Способы формирования гликозидных связей, химическая композиция, гликозид и гликозидная библиотека

Способы формирования гликозидных связей, химическая композиция, гликозид и гликозидная библиотека

Реферат

 

Описывается способ формирования множества региоселективных гликозидных связей, отличающийся тем, что проводят в одном реакторе без промежуточной очистки и выделения обработку первого бифункционального гликозида (ПГ), содержащего аномерный сульфоксидный заменитель, эффективным количеством активирующего агента (АА) в органическом растворителе с образованием ПГ, проявляющего гликозильные акцепторные и гликозильные донорные характеристики. Технический результат - упрощение пресса с сохранением высокого выхода целевого продукта. 7 с. и 43 з.п.ф-лы, 17 ил.

Образование гликозидных связей в растворе и твердой фазе. Настоящее изобретение относится к основном к способам, которые позволяют быстро конструировать олигосахариды и другие гликоконьюгаты. Более подробно, настоящее изобретение относится к способам для получения множества гликозидных связей в растворе в одну стадию. Настоящее изобретение обладает преимуществом в том, что было обнаружено, что относительная реакционная способность гликозидных остатков, содержащих аномерные сульфоксиды и нуклеофильные функциональные группы, может контролироваться. Другой аспект настоящего изобретения заключается в том, что реакционную способность аномерных сульфоксидов сахара используют в твердофазном способе для образования гликозидных связей. Раскрытые способы могут быть применены для получения конкретных олигосахаридов и других гликоконьюгатов, а также для получения гликозидных библиотек, содержащих смеси различных олигосахаридов, включая гликоконъюгаты, которые могут быть проверены на биологическую активность.

Олигосахаридные цепи гликопротеинов и гликолипидов играют важную роль в широком разнообразии биохимических процессов. Найдено, что как на поверхности клеток, так и циркулирующих в биологических жидкостях, эти гликозидные остатки выступают в качестве распознающих сигналов, которые служат связью ключевых событий в нормальном клеточном развитии и ее функции. Они включаются в оплодотворение, эмбриогенез, нейрональное развитие, гармональные активности, воспаление, клеточную пролиферацию и организацию различных типов клеток в конкретных тканях. Они также включаются во внутриклеточное классифицирование и секрецию гликопротеинов, а также в выведение плазмы гликопротеинов из циркуляции.

Дополнительно к их положительной роли в поддержании здоровья, олигосахариды также включаются в начало болезни. Например, олигосахариды на поверхности клетки выступают в качестве рецепторов вирусов и токсинов, а также более доброкачественных лигандов. Модифицированные карбогидраты поверхности клетки были вовлечены в онкогенезы и метастазы. Олигосахаридные структуры, которые связаны с промежуточным воспалением и помогают предотвратить инфекцию, могут, если образовались с избыточными уровнями, стимулировать развитие хронических воспалительных болезней. (Некоторые ссылки на роль олигосахаридов воспроизведенных зукариотами на состояние организма и болезни включают: Hakomori TIBS, 1984, 45; Feizi et., al. TIBS 1985, 24; Rademacher et.al. Annu. Rev. Biochem. 1988, 57, 785: Feizi TIBS, 1991, 84; Dennis and Laferte Cancer Res. 1985, 45, 6034; Fishman J.Membr.Biol.1982, 69,85; Markwell et. al. PNAS USA, 1981, 78, 5406; Wiley and Skehel J.Annu.Rev. Biochem., 1987, 56, 365; Kleinman et.al. PNAS USA, 1979, 76, 3367; Walz et.al. Scitnce 1990, 250).

Хотя бактерии не воспроизводят тот же тип олигосахаридов или других гликонуклеотидов как эукариоты, прикариоты, тем не менее воспроизводят широкое разнообразие гликозилированных молекул. Многие такие молекулы были выделены и было найдено, что они обладают противоопухолевой и антибиотиковой активностью. Бактериально воспроизведенные гликозилированные молекулы, обладающие потенциальной терапевтической пригодностью, включают хромацин, калихемицин, есперамицин и цикламицины. Во всех этих случаях карбогидратные цепи демонстрировали, что являются важными в биологической активности. Однако точные функции карбогидратных остатков до конца не понятны и являются непонятными связи структура-активность.

