Модифицированная фосфоенолпируваткарбоксилаза, фрагмент днк, штамм escherichia coli, рекомбинантная днк, способ получения аминокислоты (варианты), способ селекции клеток escherichia coli, способ получения модифицированной фосфоенолпируваткарбоксилазы, способ получения фрагмента днк и способ получения микроорганизма

Патент 2133772

Авторы

Классы МПК

C12N9/88 - лиаза (4.)

Реферат

Предложена фосфоенполпируваткарбоксилаза, у которой остаток глутаминовой кислоты в положении 625 замещен на остаток лизина и/или остаток аргинина в положении 222, и/или остаток глутаминовой кислоты в положении 223 на остаток гистидина и остаток лизина соответственно. Кроме того, сериновый остаток в положении 288, остаток глутаминовой кислоты в положении 289, остаток метионина в положении 551 и остаток глутаминовой кислоты в положении 804 могут быть заменены на остаток фенилаланина, остаток лизина, остаток изолейцина и остаток лизина соответственно. Также могут быть заменены остаток аланина в положении 867 на остаток треонина и/или остаток аргинина в положении 438 на остаток цистеина, и/или остаток лизина в положении 620 на остаток серина. Фосфоенолпируваткарбоксилаза продуцируется штаммом Escherichia coli. Модифицированная фосфоенолпируваткарбоксилаза малочувствительна к ингибированию аспарагиновой кислотой. 11 с. и 7 з.п. ф-лы, 9 табл., 13 ил.

Данное изобретение касается мутантной фосфоенолпируваткарбоксилазы, кодирующего ее гена и способа получения аминокислоты, и, в частности, касается гена, имеющего мутацию, вызывающую десенсибилизацию (снижение чувствительности) к ингибированию аспарагиновой кислотой по типу обратной связи, и его применение.

Предпосылки изобретения Фосфоенолпируваткарбоксилаза является ферментом, который обнаружен почти во всех бактериях и во всех растениях. Этот фермент играет роль в биосинтезе аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты и подаче C4-дикарбоновой кислоты в цикл лимонной кислоты для поддержания его оборота. Однако, в области ферментативного получения аминокислот при помощи микроорганизмов было несколько сообщений о действии этого фермента, которые не прояснили его роли (Atsushi Yokota and Isamu Shiio, Agric. Biol. Chem., 52, 455-463 (1988), Josef Cremer et al., Appl. Environ. Microbiol., 57, 1746-1752 (1991), Petra, G. Peters-Weintisch, FEMS Microbiol. Letters, 112, 269-274 (1993)).

Между прочим, аминокислота является соединением, которое повсеместно существует в клетках в виде компонентов белков, однако, в целях экономичного метаболизма энергии и метаболизма веществ ее образование строго контролируется. Этот контроль представляет собой в принципе контроль по типу обратной связи, в котором конечный продукт метаболического пути ингибирует активность фермента, катализирующего более раннюю стадию этого пути. Фосфоенолпируваткарбоксилаза также подвергается различным типа регуляции в проявлении ее активности.

Например, в случае фосфоенолпируваткарбоксилазы микроорганизмов, принадлежащих к роду Corynebacterium или к роду Escherichia, активность фермента ингибируется аспарагиновой кислотой. Таким образом, вышеупомянутый биосинтез аминокислоты, в котором участвует фосфоенолпируваткарбоксилаза, также ингибируется аспарагиновой кислотой.

В предшествующих исследованиях были разработаны различные способы эффективного получения аминокислот при помощи ферментации и ферментативным путем получали лейцин, изолейцин, триптофан, фенилаланин и т.п. с применением мутантных штаммов, которые были сделаны нечувствительными к контролю по типу обратной связи. Однако, не было известно ни о мутантной фосфоенолпируваткарбоксилазе, превращенной в фермент, нечувствительный к ингибированию аспарагиновой кислотой, ни о попытках использовать этот фермент для ферментативного получения аминокислот из семейства аспарагиновой кислоты и семейства глутаминовой кислоты.

С другой стороны, уже был клонирован ppc ген, который является геном, кодирующим фосфоенолпируваткарбоксилазу Escherichia coli, и была также определена его нуклеотидная последовательность (Fujita, N., Miwa, T., Ishijima, S. , Izui, K. and Katsuki, H., J. Biochem., 95, 909-916 (1984). Однако нет сообщений о мутанте, в котором снижена чувствительность к ингибированию аспарагиновой кислотой.

Данное изобретение осуществлено на основании указанной точки зрения и целью данного изобретения является создание мутантной фосфоенолпируваткарбоксилазы с существенно сниженной чувствительностью к ингибированию аспарагиновой кислотой по типу обратной связи, обеспечению гена, кодирующего фермент, и способа его применения.

Описание изобретения В результате усердного исследования для достижения указанной выше цели авторы данного изобретения обнаружили, что ингибирование аспарагиновой кислоты существенно десенсибилизируется посредством замены аминокислоты в специфическом сайте фосфоенолпируваткарбоксилазы Escherichia coli другой аминокислотой, что привело к получению гена, кодирующего мутантный фермент, что и явилось завершением данного изобретения.

Конкретно, данное изобретение заключается в получении мутантного фосфоенолпируваткарбоксилазы, происходящей из микроорганизма рода Escherichia и имеющей мутацию для снижения чувствительности (десенсибилизации) к ингибированию аспарагиновой кислотой по типу обратной связи, и последовательности ДНК, кодирующей мутантную фосфоенолпируваткарбоксилазу.

