Днк-фрагмент, кодирующий нейротропный фактор мозга (bdnf), белок bdnf и способ его получения

Днк-фрагмент, кодирующий нейротропный фактор мозга (bdnf), белок bdnf и способ его получения

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии. Получен белок BDNF с нейротропной активностью путем культивирования клеток млекопитающих, в частности Cos-клеток, трансформированных вектором экспрессии PCMYI-PBDNF, вектор содержит фрагмент ДНК, кодирующий указанный белок. Определена нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК человека, крысы, свиньи и цыпленка. Белок BDNF имеет молекулярную массу 12 кД, изоэлектрическую точку 9,9 и способен поддерживать выживание нейронов ганглиев орального корня, допаминергических и холинергических нейронов центральной нервной системы и ингибировать дифференциацию астроглиальных клеток. Белок BDNF может быть использован для диагностики и лечения различных неврологических нарушений. 3 с. и 3 з.п. ф-лы, 10 табл., 37 ил.

1. Введение.

Изобретение касается нуклеиновых последовательностей, кодирующих мозговой нейротропный фактор (BDNF), в основном чистого протеина, пептидных фрагментов или производных, полученных от него в больших количествах, а также к антителам, направленным против BDNF-протеина, пептидных фрагментов или производных. Дополнительно изобретение касается генов, которые являются членами вновь определенного генного семейства BDNF/NGF, и продуктов этих генов. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим эффективные количества BDNF генных продуктов или альтернативно антителам, направленным против BDNF генных продуктов, и к способам диагностики и лечения множества неврологических заболеваний и расстройств, включая болезнь Альцхаймера и болезнь Паркинсона, а также, в частности, BDNF генные продукты по изобретению ценны в диагностике и терапии расстройств допаминергических нейронов, таких как болезнь Паркинсона, а также нарушений сенсорных нейронов и дегенеративных заболеваний сетчатки.

2. Предпосылки изобретения.

2.1 Гибель нейронных клеток и роль нейротропных факторов в развитии нервной системы.

В начальный период развития во многих частях нервной системы позвоночных присутствует гораздо больше нейронов, чем обнаруживают у взрослых животных. Периоды раннего развития характеризуются волнами естественно происходящей гибели нейронных клеток (Carr и Simpson, 1978, J. Comp. Neurol., 182: 727 - 740; Cohan и др., 1984, Science 225: 1258 - 1265). Выживание, дифференциация и созревание развивающихся нейронов может регулироваться скорее факторами окружающей среды или "эпигенетическими" факторами, чем строгой наследственной генетической программой. Например, экспериментальные манипулирования куриными эмбрионами показали, что трансплантация или экстирпация периферийных "мишенных полей", таких как зачаток конечности или глаз, на ранних стадиях развития цыпленка могут привести к соответствующему увеличению или снижению соответственно количества сенсорных, симпатических или двигательных нейронов, смежных увеличенному или уменьшенному мишенному полю (Hamburger, 1934, J. Exp. Zool 68, 449; Hollyday и Hamburger, 1976, J. Comp. Neurol 170: 311 - 321; Landmesser и Pilar, 1976, J. Cell Biol., 68: 357 - 374). Мишенное поле может поддерживать только ограниченное количество нейронов, и нормальной частью процесса развития может быть отбор лишнего количества нейронов, чтобы приспособить к нему "нейтротропную" мощность мишенной ткани. Открытие и выделение протеина, названного теперь фактором нервного роста (NGF), привело к молекулярной гипотезе о том, как мишень может быть способна к регулированию количества нейронов, которые выживают и иннервируют эту ткань (Levi-Montalcini и др. , 1968, Physiol. Rev., 48: 524 - 569; Thoenen и Barde, 1980, Physiol. Rev., 60: 1284 - 1335).

Теперь хорошо установлено, по меньшей мере в периферийной нервной системе, что нейронные мишенные ткани синтезируют и освобождают ограниченные количества различных нейротропных молекул, которые являются критическими для выживания специфических типов нейронов (Korsching и Thoenen, 1983, Proc. Nath. Acad. Sci, США, 80: 3513 - 3516; Neumann и др., 1984, EMBO, 3: 3183 - 3189; Shelton и Reichardt, 1984, Proc. Nath. Acad. Sci, США, 81: 7051 - 7955; Korsching и Thoenen, 1985, Neurosci, Lett. 54: 201 - 205).

2.2 Фактор нервного роста.