Из-за их разной функции в состоянии здоровья и болезни олигосахариды находятся в фокусе исследования. Широко принято, что развитие технологии 1) обнаружения и 2) блокирования или, иначе говоря, регулирования некоторых аномальных функций олигосахаридов будет приводить к значительному улучшению здоровья и благополучия.

Однако должно быть возможным эксплуатировать некоторые нормальные функции олигосахаридов (например, различные процессы узнавания) для других целей, включая высвобождение лекарства в данные типы клетки. Кроме того, возможна разработка новых противоопухолевых агентов из синтетических гликозилированных молекул, напоминающих гликолизированные бактериальные противоопухолевые агенты.

Продолжаются попытки разработки продуктов, имеющих отношение к олигосахаридам, включая диагностику котят, для обнаружения карбогидратов, связанных с различными заболеваниями вакцины для блокирования инфекции, вызванной вирусами, которые распознают карбогидраты поверхности клетки, носители для высвобождения лекарства, которые узнают карбогидратные рецепторы и моноклональные антитела, которые узнают аномальные карбогидраты, для использования в качестве лекарств. Своевременное развитие этих и других биомедицинских продуктов на основе карбогидрата, в свою очередь, зависит от доступности технологии получения олигосахаридов и других гликоконьюгатов быстро, эффективно и в практических количествах для основных и развиваемых исследований.

В частности, существует необходимость в способах, которые позволяют быстро получать гликозидные библиотеки, включающие смеси разливных олигосахаридов или других глюкоконъюгатов, которые могут быть затем проверены на конкретную биологическую активность. Было показано, например, что проверка смесей пептидов является эффективным путем идентификации активных соединений и объяснения связей структура-активность. Существует огромное количество путей генерирования химически разнообразных смесей пептидов и определения активных соединений. См. , например, Furka et.al., Int. J.Peptide Protein Res. 1992, 37, 487; Lam et. al. Nature 1991, 354, 82; Houghten Nature 1991, 254, 84; Zuckerman et.al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 1992, 89, 4505; Petithory Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1984, 81, 3998; Houghten Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 5131; Fodor Science 1991, 251, 767. Мы не знаем эффективных способов генерирования различных смесей олигосахаридов и других гликоконьюгатов для тестирующих целей.

Антрациклины Цикламицин 0 (формулы 1, приведенной ниже), антрациклиновый антибиотик выделенный из Streptomyces capoamus обладает высокой ингибирующей активностью in vitro против экспериментальных опухолей. Это лекарство содержит алгикон эпсилон-пирромицинона и трисахарид. См., Bieber et. al J.Antibiot. 1987, 40, 1335. Трисахарид содержит две повторяющиеся единицы 2-деокси-L-фукозы (A,B) и одну единицу кетосахара (C), L-цинерулозы. Все сахара связаны друг с другом через 1-4 аксиальную связь.

Хотя цикламин был открыт почти тридцать лет назад, мало известно о его функции, потому что недостаточные количества являлись доступными из натуральных источников. Следовательно, наилучшим путем получения цикламина в больших количествах и только пути получения его аналогов является химический синтез. Агликон цикламицина, епсилон-пирромицинон может быть получен дегликозилированием других легко доступных антибиотиков, таких как марцеломицин, музетамицин и цинерубин. В литературе существуют эффективные подходы для сочетания трисахарида с агликоном. См., например, Kolar et. al. Carbohydr. Res. 1990, 208,111. Однако способы конструирования трисахарида страдают от ограничений, связанных с общей легкостью и эффективностью.