Далее данное изобретение обеспечивает микроорганизмы, принадлежащие к роду Escherichia или к коринеформным бактериям, несущие в себе этот фрагмент ДНК, и способ получения аминокислоты, предусматривающий культивирование любого из этих микроорганизмов в предпочтительной среде и выделение аминокислот, выбранных из L-лизина, L-треонина, L-метионина, L-изолейцина, L-глутаминовой кислоты, L-аргинина и L-пролина, из этой среды.

В применении к этому описанию ДНК последовательность, кодирующую мутантную фосфоенолпируваткарбоксилазу, или последовательность ДНК, содержащую, кроме того, промотор, иногда называют просто "последовательность ДНК данного изобретения", "мутантным геном" или "геном фосфоенолпируваткарбоксилазы".

Далее данное изобретение будет объяснено подробно.

<1> Мутантная фосфоенолпируваткарбоксилаза.

Мутантная фосфоенолпируваткарбоксилаза данного изобретения (далее называемая "мутантным ферментом") основана на фосфоенолпируваткарбоксилазе микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, имеющему мутацию, вызывающую десенсибилизацию (снижение чувствительности) к ингибированию по типу обратной связи аспарагиновой кислоты.

Такая мутация может быть любой мутацией при условии, что чувствительность к ингибированию по типу обратной связи существенно снижается без потери ферментативной активности фосфоенолпируваткарбоксилазы. В качестве примера можно привести мутацию, которая в случае существования мутантной фосфоенолпируваткарбоксилазы с такой мутацией в клетках микроорганизма Escherichia придает этим клеткам устойчивость к соединению, имеющему следующие свойства: соединение проявляет ингибирующее рост действие против микроорганизма рода Escherichia, продуцирующего немутантную фосфоенолпируваткарбоксилазу (дикого типа); указанное ингибирующее рост действие снимается присутствием L-глутаминовой кислоты или L-аспарагиновой кислоты; и соединение ингибирует фосфоенолпируваткарбоксилазную активность дикого типа.

Более конкретно, в качестве примеров таких мутацией могут быть приведены следующие мутации (нумерация от N-конца фосфоенолпируваткарбоксилазы): (1) мутация для замены глутаминовой кислоты 625 лизином; (2) мутация для замены 222 гистидином и глутаминовой кислоты 223 лизином, соответственно; (3) мутация для замены серина 288 фенилаланином, глутаминовой кислоты 289 лизином, метионина 551 изолейцином и глутаминовой кислоты 804 лизином соответственно; (4) мутация для замены аланина 867 треонином; (5) мутация для замены аргинина 438 цистеином; и (6) мутация для замены лизина 620 серином.

Для фосфоенолпируваткарбоксилазы микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, аминокислотная последовательность, выведенная из гена фосфоенолпируваткарбоксилазы Escherichia coli (Fujita, N., Miwa, T., Ishijima, S., Izui, K. и Katsuki, H., J. Biochem., 95, 909-916 (1984)), показана в SEQ ID N 2 в Списке последовательностей. Кроме того, полная нуклеотидная последовательностью плазмиды pT2, содержащей ген фосфоенолпируваткарбоксилазы Escherichia coli, показана в SEQ ID N 1 вместе с аминокислотной последовательностью (см. в конце описания).

Указанные выше мутантные ферменты кодируются последовательностями ДНК данного изобретения, описанными ниже, которые образуются путем экспрессии этих последовательностей ДНК в Escherichia coli и т.п.

<2> Последовательность ДНК данного изобретения и содержащие ее микроорганизмы.

Последовательность ДНК данного изобретения включает последовательности ДНК, кодирующие вышеупомянутые мутантные ферменты, и имеет мутацию, вызывающую десенсибилизацию к ингибированию по типу обратной связи фосфоенолпируваткарбоксилазы аспарагиновой кислотой, в кодирующих районах во фрагментах ДНК, кодирующих фосфоенолпируваткарбоксилазу микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia.

Конкретно можно провести в качестве примера последовательность ДНК, кодирующую фосфоенолпируваткарбоксилазу, имеющую любую из указанных выше мутаций (1) - (6). В отношении нуклеотидной последовательности SEQ ID N 1 можно привести в качестве примера последовательность ДНК, имеющую любую из следующих мутаций: i) мутацию для превращения GAA с номерами оснований 2109-2111 в AAA или AAG; ii) мутацию для превращения CGC с номерами оснований 900-902 в CAT или CAC и GAA 903-905 в AAA или AAG соответственно; iii) мутацию для превращения TCT с номерами оснований 1098-1100 в TTT или TTC, GAA 1101-1103 в AAA или AAC, ATG 1887-1889 в ATT, ATC или ATA и GAA 2646-2648 в AAA или AAG соответственно: iv) мутацию для превращения GCG 2835-2837 в любой из кодонов ACT, ACC, ACA и ACG; и v) мутацию для превращения CGT 1548-1550 в TGT или TGC; и vi) мутацию для превращения AAA 2094-2096 в TCT, TCC, TCA или TCG.

