введет мутацию, которая инактивирует этот ген. Это подтверждается: действительно, эта последовательность из 32 нуклеотидов оказывается является существенной областью, потому что она должна была увеличиться на 55 нуклеотидов, чтобы избежать возможного перекрывания между промотором фазы ORF 9 и кодирующей последовательностью 3' фазы ORF 7. В случае области, которая отделяет ORF 7 от ORF 9, включение в природной последовательности является, кроме того, нестабильным (Spehner et al., 1990), и его преобразование является необходимым. Более того, предложенный способ преобразования короткой внутригенной области не является общим.

С другой стороны, в заявке на международный патент WO 88/02022 было также предложено конструирование вируса Fowlpox и других рекомбинантных Pox у птиц, отличающихся включением чужеродной ДНК в ген тимидинкиназы. Это включение создает мутацию в гене, которая могла бы уменьшить заражающую способность вируса. Это имеет риск слишком большого ослабления штамма и уменьшенной иммуногенной способности вакцины, выведенной из рекомбинантного вируса.

Кроме того, в заявке на европейский патент 0 353 851 было предложено применение рекомбинантного вируса Fowlpox в качестве вектора экспрессии гетерологичного протеина. Включение чужеродного гена в вирусный геном осуществляется в открытых фазах для считывания (ORF), расположенных в обратных терминальных повторениях (TIR). Включение одного или нескольких чужеродных генов во внутреннюю часть открытых фаз для считывания имеет риск произвести мутацию гена, функция которого не известна.

Настоящее изобретение предоставляет другие области для включения одного или нескольких чужеродных генов в вирусный геном, которые больше не имеют недостатков, свойственных указанным выше областям включений.

В связи с этим настоящее изобретение относится к рекомбинантному вирусу Avipox, выведенному из ослабленного штамма вируса Avipox и содержащему в неосновной части своего генома по меньшей мере одну последовательность ДНК, кодирующую полностью или частично протеин, гетерологичный по отношению к вирусу Avipox, а также элементы, способные обеспечить экспрессию этого протеина в клетке, зараженной указанным рекомбинантным вирусом, причем неосновная часть генома образована внутригенной некодирующей областью вируса Avipox, т. е. областью, расположенной между двумя открытыми фазами для считывания, включая их сигналы экспрессии.

Под неосновной частью генома вируса Avipox понимают область, которая может быть модифицирована без ухудшения функций, задействованных в преобразовании вируса in vitro и in vivo. В качестве неосновной части выбирают некодирующую внутригенную область генома, т.е. расположенную между двух ORF, включая их сигналы экспрессии.

Внутригенные области по изобретению являются широкими, так чтобы риск того, что включение отделит сигналы транскрипции от их соответствующих генов, был минимален, а также чтобы их преобразование было бы не нужно. С другой стороны, последовательности этих внутригенных областей являются некодирующими, и, следовательно, риск мутации в ORF является нулевым. Под широкой областью понимают область, имеющую последовательность из более чем 60 нуклеотидов. Обычно выбирают область, имеющую последовательность из более чем 100 нуклеотидов. Предпочтительно выбирают область, имеющую последовательность из более чем 200 нуклеотидов. По особенно предпочтительному способу выбирают область, имеющую последовательность из более чем 400 нуклеотидов.