Антрациклиновые антибиотики выступают в качестве промежуточных соединений в метаболизме некоторых Streptomyces образцов. Они являются потенциальными химиотерапевтическими лекарствами, которые широко использовали при лечении различных твердых опухолей и лейкозов. См., Arcamone, F. Doxorubicin Anticancer Antibiotic; Academic Press: New York, 1981. Агликон всех антрациклинов состоит из трициклической хиноидной системы с функционализированным циклогексановым остатком. Различные примеры замещения, часто встречающиеся среди агликонов, приведены ниже.

Дауномиценон (R₁ = H) Адриамиценон (R₁ = OH) бета-Родомиценон (R₁ = H) 1- OH-бета-Родомиценон Аклавинон Эпсилон-пирромицинон Общей чертой всех антрациклиновых антибиотиков является олигосахаридный остаток, присоединенный к C-7 гидроксильной группе агликона. Остаток сахара в этом положении может быть моно-, ди- или трисахаридом. Наиболее часто встречающиеся сахара включают даунозамин, родозамин, 2-деокси-L-фукозу и L-цинерулозу.

альфа-L-даунозамин альфа-L-родозамин альфа-L-деоксифукоза альфа-L-цинерулоза альфа- L-родиноза альфа-L-ацулоза На основании некоторых исследований, проведенных на антрациклиновых антибиотиках дауномицина, адриамицина и аклациномицина, стало вполне очевидно, что олигосахаридные компоненты этих натуральных ДНК связок играют важную роль в ДНК связывании и узнавании. См., Bieber et.al. в печати. Однако мало известно о действительной функции сахаров, в частности потому, что возникают трудности при селективной модификации этих лекарств. Первый химический синтез цикламицина 0 был выполнен S.J.Danishefsky с соавторами. См. . Suzuki et.al., J.Am. Chem.Soc. 1990. 112, 8895.

Синтез 2-деоксиолигосахаридов Комплексы гликоконьюгатов, подобных антрациклинам, и ауреолеиновых кислот представляют значительный научный и фармацевтический интерес и широко применялись в раковой химиотерапии. Общей структурной чертой в этих соединениях является присутствие 2-деоксиологисахаридов. Действительно, некоторые типы альфа- и бета-2-деокси-гликозидов часто находят в биологически активных молекулах натурального происхождения. Дополнительно к антибиотикам на основе ауреолеиновых кислот и антрациклиновым антибиотикам могут быть найдены кардиотонические гликозиды, авермектины, эритромицины и енидиновые антибиотики. Эффективное конструирование этих 2-деоксигликозидов, в частности 2-деокси-бета-гликозидов, являлось застарелой проблемой в химии карбогидратов. Регулирование бета-стереоселективности в 2-деоксисахарах является трудным, потому что не может быть стерео-направляющей анхимерной помощи от C-2 положения.

Вообще конкретный терапевтический эффект этих лекарств хотя и вызывают агликоном, в то же время сахара являются ответственнными за регулирование фармакокинетики. Надеются, что модификацией карбогидратного остатка возможно увеличить эффективность, а также уменьшить цитотоксичность этих лекарств.

Разработка аналогов сахара требует хороших синтетических способов для конструирования 2-деоксиолигосахаридов. К сожалению, способы гликозилирования, пригодные для синтеза 2-деоксиолигосахаридов являются в общем неудовлетворительными. Так как у 2-деоксигликозильных доноров отсутствует заместитель в C-2 положении, они являются нестабильными. Они быстро разлагаются в большинстве реакций гликозилирования, приводя тем самым к плохим выходам гликозидов. Фактически один из наилучших существующих способов конструирования 2-деоксиолигосахаридов - гликальный способ обходит эту проблему путем непосредственного использования неистинных 2-деоксигликозильных доноров. Этот способ, который является одним из наиболее широко используемых способов гликозилирования для конструирования 2-деоксигликозидов, включает двухстадийный процесс. В первой стадии, 1,2-ангидро сахар(гликаль) обрабатывают соответствующим электрофилом, E⁺, с образованием 1,2-ониевого промежуточного соединения. Руклеофильная атака с противоположной стороны дает гликозид с 1,2-транс конфигурированными связями. Во второй стадии заместитель у C-2 удаляют с образованием желаемого 2-деоксигликозида.