Такой мутантный ген получают таким образом, что рекомбинантную ДНК, полученную лигированием гена фосфоенолпируваткарбоксилазы в виде немутантного гена фермента или имеющего другую мутацию гена, с вектором ДНК, адаптированным к хозяину, подвергают мутирующей обработке для проведения скрининга трансформантов при помощи рекомбинантной ДНК. Альтернативно приемлемо также подвергнуть микроорганизм, продуцирующий немутантный фермент, мутирующей обработке, в результате которой получают мутантный штамм, продуцирующий мутантный фермент, а затем мутантный ген скринируют из мутантного штамма. Для получения мутации рекомбинантной ДНК применяют гидроксиламин и т.п. Далее при обработке самого микроорганизма условиями мутагенеза можно применять лекарственное средство или способ, обычно применяемые для искусственного мутагенеза.

Далее в соответствии с такими способами, как способ перекрывающегося удлинения (Ho, S.N., Hunt, H.D., Horton, R.M., Publen, J.K. and Pease, L.R., Gene, 77, 51-59 (1989)), способ сайт-специфического мутагенеза (Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T.A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)) и др., указанный мутантный ген может быть также получен путем введения мутации, такой как замена аминокислоты, инсерция, делеция и т.п., в ген фосфоенолпируваткарбоксилазы в виде немутантного гена фермента или в виде гена, имеющего другую мутацию. Эти способы основаны на принципе, что немутированный ген ДНК применяют в качестве матрицы, а синтетическую ДНК, содержащую ошибочное спаривание оснований в точке мутации, применяют в качестве одного из праймеров для синтеза комплементарных цепей указанного гена ДНК, вследствие чего происходит введение мутации. С применением этих способов можно получить предполагаемую мутацию в целевом сайте.

Альтернативно синтезируют последовательность, которая имеет сайты расщепления рестриктазами на обоих концах и включает обе стороны точки мутации, и заменяют ею соответствующую часть немутированного гена, в результате чего может быть введена мутация (кассетный способ мутирования).

Ген фосфоенолпируваткарбоксилазы, представляющий немутантный ген фермента или имеющий другую мутацию, используемый для введения мутации, может быть любым геном этого фермента при условии, что он является геном, кодирующим фосфоенолпируваткарбоксилазу микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, который предпочтительно имеет определенную последовательность оснований (т. е. секвенирован) и клонирован. Если он не был клонирован, можно амплифицировать и выделить фрагмент ДНК, содержащий этот ген, при помощи PCR-метода и т.п. с последующим применением подходящего вектора для достижения клонирования.

В качестве примера гена, описанного выше, можно привести ген Escherichia coli, который был клонирован и секвенирован (Fujita, N., Miwa, T., Ishijima, S. , Izui, K. and Katsuki, H., J. Biochem., 95, 909-916 (1984)). Последовательность в кодирующем районе этого гена показана в SEQ ID N 1 (основания N 237-2888).

Скрининг хозяина, несущего этот мутантный ген, может быть выполнен с применением соединения-аналога аспарагиновой кислоты. Соединение-аналог имеет предпочтительно следующие свойства. Оно проявляет ингибирующее рост действие против микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, продуцирующего немутантную фосфоенолпируваткарбоксилазу, это ингибирующее действие снимается присутствием L-глутаминовой кислоты или L-аспарагиновой кислоты, и аналог ингибирует фосфоенолпируваткарбоксилазу дикого типа.

Если из микроорганизмов рода Esсherichia выбран мутантный штамм, устойчивый к соединению-аналогу, указанному выше, например, Escherichia coli HB101, продуцирующий фосфоенолпируваткарбоксилазу дикого типа, с применением ингибирования роста этого микроорганизма в качестве критерия, то существует большая вероятность получения микроорганизма-хозяина, который продуцирует фосфоенолпируваткарбоксилазу с пониженной чувствительностью к ингибированию по типу обратной связи аспарагиновой кислотой.

В качестве общей структуры ингибитора фосфоенолпируваткарбоксилазы предлагается в основном структура C4-карбоновых кислот. С этой точки зрения, авторы данного изобретения подвергали скринингу различные соединения. Escherichia coli HB101 культивировали в LB среде и переносили на M9 среды (содержащие 20 мкг/мл тиамина и 3 мкг/мл каждого из Leu и Pro), содержащие также одно из следующих соединений: DL-2-амино-4-фосфономасляную кислоту, бромянтарную кислоту, мезо-2,3-дибромянтарную кислоту, 2,2-дифторянтарную кислоту, 2-бромпировиноградную кислоту, -кетомасляную кислоту, -кетоадипиновую кислоту, DL-трео--гидроксиаспарагиновую кислоту, -метиловый эфир L-аспарагиновой кислоты, -метил-DL-аспарагиновую кислоту, 2,3-диаминоянтарную кислоту или -гидразид аспарагиновой кислоты, и поглощение этой среды измеряли при 660 нм по мере увеличения времени, наблюдая за ростом.

Далее, когда эти соединения присутствовали при концентрациях, ингибирующих рост, исследовали, снималось ли это ингибирование добавлением нуклеиновых кислот (уридином, аденозином, каждый в концентрации 10 мг/дл), глутаминовой кислоты или аминокислотами семейства аспарагиновой кислоты (Asp: 0,025%, каждый из Met, Thr, Lys: 0,1%).

