Способ идентификации продуктов из смеси, продукт, полученный при идентификации, способ получения смеси и способ совместного получения катализирующей нуклеиновой кислоты и продукта

Способ идентификации продуктов из смеси, продукт, полученный при идентификации, способ получения смеси и способ совместного получения катализирующей нуклеиновой кислоты и продукта

Реферат

 

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано при идентификации соединений. Получают смесь свободного реагента с нуклеиновыми кислотами. Каждая нуклеиновая кислота связана с первым реагентом. Осуществляют взаимодействие смеси со свободным реагентом. Разделяют продукты реакции по способности изменения свойств свободного реагента. Использование изобретения помогает идентифицировать нуклеиновые кислоты. 4 с. и 19 з.п. ф-лы, 1 табл., 22 ил.

Изобретение относится к способам получения продуктов из двух или более реагентов в реакции, предпочтительно к образованию связи между реагентами посредством нуклеиновой кислоты, имеющей способствующие свойства. Также включены в изобретение продукты, полученные способом. В особенности изобретение относится к способам для совместного выделения способствующей нуклеиновой кислоты и продукта, который образуется посредством вышеупомянутой способствующей нуклеиновой кислоты. Изобретение далее рассматривает способ для идентификации нуклеиновых кислот, имеющих способствующие свойства, и вышеупомянутые нуклеиновые кислоты.

Описание предшествующего уровня.

Способ для выделения in vitro молекул нуклеиновой кислоты с высокоспецифичным связыванием молекул мишени был разработан. Этот способ - Систематическое выделение лигандов экспоненциальным Обогащением, именуемый SELEX, был описан в заявке на патент Соединенных Штатов серийный N 07/536,428, где назывался Систематическое выделение лигандов экспоненциальным обогащением, в настоящее время отказная, в заявке на патент Соединенных Штатов серийный N 07/714,131, зарегистрированной 10 июня 1991, где назывался Лиганды нуклеиновой кислоты, в заявке на патент Соединенных Штатов серийный N 07/931,473, зарегистрированной 17 августа 1992, где назывался Лиганды нуклеиновой кислоты, сейчас в патенте Соединенных Штатов N 5,270,163 (см. также PCT/US91/04078), каждый из которых здесь специфически включен как ссылка. Каждая из этих заявок, совместно упоминаемых здесь как SELEX заявки на патент, описывает фундаментально новый метод для получения лиганда нуклеиновой кислоты к любой желаемой молекуле мишени.

Способ SELEX включает отбор из кандидатной смеси олигонуклеотидов и пошаговые итерации связывания, разделения и амплификации, используя одинаковую основную схему отбора, достигая фактически любого желаемого критерия аффинности связывания и селективности. Начиная со смеси нуклеиновых кислот, предпочтительно включающей сегменты случайно выбранной последовательности, SELEX-метод включает стадии взаимодействия смеси с мишенью при условиях, благоприятных для связывания, отделения несвязанных нуклеиновых кислот из тех нуклеиновых кислот, которые специфически связываются с молекулами мишени, диссоциации комплексов нуклеиновая кислота-мишень, амплификации нуклеиновых кислот, диссоциированных из комплексов нуклеиновая кислота-мишень для получения лиганд-обогащенной смеси нуклеиновых кислот, затем повторения стадий связывания, разделения, диссоциации и амплификации в течение стольких циклов, сколько желательно для получения высокоспецифичных, высокоаффинных лигандов нуклеиновой кислоты к целевой молекуле.

Настоящими изобретателями было указано, что SELEX-способ показывает, что нуклеиновые кислоты как химические соединения могут образовывать большое множество форм, размеров и конфигураций и обладают намного более широким репертуаром связывания и других функций, чем проявляемые ими в биологических системах.

В течение многих лет существовала догма, что нуклеиновые кислоты играют главным образом информационную роль. Посредством применения SELEX настоящими изобретателями было выяснено, что нуклеиновые кислоты имеют три пространственных структурных разновидности, не похожих на белковые. Таким образом, настоящие изобретатели показали, что SELEX или SELEX-подобные способы могут быть использованы для идентификации нуклеиновых кислот, которые могут способствовать любой выбранной реакции, в которой лиганды нуклеиновой кислоты могут быть идентифицированы для любой выбранной мишени. Теоретически внутри кандидатной смеси приблизительно от 10¹³ до 10¹⁸, настоящие изобретатели постулируют, что существует по крайней мере одна нуклеиновая кислота с подходящей формой, способствующая широкому ряду физических и химических взаимодействий.