Способ получения олигосахаридов в растворе В настоящее время существует два общих пути для получения олигосахаридов. Первый заключается в выделении из натуральных источников. Этот подход ограничивается олигосахаридами натурального происхождения, которые производят в больших количествах. Второй путь заключается в ферментативных или химических путях получения. Разнообразие олигосахаридов, доступных через ферментативный путь синтеза, ограничивается из-за того, что использованные ферменты могут принимать только определенные субстраты. Химические пути синтеза являются более гибкими, чем ферментативные пути синтеза, и обладают потенциалом для получения огромного разнообразия различных олигосахаридов. Проблема с химическими путями синтеза заключается в том, что они являются чрезвычайно дорогими что касается времени и усилий. Эта проблема является следствием того, что пути синтеза, по которым проводят химический синтез, олигосахаридов устарели.

Олигосахариды получают из моносахаридов, связанных гликозидными связями. При типичном химическом синтезе олигосахаридов полностью защищенный гликозильный донор активируют и позволяют взаимодействовать с гликозильным акцептором (обычно другим моносахаридом, содержащим незащищенную гидроксильную группу) в растворе. Реакция гликозилирования сама по себе протекает от нескольких минут до суток, в зависимости от использованного способа. Продукт сочетания затем очищают, химически модифицируют с превращением его в гликозильный донор. Химическая модификация может включать несколько стадий, каждая отдельная стадия требует последующей очистки. ("Одностадийным" определяют процесс химического превращения или ряда превращений, проведенных в "одном" реакционном сосуде без необходимости выделения промежуточного продукта или стадий очистки). Каждая очистка требует расхода времени и может приводить к значительным потерям вещества. Новый гликозильный донор, дисахарид, затем подвергают реакции сочетания с другим гликозильным акцептором. Затем выделяют и химически модифицируют как прежде. Не является необычным, что синтез трисахарида из компонентов моносахаридов требует десяти и более стадий. В одном из недавних примеров полностью защищенная трисахаридная боковая цепь противоракового антибиотика, названного цикламицином 0 была получена в 14 стадий с 9% выходом в расчете на компонент моносахаридов. См., Suzuki et.al. в печати. Таким образом, время и дороговизна, включенные в синтез олигосахаридов, были серьезным препятствием для разработки карбогидратных лекарств и других биохимических продуктов. Одним из путей повышения скорости и эффективности синтеза олигосахарида является разработка способов, которые позволяют конструировать множество гликозидных связей в одну стадию. До настоящего открытия заявители не знакомы с одностадийным способом, который включает региоселективное образование множества олигосахаридных связей и который обеспечивает быстрый, эффективный и с высоким выходом процесс для производства олигосахаридов.

Твердофазный синтез олигосахаридов Кроме уменьшения числа стадий, включенных в синтез олигосахаридов, можно также увеличить скорость и эффективность процесса синтеза путем исключения необходимости выделения и очистки. Теоретически исключение необходимости выделения и очистки может быть достигнуто путем разработки твердофазного способа для синтеза олигосахаридов.

Благодаря важности потенциального преимущества твердофазного синтеза, ранее существовали попытки синтеза олигосахаридов в твердой фазе. Твердофазные способы синтеза исключали необходимость выделения и очистки, потому что избыток реагирующих веществ и продуктов разложения мог быть просто отмыт из продукта, связанного со смолой. Это преимущество преобразовывалось в огромное сохранение времени, усилий и выхода. (Преимущества твердофазных способов над способами в растворе для синтеза пептидов и нуклеиновых кислот были широко продемонстрированы. Эти преимущества конечно будут распространяться и на твердофазный синтез олигосахаридов. По твердофазному синтезу пептидов, см. , например, Barany G. and Merrifield, R.B. 1980, in The Peptides, Gross, E. and Meienhofer, J. Eds., Academic Press, New York, vol.2, pp.1-284).