С другой стороны, обычно выбирают внутригенную область, в которой клонируется по меньшей мере одна последовательность ДНК, расположенную в одной из двух областей TIR вируса Avipox. Обычно по меньшей мере одна последовательность ДНК клонируется в по меньшей мере одной из двух областей TIR вируса Avipox. Предпочтительно по меньшей мере одна последовательность ДНК клонируется в обеих областях TIR вируса. По еще более предпочтительному способу выбирают внутригенную область, называемую область ₁, и/или внутригенную область, называемую область ₂, причем внутригенная область, называемая область ₁, располагается между нуклеотидами 1675 и 2165, а внутригенная область, называемая область ₂, располагается между нуклеотидами 2672 и 3605, принимая в качестве исходного нуклеотида сайт рестрикции BamHI, находящийся в TIR. Этот сайт рестрикции BamHI, выбираемый здесь для отсчета внутригенных областей, представляет собой первый нуклеотид последовательности, опубликованной в работе Tomley et al. 1988. Можно также определить эти области по изобретению следующим образом: внутригенная область, называемая область ₁, располагается между открытыми фазами для считывания ORF 1 и ORF 2, причем открытая фаза для считывания OFR 1 находится между нуклеотидами 419 (нуклеотид A из ATG) и 1674 (3-й нуклеотид стоп-кодона), а открытая фаза для считывания ORF 2 находится между нуклеотидами 2166 (нуклеотид A из ATG) и 2671 (3-й нуклеотид стоп-кодона), принимая в качестве исходного нуклеотида сайт рестрикции BamHI и TIR, а внутригенная область, называемая область ₂, располагается между открытыми фазами для считывания ORF 2 и ORF 3, причем открытая фаза для считывания ORF 2 находится между нуклеотидами 2166 (нуклеотид A из ATG) и 2671 (3-й нуклеотид стоп-кодона), а открытая фаза для считывания ORF 3 находится между нуклеотидами 3606 (3-й нуклеотид стоп-кодона) и 4055 (нуклеотид A из ATG), принимая в качестве исходного нуклеотида сайт рестрикции BamHI в TIR. По более предпочтительному способу в области ₁ выбирают часть, расположенную между нуклеотидами 1775 и 2065, а в области ₂ - часть, расположенную между нуклеотидами 2772 и 3505. Хорошие результаты были получены при клонировании на уровне нуклеотида 1842, называемого сайтом включения B1, который расположен в области ₁, и/или на уровне нуклеотида 3062, называемого сайтом включения B2, который расположен в области ₂. Хорошие результаты были получены, когда по меньшей мере одна последовательность ДНК клонируется в области ₂ в одной из двух областей TIR вируса Avipox. Хорошие результаты также были получены, когда одна последовательность ДНК клонируется в области ₁ в каждой из двух областей TIR. Это является другим преимуществом изобретения, потому что можно получить две копии гетерологичной последовательности ДНК на один геном.

Под рекомбинантным вирусом Avipox, выведенным из ослабленного штамма вируса Avipox, понимают ослабленный вирус, принадлежащий к роду Avipox, геном которого содержит гетерологичную последовательность в сопровождении сигналов экспрессии. Обычно в качестве вируса используют вирус рода Avipox, такой как Fowlpox, Pigeonpox или Canarypox. Обычно в качестве вируса используют Fowlpox. Предпочтительно в качестве вируса Fowlpox используют вакцинальный штамм вируса оспы кур или Fowlpox такого как вакцина, производимая и поставляемая в торговлю фирмой СОЛЬВЕЙ под маркой POXINE или вакцина, производимая и поставляемая в торговлю фирмой СОЛЬВЕЙ под марками CHICK-N-POX, POULVAC CHICK-N-POX, CHICK-N-POX TC, POULVAC CHICK-N-POX TC, POULVAC POXINE, POULVAC P. По более предпочтительному способу в качестве вируса Fowlpox используют вакцину, поставляемую в торговлю фирмой СОЛЬВЕЙ под марками CHICK-N-POX, POULVAC CHICK-N-POX, CHICK-N-POX TC, POULVAC CHICK-N-POX Tc, POULVAC POXINE, POULVAC P, сокращенно CNP.

Ослабление получается в результате последовательных прохождений через эмбрион или, если вирус был адаптирован к культивируемым клеткам, в результате прохождений через культуру клеток.

Под элементами, способными обеспечить экспрессию гена, который кодирует гетерологичный протеин в клетке, зараженной указанным рекомбинантным вирусом, понимают сигналы генетической экспрессии, узнаваемые вирусом, в частности промотор и терминатор, т.е. элементы, известные специалисту, такие как, в частности, описанные, например, у Moss, 1990. В общем случае используют промотор для Pox. Обычно используют промотор для Vaccinia или для Fowlpox. Предпочтительно используют промотор P11 и промотор P7.5 для Vaccinia, такие как описанные у Venkatesan et al., 1981; Cochran et al., 1985 и Bertholet et al, 1985.

Под по меньшей мере одной последовательностью ДНК, кодирующей полностью или частично протеин, гетерологичный по отношению к вирусу Avipox, понимают любой фрагмент ДНК, извлеченный из генома, или копию ДНКк или еще синтезированную ДНК в сопровождении сигналов экспрессии, последовательность которой кодирует полностью или частично протеин, чужеродный для Avipox.

Фиг. 1-11 были подготовлены, чтобы позволить лучше понять изобретение.