Исследования на данный срок показали только несколько нуклеиновых кислот, которые имеют только узкое подмножество подходящих особенностей. Известно несколько кислот катализаторов (Cech, 1987. Science 236:1532-1539 и McCorcle и соавт., 1987. Concepts Biochem. 64:221-226). Эти встречающиеся в природе РНК ферменты (рибозимы) только, как было показано, действуют на олигонуклеотидные субстраты. Кроме того, эти молекулы показывают очень узкий диапазон химических возможностей, которые до сих пор в значительной степени представлены конденсацией/гидролизом фосфодиэфирной связи, за исключением участия РНК в биосинтезе белка. Несмотря на интенсивные недавние исследования идентификации РНК или ДНК катализаторов, показано мало успехов. Фосфодиэфирное расщепление, гидролиз аминосалициловых эфиров (Piccirilli и соавт. , 1992. Science 256: 1420-1424), лигирование олигонуклеотида с 3'ОН с 5'трифосфатным концом катализатора (Bartel и соавт. ,1993. Science 261: 1411-1418), расщепление амидной связи (Dai и соавт.,1995. Science 267:237-40), бифенильная изомеразная активность (Schultz и соавт.,1994. Science 264: 1924-1927) и полинуклеотидная киназная активность (Lorch и соавт., 1994. Nature 371: 31-36) были обнаружены. Illangasekare и соавт. (Science. 1995 267: 643-47) описали первые РНК молекулы, которые катализируют образование связи углерод-кислород. Нуклеиновые кислоты катализаторы, как известно, на данный момент имеют определенные недостатки, связанные с их эффективностями в реакциях образования/разрушения связи. Среди недостатков надо указать то, что они реагируют медленно по сравнению с белковыми ферментами, и, как описано выше, преобразуют в достаточно узком пределе химических возможностей.

Основной SELEX-способ был модифицирован для достижения ряда специфических целей. Например, заявка на патент Соединенных Штатов серийный N 07/960,093, зарегистрированная 14 октября 1992, называемая Способ для отбора нуклеиновых кислот на основе структуры, описывает использование SELEX в сочетании с гель-электрофорезом для отбора молекул нуклеиновых кислот со специфическими структурными характеристиками, таких как изогнутая ДНК. Заявка на патент Соединенных Штатов серийный N 08/123,935, зарегистрированная 17 сентября 1993, называемая Фотоселекция нуклеиновых кислот, описывает SELEX, основанный на способе отбора лигандов нуклеиновой кислоты, содержащих фотореакционные группы, способные к связыванию и/или фотосшиванию и/или фотоинактивации молекулы мишени. В соответствии с PCT/US 94/10562, зарегистрированной 19 сентября 1994, которая означает CIP заявку на патент Соединенных Штатов серийный N 08/123,935, специфически включенную как ссылка, обнаружено, что определенные последовательности нуклеиновых кислот, которые содержат 5-иодурациловые остатки, как было идентифицировано, которые ковалентно связываются с HIV-1 Rev белком. Заявка на патент Соединенных Штатов серийный N 08/134,028, зарегистрированная 7 октября 1993, называемая Высокоаффинные лиганды нуклеиновых кислот, которые различают теофиллин и кофеин, описывает способ идентификации высокоспецифичных лигандов нуклеиновых кислот, способных различать близко родственные молекулы, называемый обратный SELEX. Заявка на патент Соединенных Штатов серийный N 08/143,564, зарегистрированная 25 октября 1993, называемая Систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением: растворимый SELEX, описывает SELEX-основной способ, которым достигают высокоэффективного разделения между олигонуклеотидами, имеющими высокую и низкую аффинность к молекуле мишени. Заявка на патент Соединенных Штатов серийный N 08/400.440. зарегистрированная 8 марта 1995, называемая Систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением: химический SELEX, описывает способы для ковалентного связывания лиганда нуклеиновой кислоты с его мишенью.