Еще в 1971 году Frechet and Schuerch описали требования для твердофазного синтеза олигосахарида. См., Frecht and Schuerch J.Am.Chem.Soc.1971, 93, 492. Во-первых, смола должна быть совместима с условиями реакции. Во-вторых, твердая подложка должна содержать соответствующую функциональность для обеспечения связи с гликозидным центром (или в другом месте), связи, которая является инертной к условиям реакции, но может легко разрываться с удалением олигосахарида при окончании синтеза. В-третьих, схемы соответствующих защищающих групп должны работать таким образом, чтобы с данных гидроксильных групп могла быть селективно снята защита для следующей реакции сочетания. Другие гидроксильные группы должны быть защищены "перманентными" блокирующими группами, которые удаляют по окончании синтеза. В-четвертых, реакции гликолизирования должны быть эффективными, мягкими и протекать до конца во избежания неприятных последствий. В-пятых, стереохимия аномерных центров должна быть сохранена в процессе циклов сочетания и должна быть предсказуемой на основании результатов, полученных в растворе для любой данной пары донор/акцептор. В-шестых, разрыв перманентных блокирующих групп и связи с полимером должен сохранять олигосахарид неповрежденным.

К сожалению, хотя и было вообще принято, что твердофазный синтез олигосахарида является желаемой целью, и хотя Frechet and Schuerch (а также и другие) был способен описать стратегию твердофазного синтеза олигосахарида, ни один до настоящего открытия не был способен осуществить такую стратегию. В предыдущих попытках для синтеза олигосахаридов на нерастворимых смолах, выходы реакции сочетания были низкими и стереохимический контроль был неадекватен, в частности, для конструирования бета-гликозидных связей (т.е. 1,2-транс-гликозидных связей, в которых гликозидная связь в аномерном положении сахара является транс связью, несущей заместитель в C-2 положении сахара). Эти проблемы были приписаны тому факту, что кинетика реакции в твердой фазе медленнее, чем в она имеет место в растворе. См., Eby and Achuerch, Garbohydr. Res. , 1975, 39, 151. Последствие такой неблагоприятной кинетики состоит в том, что большинство реакций гликолизирования, которые приемлемо могут протекать в растворе, просто не протекают в твердой фазе, как в смысле стереохимического контроля, так и выхода. Таким образом, напрмиер, Frechet and Schuerch нашли, что две реакции гликолизирования, обе из которых включают замену аномерного галоида в присутствии катализатора, дают преимущественно бета-аномер (т. е. 1,2-транс продукт) в растворе, но дают смесь продуктов в твердой фазе. Frechet and Schuerch пришли к заключению, что для образования бета-гликозидных связей в твердой фазе будет необходимо использование участия соседней группы.

Вновь, однако, было найдено, что соседние участвующие группы (СУГр) часто дезактивируют гликозильные доноры до такой степени, что существующие способы гликозилирования не могут быть приняты для твердой фазы. См., Eby and Schuerch, в печати. В некоторых примерах смола также подвергалась разложению вследствие жестких условий, требуемых для гликозилирования. Кроме того, для многих СУГр эфирного типа, существует большая проблема, связанная с передачей ацила от гликозильных доноров к свободным гликозильным акцепторам на смоле. Эта побочная реакция приводит к тому, что закрывает смолу и предотвращает дальнейшую реакцию.