Фиг. 1 изображает конструирование рекомбинантного вируса Avipox, модифицированного согласно Mackett et al. 1984. Клетки, зараженные (I : инфекция) вирусом Fowplpox (FPV), трансфектируются (T : "трансфекция") плазмидой переноса. Эта плазмида (P) несет ориентированный промотор (Pr), чтобы обеспечить экспрессию смежного гетерологичного гена (q), с той и с другой стороны которого располагаются последовательности вирусной ДНК. Гомологичная рекомбинация (R) имеет место в цитоплазме клетки (C) между последовательностями, которые окаймляют ген, и последовательностями, находящимися на вирусном геноме. Это приводит к включению гетерологичного гена в вирусный геном. Этот геном может упаковываться и производить рекомбинантные вирусные частицы (VP). N означает ядро клетки (C).

Фиг. 2 схематично изображает концевые части генома Fowlpox с TIR справа (TIR-R) и слева (TIR-L), обозначаемыми прямоугольниками, и с единственной последовательностью, обозначаемой чертой. Пунктир обозначает центральную область генома. Фрагмент рестрикции EcoRI из TIR-L имеет величину 6,2 ко, тогда как аналогичный фрагмент из TIR-R имеет величину 9,0 ко. Эта схема показывает, что эти два фрагмента имеют общую последовательность, причем единственную последовательность. Показан сайт BamHI, расположенный ниже EcoRI в TIR.

Фиг. 3 изображает карту рестрикции плазмиды pTIRBI (PTIRBI) для некоторых единичных сайтов и положение ORF. Единичный сайт BamHI используется для клонирований гетерологичных генов.

ori (ORI): начало репликации плазмиды в Escherichia coli (E.coli); Ap: ген устойчивости к ампициллину; ORF 1 - ORF 6; открытые фазы для считывания в Fowlpox.

Фиг. 4 представляет собой рисунок, подобный фиг. 3, но для плазмиды pTIRB2 (RTIRB2).

Фиг. 5 изображает карту рестрикции плазмиды pIILac (PIILAC). Эта плазмида несет ген LacZ микроорганизма E.coli под контролем промотора PII для Vaccinia. PII : промотор PII для Vaccinia; LACZ: ген, кодирующий -галактозидазу; ori: начало репликации в E.coli; Brin + : цепь, упакованная в фаге M13 : AP : ген устойчивости к ампициллину.

Фиг. 6 изображает пример вектора переноса для гена LacZ в TIP. Этот вектор представляет собой плазмиду pTIRBIP75Lac (PTIRBIP75LAC). Кассета P7.5-LacZ клонируется в сайте BamHI плазмиды pTIRBI (в направлении по часовой стрелке). P7.5 : промотор P7.5 для Vaccinia.

Фиг. 7 является схематическим изображением включений гена LacZ (представленного заштрихованным прямоугольником) в геноме CNP. Кассеты P7.5 LacZ и PII-LacZ включаются в терминальные области (TIR) в том или ином направлении. Область TIR справа не представлена. Стрелки указывают направление транскрипции генов, изображенных в виде прямоугольников. Масштаб не соблюдается.

Фиг. 8 изображает сегмент A для IBDV, положение праймеров и различные фрагменты, полученные в результате обратной транскрипции и амплификации ARN сегмента A из штамма Edgar.

A : строение ORF p : "праймеры", используемые для осуществления амплификации сегмента A.

>, < : ориентация праймеров по отношению к кодирующей последовательности сегмента A.

fgt PCR : фрагменты, генерируемые в результате амплификации ARN сегмента A.

pb : пар оснований.

Фиг. 9 (от 9a до 9e) изображает нуклеотидную последовательность увеличенной ДНК, соответствующей ARN сегмента A штамма Edgar и трансляцию аминокислот фаз ORF 1, 2 и 3.

Primers 0,1, 1b, 2, 3, 4, 5, и 6 : праймеры, используемые для генерирования (путем обратной транскрипции и амплификации) фрагментов ДНК, соответствующих сегменту A штамма Edgar.

Фиг. 10 изображает схему реконструирования сегмента ДНК, соответствующего сегменту A штамма Edgar, исходя из фрагментов, полученных в результате обратной транскрипции и амплификации.

* : направленный мутагенез.

Фиг. 11 изображает карту рестрикции плазмиды pTIR75EI LAC (PTIR75EILAC).

