Фрагмент рекомбинантной рнк (варианты), рибонуклеопротеиновый комплекс (варианты), плазмида

Фрагмент рекомбинантной рнк (варианты), рибонуклеопротеиновый комплекс (варианты), плазмида

Реферат

 

Изобретение относится к генетической инженерии и касается матриц вирусной РНК. Фрагмент рекомбинантной РНК содержит сайт связывания, специфичный для РНК-зависимой РНК-полимеразы РНК-ового вируса с отрицательной цепью. Сайт функционально связан с гетерологичной РНК-последовательностью, представляющей собой комплементарную последовательность соответствующей матричной РНК. Рибонуклеопротеиновый комплекс включает фрагмент рекомбинантной РНК и очищенную РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса гриппа. Плазмида pIVACAT1 включает 22 нуклеотида, происходящие из 3'- конца NS РНК вируса гриппа. Линкерную последовательность из 8 нуклеотидов, включающую Bg1П сайт рестрикции, кодирующую последовательность гена хлорамфениколацетил трансферазы в негативной полярности. 26 нуклеотидов, происходящих из 3'-конца NS РНК вируса гриппа, операбельно связанные с промотором полимеразы Т7. Изобретение позволяет использовать рекомбинантные вирусные РНК для экспрессии генных продуктов, для конструирования рекомбинантных вирусов и создавать рецептуры вакцин. 6 с. и 10 з.п.ф-лы, 20 ил., 2 табл.

Изобретение касается матриц вирусной РНК с рекомбинантной отрицательной цепью, которые могут быть использованы для экспрессии ксеногенных генных продуктов в надлежащих клеточных системах хозяина и (одновременно или по отдельности) для конструирования рекомбинантных вирусов, которые выражают, содержат и (одновременно или по отдельности) представляют ксеногенный генный продукт. Продукты экспрессии и химерические вирусы могут быть с успехом использованы при создании рецептур вакцин.

Изобретение проиллюстрировано примерами, в которых были сконструированы матрицы рекомбинантной вирусной РНК гриппа, содержащие ксеногенные генные кодирующие последовательности, находящиеся в отрицательной полярности. Эти рекомбинантные матрицы, будучи соединенными с очищенной вирусной РНК-направленной РНК-полимеразой, были инфекционно воспроизведены в надлежащих клетках хозяина и экспрессировали ксеногенный генный продукт в высокой степени. Кроме того, ксеногенный ген был экспрессирован и пакован результирующими рекомбинантными вирусами гриппа.

Ряд ДНК-вирусов был генетически сконструирован, чтобы направить экспрессию у ксеногенных белков в клеточных системах хозяина (например, вирус коровьей оспы, бакуловирус и т.д.). Недавно аналогичные успехи были достигнуты на РНК-вирусах с положительной цепью (например, полиовирус). Можно полагать, что продукты экспрессии у этих конструкций, т.е. ксеногенный генный продукт или химирический вирус, который выражает ксеногенный генный продукт, окажутся потенциально полезными для создания рецептур вакцин (либо на основе субъединицы, либо на основе всего вируса). Одним из препятствий на пути использования вирусов, таких как вирус коровьей оспы, для конструирования рекомбинантных или химерических вирусов, предназначенных для использования в вакцинах, является отсутствие изменчивости у их основных эпитопов. Это отсутствие изменчивости у вирусных штаммов накладывает строгие ограничения на возможность повторного использования химерического вируса коровьей оспы, что заключается в том, что многократные вакцинации ведут к возникновению у хозяина резистентности к штамму, в результате чего инокулированный вирус теряет способность инфектировать хозяина. Инокуляция резистентного индивидуума химерической вакциной не будет, следовательно, индуцировать иммунную стимуляцию.

В противоположность сказанному, вирус гриппа, являющийся РНК-вирусом с отрицательной цепью, обнаруживает широкую изменчивость его главных эпитопов. В самом деле, идентифицированы тысячи вариантов гриппа, причем каждый штамм характеризуется проявлением антигенной изменчивости. Вирусы с отрицательной цепью, такие как вирус гриппа, могли бы оказаться привлекательными для конструирования химерических вирусов, предназначенных для использования в вакцинах, поскольку их генетическая изменчивость обеспечивает возможность конструирования широкого разнообразия вакционных рецептур, которые будут стимулировать появление иммунитета без риска возникновения толерантности. Однако на пути к достижению этой цели препятствие состоит в том, что не удалось пока сконструировать рекомбинантные или химерические РНК-частицы с отрицательной цепью, которые обладали бы инфекционным действием.

2.1. Вирус гриппа.

Семейства вирусов, содержащих заключенную в оболочку одноцепочечную РНК у генома отрицательного характера, классифицируются на группы, имеющие несегментированные геномы (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae), или группы, имеющие сегментированные геномы (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae и Arenaviridae). Семейство Orthomyxoviridae, подробно описанное ниже и использованное в примерах в настоящем описании, содержит только вирусы гриппа типов A, B и C.