SELEX-способ включает идентификацию высокоаффинных лигандов нуклеиновых кислот, содержащих модифицированные нуклеотиды, придающие улучшенные характеристики лиганду, такие как улучшенная стабильность in vivo или улучшенные характеристики подачи. Примеры таких модификаций включают химические замещения в рибозе и/или фосфате, и/или в основных положениях. SELEX-модифицированные лиганды нуклеиновых кислот, содержащие модифицированные нуклеотиды, описаны в заявке на патент Соединенных Штатов серийный N 08/l 17,991, зарегистрированной 8 сентября 1993, называемой Высокоаффинные лиганды нуклеиновых кислот, содержащие модифицированные нуклеотиды, которые описывают нуклеотиды, содержащие нуклеотидные производные, химически модифицированные по 5- и 2-положениям в пиримидинах. Заявка на патент Соединенных Штатов серийный N 08/134,028, supra, описывает высокоспецифичные лиганды нуклеиновых кислот, содержащих один или более нуклеотидов, модифицированный 2-амино(2-NH₂), 2-фторо (2-F) и/или 2-O-метил (2-ОМе). Заявка на патент Соединенных Штатов серийный N 08/264,029, зарегистрированная 22 июня 1994, называемая Новый метод получения 2- модифицированных пиримидинов внутримолекулярным нуклеофильным замещением, описывает олигонуклеотиды, содержащие различные 2- модифицированные пиримидины.

SELEX-метод включает комбинирование выбранных нуклеотидов с другими выбранными нуклеотидами и ненуклеотидными функциональными единицами, как описано в патенте США 5270163. Эта заявка раскрывает комбинирование широкого множества форм и других свойств, а также амплификацию и репликативные свойства олигонуклеотидов относительно других молекул.

Недавно было сделано несколько попыток по использованию комбинаторной химии в качестве пути для создания новых лекарств. Было изобретено несколько тщательно разработанных схем для получения комбинаторных библиотек, имеющих множество различных структур. Структуры, связанные с известными комбинаторными библиотеками, включают нуклеиновые кислоты, как описано предварительно для SELEX-способа, пептиды (Brenner и соавт., 1992. PNAS 89:5381-5383; Needles и соавт., 1993. PNAS 90:10700-10704: Alper, l994.Science 264:1399-1401; Longman, 1994. In Vivo 23-31, Fodor и соавт., 1991, Science 251:767-773), и много меньшее число направлено на маленькие органические молекулы (Ohlmeyer и соавт. , 1993. PNAS 90:10922-10926). Существуют определенные недостатки, связанные с каждым из известных комбинаторных библиотечных подходов.

Во-первых, некоторые схемы, используемые для получения пептида или маленькой молекулы комбинаторных библиотек, требуют точные записывающе-запоминающие системы для сохранения пути каждого химического метода, попадающего в любую точку в множестве/матрице. Более того, пептиды и маленькие органические молекулы неамплифицируемы и поэтому относительно большие количества каждого индивидуального продукта должны быть представлены в библиотеке для возможности тестирования и идентификации желаемых продуктов. Для того чтобы получить достаточно большие количества специфических продуктов, реакции, которые составляют множество, должны быть высокоэффективны. Более важно для этих подходов в работе - это невозможность иметь смесь продуктов и побочные в одном и том же месте в множестве. Различие вырабатывается полимерной комбинацией многократных шагов, каждый из которых составляет одну реакцию с предсказанным результатом. Однако степень полимерного комбинирования ограничена выходом и записывающе-сохраняющими ограничениями.

Другое ограничение для маленьких молекул в комбинаторных подходах заключается в том, что схемы главным образом исключают реакции образования связи, в которых получают новые стереоцентры асимметрическими реакциями. В асимметрических реакциях элиминирования эти подходы не обеспечивают химического разнообразия, что может быть вызвано одиночным шагом. Часто асимметрические реакции трудно контролировать, таким образом, если бы реакции, которые образуют новые хиральные центры, были включены в комбинаторную химию, вероятно, что смеси рацемических продуктов были бы получены. Смеси рацемических продуктов могут приводить к фоновым проблемам. Например, возможно, что идеальные атомы и группы введены для сборки, но хиральность продукта является решающей для желаемых свойств, и правильный энантиомер присутствует только как маленький процент от общего количества. В этом примере вполне вероятно, что правильный энантиомер не может быть получен в количестве, достаточном для идентификации. Далее невозможно точно предсказать хиральность каждой индивидуальной реакции, когда большое множество реагентов включено в асимметрическую трансформацию. Поэтому невероятно, что трудность, связанная с рацемическими смесями, может быть преодолена традиционными способами. Усилие и время, необходимые для включения асимметрического катализа в обычные комбинаторные библиотечные подходы, главным образом недоступны. Поэтому асимметрические реакции исключены для обхождения описанных проблем.

