Способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных

Способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных

Реферат

 

Изобретение предназначено для изготовления средств специфической профилактики бешенства всех видов сельскохозяйственных и домашних животных. Фиксированный вирус бешенства (ВБ) культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при 35-37°С в течение 96-144 ч. По окончании репродукции ВБ в вируссодержащую суспензию вносят сначала в качестве стабилизатора полиакриловую кислоту (ПАК) или феракрил (ФА) до концентрации 0,7-1,0%. Затем вносят в качестве инактиванта димер этиленимина (ДЭИ) до концентрации 0,1-0,3%. Смесь инкубируют при 35-37°С в течение 20-24 ч. Полученную вакцину используют как в жидком, так и в сухом виде. Для получения сухого препарата жидкую вакцину высушивают сублимацией. Изобретение повышает специфическую безопасность, иммуногенную активность, стабильность и безвредность вакцины, а также снижает ее реактогенность и аллергенность. 7 з.п. ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении средств специфической профилактики бешенства всех видов сельскохозяйственных и домашних животных.

Бешенство животных относится к заболеваниям, неизбежно приводящим к гибели и, безусловно, является одной из самых страшных болезней, передаваемых человеку от животных. Поэтому борьба с ним представляется не только экономической, но социальной проблемой, успешное решение которой в значительной мере зависит от качества антирабических вакцин, применяемых с профилактической целью. Проблемы с созданием эффективной вакцины против бешенства животных обусловлены прежде всего трудностями, связанными с наработкой качественной биомассы вируса бешенства (ВБ).

Известен способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных, включающий репродукцию фиксированного ВБ, штамм "овечий" ВГНКИ, в мозговой ткани овец, внесение в вируссодержащую суспензию 1 % раствора фенола в качестве инактиванта, инкубацию смеси при 22^oC в течение 48 часов, ее соединение со средой высушивания, расфасовку препарата и его высушивание. Среда высушивания содержит 90 мл дистиллированной воды, 10 г сахарозы и 1,5 г желатины (1).

Недостатки данного способа заключаются в низкой иммуногенной активности полученной вакцины, высокой токсичности фенола и значительном содержании в препарате остаточного вируса, что способствует проявлению поствакцинальных осложнений у привитых животных, особенно у крупного рогатого скота и декоративных пород собак. Кроме того, содержащиеся в готовом препарате высокие концентрации сахарозы и желатины увеличивают реактогенность и аллергенность вакцины. Данный способ допускает выпуск нестерильного препарата.

Известен способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных с использованием инактиванта гидроксиламина (2).

Недостаток данного способа состоит в том, что используемый гидроксиламин не инактивирует микрофлору, присутствующую в вирусной суспензии.

Известен способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных, включающий репродукцию фиксированного ВБ, штамм "овечий" ВГНКИ, в мозговой ткани овец, внесение в вируссодержащую суспензию 20-21% раствора этанола в качестве инактиванта, инкубацию смеси при 30-31^oC в течение 12-14 суток, ее соединение со средой высушивания, расфасовку препарата и его высушивание. Среда высушивания включает 22.5 г сахарозы и 3 г желатины на 100 мл дистиллированной воды (3).

Недостатки данного способа заключаются в низкой иммуногенной активности полученного препарата, высокой трудоемкости его изготовления и нестерильности целевого продукта. Кроме того, содержащиеся в готовом препарате высокие концентрации сахарозы и желатины увеличивают реактогенность и аллергенность вакцины.

Известен способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных, включающий репродукцию фиксированного ВБ в культуре клеток ВНК-21, внесение в вируссодержащую суспензию в качестве инактиванта бета-пропиолактона до концентрации 0,02-0,03%, инкубацию смеси при 4-6^oC в течение 2-4 часов с последующим добавлением гидроокиси алюминия и сапонина в качестве адъювантов (4).

Недостатками данного способа являются нестабильность полученной вакцины, поскольку она выпускается в жидком виде, высокая себестоимость препарата, так как готовится из концентрированного антигена, наличие в вирусной суспензии контаминирующих вирусов и микрофлоры, попавших с сывороткой, клетками ВНК и из окружающей среды, так как использование бета-пропиолактона для инактивации инфекционности ВБ не обеспечивает стерильность вирусной суспензии.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных, включающий репродукцию фиксированного ВБ в культуре клеток ВНК-21, внесение в вируссодержащую суспензию в качестве инактиванта бета-пропиолактона до концентрации 0,02-0,03%, инкубацию смеси при 4-6^oC в течение 2-4 часов, добавление в нее стабилизатора, адьюванта и лиофилизацию целевого продукта. Стабилизатор содержит, мас.%: пептон (7,5-15), сахарозу (7,5-150), желатину (3-6), воду - остальное. В качестве адъюванта используют сапонин (5, 6).