Вирионы гриппа состоят из внутреннего рибонуклеопротеидного ядра (спирального нуклеокапсида), содержащего одноцепочечный РНК-геном, и внешней липопротеидной оболочки, покрытой изнутри матричным белком M. Сегментированный геном гриппа A состоит из восьми молекул (семи у гриппа C) линейной одноцепочечной РНК отрицательной полярности, которые кодируют десять полипептидов, включая РНК-направленные РНК-полимеризаные белки (PB2, PB1 и PA) и нуклеопротеид (NP), который образует нуклеокапсид, матричные белки (M1, M2), два поверхностных гликопротеида, которые защищают от липопротеидной оболочки, а именно, гемагглютинин (HA) и нейраминидаза (NA), и неструктурированные белки, функция которых является неизвестной (NS1 и NS2). Транскрипция и репликация генома происходит в ядрах, и сборка осуществляется почкованием на плазматической мембране. Вирусы могут давать рекомбинантные гены при действии смешанных инфекций.

Вирусы гриппа абсорбируются через гемагглютинин на сиалилолигосахаридах, находящихся в клеточных мембранных гликопротеидах и гликолипидах. После эндоцитоза вириона в молекуле гемагглютинина возникает конформационное изменение, происходящее в пределах нахождения клеточной эндосомы, что способствует протеканию мембранного слияния, в результате чего начинает происходить декапсидация. Нуклеокапсид мигрирует к ядру, где происходит транскрибирование мРНК, что является существенным начальным моментом у инфекционного заражения. Вирусная иРНК подвергается транскрибированию по своеобразному механизму, при действии которого вирусная эндонуклеаза отщепляет завершающий 5-конец от клеточных ксеногенных мРНК, которые затем выступают в роли примеров (затравок) при транскрибировании вирусных РНК-матриц вирусной транскриптазой. Концы транскрибированных последовательностей приходятся на сайты, расположенные на расстоянии от 15 до 22 оснований, считая от концов их матриц, где олигоединичные последовательности выступают в роли сигналов для добавления независящих от матрицы полимеразных участков. Из восьми вирусных молекул мРНК, образовавшихся таким способом, шесть несут моноцистронную информацию, которая подвергается трансляции непосредственно в белках, представляющих собой гемагглютинин, нейраминидазу, нуклеопротеид и вирусные полимеразные белки - PB2, PB1 и PA. Другие две матрицы претерпевают сращивание, давая в каждом случае две мРНК, которые подвергаются трансляции с различающимся представлением, в результате чего получаются матричные белки M1 и M2 и неструктурированные белки NS1 и NS2. Иначе говоря, восемь вирусных кислот мРНК кодируют 10 белков: восемь структурированных и два неструктурированных. Сводка генов вируса гриппа и их белковых продуктов приведена ниже в табл. 1.

После транскрипции вторым существенным моментом у инфекции, связанной с вирусами, имеющими РНК с отрицательной цепью, является вирусная геномная репликация. Как и в случае других РНК вирусов с отрицательной цепью, вирусная геномная репликация у гриппа происходит посредством белков, специфические характеристики которых определяются вирусом. Предположительно считается, что большая часть вирусных белков или даже все вирусные белки, которые транскрибируют мРНК-сегменты вируса гриппа, также осуществляют свою репликацию. Все вирусные РНК-сегменты характеризуются наличием общих 3'- и 5'-концов, с чем, по-видимому, связана возможность действия механизма синтеза РНК при одинаковой вероятности распознавания каждого сегмента. Механизм, посредством которого регулируется попеременное использование (т.е. транскрибирование или репликация) одного и того же набора белков (полимеразные белки PB2, PB1, PA и нуклеопротеид NP), четко не идентифицирован, однако, складывается впечатление, что здесь оказываются вовлеченными три формы одного или нескольких нуклеокапсидных белков, в частности, нуклеопротеид NP. Представляется, что ядро является местом репликации вирусной РНК, как и местом транскрипции.

Первыми продуктами репликационного синтеза РНК являются комплементарные копии (т.е. включая и цепи с положительной полярностью) всех геномных РНК-сегментов вируса гриппа (кРНК). Эти копии с цепями положительной полярности (антигеномы) отличаются от мРНК-матриц с цепями положительной полярности по структуре их концов. В отличие от мРНК матриц антигеномные кислоты кРНК не являются закрытыми на конце 5' и метилируются и не являются усеченными на конце 3' и полиаденилируются. Концы у кислот кРНК совпадают с положением их матриц с отрицательной цепью, и кислоты кРНК содержат в каждом геномном РНК-сегменте всю генетическую информацию, представленную в комплементарной форме. Кислоты кРНК выполняют роль матриц при синтезе геномных кислот вРНК с отрицательной цепью.