В результате были выбраны три соединения: 3-бромпируват (3BP) (1), аспартат--гидразид (AHУ) (2) и DL-трет--гидроксиаспартат (HA) (3).

Ингибирование роста Escherichia coli этими соединениями-аналогами показано на фиг. 1-3. Далее восстановление роста Escherichia coli в случае добавления снимающих ингибирование веществ, отдельно или в виде смеси 2 или 3 типов веществ, показано на фиг. 4-6. Кроме того, в качестве контроля рост в случае добавления снимающих ингибирование веществ в отсутствие ингибирующего вещества показан на фиг. 7. На фиг. 4-7 добавки 1, 2 и 3 обозначают нуклеиновые кислоты, глутаминовую кислоту или аминокислоты семейства аспарагиновой кислоты соответственно.

Далее ингибирование активности соединением-аналогом фосфоенолпируваткарбоксилазы также исследовали. Неочищенный фермент получали из штамма Escherichia coli HB101 согласно способу, описанному в Journal of Biochemistry, vol. 67, N 4 (1970) и активность фермента измеряли согласно методу, описанному в Eur. J. Biochem., 202, 797-803 (1991).

Клетки Escherichia coli HB101, культивируемые в LB среде, разрушали, и суспензию центрифугировали для получения супернатанта, который применяли в качестве раствора неочищенного фермента. Измеряли активность фермента измерением уменьшения в поглощении при 340 нм, добавляя ацетил-кофермент A, который, как известно, влияет на активность фермента, в концентрации 0,1 мМ в систему для измерения, содержащую 2 мМ фосфоенолпируват калия, 0,1 мМ НАДН, 0,1 М трис-ацетат (pH 8,5), 1,5 E малатдегидрогеназы и неочищенный фермент. Результаты представлены на фиг. 8.

В соответствии с представленными выше результатами очевидно, что указанные три соединения ингибируют рост Escherichia coli, это ингибирование не может быть снято добавлением только нуклеиновых кислот, но оно может быть снято добавлением глутаминовой кислоты или аминокислот семейства аспарагиновой кислоты. Таким образом, эти соединения-аналоги являются избирательными ингибиторами фосфоенолпируваткарбоксилазы. Как показано в описанных ниже примерах, с применением этих соединений в данном изобретении удалось выбрать Escherichia coli, которая продуцирует мутантную фосфоенолпируваткарбоксилазу.

При скрининге трансформанта, имеющего целевой ген мутантного фермента, при помощи указанных соединений и выделении рекомбинантной ДНК получают мутантный ген фермента. Альтернативно в случае мутирующей обработки самого микроорганизма, когда мутантный штамм, имеющий целевой ген мутантного фермента, скринируют при помощи указанных соединений, из штамма выделяют фрагмент ДНК, содержащий целевой ген мутантного фермента, и его лигируют с подходящим вектором и затем получают ген мутантного фермента.

С другой стороны, в результате обстоятельного исследования авторов данного изобретения, обращающих внимание на важность остатка аргинина в аспартатсвязующем белке Esсherichia coli (Krikos, A., Mouth, N., Boyd, A. and Simon, M. I. Cell, 33, 615-622 (1983), Mowbray, S.L. and Koshland, D.E. J. Biol. Chem., 264, 15638-15643 (1990), Milburn, M.V., Prive. G.G., Milligan, D.L., Scott, W.G., Yeh, J., Jancarik, J., Koshland, D.E. and Kim, S.H., Science, 254, 1342-1347 (1991)), было обнаружено, что ингибирование аспарагиновой кислотой существенно десенсибилизируется превращением аргинина 438 фосфоенолпируваткарбоксилазы в цистеин. Для превращения аргинина 438 в цистеин кодон аргинина 438 гена, кодирующего фосфоенолпируваткарбоксилазу, может быть превращен в кодон цистеина. Например, в SEQ ID N 1 CGT нуклеотиды 1548-1550 могут быть превращены в TGT или TGC.

Далее авторы данного изобретения осуществили химическую модификацию остатков лизина фосфоенолпируваткарбоксилазы при помощи 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты (TNBS), которая является соединением, химически модифицирующим остатки лизина в белке. Во время реакции модификации присутствовала также яблочная кислота, способная действовать как ингибитор фосфоенолпируваткарбоксилазы. Предполагалось, что остаток лизина вблизи связывающего положения фосфоенолпируваткарбоксилазы мог бы быть защищенным путем связывания яблочной кислоты и не подвергаться химической модификации. В результате было сделано предположение, что остаток лизина 620 был важен для связывания яблочной кислоты с фосфоенолпируваткарбоксилазой, и было обнаружено, что ингибирование по типу обратной связи аспарагиновой кислотой было десенсибилизировано при сохранении ферментативной активности фосфоенолпируваткарбоксилазы посредством превращения остатка лизина 620 в остаток серина. Для превращения остатка лизина в остаток серина кодон лизина 620 гена, кодирующего фосфоенолпируваткарбоксилазу, может быть превращен в кодон серина. Например, в SEQ ID N 1 AAA с номерами нуклеотидов 2094-2096 может быть заменен TCT, TCC, TCA, TCG, AGT или AGC.