Часть плазмиды, обозначенная жирной чертой, соответствует гомологичным последовательностям генома FPV. ori (ORI) : начало репликации плазмиды в E. coli; Ar : ген устойчивости к ампициллину; P7.5 : промотор P7.5 для vaccinia; ORF 1 - IBDV : ORF I сегмента A штамма Edgar; P11 : промотор P11 для vaccinia; LACZ : ген, кодирующий -галактозидазу; pb : пар оснований; OFR 1 - ORF 6 : открытые фазы для считывания в Fowlpox.

Фиг. 12 изображает описание при помощи теста ELISA протеинов IBDV, выраженных в рекомбинантах FPV (IBDV). Описание было осуществлено следующим образом: по 50 мкл клеточных суспензий и последовательных разбавлений вдвое этих суспензий были помещены в чашечки. После инкубации второго антитела анти-IBDV (моноклональный анти-VP3 или анти-VP2) была осуществлена имплификация сигнала при помощи системы анти-IgG мыши, меченной посредством биотин + стрептавидин совместно со щелочной фосфатазой.

Фиг. 12a соответствует детектированию при помощи моноклонального антитела анти-VP3. Фиг. 12B соответствует детектированию по помощи моноклонального антитела анти-VP2.

На этих фигурах абцисса изображает последовательные разбавления в 2 раза клеточных экстрактов в логарифмических единицах, а ордината изображает отношение поглощений, измеренных при 690 мм и 405 мм.

Фиг. 13 изображает описание при помощи Western blot протеинов IBDV, выраженных в рекомбинантах FPV (IBDV). Это исследование было осуществлено следующим образом: клеточные суспензии центрифугируются с ускорением 3000 g, а полученные всплывшие продукты подвергаются ультрацентрифугированию с ускорением 185 000 g; остатки, полученные после двух процессов центрифугирования, объединяются и снова переводятся в суспензию при помощи буферного раствора PBS (Phosphate Buffered Saline, Gibco).

Отстой протеинов в количестве от 20 до 40 мкг для рекомбинант FPV/IBDV и 5 мкг для клеток, зараженных при помощи IBDV (положительный контроль) наносится в расчете на одну лунку на гель типа акриламид-SDS. После переноса на мембрану протеины IBDV детектируются при помощи поликлональной сыворотки, распознающей все протеины IBDV, для фиг. 13A, или при помощи моноклонального антитела анти-VP3 для фиг. 13B. Амплификация сигнала реализуется при помощи системы анти-IgG, меченной биотином и сопряженной системой стрептавидин-щелочная фосфатаза. PM (mW): протеины с известными молекулярными массами.

Способ, используемый для осуществления изобретения, схематично показан на фиг. 1 (модифицированный согласно Mackett et al., 1984). Клетки, зараженные при помощи Avipox или Fowlpox, трансфектируются плазмидой переноса. Эта плазмида несет промотор, ориентированный так, чтобы разрешить экспрессию смежного гетерологичного гена, окаймленного с обеих сторон последовательностями вирусной ДНК. Гомологичная рекомбинация происходит в цитоплазме клетки между последовательностями, которые окаймляют ген, и последовательностями, находящимися на вирусном геноме. Таким образом, происходит включение гетерологичного гена в вирусный геном. Этот геном может упаковаться и производить рекомбинантные вирусные частицы. Этот способ включения путем заражения клеток при помощи Pox с последующим переносом плазмидой был разработан для Vaccinia и обычно используется во многих лабораториях для конструирования рекомбинантных Pox (Mackett et al., 1985).

Способ по изобретению включает обычно следующие стадии: - первая стадия заключается в конструировании плазмид переноса, разрешающих просеивание, - вторая стадия заключается в клонировании генов, кодирующих гетерологичные антигены в плазмидах переноса, - третья стадия заключается в конструировании рекомбинантных вирусов Avipox, и - четвертая стадия заключается в проведении тестов по вакцинации с рекомбинантными вирусами.

Предпочтительно способ включает следующие стадии: a. Конструирование плазмид переноса, разрешающих просеивание: - клонирование фрагментов, несущих TIR, - включение сайта клонирования в TIR, - клонирование промоторов P11 и P7.5 из Vaccinia; - конструирование кассеты, несущей ген LacZ, и ее клонирование ниже P11 или P7.5, - клонирование элементов P11 LacZ или P.7.5 LacZ в плазмидах переноса TIR.