Фактор нервного роста является пока наиболее полно охарактеризованным из этих нейротропных молекул, и как "ин витро", так и "ин виво" было показано, что он необходим для выживания симпатических и происходящих от неврального гребня сенсорных нейронов на стадии раннего развития как цыплят, так и крыс (Levi-Montalcini и Angeletti, 1963, Develop. Biol. 7: 653 - 659; Levi-Montalcini и др., 1968, Physiol. Rev. 48: 524 - 569). Инъекции очищенного NGF в развивающиеся куриные эмбрионы обнаружили, что NGF вызывает массивную гиперплазию и гипертрофию сенсорных нейронов спинного мозга и симпатических нейронов (Levi-Montalcini и Booker, 1960, Proc. Nath. Acad. Sci, США, 46: 373 - 384; Hamburger и др., 1981, J. Neurosci 1: 60 - 71). Наоборот, удаление или разрушение эндогенного NGF путем ежедневных инъекций антиNGF-антител неонатальным крысам было связано в итоге с деструкцией симпатической нервной системы (Levi-Montalcini и Booker, 1960, Proc.Nath.Acad.Sci. США, 46: 384-391; Levi-Montalcini и Angeletti, 1966, Pharmacol.Rev. 18: 619-628). Применение NGF антител даже наиболее ранней стадии развития либо путем внутриматочных инъекций антител или путем пассивного трансплацентарного переноса материнских антител привело к существенной потере происходящих от неврального гребня сенсорных нейронов, таких как спинальные и дорсомедиальные тройничные сенсорные нейроны (Goedert и др., 1984, Proc.Natl. Acad. Sci. США 81: 1580-1584; Gorin и Johnson, 1979, Proc.Nath.Acad.Sci. США, 76: 5382-5386). До недавнего времени почти все исследования NGF фокусировались на его роли в периферийной нервной системе, но теперь очевидно, что NGF также влияет на развитие и поддержание специфических популяций нейронов в центральной нервной системе (Thoenen и др., 1987, Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol. 109: 145 - 178; Whittmore и Senger, 1987, Brain Res. Rev. 12: 439 - 464).

Удачное открытие больших количеств протеина NGF в подчелюстной железе взрослого самца мыши (Cohen, 1960, Proc.Nath.Acad.Sci. США 46: 302 - 311) и еще более раннее открытие высоких уровней NGF в змеином яде (Cohen и Levi-Montalcini, 1956, Proc. Nath.Acad.Sci. США 42: 571 - 574) дало достаточные количества NGF для проведения исследований, касающихся физиологии, химии белков и позднее молекулярной биологии NGF (т.е. для молекулярного клонирования NGF и его рецептора). Функция больших количеств NGF в подчелюстной железе взрослого самца крысы остается неясной; однако понятно, что такой богатый источник NGF не может играть какую-либо роль в развитии и поддержании периферийной или центральной нервной системы. В мишенных тканях, иннервированных чувствительными к NGF нейронами (это нейроны, для которых было установлено, что они зависят от NGF для их выживания, для обладания высокой аффинности NGF-рецепторами для интернализации и ретроградной транспортировки NGF с высокой специфичностью), устойчивое состояние измеримых уровней NGF было крайне низким, в районе пикограммов или нанограммов на грамм тканей, по сравнению с тысячекратно более высокими уровнями в ткани подчелюстной слюнной железы взрослого самца крысы. NGF не был обнаружен на каком-либо ощутимом уровне в сыворотке крови и поэтому, очевидно, не является циркулирующим фактором роста или гормоном (Suda и др., 1978, Proc.Nath.Acad.Sci. США 75: 4042 - 4046).

В дополнение к важному открытию основного источника NGF-протеина в мышиной подчелюстной железе развитие чувствительных, надежных и эффективных биологических экспериментов сыграло основную роль в объяснении биологии и биохимии NGF. Ганглии дорсального корня (DRG) развивающегося куриного эмбриона были одними из самых первых нейронных типов, у которых была обнаружена способность реагировать на NGF "ин витро". Культуры эксплантантов E8 - E12 DRG цыпленка в сгустке плазмы и, позднее, обогащенные нейронами культуры DRG цыпленка оказались очень полезными в биоэкспериментах на NGF-активность (например, во время его очистки) и для исследований "ин витро" биологии NGF (Levi-Montalcini и др., 1954, Cancer Res. 4: 49 - 57; Levi-Montalcini и Angeletti, 1963, Develop-Biol 1: 653 - 659; Greene, 1977, Develop.Biol. 58: 96, там же, 58: 106). Тот факт, что путем диссекции может быть получено более 40 DRG из единственного куриного эмбриона привел к широкому распространению использования NGF-биоэкспериментов во многих лабораториях.

В дополнение к доступности больших количеств NGF-протеина и эффективным системам опытов на NGF третьим основным фактором, который сделал важный вклад в наше понимание биологии NGF, является относительная легкость, с которой антитела к NGF могут быть получены от гвинейских свиней, кроликов, овец и т. д.; представляется, что мышиный NGF является высокоиммуногенным. Cohen (1960, Proc.Nath. Acad.Sci. США 46: 302 - 311) получал антитела к NGF, выделявшимся им из подчелюстной железы мыши, и показал вместе с Леви-Монтальчини и Букером (1960, Proc.Nath.Acad.Sci. США, 46: 384 - 391), что эти антитела вызывают деструкцию симпатических ганглиев или "иммуносимпатектомию" при ежедневном введении их новорожденным крысам (Levi-Montalcini и Angeletti, 1966, Pharmacol.Rev. 18: 619 - 628).