Геномы вируса гриппа с отрицательной цепью (вРНК) и антигеномы (кРНК) всегда находятся в инкапсидированном состоянии с покрытием из нуклеокапсидных белков, единственными неинкапсидированными РНК-частицами являются вирусные кислоты мРНК. В противоположность другим заключенным в оболочку РНК-вирусам нуклеокапсидное образование возникает, по-видимому, в ядре, а не в цитоплазме. Вирус развивается с отделением от апикальной поверхности клетки, содержащей матричный белок на цитоплазматической стороне или на внутренней поверхности отделяющей оболочки. Гемагглютинин и нейраминидаза становятся гликосилированными и встроенными в липидную оболочку. В клетках, где это допустимо, гемагглютинин в конечном итоге расщепляется, но при этом две образующиеся цепи остаются соединенными дисульфидными мостиками.

Остается неизвестным механизм выбора одной копии из восьми геномных вирусных кислот РНК для вхождения в каждый новый вирион. Часто образуются дефективные мешающие частицы, особенно после появления инфекции с высокой множественностью.

2.2. РНК-направленная РНК-полимераза У вирусов животных РНК-направленные РНК-полимеразы были подвергнуты обширному исследованию по многим аспектам, касающимся строения белков и условий протекания реакций. Однако элементы информационной РНК, которые промотируют оптимальную экспрессию под воздействием полимеразы, могут быть изучены лишь в результате использования существующих вирусных РНК-последовательностей. Такой аналоги действия промотора представляет интерес, поскольку остается неизвестным способ распознавания вирусной полимеразой специфических вирусных кислот РНК среди многих закодированных у хозяина кислот РНК, обнаруживаемых в инфектированной клетке.

Вирусы животных, содержащие геном РНК с цепью положительного характера, могут быть подвергнуты репликации при введении выделенной плазмидой РНК в клетки посредством трансфекции (см. , например, работы Racaniello, et al. 1981, Science 214: 916-919, Legis, et al. 1986, Cell 44: 137-145). В случае полиовируса очищенная полимераза способна воспроизводить геномную РНК в реакциях in vitro, и при трансфекции этого препарата в клетки они оказываются инфекционными (Kaplan, et al., 1985, Proc. Acad. Sci. USA 82-8424-8428). Однако матричные элементы, которые выступают в роли промоторов транскрибирования для закодированной по полиовирусу полимеразы, являются неизвестными, так как могут быть копированы только четные РНК-гомополимеры (Ward, et al., 1988. J. Virol 62: 558-562). Матрицы SP6 были также использованы для получения модельных дефектных мешающих кислот РНК применительно к геному вируса Sindbis. При введении РНК в зараженные клетки она подвергается репликации и упаковке. Было показано, что РНК-последовательности, которые являются ответственными как за распознавание полимеразы вируса Sindbis, так и за попадание генома в вирусные частицы, состоят из 162 нуклеотидов у конца 5' и 19 нуклеотидов у 3'- конца генома (Levis, et al., 1986, Cell 44: 137-145). В случае вируса костерной мозаики (растительный РНК-вирус с положительной цепью) PS6-матрицы были использованы для идентификации промотора, который был идентифицирован как тРНК-подобная последовательность, содержащая 134 нуклеотида у 3'-конца (Dreher, and Hall, J. Mol. Biol. 1988, 201: 31-40). Было показано, что распознавание полимеразы и синтез зависят как от характера последовательности, так и от вторичных структурных особенностей (Dreher, et al., 1984, Nature 311: 171-175).

РНК-вирусы с отрицательной цепью оказались неподатливыми в плане изучения характеристик последовательности у репликазы. Очищенная полимераза вируса визикулярного стоматита является активной в отношении транскрибирования лишь тогда, когда выделенные из вируса рибонуклеопротеидные комплексы (кислоты РНК) включаются в виде матрицы (De and Banerjee 1985, Biochem. Biophys, Res. Commun. 126: 40-49, Emerson and Yu, 1975 Virol 15: 1348-1356, Naito, and Ishihama, 1976, J. Biol. Chem. 251: 4307-4314). Рибонуклеопротеиды были воссозданы из РНК, выделенной из частиц D1 вируса визикулярного стоматита при использовании экстрактов из зараженных клеток в качестве источника белка. Эти рибонуклеопротеиды затем подвергали репликации, вводя их обратно в зараженные клетки (Mirakhur, and Peluso 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7511-7515). Что касается вирусов гриппа, то недавно появилось сообщение, что выделенная РНК, полученная из вируса, была использована для воссоздания рибонуклеопротеидов. Вирусные нуклеокапсидные и полимеразные белки были повергнуты гелевой очистке и ренатурации на вирусной РНК при использовании тиоредоксина (Szewczyk, et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 7907-7911). Однако эти исследователи ничего не говорят ни о специфической активности препарата в отношении РНК вируса гриппа, ни об анализе данных по промотированию транскрипции.