В соответствии с такими способами, как способ перекрывающегося удлинения (Ho, S. N. , Hunt, H.D., Horton, R.M., Pullen, J.K., and Pease, L.R., Gene, 77, 51-59 (1989)), способ сайт-специфической мутации (Kramer, W. and Frits, H. J. , Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T.A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)) и т.п., превращение этого кодона может быть достигнуто введением такой мутации, как замена аминокислоты, инсерция, делеция и т. п. , в ген фосфоенолпируваткарбоксилазы в виде гена фермента дикого типа или в виде гена, имеющего другую мутацию. Эти способы основаны на принципе, что немутированный ген ДНК используют в качестве матрицы, а синтетическую ДНК, содержащую ошибочное спаривание при точке мутации, используют в качестве одного из праймеров для синтеза комплементарных цепей вышеупомянутого гена ДНК, тем самым вводя мутацию. При помощи этих способов можно получить желаемую мутацию в целевом сайте.

Альтернативно синтезируют последовательность, имеющую сайты расщепления рестриктазами на обоих концах и содержащую обе стороны точки мутации, и заменяют ею соответствующую часть немутированного гена, посредством чего может быть введена мутация (кассетный способ мутирования).

Фрагмент ДНК, кодирующий фосфоенолпируваткарбоксилазу с введенной, как описано выше, мутацией экспрессируют с применением подходящей системы хозяин-вектор, при помощи которой можно получить мутантный фермент. Альтернативно даже выполнением трансформации посредством встраивания фрагмента ДНК данного изобретения в хромосомную ДНК хозяина можно получить целевой мутантный фермент.

В качестве хозяина могут применяться микроорганизмы, принадлежащие к роду Escherichia, например Escherichia coli, коринеформные бактерии и т.п. Коринеформные бактерии включают в себя бактерии, принадлежащие к роду Corynebacterium, бактерии, принадлежащие к роду Brevibacterium, классифицированные до настоящего времени как принадлежащие к роду Brevibacterium, но в настоящее время объединенные как бактерии, принадлежащие к роду Corynebacterium, и бактерии, действительно принадлежащие к роду Brevibacterium, близко родственные бактериям, принадлежащим к роду Corynebacterium. Хозяева, предпочтительные для получения аминокислоты, будут описаны ниже.

С другой стороны, в качестве вектора ДНК предпочтителен плазмидный вектор и предпочтительны плазмидные векторы, способные самореплицироваться в клетке-хозяине. В случае хозяина Escherichia coli, например, применимы pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, RSF1010 и т.п. Альтернативно можно также использовать в качестве вектора ДНК фага.

Далее в случае, если хозяином является коринеформная бактерия, могут использоваться векторы и несущие их хозяева, указанные ниже. В этих примерах номера депозитов в международных хранилищах (депозитариях) показаны в скобках.

pAj655 Escherichia coli Aj11882 (FERM BP-136) Corynebacterium glutamicum SR8201 (ATCC 39135) pAj1844 Escherichia coli Aj11883 (FERM BP-137) Corynebacterium glutamicum 8202 (ATCC 39136) pAj611 Escherichia coli Aj11884 (FERM BP-138) pAj3148 Corynebacterium glutamicum 8203 (ATCC 39137) pAj440 Bacillus subtilis Aj11901 (FERM BP-140) Эти векторы могут быть получены из депонированных микроорганизмов следующим образом. Клетки, собранные в логарифмической фазе роста, подвергают бактериолизу с применением лизозима и додецилсульфата натрия (SDS) и центрифугируют при 30000g для получения раствора супернатанта из лизата, к которому добавляют полиэтиленгликоль для выполнения отделения и очистки векторов при помощи равновесного центрифугирования в градиенте плотности хлорид цезия-бромида этидия.

Для трансформации Escherichia coli рекомбинантным вектором, полученным встраиванием последовательности ДНК данного изобретения в указанный выше вектор, можно использовать способ, обычно применяемый для трансформации Escherichia coli, например способ, в котором клетки обрабатывают хлоридом кальция для усиления проникаемости ДНК (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1977)) и т.п.

Далее в качестве способа трансформации коринеформных бактерий также применяют указанный выше способ, в котором клетки обрабатывают хлоридом кальция, или способ, в котором включение выполняют при специфическом периоде роста, в котором клетки могут включать в себя ДНК (сообщение в отношении Bacillus subtilis Duncan, C. H. et al.). Далее включение в бактериальные клетки может быть достигнуто путем образования протопластов или сферопластов реципиентов ДНК, которые легко включают плазмидную ДНК. Они известны для Bacillus subtilis, Actinomyces и дрожжей (Chang, S. et al., Molec. Gen. Genet. , 168, 111 (1979), Bibb et al., Nature 274, 398 (1978), Hinnen, A. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)). Дополнительно способ трансформации коринеформных бактерий описан в JP Laid-open N 2-207791.

Для экспрессии последовательности ДНК данного изобретения в указанных выше хозяевах можно использовать такие промоторы, как lac, trp, PL и т.п., которые эффективно работают в микроорганизмах, или когда последовательность данного изобретения содержит промотор гена фосфоенолпируваткарбоксилазы, этот промотор можно использовать как таковой. Альтернативно в случае применения коринеформной бактерии в качестве хозяина можно также использовать известный trp промотор из бактерии, принадлежащей к роду Brevibacterium (JP Laid-open N 62-244382) и др.