Недостатки способа - прототипа: 1) низкая иммуногенная активность полученной вакцины; 2) использование бета-пропиолактона в режиме инактивации инфекционности ВБ не обеспечивает стерильность вирусной суспензии от контаминирующих агентов, попавших в нее с сывороткой, клетками ВНК и из окружающей среды; 3) содержащиеся в готовом препарате высокие концентрации пептона, сахарозы, желатины и сапонина увеличивают реактогенность и аллергенность вакцины.

В задачу создания изобретения входила разработка способа изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных, обеспечивающего унифицированное производство специфически безопасной, высокоиммуногенной, стабильной, безвредной, свободной от контаминирующих агентов вакцины как в жидком, так и сухом виде. Применение препарата должно гарантировать эффективную профилактику бешенства у всех видов сельскохозяйственных и домашних животных.

Технический результат от использования изобретения заключается в повышении специфической безопасности, иммуногенной активности, стабильности и безвредности вакцины, а также в снижении ее реакгогенности и аллергенности.

Указанный технический результат достигается созданием изобретения, охарактеризованного следующей совокупностью признаков: 1) способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных; 2) репродукция фиксированного ВБ в культуре клеток; 3) в качестве культуры клеток используют суспензионную культуру клеток ВНК-21; 4) по окончании репродукции вируса в вируссодержащую суспензию сначала вносят стабилизатор, а затем инактивант; 5) в качестве стабилизатора используют полиакриловую кислоту (ПАК) или ее соль; 6) в качестве соли ПАК используют феракрил (ФА); 7) ПАК или ФА вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,7-1,0%; 8) в качестве инактиванта вируса используют димер этиленимина (ДЭИ); 9) ДЭИ вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,1-0,3%; 10) смесь вируссодержащей суспензии, ПАК или ФА с ДЭИ инкубируют при 35-37^oC в течение 20-24 часов; 11) полученный препарат используют в жидком виде; 12) полученный препарат высушивают сублимацией.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана: 1) способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных; 2) репродукция фиксированного ВБ в культуре клеток; 3) по окончании репродукции вируса в вируссодержащую суспензию сначала вносят стабилизатор, а затем инактивант; 4) использование ПАК или ее соли в качестве стабилизатора; 5) использование ДЭИ в качестве инактиванта ВБ.

Предлагаемый способ характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы его выполнения: 1) в качестве культуры клеток используют суспензионную культуру клеток ВНК-21; 2) в качестве соли ПАК используют феракрил (ФА); 3) стабилизатор ПАК или ФА вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,7-1,0%; 4) ДЭИ вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,1-0,3%; 5) смесь инкубируют при 35-37^oC в течение 20-24 часов; 6) полученный препарат используют в жидком виде; 7) полученный препарат высушивают сублимацией.

Достижение технического результата от использования предлагаемого изобретения можно объяснить следующим образом.

Повышение специфической безопасности препарата, полученного предлагаемым способом, достигается за счет инактивации ВБ и контаминирующих агентов смесью ПАК или ФА с ДЭИ.

Повышение иммуногенной активности препарата, полученного предлагаемым способом, достигается за счет присутствия в вакцине смеси ПАК или ФА с ДЭИ.

Повышение стабильности вакцины, полученной предлагаемым способом, достигается за счет иммобилизации органических веществ в вируссодержащей суспензии с помощью ПАК или ФА.

Снижение реактогенности и аллергенности сухого препарата, полученного предлагаемым способом, достигается за счет исключения сапонина и среды высушивания, включающей пептон, сахарозу и желатину, а жидкой вакцины - за счет исключения гидроокиси алюминия и сапонина. ПАК и ФА не являются антигенами.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый способ и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются: 1) способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных; 2) репродукция фиксированного ВБ в культуре клеток; 3) внесение инактиванта в вируссодержащую суспензию для инактивации полученного вируса; 4) инкубация смеси; 5) внесение стабилизатора.

По сравнению со способом-прототипом существенными отличительными признаками изобретения являются: 1) по окончании репродукции вируса в вируссодержащую суспензию сначала вносят стабилизатор, а затем инактивант; 2) использование ПАК или ее соли в качестве стабилизатора; 3) использование ДЭИ в качестве инактиванта ВБ.