b. Конструирование рекомбинантных вирусов CNP (ген LacZ для осуществления предварительного теста): - перенос клеток QT35 вирусом CNP и плазмидой переноса, - просеивание с последующей очисткой рекомбинант благодаря экспрессии гена LacZ, - анализ геномов рекомбинант и экспрессии гена LacZ c. Тест вакцинации: - вакцинация цыплят рекомбинантными вирусами и защита от птичьей оспы, внесенной при помощи рекомбинантного вируса LacZ.

d. Клонирование генов, кодирующих гетерологичные антигены (гетерологичный протеин) в плазмидах переноса: - клонирование генов, кодирующих гетерологичные антигены ниже P11 или P7.5, - клонирование кассет P11-антиген и P7.5 - LacZ или P7.5-Антиген и P11-LacZ в плазмидах TIR.

e. Конструирование рекомбинантных вирусов CNP: - перенос клеток QT35 вирусом CNT и плазмидой переноса, - просеивание с последующей очисткой рекомбинантных вирусов благодаря экспрессии гена LacZ, - анализ экспрессии антигена на культуре клеток и анализ генома рекомбинантных вирусов.

f. Вакцинация: - вакцинация рекомбинантными вирусами CNP, - оценка степени защиты, обусловленной экспрессией антигена, гетерологичного по отношению к CNP.

Изобретение относится также к последовательностям переноса, которые позволяют включать гетерологичную ДНК в геном вируса Avipox, как определено выше, и, в частности, на сайтах B1 или B2. Изобретение относится к также к плазмидам, которые несут эти последовательности. Под плазмидой переноса понимают плазмиду, которая содержит гетерологичный ген под контролем промотора, распознаваемого вирусом Avipox, который окаймлен с обеих сторон последовательностями, расположенными с одной и с другой стороны от сайта B1 или от сайта B2. Длина этих последовательностей, гомологичных для FPV, которые окаймляют гетерологичный ген, должна быть достаточно велика, чтобы разрешить рекомбинацию слева и справа от гетерологичного гена. Обычно выбирают последовательности величиной не менее 1 ко. Хорошие результаты получаются для B1, окаймленного последовательностью величиной примерно 1850 нуклеотидов сверху и 4321 нуклеотидов снизу, а для B2 - примерно 3070 нуклеотидов сверху и 3100 нуклеотидов снизу. Плазмиды переноса принимают участие в процессе для изолирования рекомбинантных Avipox, причем способ вводит в действие перенос клеток перепелки QT35, предварительно зараженных вирусом Avipox.

Изобретение относится также к культивированию эукариотных клеток, зараженных рекомбинантным вирусом Avipox, выведенным из ослабленного штамма вируса Avipox и содержащим в неосновной части своего генома по меньшей мере одну последовательность ДНК, кодирующую полностью или частично протеин, гетерологичный для вируса Avipox, а также элементы, способные обеспечить экспрессию этого протеина в клетке, зараженной указанным рекомбинантным вирусом, причем неосновная часть образована некодирующей внутригенной областью вируса Avipox, расположенной между двух OFR, включая их сигналы экспрессии.

Предпочтительно применяют культивирование клеток домашней птицы. Хорошие результаты были получены с культурой клеток перепелки. Превосходные результаты были получены с культурой клеток перепелки QT35 такой, которая описана Cho (1981).

Рекомбинантный вирус Avipox по изобретению развивается в качестве векторов, способных выражать полностью или частично гетерологичный протеин. Следовательно, настоящее изобретение относится также к применению вируса по изобретению в качестве вектора, способного выражать полностью или частично гетерологичный протеин, такой как, в частности, антиген.

Изобретение относится также к вакцине, содержащей рекомбинантные вирус Avipox, выведенный из ослабленного штамма вируса Avipox и содержащий в неосновной части своего генома по меньшей мере одну последовательность ДНК, кодирующую полностью или частично протеин, гетерологичный для вируса Avipox, а также элементы, способные обеспечить экспрессию этого протеина в клетке, зараженной указанным рекомбинантным вирусом, причем неосновная часть генома образована некодирующей внутригенной областью вируса Avipox, расположенной между двумя ORF, включая их сигналы экспрессии.

Под гетерологичным протеином понимают любой протеин или часть протеина, которые чужеродны по отношению к вирусу Avipox, причем протеин может быть естественным или модифицированным. В общем случае этот протеин может быть антигеном, позволяющим разработать вакцину против патогенного организма. Обычно антигенами являются, в частности, протеины агентов, заражающих птиц: вирусов, бактерий, хламид, микоплазм, простейших одноклеточных организмов, грибов и червей.