Frechet описывал проблемы, встречающиеся при попытке осуществления стратегии твердофазного синтеза олигосахаридов. См., Frechet, Polymer-supported Reactios in Organic Synthesis, p. 407, P.Hodge and D.C.Sherrington, Eds. , John Wiley and Sons, 1980. Он пришел к заключению, что твердофазный синтез олигосахаридов является пока еще неконкурентноспособным с синтезом в растворе "в основном, из-за отсутствия подходящих реакций гликозилирования", Были предприняты некоторые усилия по преодолению неблагоприятной кинетики реакции, связанной с твердофазными реакциями путем использования растворимых смол. В наилучшем примере по данным Douglas et.al. использовал растворимую полиэтиленгликолевую смолу с янтарной кислотой в качестве линкера и достиг 85-95% выходов реакции сочетания, используя способ гликозилирования, известный в течение 80 лет (реакция Koenigs-Knorr) с превосходным регулированием агломерной стереохимии. См., Douglas et.al., J.Am. Chem. Soc. 1991, 113, 5095. Растворимые смолы могут обладать преимуществом для некоторых реакций гликозилирования, потому что они дают более "растворимо-подобное" окружение. Однако постадийный синтез на растворимых полимерах требует, чтобы промежуточное соединение было высажено после каждой стадии и подвергнуто кристаллизации до того как другой остаток сахара может быть подвергнут реакции сочетания. Однако некоторое добавление того же гликозилирующего агента обычно требуется для того, чтобы сдвинуть реакцию к завершению. В приведенном выше случае, например, Douglas et.al. повторял одну и ту же реакцию сочетания пять раз для достижения высокого выхода. Каждое повторение требует стадии осаждения с удалением реагирующих веществ путем промывания. Продукт может быть потерян в каждой стадии осаждения. Кроме того, повторение переосаждений делает процесс очень неэкономичным по времени. Таким образом, подход к синтезу олигосахарида с растворимой смолой не в состоянии обеспечить все потенциальные преимущества, связанные с твердофазным синтезом, использующим нерастворимые смолы.

Новый способ гликозилирования, включающий аномерные сульфоксиды сахара сообщался Kahne с соавторами. См., Kahne et.al. Chem. Soc. 1989, 111, 6881. Аномерные сульфоксиды сахара были активированы эквимолярными количествами ангидрида трифторметансульфоновой кислоты (трифлик ангидрида) в присутствии затрудненного основания. Гликозильный донор, активированный трифликовым ангидиридом, вполне обеспечивает реакционную способность в растворе и может быть использован для гликозилирования чрезвычайно нереакционноспособных субстратов в мягких условиях. Однако это сообщение ограничивалось реакциями в растворе и не было подтверждено, что твердофазные реакции могут быть проведены с любой приемлемой степенью пригодности.

Таким образом, уровень развития техники подчеркивает преобладающую и неосуществленную необходимость в способе гликозилирования, который обеспечивает быстрый, эффективный и с высоким выходом синтез олигосахаридов. Однако эффективный синтез олигосахаридов в твердой фазе, который обеспечивал все ранее упомянутые преимущества твердофазных способов и не был продемонстрирован.

Настоящее изобретение обеспечивает способы конструирования множеств гликозидных связей в растворе, используя аномерные сульфоксиды сахара в качестве гликозильных доноров, и конструирования последовательных гликозидных связей в твердой фазе, с регулированием стерехимической конфигурации аномерной связи. Таким образом, в зависимости от выбранных условий и исходных веществ могут быть получены альфа- и бета-аномеры в твердой фазе, используя аномерные сульфоксиды сахара в качестве гликозильных доноров.

Способы настоящего изобретения могут быть применены для получения определенных олигосахаридов или гликоконъюгатов или для получения смеси различных олигосахаридов или гликоконъюгатов для создания гликозидных библиотек, которые могут быть впоследствии испытаны для обнаружения соединений, обладающих желаемой биологической активностью.

Настоящее изобретение также относится к открытию того, что активация аномерных сульфоксидов каталитическими количествами активирующего агента обеспечивает очень хорошие выходы продукта конденсации в очень мягких условиях. Предпочтительно активирующий агент представляет сильную органическую кислоту, такую как трифторметансульфоновая кислота или "трифликовая" кислота (TfOH), п-толуолсульфоновая кислота (TsOH) или метансульфоновая кислота (MsOH), более предпочтительно TfOH. В частности, было найдено, что для конструирования 2-деоксигликозидов процедура каталитического гликозилирования, описанная здесь, рассматривает выбор способа.