Обилие NGF-протеина позволяет определить первичную последовательность сравнительно традиционной белковой химией (Angeletti и Bradshaw, 1971, Proc. Nath.Acad.Sci. США, 68: 2417 - 2420). Ген NGF был клонирован от многих видов животных, включая мышь (Scott и др., 1983, Nature, 302 538 - 540), человека (Ullrich и др., 1983, Nature 303-821-825), корову и цыпленка (Meier и др., 1986, EMBO 5: 1489 - 1493) и крысу (Whittmore и др., 1988, J. Neurosci.Res. 20-402-410) с использованием в основном традиционной молекулярной биологии, основанной на доступности белковой последовательности мышиного NGF для создания подходящих олигонуклеотидных зондов. Доступность NGF также значительно облегчила исследования NGF рецептора, что в конечном счете привело к молекулярному клонированию NGF рецепторов человека и крысы (Johnson и др., 1986, Cell, 47, 545-554; Radeke и др., 1987, Nature 325: 593-597).

Теперь хорошо известно, что NGF не является везде присутствующим нейротропным фактором. В периферийной нервной системе NGF, вероятно, не является фактором выживания парасимпатических нейронов, происходящих от невральной плакоды сенсорных нейронов или кишечных нейронов, как определено в исследованиях "ин витро" и "ин виво". Более того, NGF, вероятно, не является фактором выживания для развивающихся двигательных нейронов (Oppenheim, 1982, J. Comp. Nunol 210: 174 - 189), хотя эти нейроны экспрессируют по меньшей мере слабоаффинную форму NGF-рецептора во время своего развития (Raivich и др., 1985, EMBO, 4: 637 - 644). Отсутствие действия NGF на эти типы нейронов побудило к поиску других нейротропных факторов, особенно факторов, которые бы поддерживали выживание двигательных нейронов спинного мозга и/или парасимпатических нейронов силиарного ганглия.

2.3. Другие нейротропные факторы.

В последние десятилетия были многочисленные сообщения о нейротропной активности в экстрактах самых разных тканей и в кондиционированной культурирующей среде многих различных клеточных типов. Почти во всех случаях, однако, прогресс в очистке и характеризирования этих активностей был затруднен тем, что такие активности присутствуют в крайне малых количествах, в пределах от пико- до нанограммов на грамм ткани.

Кроме того, в то время как адекватные биоэксперименты были поставлены для периферийных нейронов, создание надежных, повторимых и специфичных экспериментов для нейронов центральной нервной системы оказалось проблематичным. Тогда как отдельные типы периферийных нейронов обнаруживаются как дискретные, легко подвергающиеся диссекции ганглии, нейроны центральной нервной системы являются неизменно высокогетерогенными в их распределении. Так, для идентификации или обогащения отдельных классов ЦНС-нейронов требуются специфичные маркеры. Прогресс в получении таких маркеров, например антител, направленных против клеточной поверхности, или цитоскелетных компонентов, или специфичных гистологических красок, был очень ограничен. Соответственно оказалось крайне трудным процессом характеризование нейтропных факторов, которые: (I) не так обильны, как NGF, (II) трудны для проведения эксперимента и (III) не имеются в достаточных количествах для получения антител.

2.3.1. Сравнение мозгового нейтропного фактора (BDNF) и фактора нервного роста.

Нейротропная активность, способная поддерживать выживание нейронов ганглия дорсального корня куриного эмбриона "ин витро" была идентифицирована в "кондиционированной среде", в которой культурировали крысиные C-6 глиомные клетки (Barde и др., 1978, Nature 274: 818). Эта активность была нейтрализована антителами к мышиному NGF, предполагая присутствие другого нейротропного фактора в кондиционированной среде. О сходных активностях, которые не могли быть блокированы NGF-антителами, сообщалось впоследствии в культурах нормальных астроглиальных клеток головного мозга взрослой крысы (Lindsay 1979, Nature 282: 80-82 Lindsay и др., 1982, Brain Res 243:329-343) и в экстрактах головного мозга развивающейся и взрослой крысы (Bardl и др., 1980, Proc. Nath. Acad. Sci. США 77: 1199-1203) и спинном мозге развивающегося и зрелого цыпленка (Lindsay и Peters 1984, Neurosci 12: 45-51). Однако ни в одном из случаев не были изолированы или идентифицированы активные факторы, и остается не ясным, относятся наблюдающиеся активности к одному и тому же или к нескольким факторам.