Это, в частности, Adenoviridae, такие как вирус, ответственный за апластичную анемию (AA) или за синдром снижения кладки яиц (EDS), Birnaviridae, такие как вирус болезни Гумборо (IBDV), Coronaviridae, такие как вирус инфекционного бронхита (IBY), Herpesviridae, такие как вирус болезни Макера (MDV) и вирус, ответственный за инфекционный ларинготрахеит (ILTV), Orthomyxoviridae, такие как вирус, ответственный за грипп (Influeusa), Paramyxoviridae, такие как вирус болезни Ньюкасла (NDV), Picornaviridae, такие как вирус, ответственный за энцефаломиелит (AE), Roeviridae, ответственный за тенозиновит, Retrovirus, такие как вирус, ответственный за лимфоидный лейкоз (LL), вирус, ответственный за анемию у кур (CAV).

Это, в частности, хламиды, такие как Chlamydia psittaci.

Это, в частности, микоплазмы, такие как Mycoplasma gallisepticum и M. synoviae.

Это, в частности, бактерии, такие как Escherichia coli, Haemophilus, в том числе H. paragallinarum, которая является ответственной за насморк, Pasteurella, в том числе P. multocida, которая является ответственной за холеру, Salmonella, в том числе S.gallinarium, ответственная за тиф, и S. pullorum, Clostridium, в том числе C.botulinum, которая вырабатывает токсин, ответственный за ботулизм, C. perfringens и C.septicum ответственные за дерматозы, C.colinum, Campilobacter jejuni, Streptococcus aures.

Это, в частности, простейшие одноклеточные организмы, такие как Eimeria, ответственный за кокцидиоз, и Cryptosporidiosis baileyi, ответственный за криптоспородиоз.

Это, в частности, черви, такие как ленточные черви и круглые черви, в том числе Ascaridia galli.

Это, в частности, грибы, такие как Aspergillus fumigatis.

Предпочтительными антигенами являются антигены вируса болезни Гумборо (IBDV), вируса инфекционного бронхита (IBV), вируса, ответственного за анемию у кур (CAV), простейшего одноклеточного организма Eimeria, ответственного за кокцидиоз, вируса болезни Ньюкасла (NDY) и вируса болезни Марека (MDV).

Особенно предпочтительными антигенами являются антигены вируса болезни Гумборо (IBDV), вируса инфекционного бронхита (IBV), вируса, ответственного за анемию у кус (CAV) и простейшего одноклеточного организма Eimeria, ответственного за кокцидиод. Хорошие результаты были получены в следующих условиях: - для IBDV : полностью или частично открытые фазы для считывания, в том числе полипротеин и части полипротеина. Такими протеинами являются, в частности, VP2, VP3, VP4. Сюда входят также все их комбинации или модификации. Эти модификации представляют собой, например, включение сайта расщепления, - для IBV : антигена E2, - для Eimeria : естественный поверхностный антиген TA4 и поверхностный антиген, у которого последовательность сайта протеолитического расщепления была модифицирована, - для CAV : протеин P50.

Превосходные результаты были получены с IBDV, причем гетерологичным протеином является часть полипротеина, содержащая аминокислоты с 1 по 493, за которыми следуют аминокислоты с 1010 по 1012, причем в эту часть включен протеин VP2, как изображено на фиг. 9.

Последовательности ДНК могут кодировать протеин полностью или же фрагменты протеина и могут вызывать у животных соответствующую ответную реакцию иммунитета. Другие молекулы, отличные от антигенов, также могут приниматься во внимание, в том числе факторы роста и иммуномодуляторы, такие как интерлейкины. Целью настоящего изобретения является также производство in vivo (в домашней птице) фактора, участвующего в метаболизме животного, такого как, например, гормон роста или фактор, индуцирующий последний. Настоящее изобретение относится также к получению протеинов или пептидов путем культивирования клеток in vitro или in vivo у животных. В зависимости от введенного гетерологичного протеина он может выступать, в частности, в качестве фермента, в качестве компонента пищи или в области здоровья людей или животных в качестве фармацевтического продукта для медицинского или ветеринарного применения.

С другой стороны, могут генерироваться мультиплетные рекомбинантные вирусы, несущие несколько гетерологичных генов, т.е. путем клонирования нескольких генов в одном и том же геноме, в одном и том же сайте или в различных областях или сайтах. Полифункциональный продукт также может быть создан в результате комбинации различных рекомбинантных вирусов.