Далее, как описано выше, допустимо, чтобы последовательность ДНК данного изобретения была встроена в вектор ДНК, способный самореплицироваться, и введена в хозяина, чтобы хозяин удерживал ее в виде плазмиды. Также допустимо, чтобы последовательность ДНК данного изобретения была интегрирована в хромосому микроорганизма при помощи способа с применением транспозона (Berg, D. E. and Berg, C.M., Bio/Technol, 1, 417 (1983)) Mu-- фага (Japanese Patent Laid-open N 2-109985) или гомологичной рекомбинации (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)). Кроме того, для интеграции ДНК данного изобретения в коринеформные бактерии можно использовать чувствительную к температуре плазмиду, описанную в Japanese Patent Laid-open N 5-7491.

При культивировании микроорганизма, трансформированного последовательностью ДНК данного изобретения, описанной выше, и экспрессии этой последовательности ДНК получают мутантный фермент. В результате измерения активности путем добавления аспарагиновой кислоты к реакционной системе фермента становится ясно, имеет ли полученный таким образом мутантный фермент сниженную чувствительность к ингибированию по типу обратной связи аспарагиновой кислотой. Для измерения активности фермента можно использовать спектрометрический способ (Yoshinage, T. , Izui, K. and Katsuki, H., J. Biochem., 68, 747-750 (1970)) и т.п.

Далее последовательность ДНК данного изобретения кодирует мутантный фермент, в котором десенсибилизировано ингибирование по типу обратной связи аспарагиновой кислотой, так что микроорганизм, несущий эту последовательность ДНК, можно использовать для эффективного ферментативного продуцирования аминокислот семейства аспарагиновой кислоты и семейства глутаминовой кислоты, как описано ниже.

Escherichia coli AJ12907, AJ12908, AJ12909 и AJ12910, несущие гены мутантного фермента, полученные в примерах, описанных ниже, депонированы в National Institute of Bioscience and Human Technology of Agancy of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan; zip code 305) 3 августа 1993 г. под депозитными номерами FERM P-13774, FERM P-13775, FERM P-13776 и FERM P-13777, перенесены из первоначальных депозитариев в международный депозитарий на основе Budapest Treaty 11 июля 1994 г. и депонированы под депозитными номерами FERM BP-4734, FERM BP-4735, FERM BP-4736, FERM BP-4737 соответственно в этой последовательности.

<3> Способ получения аминокислот.

Аминокислоты могут быть получены культивированием микроорганизма, несущего в себе последовательность ДНК данного изобретения, в предпочтительной среде и выделением образовавшихся аминокислот. Такими аминокислотами могут быть, например, L-лизин, L-треонин, L-метионин, L-изолейцин, L-глутаминовая кислота, L-аргинин и L-пролин.

Примеры предпочтительных хозяев, в которые вводят последовательность ДНК данного изобретения для использования для получения каждой из этих аминокислот, и способа культивирования приводятся ниже.

(1) Хозяева, предпочтительные для получения L-лизина.

Примером хозяина, который может быть использован для получения L-лизина согласно данному изобретению, могут быть бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, предпочтительно продуцирующая L-лизин Escherichia coli. Конкретно может быть использован мутантный штамм, устойчивый к аналогу лизина. Такими аналогами лизина являются аналоги, которые ингибируют рост микроорганизмов, принадлежащих к роду Escherichia, однако эта супрессия полностью или частично десенсибилизируется при условии, что L-лизин также присутствует в среде. Например, имеются такие аналоги, как оксализин, лизингидроксамат-S-(2-аминоэтил)-цистеин (далее сокращаемый как "AEC"), -метиллизин, -xлоркапролактам и др. Мутантные штаммы, обладающие устойчивостью к этим аналогам лизина, могут быть получены путем применения обычной искусственной мутационной обработки к микроорганизмам рода Escherichia. Конкретно в качестве бактериального штамма, который можно применять для получения L-лизина, можно привести Escherichia coli AJ11442 (депонированный как FERM P-5084, см. нижний левый столбец на стр. Japanese Patent Laid-open N 56-18596).

С другой стороны, для данного изобретения можно использовать различные искусственные мутантные штаммы коринеформных бактерий в качестве продуцирующих лизин бактерий. Такими искусственными мутантными штаммами являются следующие: AEC-резистентный мутантный штамм; мутантный штамм, требующий для его роста аминокислоты, такой как L-гомосерин (Japanese Patent Publication N 48-28078 и N 56-6499); мутантный штамм, проявляющий резистентность к AEC и требующий аминокислоты, такой как L-лейцин, L-гомосерин, L-пролин, L-серин, L-аргинин, L-аланин, L-валин и т.п. для его роста (US Patent N 3708395 и N 3825472); продуцирующий L-лизин мутантный штамм, проявляющий резистентность к DL -амино -капролактаму, -амино-лауриллактаму, хиноиду и N-лауроиллейцину; продуцирующий L-лизин мутантный штамм, проявляющий резистентность к ингибитору оксалоацетатдекарбоксилазы или фермента дыхательной системы (Japanese Patent Laid-open N 50-53588, 52-102498, 53-86089, 55-9783, 55-9759, 56-32995, 56-39778 и Japanese Patent Publication N 53-43591 и 53-1833); продуцирующий L-лизин мутантный штамм, требующий инозита или уксусной кислоты (Japanese Patent Laid-open N 55-9784 и 56-8692); продуцирующий L-лизин мутантный штамм, проявляющий чувствительность к фторпирувату или температуре не менее 34^oC (Japanese Patent Laid-open N 55-9783 и 53-86090); и мутантный штамм Brevibacterium или Corynebacterium, проявляющий резистентность к этиленгликолю и продуцирующий L-лизин (см. US Patent Application Serial N 333455).