Использовав свиной мозг в качестве исходного материала, Barde и др. (1982, ЕМВО, 1: 549-553) сообщил о факторе, названном теперь мозговым нейротропным фактором (BDNF), который способствовал выживанию нейтронов ганглия дорсального корня от E10/E11 куриных эмбрионов. Было обнаружено, что нейротропная активность располагается в высокощелочном белке (с изоэлектрической точкой p1 более 10.1), который мигрировал при электрофорезе на геле с додецил-сульфатом натрия (SDS) в виде единственной полосы молекулярного веса 12,3 кД. Очищенный фактор оценивался 1,4 10⁶, но выход был очень мал, всего лишь приблизительно 1 мкг BDNF, очищенного из 1,5 кг свиного мозга. Кроме того, поскольку последней стадией процесса очистки был гелевый электрофорез, активность BDNF не могла быть полностью вторично ренатурирована из-за присутствия остаточного SDS (Barde и Thoenen, 1985, в "Hormones and Cell Regulation", том 9, изд. Дюмон и др., Элсвир саенс паблишерз, стр. 385-390). Было отмечено, что высокощелочная природа и молекулярный размер BDNF были очень сходными со свойствами мономера NGF. Однако BDNF показал свойства, которые отличаются от известных свойств NGF в том, что (а) в биоэксперименте на ганглии дорсального корня цыпленка антитела к NGF не дали видимого эффекта воздействия на биологическую активность BDNF, (б) действия BDNF и NGF оказались дополняющими и (в) в отличие от NGF было обнаружено, что BDNF не оказывает влияния на выживание симпатических нейронов E12 куриного эмбриона. В дополнение во время ранних исследований мозгового экстракта наблюдалось, что нейротропная активность в этих источниках действует на сенсорные нейроны на более поздних стадиях развития, чем активность, связанная с NGF. С использованием диссоциированных культур нейронов куриного эмбриона, культурированных на поликатионном субстрате, таком как полилизин или полиорнитин, было обнаружено, что BDNF поддерживает выживание более чем 30% E10-E11 (десятого или одиннадцатого дня эмбрионального развития) нейронов ганглия дорсального корня, но слабо действует на выживание тех же нейронов при E6 (Barde и др. , 1980, Proc. Nath. Acad. Sci. США, 77: 1199-1203, выше). При сходных условиях сообщалось, что NGF поддерживает выживание 30-40 процентов E6 DRG-нейронов. Любопытно, что позднее было обнаружено, что при культурировании на субстрате, покрытом внеклеточным матричным гликопротеином ламинином, как NGF так и BDNF поддерживали выживание примерно 50% DRG-нейронов от куриных эмбрионов возраста E6 - E12 (Lindsay и др., 1985, Develop. Biol. 112: 319-328). В более позднем исследовании было обнаружено, что действия NGF и BDNF являются дополняющими, когда оба присутствуют в насыщающих концентрациях.

Ранние исследования Леви-Монтальчини (1966, Harvey Lectures 60: 217-259) нейронной специфичности NGF позволяли предположить, что NGF не является вездесущим нейротропным фактором даже для сенсорных нейронов, поскольку NGF не оказал действия на нейроны определенных черепных сенсорных ганглиев цыпленка, особенно на нодозный ганглий десятого черепного нерва. Позднее "ин виво" исследования (Johnson и др., 1980, Science 210: 916-918; Pearson и др. , 1983, Develop. Biol. 96: 32-36) показали, лишение NGF во время эмбриогенеза не оказало влияния на выживание нейронов в большинстве черепных сенсорных ганглиев крыс, тогда как подобная обработка сильно уменьшила число нейронов в сенсорных ганглиях, происходящих от нервного гребня. Более детальные исследования "ин витро" (Lindsay и Bhrer, 1985, Develop Biol 112: 30-48; Davies и Lindsay, 1985, Develop. Biol. III: 62-72, Lindsay и др., 1985, J. Cell Sci. Suppl 115-129) ясно указывали, что NGF поддерживает выживание большинства неврального гребня сенсорных нейронов, но не оказывает видимого влияния на выживание черепных сенсорных нейронов, происходящих от невральных плакод.

Первым свидетельством нейронной специфичности BDNF, отличающейся от активности NGF, была демонстрация "ин витро" того, что очищенный BDNF поддерживает выживание 40-50% сенсорных нейронов, диссоциированных из происходящего от невральной плакоды нодозного ганглия куриного эмбриона возраста E6, E9 или E12 (Lindsay и др., 1982, J. Cell. Sci. Suppl 3: 115-129). NGF не оказал при этом видимого действия на эти нейроны как сам, так и в сочетании с BDNF. Позднее было показано в исследованиях культур эксплантантов, что BDNF поддерживает выживание и отрастание нейритов от сенсорных ганглиев, происходящих от невральных плакод, включая височный, коленчатый и вентролатеральный тройничный ганглии (Davies и др., 1986, J. Neurosci. 6: 1897-1904), ни в одном из которых не была обнаружена чувствительность к NGF. Во всех вышеуказанных исследованиях антитела к NGF не дали эффекта на наблюдаемой активности BDNF. В дополнение к этим эффектам на культурированных нейронах из периферийных ганглиев было обнаружено, что BDNF стимулирует выживание и нейронную дифференциацию клеток, культурированных из неврального гребня перепелки (Kolcheim и Gcandreau, 1988, Develop. Brain Res. 41: 79-86).