Мишенью животного происхождения для вируса Avipox по изобретению являются птицы, в частности домашние птицы. Рекомбинантный вирус может также применяться для объектов, отличных от птиц.

Вакцина по изобретению может вводится в виде различных форм, известных специалисту. Обычно вакцина вводится оральным путем с пищей или с водой для питья, интраназальным путем, в результате подкожной инъекции, в виде аэрозоля, в результате внутримышечной инъекции или путем прокалывания крыла в соответствии с методом, называемым "wing web". Предпочтительно вакцина вводится путем прокалывания перепонки крыла в соответствии с методом, называемым "wing web", в результате внутримышечной инъекции или в результате подкожной инъекции.

Рецептура вакцины по изобретению составляется известным специалисту способом. Обычно вакцинальная композиция содержит стабилизаторы, соответствующие способу введения вакцины. Вакцина может храниться в лиофилизированной форме.

Настоящее изобретение иллюстрируется последующими примерами.

Пример 1. Очистка вируса CNP и его ДНК.

В качестве вируса Fowlpox используют вакцинальный штамм, поставляемый в торговлю фирмой Сольвей под маркой POULVAC CHICK-N-POX, CHICK-N-POX, CHICK-N-POX TC, POULVAC CHICK-N-POX TC (CNP) в виде живущей ослабленной вакцины. Первоначальная колония происходит из почвенного штамма, пропущенного несколько раз через яйца и адаптированного к клеткам in vitro в результате 2 прохождений через CEF (фибробласты куриного эмбриона) и 5 прохождений через клеточное потомство перепелки QT35, описанное Chno (1981). Клеточное потомство перепелки QT35 получено у Dr.Moscovici (6816, Нортвест, 18-я авеню, Гайнесвиль, Флорида 32605, Соединенные штаты), который его выделил и распределяет его.

CNR культивируется на клеточном потомстве QT35, среда для роста которого состоит из E199 (Gibco 500 мл), F12 (Gibco 500 мл), LAH (Gibco, гидролизат лактальбумина, 25 мл), FCS (Gibco, Foetal Calf Serum 25 мл) и фруктозы (5 мл раствора с концентрацией 200 г/л), инкубация при температуре 38^oC, 3% CO₂. Обычная мультиплетность заражения (MOI) составляет 0,01 вируса на одну клетку, причем клетки на 80% находятся в слиянии.

Вирусная колония очищалась следующим образом: клетки, зараженные вирусом Fowlpox CNP и извлеченные из фосфатного буферного раствора PBS (Phosphate Buffered Saline, Gibco) центрифугируются с ускорением 6000 g (15 минут). Осадок после центрифугирования снова переводится в суспензию в буферном растворе Трис (pH 9,1 мМ), обрабатывается трипсином (конечная концентрация трипсина 0,25 мг/мл; Gibco) и ультразвуком. Этот продукт помещается в среду с 36% сахарозы (вес/объем) и центрифугируется в течение 45 минут с ускорением 30000 g. Остаток после центрифугирования извлекается в буферном растворе Трис с концентрацией 1 мМ, pH = 9,0. Вирусы центрифугируются последний раз в течение 30 минут с ускорением 40000 g. Осадок после центрифугирования извлекается в буферном растворе для разложения лизинами : 10 мМ Трис-HCl, pH = 8,0, 10 мМ ЭДТА, 1% SDS (додецилсульфат натрия), 500 мкг/мл протеиназы K (Boehringer) 0,1 мг/мл RN-азы (Boehringer), и инкубируется в течение 2 часов при температуре 37^oC. Экстрагированная в феноле ДНК осаждается в этаноле. Было очищено порядка 20 мкг ДНК, исходя из 40 зараженных чашек с площадью 150 см².

Пример 2. Конструирование геномного банка EcoRI и геномного банка BamHI для CNP Используемые генетические методы описания у Maniatis et al., 1982. Ферменты рестрикции, полимеразы, лигазы и фосфатазы были поставлены фирмами Pharmacia, Boehringer et Biolabs. Синтетические ДНК были поставлены фирмой Eurogentec.