В ходе действия инфекции вируса гриппа полимераза катализирует три отдельных транскрипционных процесса. Сюда относятся а) синтез субгеномной мРНК, которая содержит 5'-верхушку и 3'-поли-A-хвост, б) синтез полной цепи положительной полярности или антигенома (кРНК), скопированного с геномной РНК, и в) синтез геномной вРНК, синтезированной на основе кРНК полной длины (обзор содержится в Ishihama and Nagata, 1988, CRC Crit. Rev. Biochem. 23: 27-76 и у Krug, Transcription and replication of influenza viruses в книге Genetics of influenza viruses, редакторы Palese, P. and Kingsbury, D.W., New York, Springa-Verley, 1983, p. 70-98). Полагают, что белки PB2, PB1 и PA катализируют все синтезы специфической в отношении вируса гриппа РНК, когда в избытке содержится нуклеокапсидный белок (NP, см. приведенные выше обзоры). Функциональные назначения этих полимераз были изучены при использовании рибонуклеопротеидных нуклеотидов, выделенных из разрушенного моющим средством вируса, и рибонуклеопротеидов, взятых из ядерных экстрактов, выделенных из зараженных клеток. Транскрипция из рибонуклеопротеидов, выделенных из разрушенного вируса, происходит тогда, когда воздействуют затравкой либо в виде динуклеотидного аденилил-(3'-5')-гуанозина (ApG), либо в виде завершенных кислот мРНК. Синтезы мРНК-продуктов с положительной цепью завершались образованием 17-20 нуклеотидов, считая от 5'-конца РНК-матрицы, и завершались добавлением поли-A-хвостов. Эти продукты не могут служить в качестве матрицы для генома в вирусном понимании, поскольку у них отсутствуют концевые последовательности (Hay, et al., 1977, Virology 83: 337-355). Рибонуклеопротеиды, выделенные из ядерных экстрактов, взятых из зараженных клеток, также производят синтез полиаденилированной мРНК, что происходит в присутствии завершенных РНК-полимеров. Однако, если при этих условиях использовать аденилил-(3'-5')-гуанозин, то тогда могут быть получены обе кислоты РНК, полиаденилированная и кРНК полной длины (Beaton and Krug, 1986, Proc. Natl. Acad., Sci, USA 83: 6282-6286, Takeuchi, et al., 1987, J. Biochem. 101: 837-845). Недавно было показано, что репликационный синтез кРНК может идти и при отсутствии экзогенного примера, если ядерный экстракт был выделен в определенные времена после заражения. В этих же самых препаратах наблюдали также протекание синтеза вРНК отрицательного характера из кРНК-матрицы (Shapiro and Krug 1988, J. Virol 62: 2285-2290). Было показано, что синтез кРНК с полной длиной цепи идет независимо от наличия нуклеокапсидного белка, который отсутствовал в растворе (Beaton and Krug, 1986, Proc. Natl. Acad, Sci., USA 83: 6282-6286, Shapiro and Krug, 1988, J. Virol 62: 2285-2290). Эти результаты дают основания предполагать, что при синтезе регуляция между мРНК и кРНК, связанная с воздействием рибонуклеопротеидного комплекса, сводится к необходимости присутствия избыточного количества растворимого нуклеопротеида (Beaton and Krug, 1986, Proc. Natl. Acad, Sci., USA 83: 6282-6286).

Еще одно направление исследований сводилось к изучению препарата из полимераза-РНК-комплексов, выделенных из рибонуклеопротеидов, взятых из вируса, разрушенного моющим средством. При центрифугировании рибонуклеопротеидного комплекса через CsC1-глицерольный градиент РНК может быть найдена связанной с тремя полимеразными белками у низа градиента. Вблизи верха градиента может быть найден свободный нуклеопротеидный белок (Honda, et al., 1988, J. Biochem, 104: 1021-106, Kato, et al., 1985, Virus Research 3, 115-127). Очищенный полимераза-РНК-комплекс (низ градиента) является активным в отношении инициирования синтеза РНК при воздействии затравки из аденилил-(3'-5')-гуанозина, но оказывается неспособным удлинять цепь выше 12-19 нуклеотидов. При обратном добавлении фракции, взятых из верхней части градиента, содержащей нуклеопротеидный белок, к полимераза-РНК-комплексу удлинение может инициироваться (Honda, et al., 1987, J. Biochem. 102: 41-49). Из этих данных следует, что инициирование может происходить и при отсутствии нуклеопротеида.

Было показано, что геномная РНК вирусов гриппа обладает круговой конформацией, достигнутой через соединение пары оснований концов с образованием ободка из 15-16 нуклеотидов (Honda, et al., 1988, J. Biochem. 104: 1021-1026, Hsi, et al. , 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8140-8144). Поскольку, как установлено, вирусная полимераза присоединяется к ободку, из сказанного следует, что ободковая структура является необходимой для распознавания вирусной полимеразой (Honda, et al. , 1988, J. Biochem. 104: 1021-1026). По этой причине в указанных двух сообщениях высказывается гипотеза, что промотором для вирусной РНК-полимеразы является двухспиральная РНК в ободковой конформации.