До настоящего изобретения невозможность получить достаточное количество BDNF для иммунизации препятствовала производству антиBDNF-антител для сравнения с антителами против NGF по их действию на нейронные популяции и не позволяла осуществить BDNF/NGF эксперименты по их перекрестной нейтрализации. Два недавних исследования BDNF (Kalcheim и др., 1987, ЕМВО 6: 2873; Hofer и Barde, 1988, Nature 331: 261-262) показали, однако, физиологическую роль BDNF в развитии птичьей периферийной нервной системы. Если в яйце между E3/E4 DRG и их ЦНС мишенью в невральной трубке было установлено механическое препятствие, то наблюдалась гибель многих DRG-нейронов (Kalcheim и Le Douarin, 1986, Develop. Biol. 116: 451-466). Было постулировано, что эта нейронная гибель может происходить вследствие лишения ЦНС-(невральной трубки)-нейтропного фактора. Впоследствии наблюдали, что BDNF, прикрепленный к покрытой ламинином сиаластиковой мембране, смог предотвратить эту клеточную гибель (Kalcheim и др., 1987, ЕМВО 6: 2871). Было обнаружено, что инъекции в развивающиеся яйца перепелки снизили естественно происходящую клеточную гибель в нодозных ганглиях, эффект, который не наблюдался с NGF (Hofer и Barde 1988, Nature 331: 261-262). В дополнение к этому эффекту на периферийных сенсорных нейронах происхождения как от неврального гребня, так и от невральных плакод было обнаружено, что BDNF поддерживает выживание развивающихся ЦНС-нейронов. Джонсон и др. (1986, J. Neurosci 6: 3031-3938) представил данные, которые указывают, что BDNF поддерживает выживание клеток ганглиев сетчатки, культурированных из крысиных эмбрионов E17. Это согласуется с предыдущими исследованиями, которые показали, что кондиционированные среды и мозговые экстракты, приготовленные из мишенных областей клеток ганглиев сетчатки, поддерживают выживание этих нейронов (McCaffery и др., 1982, Ex Brain Res. 48: 37-386; Sarthy и др., 1983, J. Neurosci 3: 2532-2544; Turner и др., 1983, Dev. Brain Res. 6: 77-83).

В дополнение к этому действию на выживание развивающихся нейронов в культуре было показано, что BDNF действует на культурированные взрослые нейроны периферийной и центральной нервной системы. BDNF как и NGF стимулировал регенерацию аксонов от DRG-нейронов взрослой крысы в культуре (Lindsay, 1988, J. Neurosci 8: 2394-2405), хотя взрослые сенсорные нейроны не требовали нейротропных факторов для своего поддержания "ин витро" в течение более 3 или 4 недель. Кроме того, в культурах сетчатки взрослой крысы, наблюдалось, что BDNF способствует выживанию и аксонному удлинению от ганглиевых клеток сетчатки (Thonos и др., 19 Eur. J. Neurosci 1: 19-26). Сравнение биологического действия NDF и BDNF представлено в табл. I.

2.3.2. Нейронные мишени мозгового нейротропного фактора.

Было обнаружено, что сенсорные нейроны периферийных нервных ганглиев происходят от двух отличных временных эмбриологических образований, а именно от неврального гребня и невральных плакод. Невральный гребень дает начало нейронам и сателлитным клеткам автономных ганглиев и сенсорным ганглиям спинного мозга, т. е. DRG. Вклад неврального гребня и невральных плакод в образование сенсорных ганглиев черепных нервов изучался с использованием перепелка (цыпленок химерной трансплантационной системы согласно Le Douarin, 1973, Develop. Biol 20:217 - 222; Noden, 1987, Develop. Biol 67: 313 - 329; Narayanan и Narayanan, 1980, Anat. Rec. 196: 71 - 82; Ayer - Le Lievre и Le Douarin, 1982, Develop. Biol 94: 291 - 310; D'Amico - Maratel и Noden, 1983, Am J. Anat. 166: 445 - 468). Как указано в обзоре Линдсея и др. (1985, J.Cell. Sci. Supp. 3: 115 - 129), теперь полагают, по меньшей мере в отношении птиц, что нейроны дистальных ганглиев восьмого и десятого черепных нервов (коленчатый, височный и нодозный ганглии соответственно) и нейроны вестибулоакустического комплекса восьмого черепного нерва происходят исключительно от невральных плакод. Тройничный ганглий пятого черепного нерва содержит нейроны как гребневого, так и плакодного происхождения (с нейронами плакодного происхождения, преобладающими в вентролатеральном полюсе максилло-мандибулярной доли), тогда как сателлитные клетки всех черепных ганглиев имеют полностью гребневое происхождение.

Из экспериментов "ин витро" с использованием как эксплантанта, так и диссоциированных обогащенных нейронами культур сенсорных нейронов нервов спинного мозга и черепных нервов было обнаружено, что сенсорные нейроны, происходящие от неврального гребня, реагируют на NGF, напротив нейроны плакодного происхождения (включая нейроны вентролатеральной части тройничного ганглия и всю нейронную популяцию вестибулярного, коленчатого, височного и нодозного ганглиев) в основном были нечувствительны к NGF во время эмбрионального развития. Несмотря на их различия в потребности и чувствительности к NGF как плакодные, так и гребневые сенсорные нейроны, как было обнаружено, реагируют (табл. I) на способствующую выживанию и отрастанию нейритов активность BDNF (Lindsay и др., 1985, J.Cell. Sci Supp. 3:115 - 129; Lindsay и др. , 1985, Develop Biol 112: 319-328; Kalcheim и Geandreau, 1988, Develop. Brain Res. 41: 79-86) Тебар и Бард (Tebar и Barde, 1988, J.Neurosci 8: 3337-3342) исследовали связывающие параметры радиоактивного меченного BDNF к нейронам ганглия дорсального корня куриного эмбриона; эти результаты согласуются с существованием двух классов BDNF рецепторов, одного - с высокой аффинностью к BDNF и другого - низкой аффинностью. На симпатических нейронах не наблюдалось рецепторов с высокой аффинностью.