Однако асимметрические реакции включают один из наиболее энергетических типов реакций образования связи. Отсутствие асимметрических реакций в комбинаторных библиотечных подходах значительно ограничивает типы продуктов, которые могут быть получены, и широту библиотеки. Следующий пример иллюстрирует неограниченное разнообразие, даваемое асимметрическими реакциями. Общее число возможных продуктов, получаемое из матрицы реагентов, составляет M2ⁿ, где M= числу реагентов и n-число хиральных центров. Рассматриваем матрицу, включающую реакции образования связи, где образуется одна асимметрическая связь, число возможных продуктов увеличивается в 2 раза по сравнению с продуктом матрицы. Замечено, что для каждой образованной связи существует возможность получения двух хиральных центров, таким образом, для одного превращения число возможных комбинаций 4 или 2². Рассмотрим специфический пример асимметрической реакции, реакцию Дильса-Альдера, в которой две углерод-углеродные связи образуются, и существует возможность получения 4 хиральных центров.

В течение реакции Дильса-Альдера относительная стехиометрия двух концов диенофильного реагента связана с двумя концами диенового реагента, поэтому число возможностей уменьшается до 2³ для каждой диен/диенофил пары. Это означает, что для одного диенофила в комбинировании с 10 диенами число возможных молекул продукта, которые могут быть образованы, составляет 1102³= 80 (1 первичный реагент и 80 вторичных реагентов). Для достижения такого уровня разнообразия из традиционных подходов, используя только один формирующий связь шаг, потребуется прямой синтез 81 соединения. Для множества 10х10 реагентов стандартный комбинаторный подход дает 100 соединений. Расширение асимметрической реакции Дильса-Альдера множеством 10х10 реагентов дает возможность получить 800 новых соединений из начальных 20. Текущие комбинаторные стратегии не могут скринировать все возможные продукты асимметрических превращений, потому что главным образом невозможно получить каждый из желаемых продуктов. Как описано выше, удаление асимметрических реакций представляет серьезное ограничение стандартных комбинаторных библиотечных подходов.

В идеале комбинаторный библиотечный подход должен быть комплементарен SELEX-способу, где выход не имеет значения благодаря способности амплифицировать олигонуклеотидные продукты, и, кроме того, выход маленьких органических молекул, которые в основном орально активны и относительно недороги для производства. Настоящее изобретение сочетает производительность SELEX с новым подходом для получения большой, структурно разнообразной библиотеки продуктов. Подход, представленный в настоящем изобретении, покрывает многие несоответствия требованиям, связанные с другими комбинаторными библиотечными подходами и представляет революционную концепцию для будущего в открытии лекарств.

Краткое изложение сущности изобретения.

Настоящее изобретение представляет библиотеки продуктов, которые выделяют одновременно с соответствующим помощником нуклеиновой кислотой, требуемой для получения каждого члена библиотеки из одного или более химических реагентов. Более важно, что продукты, которые могут быть идентифицированы из библиотеки продуктов, имеют заранее определенные желательные характеристики. Этот способ, упоминаемый здесь как параллельный SELEX, означает SELEX-подобный способ, который используют для получения такой библиотеки продуктов и затем для идентификации продуктов с желательными характеристиками. Как и в SELEX способе, представлена огромная, разнообразная тестируемая смесь нуклеиновых кислот. Каждая нуклеиновая кислота связана с определенным химическим реагентом. Изобретение основано на предположении, что в довольно большой библиотеке нуклеиновых кислот можно идентифицировать нуклеиновые кислоты в тестируемой смеси нуклеиновых кислот посредством проведения химической реакции между химическим реагентом, присоединенным к нуклеиновой кислоте, и свободным химическим реагентом. Кроме того, среди подмножества нуклеиновых кислот, способных к проведению химической реакции, существует несколько высокоспецифичных для получения каждого или значительной доли всех возможных продуктов. Более того, библиотека продуктов может содержать по крайней мере несколько из всех возможных продуктов для данной реакции. Нуклеиновая кислота обеспечивает способствующую специфичность для продукта, и продукт в свою очередь обеспечивает специфичность для заранее определенного желаемого действия на мишень.