Предлагаемый способ характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы его выполнения: 1) в качестве культуры клеток используют суспензионную культуру клеток ВНК-21; 2) в качестве соли ПАК используют ФА; 3) ПАК или ФА вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,7-1,0%; 4) ДЭИ вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,1-0,3%; 5) смесь инкубируют при 35-37^oC в течение 20-24 часов; 6) полученный препарат используют в жидком виде; 7) полученный препарат высушивают сублимацией.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентам и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого способа, позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого способа. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков аналога, позволил установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков в предлагаемом способе, изложенных в формуле изобретения.

Следовательно, предлагаемый способ соответствует условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемого способа условию патентоспособности "изобретательский уровень" заявителем проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть формулы изобретения. В результате поиска установлено следующее.

Известно использование ПАК в качестве стимулятора иммунитета (7, 8).

Известно использование ФА (неполная железная соль полиакриловой кислоты) в качестве гемостатика, обезболивающего средства, а также препарата, обладающего бактерицидной и бактериостатической активностью в отношении ряда грамположительных и грамотрицательных микробов (9, 10).

Авторами изобретения установлены новые, ранее не известные свойства ПАК и ее соли ФА повышать вирулицидную и бактерицидную активность ДЭИ при их добавлении в вирусную суспензию перед внесением в нее инактиванта и одновременно служить стимуляторами иммуногенности и стабилизаторами вакцины при ее высушивании или хранении в жидком виде. Последовательное внесение ПАК или ФА и ДЭИ в вирусную суспензию позволили получить стерильную суспензию инактивированного ВБ. В этом случае инактивацию микрофлоры обеспечивает в три раза меньшая концентрация ДЭИ. При использовании каждого препарата в отдельности или порядка их внесения в вирусную суспензию не удалось добиться ее стерильности и стабильности.

Авторами установлено также, что при высушивании ПАК или ФА формируют прочную строму, предотвращающую потери препарата в процессе сушки. Сохранность иммуногенности жидкой вакцины проверена в течении 12 месяцев при температуре 4-8^oC с положительным результатом.

Известно также использование ДЭИ для инактивации вируса ящура (II).

Для инактивации ВБ ДЭИ использован авторами впервые. ДЭИ инактивирует ВБ по реакции первого порядка. Однако исследования по инактивации контаминирующей микрофлоры в образцах суспензии ВБ с помощью ДЭИ показали, что при 37^oC в течение 24 часов концентрация ДЭИ вплоть до 0,3% не всегда обеспечивала стерильность специально контаминированной суспензии. Вопрос получения стерильной суспензии ВБ был решен с помощью ПАК или ФА при добавлении их в вирусную суспензию перед внесением в нее ДЭИ. При этом от использования ПАК и ФА получены одинаковые результаты.

Результаты поиска показывают, что предлагаемый способ не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого способа), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого способа преобразований для достижения технического результата. Следовательно, предлагаемый способ соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Пример 1.

Для изготовления вакцины против бешенства животных используют фиксированный ВБ штамм "Щелково-51", репродуцированный в суспензионной культуре перевиваемых клеток ВНК-21 в среде Игла, содержащей 5-10% сыворотки и 0,25% гемогидролизата. Культивирование вируса ведут в течение 96-144 часов при температуре 35-37^oC, получая вирусную суспензию с титром инфекционности 5,5-6,5 lg ЛД_50/мл. Накопление ВБ в среде культивирования и клетках ВНК-21 происходит без признаков цитопатического действия вируса. По окончании репродукции вируса в вируссодержащую суспензию вносят сначала в качестве стабилизатора ПАК м.м. ~ 1.000.000 или ФА до концентрации 0,7-1,0%, а затем - в качестве инактиванта ДЭИ до концентрации 0,1-0,3%. Смесь инкубируют при 37^oC в течение 20-24 часов. Полученную вакцину расфасовывают в 10 мл флаконы для сублимационного высушивания или реализации в жидком виде. В жидком виде вакцина имеет следующее соотношение компонентов, об.%: ПАК или ФА - 14-20 ДЭИ - 0,5-1,5 вируссодержащая суспензия - остальное.

Для приготовления сухого препарата жидкую вакцину высушивают сублимацией. Готовую вакцину контролируют на физические свойства, стерильность, иммуногенность, безвредность, авирулентность.

Пример 2.