Известные нейронные мишени BDNF далее рассматривались в обзоре Берда и др. (1987, Prog. Brain Res. 71: 185-189). До настоящего изобретения, идентификация клеток, синтезирующих BDNF, была невозможна вследствие отсутствия нуклеиновокислотных или антительных зондов, специфичных для BDNF. Попытки приготовить поли- или моноклональные антитела к BDNF были безуспешными. Эта неудача в получении антител воспрепятствовала молекулярному клонированию BDNF детерминированию физиологического действия, создаваемого лишением развивающихся нейронов BDNF "ин виво", коническому определению BDNF в такнях с использованием иммуноопытов и локализации BDNF с использованием иммуноцитохимии.

Список реагирующих и нереагирующих на BDNF нейронов (Barde и др., 1987, Prog. Brain Res. 71: 185-189).

A. Реагирующие нейроны.

I. Сенсорные нейроны цыпленка происхождения от неврального гребня в: а) ганглии дорсального корня, б) шейном ганглии, в) дорсомедиальном тройничном ганглии, г) мезенцефальном тройничном нуклеусе (Dav'us и др., 1986, Nature 319: 497-499).

II. Сенсорные нейроны цыпленка происхождения от эктодермальной плакоды в: а) нодозном ганглии, б) вестибулярном ганглии, в) височном ганглии, г) коленчатом ганглии, д) вентролатеральном тройничном ганглии.

III. Клетки ганглия сетчатки крысы.

B. Нереагирующие нейроны.

I. Симпатические нейроны крысы и цыпленка.

II. Парасимпатические цилиарные нейроны цыпленка.

3. Краткое содержание изобретения.

Настоящее изобретение касается нуклеиновокислотных последовательностей, кодирующих мозговой нейротропный фактор (BDNF) в основном чистого протеина, а также пептидных фрагментов или производных, производимых от него в большом количестве, и антител, направленных против протеина BDNF, пептидных фрагментов или производных. Настоящее изобретение обеспечивает впервые достаточные количества BDNF, позволяющие осуществить производство антиBDNF-антител и поддержать диагностическое и терапевтическое применение BDNF.

В различных выполнениях изобретения BDNF нуклеиновые кислоты, протеины, пептиды, производные или антитела по изобретению могут быть использованы в методах для диагностики и лечения разнообразных неврологических заболеваний и расстройств и, в частности, в диагностике и лечении нарушений, связанных с сенсорными нейронами, а также дегенерации сетчатки. Кроме того, в специфических выполнениях изобретения нуклеиновые кислоты BDNF и BDNF-генные продукты могут быть использованы для диагностики и лечения нейробластомной опухоли, болезни Паркинсона и болезни Альцхаймера. BDNF-генные продукты могут быть также использованы для того, чтобы облегчить инкорпорацию имплантантов в нервную ткань или альтернативно для способствования нервной регенерации после повреждений, вызванных травмой, инфарктом, инфекцией или хирургическим вмешательством (послеоперационно) в дополнительных специфических выполнениях изобретения.

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим эффективные количества BDNF-генных продуктов или альтернативно антител, направленных против BDNF-генных продуктов, которые могут быть использованы в диагностике или лечении различных неврологических болезней и расстройств.

Дополнительно, путем обеспечения полной нуклеотидной последовательности BDNF настоящее изобретение позволяет провести сравнение BDNF- и NGF-генов, при этом идентифицируя гомологичные области и определяя BDNF/NGF-генное семейство. Соответственно настоящее изобретение касается способа идентифицирования дополнительных членов BDNF/NGF-генного семейства. В специфическом выполнении этот способ по изобретению используется для идентифицирования нового, не-BDNF и не-NGF члена генного семейства BDNF/NGF. Изобретение далее обеспечивает получение дополнительных членов генного семейства BDNF/NGF, идентифицированных согласно раскрытому способу, и также их генные продукты.

3.1. Сокращения и их значение.

BDNF - мозговой нейротропный фактор.

hBDNF - человеческий BDNF.

САТ - холин-ацетилтрансфераза.

ЦНС - центральная нервная система.

DRG - ганглий (или ганглии) дорсального корня.

ЭДТК - этилен-диамин-тетрауксусная кислота.

NGF - фактор нервного роста.

PBS - буферированный фосфатом физиологический раствор.

PCS - реакция цепной полимеризации.

RNG - периферийная нервная система.

SDS -натрия додецил-сульфат.

Tris - три-/гидроксиметил/аминометан.

4. Описание чертежей.

Фиг. 1 - нуклеотидная последовательность и выведенная из нее аминоксилотная последовательность свиной prepro-BDNF кДНК. На этом чертеже показана полная последовательность двух перекрывающих кДНК клонов. Подчеркнуты пептидные последовательности, полученные при микросеквенировании (табл. II).