Параллельный SELEX облегчает многие недостатки предшествующих комбинаторных библиотечных подходов. В своей наиболее основной форме параллельный SELEX включает образование библиотеки продуктов взаимодействием двух или более реагентов, где один реагент, связанный с нуклеиновой кислотой, способен к образованию промежуточной связи, выбор продукта, имеющего заранее определенные желаемые характеристики, и идентификацию продукта, используя энергию способа SELEX для амплификации. Схематическое изображение способа, параллельного SELEX представлено на фиг. 1.

Изобретение представляет способ для идентификации желаемого продукта из библиотеки продуктов, где вышеупомянутый желаемый продукт выбран по его способности преобразовывать заранее выбранную функцию мишени, вышеупомянутый способ включает: получение тестируемой смеси нуклеиновая кислота-реагент, включающей нуклеиновые кислоты, которые имеют ряд случайных полученных последовательностей, и каждая связана с первым реагентом; реакция вышеупомянутой тестируемой смеси нуклеиновая кислота-реагент со свободным реагентом для образования библиотеки продуктов, включающей нуклеиновые кислоты, связанные с продуктом, полученным реакцией вышеупомянутых первого и свободного реагентов; и разделение компонентов вышеупомянутой библиотеки продуктов, основанное на их сравнительной способности преобразовывать вышеупомянутую заранее выбранную функцию, посредством чего желаемые продукты могут быть идентифицированы.

Изобретение представляет библиотеку продуктов, которые являются результатом реакции между по крайней мере связанным реагентом и свободным реагентом, где вышеупомянутый связанный реагент связывается с нуклеиновой кислотой, что помогает реакции между вышеупомянутыми реагентами.

Параллельный SELEX не требует сохранения трэка матрицы продуктов и по отношению к химии также не требует высокоэффективной или скоростной реакций. Это достоинство связано с тем, что образование продукта направляется специфическими нуклеиновыми кислотами. Этот направленный подход контрастирует с кодированным подходом, используемым другими комбинаторными библиотечными подходами. Нуклеиновая кислота, которая особенно удобна для образования желаемого продукта, может быть легко амплифицирована, и продукт достоверно воспроизводится в последующих циклах производства. Этот способ позволяет изначально случаться множеству реакций, которые можно рассортировать позже, это определяет, что продукты, которые показывают заранее определенные характеристики, могут быть получены. Этим способом продукты могут быть выделены при отсутствии подробной структурной информации.

Параллельный SELEX может включать образование библиотек продуктов, используя асимметрические реакции. В отличие от традиционных комбинаторных библиотечных подходов, даже если невозможно предсказать стереохимический выход в начале реакции, асимметрические реакции могут быть включены. Специфическая химия, не имеющая намеченного пути, для параллельного SELEX является эффективной. Есть только одно требование - нуклеиновая кислота принимает участие в по крайней мере ограниченном подмножестве общего числа возможных реакций.

В другом воплощении представляются способствующие нуклеиновые кислоты. Нуклеиновые кислоты, имеющие способствующие свойства, способны к проведению химических реакций связывания, таких как образование связи или разрыв связи. Нуклеиновые кислоты могут быть модифицированы различными путями для включения других химических групп, которые обеспечивают дополнительный заряд, поляризацию, водородные связи, электростатическое взаимодействие и подвижность, которые присутствуют в химической реакционной среде. Другие химические группы могут включать, inter alia, алкильные группы, аминокислотные цепи, различные кофакторы и металлоорганические части. Изобретение требует, чтобы способствующие нуклеиновые кислоты направляли синтез продуктов, которые имеют заранее определенные желаемые характеристики.

В изобретение включены фармацевтические соединения, содержащие изобретенные продукты и методы назначения соединений. Также включены диагностические реагенты, сельскохозяйственные соединения и промышленные соединения, содержащие изобретенные продукты.

Краткое описание чертежей.

Фиг. 1 изображает схематическое представление процесса, параллельного SELEX в его наиболее основной форме.