Инактивацию инфекционности ВБ изучали по методике определения величины К₅₀ и в динамике снижения титра инфекционности, используя для этого мышат массой 10-12 г.

К₅₀ - это выраженная в % концентрация ДЭИ, снижающая инфекционность ВБ до уровня 1 ЛД_50/0,03 мл в течение 24 часов при температуре 37^oC. К₅₀ рассчитывают по формуле Кербера-Ашмарина K₅₀= lgDm-lgd(Li-0,5), где D_m - концентрация ДЭИ в образце суспензии, обеспечивающая авирулентность ВБ; d - кратность испытанных концентраций ДЭИ; L - отношение числа живых мышей к числу зараженных по каждому образцу вирусной суспензии; i - номер образца суспензии.

Результаты опытов приведены в таблице 1.

Из приведенных в таблице 1 данных следует, что авирулентность суспензий обеспечивала концентрация ДЭИ ниже 0,009-0,012%. Расчетная концентрация ДЭИ, равная 0,004%, снижала инфекционность ВБ до одной ЛД_50/0,03 мл.

Пример 3.

Известно, что олигомеры этиленимина, к которым относится ДЭИ, инактивируют все вирусы по реакции первого порядка. Для проверки этого факта сняли динамику инактивации ВБ, используя 0,2% концентрацию ДЭИ при 37^oC. Проба суспензии, взятая через час инактивации, имела титр инфекционности < 0,5 lg ЛД_50/0,03 мл. Эти данные подтверждают характер кривой инактивации ВБ, так как при увеличении концентрации ДЭИ в 50 раз (0,2 : 0,004 = 50) скорость инактивации возросла ~ в 50 раз, т.е. через 28 мин инактивации инфекционность ВБ в суспензии должна быть около одной ЛД_50/0,03 мл.

Пример 4.

Исследования по инактивации контаминирующей микрофлоры в образцах суспензии ВБ с помощью ДЭИ показали, что при 37^oC в течение 24 часов концентрация ДЭИ вплоть до 0,3% не всегда обеспечивала стерильность специально контаминированной суспензии. Контроль стерильности проводили по ГОСТ 28085-89. Вопрос получения стерильной суспензии ВБ был решен с помощью ПАК или ФА при добавлении их в вирусную суспензию до оптимальной концентрации 0,7-1,0% перед внесением в нее ДЭИ. В такой последовательности внесения в вирусную суспензию вышеуказанных препаратов инактивацию микрофлоры обеспечивала в три раза меньшая концентрация ДЭИ.

Пример 5.

Различия в количестве ДЭИ, обеспечивающем авирулентность суспензии ВБ (0,009-0,012%) и инактивацию микрофлоры в вирусной суспензии (0,2-0,3%) требовали проведения исследований по влиянию высоких концентраций ДЭИ на иммуногенную активность жидкой и сухой вакцины против бешенства.

Установлено, что иммуногенная активность указанных препаратов не снижалась при увеличении концентрации ДЭИ от 0 до 0,5% (пределы исследований). Следовательно, ДЭИ можно использовать в концентрации 50-кратно превышающей минимально необходимую для инактивации инфекционности ВБ, обеспечивая высочайшую степень специфической безопасности вакцины.

ПАК и ФА, кроме повышения активности ДЭИ, являются стимуляторами иммунитета. При этом они проявляют одинаковую активность. При изготовлении сухой вакцины ПАК и ФА формируют прочную строму, предотвращающую потери препарата в процессе его высушивания сублимацией.

Сохраняемость иммуногенной активности жидкой вакцины проверена в течение 12 месяцев при 4-8^oC с положительным результатом.

Результаты контроля иммуногенной активности на мышах жидких и сухих вакцин против бешенства, изготовленных предлагаемым способом, приведены в таблице 2.

Из приведенных в таблице 2 данных следует, что ФА и ПАК, являясь стимуляторами бактерицидности ДЭИ, существенно повышают иммуногенность как жидких, так и сухих вакцин.

Экономическая эффективность от использования предлагаемого способа будет обусловлена следующими факторами: 1) отсутствием в готовом препарате биологических контаминирующих агентов, способных к репродукции в благоприятных условиях; 2) отсутствием дополнительных органических или неорганических примесей в виде пептона, желатины и сахарозы в сухой вакцине или гидроокиси алюминия и сапонина в жидком препарате; 3) унификацией производства жидкой и сухой вакцины.