Фиг. 2 - сравнение последовательностей NGR и BDNF. Области с более чем двумя аминокислотами, обнаруживаемыми в идентичных положениях, отмечены. Эти последовательности начинаются с первых аминокислот зрелых протеинов и кончаются с последними аминокислотами перед стоп-кодонами. 51 аминокислота - общие для BDNF и различных NGF (Schwarz и др., 1989, J.Neurochem. 52: 1203-1209), включая шесть цистеиновых остатков.

Фиг. 3 - авторадиография саузерн-блоттинга EcoRI разреза геномной ДНК человека, обезьяны, крысы, мыши, собаки, коровы, кролика, цыпленка и дрожжей, гибридизированной к меченным 32 P NGF и BDNF-зондам.

Фиг. 4 - последовательность кДНК человеческого BDNF и выведенная из нее аминокислотная последовательность, и сравнение последовательностей ДНК свиньи, крысы и цыпленка.

Фиг.5 - BDNF-экспрессионная плазмида pCMVI-pBDNF.

Фиг.6: (A) - результаты ELI SA-детерминирования связывания антисывороток к B5 пептиду с использованием серийных разведений антисывороток; (B) - количественное определение связывания при разведении 1:500 различных антисывороток к 50 нг BDNF.

Фиг. 7 - результаты иммуногистохимического окрашивания на тирозингидроксилазу в BDNF-обработанной (прерывистые линии) и контроль (сплошные линии) культур вентрального среднего мозга.

Фиг.8 - потребление допамина культурами вентрального среднего мозга. Культуры с BDNF отмечены прерывистыми линиями, контрольные культуры показаны сплошными линиями.

Фиг.9: (A) - действие BDNF на несколько CAT положительных клеток в культурах холинергических нейронов переднего мозга; (B) - культуры холинергических нейронов переднего мозга при плотности 260,000 клеток (черная полоса) или 150,000 клеток на лунку (прерывистая полоса) обрабатывали 150 нг/мл NGF. Было сравнено количество CAT иммуноположительных клеток среди NGF-обработанных и необработанных клеток.

Фиг.10 - изменения количества CAT энзимной активности, в пикомолях субстрата, катализируемого за минуту, в виде функции концентрации BDNF в культурах холинергических нейронов переднего мозга.

Фиг. 11 - культуры астроглиальных клеток, примерно с 60%-ным слиянием, были обработаны: (A) - фактором эпидермального роста или (B) - BDNF в течение 42 часов, а затем инкубированы с [³H] метилтимидином. Количество присоединенного [³H] измеряли относительно концентраций EGF и BDNF (EGF - фактор эпидерм. роста).

Фиг. 12 - саузерн-блоттинг EcoRI-разрезанных BDNF/NGF цыпленка, мыши, крысы, гибридизированных к зонду RIB/20. Положения NGF и BDNF геномных EcoRI фрагментов указаны как N и B соответственно.

Фиг.13 - сравнение последовательностей BDNF и NGF с новым членом генного семейства BDNF/NGF, идентифицированным путем PCR-реакции из мышиной ДНК с праймерами Box 3/Box 4: новый ген (обозначенный здесь M3-4), а также известный как Нейротропин-3 (NT-3), показывающий последовательность только кодирующей нити, а также выведенная аминокислотная последовательность в сравнении со зрелым мышиным NGF и зрелым свиным, крысиным, мышиным или человеческим BDNF. Тире обозначают позиции, в которых использована делеция одного кодона в NGF для оптимизации сравнения относительно DBNF и M3/4. Подчеркнутое указывает на совместимости в аминокислотной последовательности и/или консервативные аминокислотные замещения.

Фиг. 14 - назерн-блоттинг РНК из различных клеточных линий из опухоли человека, гибридизированной к BDNF человека зонду.

Фиг. 15 - эффект деполяризации уровней BDNF-мРНК на нейроны аммонова рога. (A) - экспрессия BDNF мРНК по времени в первичных культурах нейронов аммонова рога в присутствии 50 мМ KCl. Общую клеточную РНК экстрагировали из 0,5 10⁶ клеток, гликозилировали и анализировали посредством электрофореза на 1,3% агарозном геле (Biziere, K. Coyle, T. Neurosei., 1978, Lett, 8:303; McGeer и др. , 1978, Brain Res., 139:381). РНК, перенесенную на фильтры Hybond N, гидридизировали 32P-меченым кРНК зондом (специфическая активность, 10⁹ срм/мг), специфичным для мышиного BDNF и полученным сбегающей транскрипцией "ин витро". Две верхние полосы соответствуют (4 и 1,5 кВ) BDNF-мРНК; две полосы для BDNF (4 кб и 1,5 кб) являются рибонуклеазо-A-резистентными и представляют два различных транскрипта, которые, однако, регулируются одинаковым образом, а нижняя полоса (700 бр) соответствует 10 пикограммам стандартного выхода короткой BDNF-мРНК, который был добавлен к образцам перед экстракцией РНК.