Фиг. 2 изображает схематическое представление процесса, параллельного SELEX, где способствующая нуклеиновая кислота принимает участие в общей реакции Дильса-Альдера между диеном и диенофилом.

Фиг. 3 изображает, как лигированные последовательности могут быть использованы для расширения множества вторичных молекул реагентов в параллельном SELEX. Фиг. 3A-E изображает пять из возможных 16,384 вероятностей, соответствующих фиг. 2.

Фиг. 4 изображает схематическое представление процесса параллельного SELEX, где способствующая нуклеиновая кислота принимает участие в общем образовании связи реакцией альдольной конденсации между кетоном и альдегидом.

Фиг. 5A-C изображает влияние смешанной альдольной реакции, описанной на фиг. 4, на структурное разнообразие продуктов. Фиг. 5A изображает реагенты. Фиг. 5B изображает диастереомеры, образованные когда A является нуклеофилом и B является электрофилом. Только диастереомеры показаны, и каждая структура может иметь еще соответствующий энантиомер.

Фиг. 6A изображает циклотримеризацию трех алкинов с выходом замещенного бензольного кольца. Фиг. 6B изображает матрицу вероятностей для сообщества бензольных соединений при циклотримеризации трех алкинов, изображенных на фиг. 6A. Фиг. 6C изображает механизм циклотримеризации алкинов. Только один из возможных продуктов показан.

Фиг. 7 изображает возможную стратегию для ретросинтеза типичного продукта изобретения.

Подробное описание изобретения.

Параллельный SELEX представляет библиотеки продуктов, которые образованы соединением пула первых химических реагентов, связанных с нуклеиновой кислотой, с пулом свободных химических реагентов. Связанная нуклеиновая кислота способна к химическим реакциям связывания, которые приводят к библиотеке продуктов, и далее нуклеиновая кислота амплифицируется, таким образом, можно повысить содержание продукта, который имеет заранее выбранные свойства, и выделить его из библиотеки продуктов.

В своем общем виде параллельный SELEX может быть описан на фиг. 1. Тестируемая смесь нуклеиновая кислота-реагент, образуется при воздействии первого реагента (R) на каждую из нуклеиновых кислот в тестируемой смеси (содержащей от 10² до 10¹⁸ нуклеиновых кислот со случайными последовательностями). Тестируемая смесь нуклеиновая кислота-реагент обрабатывается свободными реагентами (обозначаемыми как треугольник, пятиугольник и шестиугольник), которые могут связываться с первым реагентом (R) с образованием различных продуктов. Важно заметить, что в тестируемой смеси нуклеиновых кислот (NA) отдельные последовательности нуклеиновых кислот могут быть ассоциированы для облегчения образования различных продуктов с определенной формой, обозначаются как последовательность-A, последовательность-B, последовательность-C на фиг. 1. Продукты могут различаться по форме, реакционной способности или по форме и реакционной способности вместе. Отделение желаемого продукта по форме или реакционной способности осуществляется связыванием или реакцией с мишенью. Белки, маленькие молекулы, липиды, сахариды и т.д. являются примерами мишени (Т). После связывания или реакции с мишенью непрореагировавшие продукты, которые связаны с последовательностью-В и последовательностью-С как показано на фиг. 1, отделяются от последовательности-A и отбрасываются. Последовательность A нуклеиновой кислоты затем амплифицируют рядом известных способов. Последовательность A затем используют для сообщества желаемого продукта для облегчения специфической реакции по образованию выбранного продукта и реагента при обработке смеси начальных реагентов. В типичной реакции последовательность А может быть снова обработана первым реагентом, однако вышеупомянутое повторное воздействие не всегда требуется. Это идеализированный случай и во многих примерах помощник нуклеиновая кислота может сообщаться более чем с одним продуктом из начальной смеси, но все выбранные продукты будут иметь желаемые свойства связывания или химического реагирования с мишенью.