Описаны вирусные РНК-матрицы с рекомбинантной отрицательной цепью, которые могут быть использованы с очищенным РНК-направленным РНК-полимеразным комплексом для экспрессии ксеногенных генных продуктов у надлежащих клеток хозяина и (одновременно или по отдельности) для спасения ксеногенного гена в вирусных частицах. РНК-матрицы готовили транскрипцией надлежащих ДНК-последовательностей с использованием ДНК-направленной РНК-полимеразы. Образующиеся РНК-матрицы обладают отрицательной полярностью и содержат надлежащие концевые последовательности, которые делают возможным включение механизма синтеза вирусной РНК с распознаванием матрицы.

Как это продемонстрировано на примерах, описанных ниже, РНК-матрицы гриппа с рекомбинантной цепью отрицательного характера могут быть смешаны с очищенными вирусными полимеразными белками и нуклеопротеидом (т.е. с очищенным вирусным полимеразным комплексом) для получения инфекционных рекомбинантных рибонуклеопротеидов. Последние могут быть использованы для экспрессии ксеногенных продуктов у клеток хозяина или для спасения ксеногенного гена в вирусных частицах посредством совместной трансфекции клеток хозяина с рекомбинантными рибонуклеопротеидами и вирусом. Или же рекомбинантные РНК-матрицы и рекомбинантные рибонуклеопротеиды могут быть использованы для трансфекции трансформированных клеточных линий, которые экспрессируют РНК-зависимую РНК-полимеразу и обеспечивают возможность протекания комплементации. Кроме того, описана также для вируса гриппа невирусная зависимая репликационная система. Носители коровьей оспы, экспрессирующие полипептиды вируса гриппа, были использованы в качестве источника белков, которые обладают способностью репликатировать и транскрибировать синтетически полученные рибонуклеопротеиды. Было установлено, что минимальный поднабор белков вируса гриппа, необходимых для осуществления специфической репликации и экспрессии вирусного рибонуклеопротеида, состоит из трех полимеразных белков (PB2, PB1 и PA) и нуклеопротеида (NP). Отсюда следует, что бесструктурные белки NS1 и NS2 не являются абсолютно необходимыми для осуществления репликации и экспрессии вирусного рибонуклеопротеида.

Полученные продукты экспрессии и (одновременно или по отдельности) химерические вирионы могут быть с успехом использованы при составлении рецептур вакцин. Использование рекомбинантного вируса гриппа для этой цели является особенно привлекательным, поскольку грипп демонстрирует громадное разнообразие штаммов, чем обеспечивается возможность создания широкого ассортимента рецептур вакцин. Возможность выбора из многих тысяч вариантов гриппа варианта, пригодного для конструирования химерических вирусов, снимает проблему резистентности хозяина, возникающую при использовании других вирусов, таких как вирус коровьей оспы. Кроме того, поскольку грипп стимулирует проявление сильной секреторной активности и вызывает цитотоксическую T-клеточную реакцию, представление инородных эпитопов в строении вируса гриппа может также инициировать появление секреторного иммунитета и клеточно-опосредованного иммунитета.

В настоящем описании приняты следующие термины: cRNA - антигеномная РНК (мРНК); HA - гемагглутинин (оболочечный гликопротеид); M - матричный белок (линии внутри оболочки); MDCK - собачьи почечные клетки Мейдина Дарби (Madin Darby); MDBK - бычьи почечные клетки Мейдина Дарби; moi - множественность инфекции; NA - нейтраминидаза (оболочечный гликопротеид); NP - нуклеопротеид (связанный с РНК и необходимый для обеспечения полимеразной активности); NS - неструктурный белок (функция является неизвестной); nt - нуклеотид; PA, PB1, PB2 - РНК-направленные РНК-полимеразные компоненты; RNP - рибонуклеопротеид (RNA, PB2, PB1, PA и NP); rRNP - рекомбинантный рибонуклеопротеид (рРНП); vRNA - гемомная вирусная РНК (вРНК); Вирусный полимеразный комплекс - PA, PB1, PB2 и NP; WSN - вирус гриппа A/WSN/33.

Вирус WSN - НК-рекомбинантный вирус, содержащий семь генов из вируса WSN и нейтраминидазный ген (NA-ген) из вируса гриппа A/НК/68.

Фиг. 1. Очистка полимеразного препарата. РНК-остовы очищали, извлекая из всего вируса, и затем подвергали CsC1-глицерольному градиентному центрифугированию. Полимеразу очищали от фракций использованием хлорида цезия с концентрацией раствора от 1,5 до 2,0 М. Образцы затем анализировали, подвергая электрофорезу с использованием полиакриламидного геля в условиях линейного изменения градиента у геля в пределах 7-14% в присутствии 0,1%-ного раствора додецилсульфата натрия, после чего проводили окрашивание серебром. Белковые образцы содержали 1,4 мкг всего вируса (полоса 1), 0,3 мкг всего вируса (полоса 2), 5 мкл RNP-остовов (полоса 3) и 25 мкл РНК-полимеразы (полоса 4). Известные названия белков указаны слева.