(B) - кальциевая зависимость. Нейроны инкубировали в течение 3 часов в нормальной культурирующей среде (СМ), в модифицированной среде без кальция (-Ca) или в среде с 10 м нифедипина (NIF). Где указано (+K), там добавляли 50 мМ KCl.

Фиг.16 - повышение уровней NSF-мРНК у нейронов аммонова рога посредством калия и каиновой кислоты. Нейроны инкубировали в течение 3 ч в контрольной среде (C) или в присутствии 50 мМ RCl (+K) или 25 мМ каиновой кислоты (KA). РНК экстрагировали и определяли уровни NGF-мРНК количественной PCR-реакцией (II). Оценки даны: среднее .

Фиг.17 - кривая реакции на дозу, показывающая действие каиновой кислоты. Нейроны аммонова рога инкубировали в течение 3 часов в присутствии различных концентраций каиновой кислоты. РНК экстрагировали и анализировали, как описано на фиг.16. Оценки представляют среднее SEM трех экспериментов.

Фиг. 18 - временная зависимость повышения уровней BDNF- и NGF-мРНК вследствие обработки каиновой кислотой. Общую клеточную РНК экстрагировали и анализировали, как указано на фиг.16, из аммонова рога (A) или кортекса (B) в указанное время (в часах) после внутрибрюшинной инъекции каиновой кислоты (12 мг/кг). Одну разовую дозу диацепама (10 мг/кг) вводили инъекцией через 90 мин после каиновой кислоты (две полосы для BDNF (4 кб и 165 кб) являются рибонуклеазо-A-резистентными и представляют два различных транскрипта, которые, однако, регулируются схожим образом). Показаны значения, соответствующие 1,5 кб BDNF-мРНК (кружок) и 1,3 кб NGF-мРНК (закрашенный кружок). Похожие повышения уровней наблюдались для 4 кб BDNF-мРНК. Данные на фиг. значения представляют среднее SEM от 3-4 экспериментов.

Фиг. 19. Действие антиконвульсантов на вызванную каиновой кислотой экспрессию BDNF-мРНК. Крыс инъецировали внутрибрюшинно диацепамом (10 мг/кг) (DZ); MK-801 (1 мг/кг) (MK) или кетамином (20 мг/кг) (KET) за 15 мин до инъекции каиновой кислоты (12 мг/кг) (+KA) или физиологического раствора (контроль). Тремя часами позже ткань аммонова рога использовали для приготовления общей РНК, как указано на фиг.16. Значения представляют среднее SEM трех экспериментов.

Фиг.20 - перегородочные клеточные культуры.

(A) - фазово-контрастная микрография роста клеток в культуре в зависимости от времени. Клетки помещали на чашку с плотностью 1,3 10⁵ клеток на см² и поддерживали в 5 HS/NS, как описано в тексте. Указанные моменты времени - A, B - 1 день, C, D - 2 дня и E, F - 4 дня.

Специфичные для клеточного типа маркеры использовали для идентификации популяций клеток, ACL E гистохимически окрашенных нейронов (C, H) и NGF рецептор иммуноположительных нейронов (1). Масштаб шкалы = 25 мм.

Фиг. 21 - cравнение реакции диссоциированных перегородочных клеток на обработку BDNF и NGF на основе AchE клеточного количества.

(A) - cравнение реакции на BDNF (25 нг/мл), NGF (50 нг/мл) или сочетание обоих лигандов при различной чашечной плотности.

(B) - cравнение реакции холинергических нейронов на разные концентрации BDNF и NGF (от 0 до 50 нг/мл). Клетки, на которых были получены эти результаты, выращивали в течение 11-12 дней в серосодержащей среде. Данные представляют среднее SEM от 6-9 определений.

Фиг. 22 - полосовой график изображает действие задержки добавления BDNF или NGF к диссоциированным перегородочным культурам, BDNF (50 нг/мл) и NGF (50 нг/мл) добавляли к диссоциированным клеточным культурам с задержкой 5-6 часов (+12), 5 дней (-5/+7) или 7 дней (-7/+5). Культуры поддерживали в течение 12 дней. Клетки подсчитывали на основе положительного гистохимического окрашивания. Результаты выражены в виде среднего SEM от 4-5 определений.

Фиг. 23 - полосовой график, изображающий способность BDNF или NGF регулировать количество NGF-рецепторных иммуноположительных клеток. Иммунное исследование для NGF-рецептора было проведено с использованием моноклонального антитела 192- IgG при разведении 121000. Диссоциированные перегородочные клетки помещали на чашку с плотностью 1,3 10⁵ на см² и непрерывно обрабатывали в течение 12 дней. Сравнение сделано между насыщающей дозой NGF и разными дозами BDNF (от 0 до 100 нг/мл). Изображенные результаты представляют среднее SEM при n = 4.

Фиг. 24 - кривая реакции на дозу перегородочных холинергических нейронов на дозу CAT вызывающих активностей BDNF (A) и NGF (B). Культуры помещали в чашки с покрытыми полиорнитином и ламинином 6 мм лунками и поддерживали в течение 12 дней в 5 HS/NS. Клетки подвергали воздействию BDNF или NGF через 5-6 часов после помещения на чашку. Факторы заменяли каждые 3 дня, ког