Таким образом, изложенные сведения свидетельствуют о выполнении при использовании предлагаемого способа следующей совокупности условий: - способ, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в области ветеринарной вирусологии и биотехнологии; - для предлагаемого способа в том виде, как он охарактеризован в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов; - способ, воплощающий предлагаемое изобретение при его осуществлении, обеспечивает достижение усматриваемого заявителем технического результата: повышение специфической безопасности, иммуногенной активности, стабильности и безвредности вакцины, а также снижение ее реактогенности и аллергенности.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации.

1. Авт. свид. СССР N 117464, A 61 K 39/205, 21.11.58 г.

2. Вагабов P. M. Разработка и экспериментальное изучение сухой антирабической вакцины, инактивированной гидроксиламином. Канд. дис. М., 1969, 44-60.

3. Авт. свид. СССР N 770196; C 12 N 7/00, A 61 K 39/205; 23.05.79 г.

4. Лихачев Н.В. Вакцины против бешенства. В кн. Биологические и химиотерапевтические ветеринарные препараты. М., 1963, 28-38.

5. Пат. РФ N 955577, A 61 K 39/205, 03.03.81 г. (прототип).

6. Временная инструкция по изготовлению и контролю сухой инактивированной культуральной антирабической вакцины. Утверждена ГУБ МСХ СССР 16.09.76 г.

7. Петров Р.В., Хаитов P.M. и др. Иммуногенетика и искусственные антигены. М., Медицина, 1983, 255 с.

8. Химическая энциклопедия. М., БРЭ, 1992, 3, 602 (ПАК).

9. Регистр лекарственных средств России. М. Инфармхим, 1993, 876-877 (ФА).

10. Авт. свид. СССР N 698622, A 61 K 33/26, 22.02.74 г. (ФА).

11. Пат. РФ N 594771, A 61 K 39/12, C 12 N 7/04; 07.05.73 г.

12. ГОСТ 28085-89. Препараты биологические. Метод бактериологического контроля стерильности.

13. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В. и др. Динамика вирусных болезней животных. Справочник. М., Агропромиздат, 1991, 255-270.

14. Иванов B. C. Перспективы совершенствования технологии изготовления культуральных инактивированных антирабических вакцин. Вирусные болезни с.-х. животных. Владимир, 1995, 203.

15. Иванов B.C., Скичко Н.Д. Разработка и внедрение в промышленное производство и ветеринарную практику России культуральных инактивированных вакцин против бешенства. Курской биофабрике и агробиологической промышленности России - 100 лет. Тез. докл. науч.-прооизвод. конф., 27-30 августа 1996 г., Курск, 1996, 126-128.

16. Пат. Великобритании N 1551437, C 12 N 7/00, 30.08.79 г.

17. Пат. Великобритании N 1596653, A 61 K 39/205, 26.08.81 г.

18. Пат. США N 4347239, A 61 K 39/205, 31.08.82 г.

19. Пат. США N 4584194, A 61 K 39/205, 22.04.86 г.

20. Пат. США N 4649049, A 61 K 39/205, 10.03.87 г.

21. Пат. США N 4664912, A 61 K 39/205, 12.05.87 г.

22. Пат. США N 4726946, A 61 K 39/12, 23.02.88 г.

23. Пат. Румынии N 87856, A 61 K 39/12, 30.11.85 г.

24. Пат. ЧССР N 238794, A 61 K 39/205, 16.12.85 г.

25. Пат. Швейцарии N 658192, A 61 K 39/205, 31.10.86 г.

Формула изобретения

1. Способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных, включающий репродукцию фиксированного вируса бешенства в культуре клеток, внесение инактиванта в вируссодержащую суспензию, инкубацию смеси и внесение в нее стабилизатора, отличающийся тем, что по окончании репродукции вируса в вируссодержащую суспензию сначала вносят стабилизатор, а затем инактивант, при этом в качестве стабилизатора используют полиакриловую кислоту или ее соль, а в качестве инактиванта - димер этиленимина.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве культуры клеток используют суспензионную культуру перевиваемых клеток ВНК-21.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве соли полиакриловой кислоты используют феракрил.

4. Способ по пп.1-3, отличающийся тем, что полиакриловую кислоту или феракрил вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,7-1,0%.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что димер этиленимина вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,1-0,3%.

6. Способ по пп.1-5, отличающийся тем, что смесь инкубируют при 35-37^oC в течение 20-24 ч.

7. Способ по пп.1-6, отличающийся тем, что полученный препарат используют в жидком виде.

8. Способ по пп.1-6, отличающийся тем, что полученный препарат высушивают сублимацией.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2