Фиг. 2. Плазмидные конструкции, использованные для приготовления РНК-матриц. Плазмида обозначается зачерненным блоком, характеризующим pUC-19-последовательности, штрихованный блок характеризует усеченный промотор, специфически распознаваемый полимеразой бактериофага T7 РНК, сплошная линия характеризует ДНК, которая транскрибируется из плазмид, подвергнутых расщеплению реактивом Mbo II. Светлый блок характеризует последовательности, кодирующие сайты распознавания для Mbo II, EcoR1 и Pst1, причем именно в таком порядке. Указаны сайты расщепления ограничительными эндонуклезами. Под диаграммой приведены полные последовательности кислот РНК, которые образуются при синтезе с воздействием РНК-полимеразы T7 из плазмид, подвергнутых расщеплению посредством Mbo II. Кислота V-wt - РНК имеет идентичные 5'- и 3'-концы, как это установлено у РНК-сегмента 8 вирусов гриппа A, разнесенных на 16 "прокладочных" нуклеотидов. Кислоты M-wt-РНК характеризуется наличием в точности обратной цепи, или является "информационно восприимчивой" V-wt-кислотой. Для DraI, EcoR1, Pst1 и Sma1 указаны ограничительные эндонуклеазные сайты. У плазмид, отщепленных этими ферментами, T7-матрицы представляют собой кислоты РНК с нуклеотидной длиной соответственно 32, 58, 66 и 91. Последовательности у V - d5'-РНК показаны на фиг.2. Конструкция плазмиды является в основном такой же, что и использования в случае V - wt-РНК, исключением является лишь то, что иными являются второстепенные изменения у "прокладочной" последовательности. Точечные мутанты у кислот V - d5'-РНК, которые были изучены, указаны в табл. 1.

Фиг. 3. Анализ продуктов у полимеразы вируса гриппа. В случае фиг. 3A полимеразные реакционные смеси, содержащие 0,4 мМ ApG (Аденилил- (3'-5')-гуанозин) или не содержащие пример (полоса 2 в первом случае и полоса 3 во втором), подвергали электрофорезу на 8%-ных полиакриламидных гелях, содержащих мочевину в концентрации 7,7 . Фиг. 3B свидетельствует о том, что РНК в момент образования является резистентной в отношении воздействия односпиральной специфической нуклеазы 1. После проведения стандартной полимеразной реакции растворы разбавляли в нуклеазном S1-буфере (полоса 1) и добавляли фермент (полоса 2). С целью контроля условий S1-расщепления односпиральную V - wt-РНК с радиоактивной меткой обрабатывали нуклеазой S1 (полоса 3) или только буферным раствором (полоса 4). На фиг. 3C показаны результаты проведения рибонуклеазного T1-анализа продуктов взаимодействия, очищенных на геле. Продукты реакции вирусной полимеразы в условиях использования V - wt-РНК-матрицы подвергали электрофорезу на 8%-ном полиакриламидном геле. Наблюдались полоса из 53 нуклеотидов и полоса меньшего размера, и эти цепи элюировали из гелиевой матрицы. Эти кислоты РНК расщепляли рибонуклеазой T1 и анализировали посредством электрофореза на 20%-ном полиакриламидном геле, содержащем мочевину в концентрации 7,7 М. С целью сопоставления T7-копии кислот M-wt- и V-wt-РНК, которые были синтезированы в присутствии -- ³²P-УТФ, также подвергали анализу с воздействием рибонуклеазы T1. У контрольных кислот РНК показаны предсказанные олигонуклеотиды с радиоактивной меткой. Полоса 1 отвечает продукту с полной длиной в 53 нуклеотида, полоса 2 отвечает продукту с меньшей длиной цепи у РНК, составляющей 40-45 нуклеотидов, полоса 3 отвечает M-wt-РНК, помеченной введением ³²P-УТФ, и полоса 4 отвечает V-wt-РНК, помеченной как и в случае полосы 3.

Фиг. 4. Оптимальные условия взаимодействия для вирусной полимеразы. В случае фиг. 4A реакции с V-wt-матрицей проводили на льду и затем инкубировали при указанных температурах в течение 90 мин. В случае фиг. 4B реакции с V-wt-матрицей проводили параллельно при указанных концентрациях хлорида натрия или хлорида калия и инкубировали при 30^oC в течение 90 мин. В случае фиг. 4C проводили единственную реакцию с V-wt-матрицей, инкубируя при 30^oC, и при указанных временах образцы извлекали и сразу же подвергали экстракции с использованием смеси фенола с хлороформом. Во всех случаях использовали 8%-ные полиакриламидные гели с содержанием мочевины 7,7 М.