I. Определения.

Определенные термины, использованные здесь для описания изобретения, объясняются следующим образом: "Нуклеиновая кислота" означает или ДНК, РНК одноцепочечную или двухцепочечную и любые их химические модификации. Модификации включают, но этим не ограничиваются, те, которые обеспечиваются другими химическими группами, которые вносят дополнительный заряд, поляризацию, водородное связывание, электростатическое взаимодействие и подвижность в индивидуальные нуклеиновые основания или нуклеиновую кислоту в целом. Такие модификации включают, но этим не ограничиваются, модифицированные основания, такие как модифицированные основания по 2'-положению, пиримидиновые модификации по 5-положению, пуриновые модификации по 8-положению, модификации по цитозиновому экзоциклическому амину, замещение 5-бромурацила; модификации остова, метилирование, неканонические взаимодействия нуклеотидов, таких как, например, изооснований - изоцитидина и изогуанидина и т.д. Модификации могут также включать 3'- и 5'- модификации, такие как кэпирование. Модификации, которые появляются после каждого цикла амплификации, также соответствуют этому изобретению. Постамплификационные модификации могут быть обратимо или необратимо добавлены после каждого цикла амплификации. В сущности любую модификацию нуклеиновой кислоты рассматривают этим изобретением. Длина случайного сегмента нуклеиновой кислоты в основном между 8 и 250 нуклеотидами, предпочтительно между 8 и 160 нуклеотидами.

"Тестируемая смесь нуклеиновых кислот" является смесью нуклеиновых кислот различных случайных последовательностей, включая несколько, имеющих форму, которая дает им возможность содействовать образованию и/или разрушению химических связей. Источником "тестируемой смеси нуклеиновых кислот" могут быть встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты или даже фрагменты, химически синтезированные нуклеиновые кислоты, энзиматически синтезированные нуклеиновые кислоты или нуклеиновые кислоты, полученные комбинированием предшествующих технологий. В предпочтительном виде каждая нуклеиновая кислота имеет фиксированные последовательности вокруг случайного района для облегчения амплификационного процесса.

"Нуклеиновая кислота, имеющая способствующие свойства", или "способствующая нуклеиновая кислота", или "облегчающая нуклеиновая кислота", или "помощник нуклеиновая кислота" относится к нуклеиновой кислоте, которая способна к проведению или облегчению химической реакции. Химическая реакция может быть связь-образующая или связь-разрушающая. Предпочтительные представления этого изобретения направлены в сторону связь-образующих реакций. Нуклеиновая кислота не нуждается особо в показе каталитической стороны для объяснения имеющихся способствующих свойств. Сворачивание способствующих нуклеиновых кислот такое, что их трехмерная структура способствует специфической химической реакции. Нуклеиновая кислота может проводить химическую реакцию или самостоятельно, в комбинации с другой каталитической частью, связанной непосредственно с нуклеиновой кислотой, или в комбинации с другой каталитической частью, которая может находиться в растворе. Другие каталитические части могут включать металлоорганические части, ионы металлов и т.д. Нуклеиновая кислота может вызывать образование различных стереоизомеров. Нуклеиновая кислота может участвовать в образовании или разрыве связей различных типов, включая, но не ограничиваясь этим, реакции конденсации/гидролиза, циклообразующие реакции (такие как реакция Дильса-Альдера, реакция Ене и 1,3-диполярная реакция), конъюгирование ,- ненасыщенных соединений, альдольные конденсации, реакцию Кляйзена, гликозилирование пептидов, сахаров и липидов. Дополнительно, когда модификация нуклеиновой кислоты включает металлоорганическую часть, другие реакции могут появиться, которые будут давать симметрические или асимметрические продукты, включая, но не ограничиваясь этим, циклопропанирование, эпоксидирование, азридинирование, гидрогенирование, циклотримеризацию алкинов [3+2] и [4+1] циклоприсоединение ненасыщенных молекул и олефиновую реакцию обмена.

"Реагент" относится к любому химическому представителю, который может быть включен в связь-образующую или связь-разрушающую реакцию, который похож по термической и химической стабильности с нуклеиновыми кислотами, включая модификации, описанные выше. Термин "реагент" может относится к одному химическому представителю или к классу химических соединений, включая несколько реагентов некоторых общих химических структур или несколько реагентов различных химических структур. Реагент обычно имеет молекулярный вес в пределах от 2 до 1000, предпочтительно от 26 до 500. Особенно предпочтительные реагенты включают маленькие органические молекулы, такие как алкены, алкины, спирты, альдегиды, кетоны, сложные эфиры, карбоновые кислоты, ароматические карбоциклы, гетероциклы, диены, тиолы, сульфиды, дисульфиды, эпоксиды, сложные эфиры, амины, имины, фосфаты, амиды, тиоэфиры, сульфонаты и галогенированные соединения. Неорганические реагенты также рассматриваются этим изобретением. Однако в некоторых проявлениях изобретения и более крупные реагенты могут быть включены, такие как полимеры или белки. Выбор использованного химического реагента может быть случайным или основанным на ряде критериев, включая природу желаемого продукта, активность продукта, которую предполагается иметь, или информация основана на природе мишени, на которую предполагают действовать.