Далее приведены конкретные примеры коринеформных бактерий, применимых для получения лизина: Brevibacterium lactofermentum AJ12031 (FERM-BP277), см. стр. 525 в Japanese Patent Laid-open N 60-62994; Brevibacterium lactofermentum ATCC 39134, см. нижнюю правую колонку на стр. 473 в Japanese Patent Laid-open N 60-62994; Brevibacterium lactofermentum AJ3463 (FERM-P1987), см. Japanese Patent Publication N 51-34477.

Кроме того, дикие штаммы коринеформных бактерий, описанные ниже, также можно применять таким же образом для данного изобретения.

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806 Corynebacterium callunae ATCC 14991 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 ATCC 13060 (Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020 (Brevibacterium Lactofermentum) ATCC 13869 (Corynebacterium lilium) ATCC 15990 Corynebacterium melassecola ATCC 17965 Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066 Brevibacterium immariophilum ATCC 14068 Brevibacterium roseum ATCC 13825 Brevibacterium flavum ATCC 13826 Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240 Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354 (ii) Хозяева, предпочтительные для получения L-треонина.

Escherichia coli B-3996 (RIA 1867), см. Japanese Patent Laid-open N 3-501682 (PCT); Escherichia coli AJ12349 (FERM-P9574), см. верхнюю левую колонку на стр. 887 в Japanese Patent Laid-open N 2-458; Escherichia coli AJ12351 (FERM-P9576), см. нижнюю правую колонку на стр. 887 в Japanese Patent Laid-open N 2-458; Escherichia coli AJ12352 (FERM P-9577), см. верхнюю левую колонку на стр. 888 в Japanese Patent Laid-open N 2-458; Escherichia coli AJ11332 (FERM P-4898), см. верхнюю левую колонку на стр. 889 в Japanese Patent Laid-open N 2-458; Escherichia coli AJ12350 (FERM P-9575), см. верхнюю левую колонку на стр. 889 в Japanese Patent Laid-open N 2-458; Escherichia coli AJ12353 (FERM P-9578), см. верхнюю правую колонку на стр. 889 в Japanese Patent Laid-open N 2-458; Escherichia coli AJ12358 (FERM P- 9764), см. верхнюю левую колонку на стр. 890 в Japanese Patent Laid-open N 2-458; Escherichia coli AJ12359 (FERM P-9765), см. верхнюю левую колонку на стр. 890 в Japanese Patent Laid-open N 2-458; Escherichia coli AJ11334 (FERM P-4900), см. колонку 6 на стр. 201 в Japanese Patent Publication N 1-29559; Escherichia coli AJ11333 (FERM P-4899), см. колонку 6 на стр. 201 в Japanese Patent Publication N 1-29559; Escherichia coli AJ11335 (FERM P-4901), см. колонку 7 на стр. 202 в Japanese Patent Publication N 1-29559.

Следующие бактериальные штаммы приведены в качестве примеров коринеформных бактерий: Brevibacterium lactofermentum AJ11188 (FERM P-4190), см. верхнюю правую колонку на стр. 473 в Japanese Patent Laid-open N 60-87788; Corynebacterium glutamicum AJ11682 (FERM BP418), см. колонку 8 на стр. 230 в Japanese Patent Publication N 2-31956; Brevibacterium flavum AJ11683 (FERM BP-119), см. колонку 10 на стр. 231 в Japanese Patent Publication N 2-31956.

(iii) Хозяева, предпочтительные для получения L-метионина.

Следующие бактериальные штаммы приведены в качестве примеров бактерий для получения L-метионина: Escherichia coli AJ11457 (FERM P-5175), см. верхнюю правую колонку на стр. 552 в Japanese Patent Laid-open N 56-35992; Escherichia coli AJ11458 (FERM P-5176), см. верхнюю правую колонку на стр. 552 в Japanese Patent Laid-open N 56-35992; Escherichia coli AJ11459 (FERM P-5177), см. верхнюю правую колонку на стр. 552 в Japanese Patent Laid-open N 56-35992; Escherichia coli AJ11539 (FERM P-5479), см. нижнюю левую колонку на стр. 435 в Japanese Patent Laid-open N 56-144092; Escherichia coli AJ11540 (FERM P-5480), см. нижнюю левую колонку на стр. 435 в Japanese Patent Laid-open N 56-144092; Escherichia coli AJ11541 (FERM P25481), см. нижнюю левую колонку на стр. 435 в Japanese Patent Laid-open N 56-144092; Escherichia coli AJ11542 (FERM P-5482), см. нижнюю левую колонку на стр. 435 в Japanese Patent Laid-open N 56-144092.

(iv) Хозяева, предпочтительные для получения L-аспарагиновой кислоты.