Фиг. 5. Матричная специфичность у вирусной полимеразы. Из фиг. 5A следует, что для протекания вирусной полимеразной реакции необходимы 3-концевые промоторные последовательности. При проведении реакций в стандартных условиях использовали разные матричные кислоты РНК. Полоса 1 отвечает V-Pst-РНК, которая является идентичной V-wt-кислоте за исключением того, что у нее на 3'-конце имеется отросток длиной в 13 нуклеотидов, полоса 2 отвечает V-Sma-РНК, протяженность которой на конце 3' составляет 38 нуклеотидов, полоса 3 отвечает V-wt-РНК, полоса 4 отвечает ДНК-полинуклеотиду с идентичной последовательностью, что и у V-wt-РНК, полоса 5 отвечает РНК в 80 нуклеотидов, получаемой воздействием бактериофаговой Т3-ДНК-полимеразой при транскрипции pIBI-31-плазмиды, подвергнутой расщеплению реактивом Hind III. Авторадиограмма наложена с целью иллюстрации отсутствия специфических продуктов реакции, когда используются эти другие матрицы. В случае фиг. 5B 10 нг каждой матричной РНК подвергали инкубированию совместно с вирусной полимеразой, и продукты затем подвергали электрофорезу на 8%-ных полиакриламидных гелях, содержащих 7,7 М мочевины. Полоса 1 отвечает V-wt-РНК, полоса 2 отвечает V-Dra-РНК, полоса 3 отвечает V-Eco-РНК, полоса 4 отвечает M-wt-РНК, и полоса 5 отвечает маркерному олигонуклеотиду длиной в 53 нуклеотида. По вопросу точного различия последовательностей см. фиг. 2 и раздел 6.1, а также последующие разделы.

Фиг. 6. РНК-промотор не требует наличия концевого ободка. Полимеразная реакция идет с использованием двух матричных кислот РНК. В случае каждой реакции содержание V-wt-РНК составляет 5 нг. Что касается второй матрицы, то в реакциях использовали 0 нг (полоса 1), 0,6 нг (полоса 2) и 3,0 нг (полоса 3) кислоты V-d5'-РНК. Результирующие молярные отношения были такими, какие указаны на чертеже. Реакционные продукты анализировали на 8%-ном полиакриламидном геле в присутствии 7,7 М мочевины. После проведения денситометрического анализа авторадиограмм относительную интенсивность каждого пика исправляли на величину от воздействия радиоактивного УМФ, захваченного каждым продуктом.

Фиг. 7. Специфичность промоторных последовательностей. Кислоты РНК, у которых отсутствует 5'-конец и которые содержат точковые мутации (табл. 2), сопоставляли с V-d5'-РНК, участвующей в стандартных полимеразных реакциях. Правая группа данных относится к отдельной совокупности реакций. Количественное сопоставление проведено в табл. 2.

Фиг. 8. Высококонцентрированные полимеразные препараты являются активными в реакциях синтеза накрытых эндонуклеазных кислот РНК, идущих с участием примера и без него. На фиг. 8A проиллюстрирована примерная специфичность высококонцентрированного фермента. Радиоактивная синтезированная матрица, состоящая из 30 нуклеотидов, дается полосой 1. Реакции с использованием 20 нг V-d5'-РНК и 5 мкл вирусной полимеразы проводили с применением в качестве примера следующих препаратов: пример не использовали (полоса 2), 100 нг BMV-РНК (De and Banerjee, 1985, Biochem. Biophys. Res. Commun. 6: 40-49) с концевой структурой 0 (полоса 3), 100 нг кроличьей глобиновой мРНК с концевой структурой 1 (полоса 4) и 0,04 мМ ApG (полоса 5). Полоса 5 при меньшей экспозиции показана в виде полосы 6. На фиг. 8B проиллюстрированы результаты анализа очищенных на геле кислот РНК в условиях воздействия нуклеазы S1. Продукты, полученные при взаимодействии с использованием в качестве примера ApG (полосы 1 и 2), без использования примера (полосы 3 и 4) или при использовании глобиновой мРНК (полосы 5 и 6), подвергали электрофорезу при отсутствии мочевины, и надлежащий кусочек геля отделяли, и РНК элюировали. Эту РНК затем расщепляли нуклеазой S1 (полосы 2, 4 и 6), и продукты подвергали денатурации и анализировали на 9%-ном полиакриламидном геле, содержащем 7,7 М мочевины.

Фиг. 9. Синтез РНК геномной длины из воссозданных рибонуклеопротеидов. Реакционные продукты, полученные с использованием 10 мкл полимеразы и использованием в качестве матрицы РНК с цепью из 890 нуклеотидов, идентичной последовательности сегмента 8 вируса A/WSN /33, и РНК, экстрагированной из вируса A/PP/8/34, анализировали на 4%-ном полиакриламидном геле, содержащем 7,7 мочевины. Полосой 1 показана матрица с цепью из 890 нуклеотидов, синтезированная с использованием радиоактивной метки при воздействии РНК-полимеразы T7. РНК, извлеченную из плазмиды длиной 890 нуклеотидов, использовали в качестве матрицы в случае полос 2, 3, 8 и 9. РНК, извлеченную из вируса, использовали в качестве матрицы в случае полос 4, 5, 10 и 11. Матрицу не использовали в случае полос 6 и 7. Пример не использовали в случае полос 2-5, и препарат ApG использовали в качестве примера в случае полос 6-11. Продукты взаимодействия обрабатывали нуклеазой S1 в случае полос 3, 5, 7, 9 и 11.