"Связанный реагент", или "первый реагент", или "первый химический реагент" относится к тем реагентам, которые связаны с нуклеиновой кислотой для образования тестируемой смеси нуклеиновая кислота-реагент. Связывание первого реагента с нуклеиновой кислотой может быть или ковалентным или нековалентным. Первый химический реагент может быть одиночным химическим представителем или классом химических молекул, включая несколько реагентов различных основных химических структур. Например, первый реагент может быть одним алкеном (например, 1-пропен), или 10 различными алкенами и 10 различными алкинами.

"Свободный реагент", или "второй реагент", или "свободный химический реагент" относится к тем реагентам, которые не связаны нуклеиновой кислотой. Свободные реагенты могут быть одинаковыми или отличными друг от друга или от связанного реагента. Например, свободный реагент может быть одним алкеном (например, 1-пропен), или 10 различными алкенами и 10 различными алкинами.

"Тестируемая смесь нуклеиновая кислота-реагент" соответствует смеси нуклеиновых кислот, каждая из которых связана с первым химическим реагентом. Связывание может быть ковалентным иди нековалентным, прямым или с линкером между нуклеиновой кислотой и реагентом. Тестируемая смесь нуклеиновая кислота-реагент взаимодействует с пулом свободных химических реагентов, что дает возможность получить библиотеку продуктов.

"Продукт" соответствует соединению, получающемуся из связь-образующей или связь-разрывающей реакции между одним или более реагентов, которой способствует нуклеиновая кислота. В предпочтительном виде продукт обычно формируют между связанным реагентом и свободным реагентом. Два реагента, которые реагируют с образованием продукта, необязательно должны быть различными химическими структурами. Предпочтительные продукты этого изобретения означают маленькие органические молекулы, которые могут быть медицински активны и показывать терапевтический эффект, или быть полезными как диагностические средства, или сельскохозяйственные средства. Обычно молекулярный вес находится в пределе от 40 до 2000, предпочтительно от 100 до 1000. Однако в определенных менее предпочтительных воплощениях продукты могут быть более крупными молекулами, которые представлены пептидами, белками, полимерами и т.д. В определенных менее предпочтительных воплощениях реакция означает реакцию связь-разрывающую и может происходить только со связанным реагентом или между двумя и более реагентами.

"Библиотека продуктов" соответствует набору продуктов, полученных химической реакцией между реагентом, связанным со способствующей нуклеиновой кислотой и предпочтительно по крайней мере с одним свободным реагентом. Благодаря природе изобретения библиотека продуктов может содержать много разнообразных продуктов различающихся химических структур.

"Продукт, способный изменять заранее выбранную функцию мишени", или "продукт, имеющий заранее определенную характеристику", или "желаемый продукт" означает продукт, который действует на мишень заранее выбранным желательным образом. Примеры заранее выбранных желательных действий на мишень включают, но не ограничиваются этим, связывание мишени, каталитическое изменение мишени, реакцию с мишенью таким образом, чтобы модифицировать/изменить мишень или функциональную активность мишени, ковалентное воздействие на мишень в качестве суицидного ингибитора, способствующего реакции между мишенью и другой молекулой. В качестве одного примера в библиотеке продуктов продукт, имеющий заранее определенную характеристику, которая означает связывание мишени с большей аффинностью, чем у большей части окружения. В любой данной библиотеке продуктов может существовать более чем один продукт, имеющий заранее определенную характеристику для данной мишени. Продукты, имеющие заранее определенные характеристики, могут отличаться друг от друга по своей аффинности связывания с мишенью или по их другим свойствам действия на мишень.

"Мишень" означает любое соединение, на которое продукт, идентифицированный способом параллельного SELEX, может действовать заранее выбранным желательным способом. Молекула мишени может быть белком, пептидом, полисахаридом, гликопротеином, гормоном, рецептором, антигеном, антителом,