Фрагменты рестрикции вирусной ДНК посредством EcoRI или BamHI были связаны в векторе PUC18, описанном у Messing (1983), и введены в бактерию E. coli MC1061 (araD139, (ara, Leu) 7697, LacX74, galU, galK, hsdR, strA, продаваемые фирмой Фармация). Оба геномных банка хранятся при температуре -70^oC в глицерине в виде двух трансформированных клеточных суспензий. Восемьдесят % плазмид содержат одно включение. Семнадцать фрагментов BamHI и 45 фрагментов EcoRI были дифференцированы на основе их размера и их модели рестрикции посредством Bg12 или HinFI. Включения имеют размеры от 0,5 до 15 ко; сумма охарактеризованных таким образом включений BamHI составляет 82 ко и 210 ко для фрагментов EcoRI. Размер генома Pox у птиц близок к 300 ко (Coupar et al. , 1990). Выделенные фрагменты составляют тем самым 25% для BamHI и 70% для EcoRI от всего генома.

Пример 3. Клонирование фрагментов, несущих TIR Обратные терминальные повторения (TIR) представляют собой две идентичные последовательности, находящиеся на концах генома вирусов Pox и имеющие противоположное направление. Последовательность величиной более 17 ко одного конца генома штамма HP вируса Fowlpox была опубликована (Campbell et al., 1989 и Tomley et al., 1988). Она содержит примерно 10 ко повторяемой последовательности и 7,0 ко ее смежной последовательности.

Осуществляют клонирование фрагментов EcoRI для TIR. Повторяемая последовательность содержит сайт EcoRI. Как это показывает фиг. 2, клонируются два фрагмента EcoRI: каждый несет одну часть TIR и одну единичную смежную последовательность. Единичная последовательность ограничена наиболее близким сайтом EcoRI из TIR. Эти два фрагмента были выделены благодаря олигонуклеотиду, комплементарному по отношению к последовательности, расположенной в повторяемой части. Первый фрагмент имеет размер 6,2 ко и будет называться (по договоренности) TIR-L. Второй имеет размер 9,0 ко и будет называться (по договоренности) TIR-R. Последовательность фрагмента EcoRI TIR- для CNP является идентичной с опубликованной последовательностью.

Место соединения между TIR и единичной последовательностью, идентифицированной при сравнении последовательностей TIR-L и TIR-R, находится на нуклеотиде 4007, причем сайт BamHI последовательности, опубликованной у Tomley et al., (1988), принимается за нуклеотид номер 1. Место соединения находится в открытой фазе для считывания, называемой ORF 3 указанными авторами.

Пример 4. Создание в результате направленного мутагенеза сайтов BamHI в TIR Открытые фазы для считывания (ORF) были идентифицированы в результате анализа нуклеотидных последовательностей TIR. В частности, OFR 1 находится между нуклеотидами 416 и 1674, OFR 2 находится между нуклеотидами 2166 и 2671 и, наконец, ORF 3 находится между нуклеотидами 3606 и 4055 и кодируется на комплементарной цепи. Мы принимаем в качестве нуклеотида N 1 первый нуклеотид G сайта BamHI из TIR. Эти ORF ограничивают две больших некодирующих внутригенных последовательности, называемых область ₁, между ORF 1 и ORF 2, с одной стороны, и область ₂, между ORF 2 и ORF 3, с другой стороны. Именно эти две внутригенные области выбираются в качестве областей для включения.

Единичный сайт клонирования был введен в результате направленного мутагенеза (оборудование для мутагенеза фирмы БиоРад) в области ₁ и ₂. Сайт BamHI был выбран в качестве сайта клонирования, потому что он совместим с другими сайтами рестрикции, в том числе Bg11 и Bg12. Положение сайта клонирования выбиралось примерно в середине каждой внутригенной области, чтобы избежать всякого риска отделить сигналы транскрипции от их соответствующих генов, т.е.: - в области ₁ : сайт B1 представляет собой последовательность 5' GATC 3' на нуклеотиде 1842, трансформированную в BamHI GGATCC путем включения G в 5' и C в 3'; - в области ₂ : сайт B2 представляет собой последовательность 5' GGATT 3' на нуклеотиде 3062, трансформированную в BamHI путем мутации второго T в CC.

Два сайта BamHI находятся в плазмиде, которая несет фрагмент TIR-L (пример 3). Один сайт происходит из вектора pUC18. Второй сайт происходит из TIR и находится на 71 нуклеотид ниже сайта EcoRI, выбранного для клонирования (Campbell et al., 1989, фиг. 2). Эти два сайта BamHI были подвергнуты делеции из плазмиды, несущей TIR-L, путем рестрикции BamHI с последующим заполнением на полимеразе Klenow и связыванием. Плазмида, которая при этом получается, представляет собой pTIRI.