Фиг. 10. Схематическое изображение метода проведения мутогенеза, направленного полимеразной цепной реакцией, который может быть использован для замены вирусных кодирующих последовательностей в пределах вирусных генных сегментов.

Фиг. 11. На фиг. 11A представлено схематическое изображение представляющих интерес частей цепи pIVCAT1. На фиг. помечены различные области, и ими, слева направо, являются усеченный T7-промотор, нетранслированный 5'-конец сегмента -8 (22 нуклеотида) вируса гриппа A/PP/8/34, связующая последовательность из восьми нуклеотидов, вся кодирующая область CAT-гена (хлорамфениколацетилтрансферазный ген) (660 нуклеотидов) весь нетранслированный 3'-конец сегмента 8 (26 нуклеотидов) вируса гриппа S/PR/8/34 и связующая последовательность, содержащая HgaI-ограничительный ферментативный сайт. Для гена CAT показаны места ограничительного действия ферментов, представляющие интерес, и показаны старт- и стоп-сайты. На фиг. 11B показан РНК-продукт, состоящий из 716 оснований, полученный после расщепления ферментом HgaI и проведения транскрипции pIVACAT1 РНК-полимеразой T7. Последовательности, отвечающие вирусу гриппа, показаны жирными буквами, последовательности, отвечающие гену CAT, показаны обычными буквами, и связующие последовательности показаны закурсивленным шрифтом. Триплеты (в направлении, обратном ориентации), представляющие собой кодоны инициирования и завершения у CAT-гена, указываются стрелкой и подчеркиванием, соответственно.

Фиг. 12. РНК-продукты при проведении транскрипции полимеразой T7 и транскрипции полимеразой вируса гриппа in vitro. Полосы 1-4 характеризуют результаты анализа на полиакриламидном геле T7-полимеразных копий с радиоактивной меткой, снятых с PIVACATI и pHgaNS. Полосы 5 и 6 характеризуют результаты анализа, выполненного на полиакриламидном геле, продуктов с радиоактивной меткой, полученных при проведении транскрипции in vitro под воздействием полимеразного белка вируса гриппа A в условиях использования матриц РНК IVACATI и РНК HgaNS. Полоса 1 отвечает РНК HgaNS с числом нуклеотидов 80. Полосы 2-4 отвечают различным препаратам РНК IVACATI. Полоса 5 отвечает вирусному полимеразному продукту транскрибирования РНК IVACATI. Полоса 6 отвечает вирусному полимеразному продукту транскрибирования РНК HgaNS.

Фиг. 13. Схематическое изображение последовательности проведения опытов по рибонуклеопротеидной трансфекции и переносу.

Фиг. 14. Хлорамфениколацетилтрансферазные анализы (CAT-анализы) клеток, подвергнутых рибонуклеопротеидной трансфекции с РНК IVACATI. На фиг. 14a показан временной ход рибонуклеопротеидной трансфекции в 293 клетках. Клетки подвергали трансфекции рекомбинантным рибонуклеопротеидом, делая это в момент времени - 1 ч, и заражали вирусом в момент времени 0 ч. Клетки собирали в указанные моменты времени и подвергали анализу на CAT-активность. На фиг. 14B указаны условия проведения рибонуклеопротеидной трансфекции 293 клеток Paramaeters, находящихся в реакционных смесях. На фиг. 14C проиллюстрирована рибонуклеопротеидная трансфекция клеток MDCK. Клетки MDCK подвергали трансфекции IVACATI РНК-полимеразой в момент времени, составляющий либо - 1 ч, либо + 2 ч относительно момента заражения вирусом. Клетки собирали и подвергали анализу на CAT-активность в указанные моменты времени. Компоненты и условия проведения реакции были такими, какими они указаны на чертеже. Параметр "время" ("ТЙМЕ") отвечает моменту сбора клеток. Момент времени T=0 отвечает моменту добавления помогающего вируса. Надпись "RNA" отвечает IVACATI-РНК. Надпись "Pol" отвечает белковому комплексу с полимеразой вируса гриппа A/PR/8/34. Надпись "WSN" отвечает вспомогательному вирусу гриппа A/WSN/33. Надпись "Pre-Inc" указывает на проведение предварительной инкубации РНК и полимеразы в транскрипционном буфере при 30^oC в течение 30 мин. Надпись "RNP transafection "(РНП (рибонуклеопротеидная) трансфекция") указывает время проведения рибонуклеопротеидной трансфекции, заданное относительно времени вирусного заражения. Обозначения "+/-" указывают на наличие или отсутствие данного компонента/признака. Обозначение "C" отвечает контрольным анализам, проведенным с использованием выпускаемого промышленностью CAT-фермента (фирма "Боерингер-Маннгейм").