Следующие бактериальные штаммы приведены в качестве примеров бактерий для получения L-аспарагиновой кислоты: Brevibacterium flavum AJ3859 (FERM P-2799), см. верхнюю левую колонку на стр. 524 Japanese Patent Laid-open N 51-61689; Brevibacterium lactofermentum AJ3860 (FERM P-2800), см. верхнюю левую колонку на стр. 524 в Japanese Patent Laid-open N 51-61689; Corynebacterium acetoacidophilum AJ3877 (FERM P-2803), см. верхнюю левую колонку на стр. 524 в Japanese Patent Laid-open N 51-61689; Corynebacterium glutamicum AJ3876 (FERM P-2802), см. верхнюю левую колонку на стр. 524 в Japanese Patent Laid-open N 51-61689; (v) Хозяева, предпочтительные для получения L-изолейцина.

Escherichia coli КХ141 (VKPM-B4781) (см. параграф 45 в Japanese Patent Laid-open N 4-33027) приведена в качестве бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, и Brevibacterium lactofermentum AJ12404 (FERM P-10141) (см. нижнюю левую колонку на стр. 603 в Japanese Patent Laid-open N 2-42988) и Brevibacterium flavum AJ12405 (FERM P-10142) (см. нижнюю левую колонку на стр. 524 в Japanese Patent Laid-open N 2-42988) приведены в качестве примеров коринеформных бактерий.

(vi) Хозяева, предпочтительные для получения L-глутaминoвoй кислоты.

Следующие бактериальные штаммы приведены в качестве бактерий, принадлежащих к роду Escherichia: Escherichia coli AJ12628 (FERM P-12389), см. Franch Patent Publication N 2 680 (1993); Escherichia coli AJ12624 (FERM P-12379), см. French Patent Publication N 2 680 178 (1993).

Следующие бактериальные штаммы приведены в качестве примеров коринеформных бактерий: Brevibacterium lactofermentum AJ12745 (FERM BP-2922), см. нижнюю правую колонку на стр. 561 в Japanese Patent Laid-open N 3-49690; Brevibacterium lactofermentum AJ12746 (FERM BP-2923), см. верхнюю левую колонку на стр. 562 в Japanese Patent Laid-open N 3-49690; Brevibacterium lactofermentum AJ12747 (FERM BP-2924), см. верхнюю левую колонку на стр. 562 в Japanese Patent Laid-open N 3-49690; Brevibacterium lactofermentum AJ12748 (FERM BP-2925), см. верхнюю левую колонку на стр. 562 в Japanese Patent Laid-open N 3-49690; Brevibacterium flavum ATCC 14067, см. таблицу 1 на стр. 3 в Japanese Patent Laid-open N 5-3793; Corynebacterium glutamicum ATCC 21492, см. таблицу 1 на стр. 3 в Japanese Patent Laid-open N 5-3793.

(vii) Хозяева, предпочтительные для получения L-аргинина.

Следующие бактериальные штаммы приведены в качестве бактерий, принадлежащих к роду Escherichia: Escherichia coli AJ11593 (FERM P-5616), см. верхнюю левую колонку на стр. 468 в Japanese Patent Laid-open N 57-5693; Escherichia coli AJ11594 (FERM P-5617), см. верхнюю правую колонку на стр. 468 в Japanese Patent Laid-open N 57-5693.

Следующие бактериальные штаммы приведены в качестве примеров коринеформных бактерий: Brevibacterium flavum AJ12144 (FERM P-7642), см. колонку 4 на стр. 174 в Japanese Patent Publication N 5-27388; Corynebacterium glutamicum AJ12145 (FERM P-7643), см. колонку 4 на ст. 174 в Japanese Patent Publication N 5-27388; Brevibacterium flavum ATCC 21493, см. таблицу 1 на стр. 3 в Japanese Patent Laid-open M 5-3793; Corynebacterium glutamicum ATCC 21659, см. таблицу 1 на стр. 3 в Japanese Patent Laid-open N 5-3793.

(viii) Хозяева, предпочтительные для получения L-пролина.

Следующие бактериальные штаммы приведены в качестве бактерий, принадлежащих к роду Escherichia: Escherichia coli AJ11543 (FERM P-5483), см. нижнюю левую колонку на стр. 435 в Japanese Patent Laid-open N 56-144093; Escherichia coli AJ11544 (FERM P-5484), см. нижнюю левую колонку на стр. 435 в Japanese Patent Laid-open N 56-144093.

Следующие бактериальные штаммы приведены в качестве примеров коринеформных бактерий: Brevibacterium lactofermentum AJ11225 (FERM P-4370), см. верхнюю левую колонку на стр. 473 в Japanese Patent Laid-open N 60-87788; Brevibacterium flavum AJ11512 (FERM P-5332), см. колонку 2 на стр. 185 в Japanese Patent Publication N 62-36679; Brevibacterium flavum AJ11513 (FERM P-5333), см. колонку 2 на стр. 185 в Japanese Patent Publication N 62-36679; Brevibacterium flavum AJ11514 (FERM P-5334), см. колонку 2 на стр. 185 в Japanese Patent Publication N 62-36679; Corynebacterium glutamicum AJ11522 (FERM P-5342), см. колонку 2 на стр. 185 в Japanese Patent N 62-36679; Corynebacterium glutamicum AJ11523 (FERM P-5343), см. колонку 2 на стр. 185 в Japanese Patent Publication N 62-36679.

(2) Способ культивирования.

Способ культивирования вышеуказанных хозяев не особенно отличается от способа культивирования продуцирующих аминокислоты микроорганизмов в предшествующих описаниях. Конкретно используют стандартную среду, содержащую источник углерода, источник азота и неорганические ионы