Предпочтительный вариант этого аспекта изобретения, включающий синтез 2-деоксигликозидов через гликозилирование, катализированное трифликовой кислотой, описывают более детально ниже.

Другие цели настоящего изобретения будут очевидны специалисту при рассмотрении настоящего описания.

Фиг. 1 иллюстрирует способ синтезируемого в одну стадию защищенного трисахарида цикламицина 0 из компонентов моносахаридов.

Фиг. 2 иллюстрирует способ получения гомополимеров 2-деоксифукозы в одну стадию.

Фиг. 3 иллюстрирует способ синтезируемой смеси гликоконъюгатов, обладающих биологической активностью, включающий потенциальную связывающую активность ДНК. Гликонконъюгаты, полученные таким образом, могут быть впоследствии испытаны (например, на ДНК связующую активность) для оценки предпочтительной длины и предпочтительных остатков сахара олигосахаридной части гликоконъюгата на основании испытанной активности.

Фиг. 4 иллюстрирует способы образования и удаления двух примерных типов связей с твердой подложки (например, плистирольной смоле).

Фиг. 5 иллюстрирует аппараты использования для проведения твердофазного синтеза олигосахарида.

Фиг. 6 иллюстрирует общую схему синтеза бета-связанного дисахарида в твердой фазе.

Фиг. 7 иллюстрирует общую схему синтеза альфа-связанного дисахарида в твердой фазе.

Фиг. 8 иллюстрирует общую схему синтеза трисахарида в твердой фазе.

Фиг. 9 представляет ¹H-ЯМР спектр моносахарида 1 фиг. 1.

Фиг. 10 представляет ¹H-ЯМР спектр моносахарида 2 фиг. 1.

Фиг. 11 представляет ¹H-ЯМР спектр моносахарида 3 фиг. 1.

Фиг. 12 представляет ¹H-ЯМР спектр трисахарида 5 фиг. 1.

Фиг. 13 представляет расширенную область ¹H-ЯМР спектра трисахарида 5, в котором отмечают аномерные протоны трисахарида.

Фиг. 14 представляет ¹H-ЯМР спектр дисахарида 4 фиг. 1.

Фиг. 15 представляет схему синтеза цикламицина 0.

Фиг. 16 представляет схему синтеза трисахарида.

Фиг. 17 представляет схему синтеза выбранных дисахаридов.

За этим следует детальное описание предпочтительных вариантов настоящего изобретения.

Определения Активирующий агент: Химический агент, который добавляют к гликозильному сульфоксиду, взаимодействует с аномерной сульфоксидной группой, превращая таким образом аномерный углерод в способный к нуклеофильной атаке. В случае бифункциональных сахаров или гликозидных остатков активирующий агент способен также к снятию защиты блокированной нуклеофильной группы в тех же условиях, использованных для активации аномерной сульфоксидной группы.

Акцептор кислоты: Такой химический агент как любое основание, которое принимает протоны, уменьшая тем самым побочные реакции, которые ускоряются в кислых условиях.

Акцептор сульфеновой кислоты: Химический агент, такой как метилпропионат, который конкретно принимает сульфеновую кислоту, обычно приводя к образованию нереакционноспособного монофенилсульфоксида. В отсутствие акцептора сульфеновой кислоты, сульфеновая кислота взаимодействует сама с собой с образованием дифенилдисульфидного моносульфоксида и воды. Вода мешает реакции гликозилирования.

Бифункциональный: Характеристика сахара или гликозидного остатка, который способен активировать как гликозильный донор, так и гликозильный акцептор в условиях одностадийного процесса настоящего изобретения.

Биологическая активность: Любая активность, проявляемая соединением или молекулой, которые обладают потенциальными физиологическими, фармакологичекими, диагностическими или терапевтическими применениям.

Карбогидратный рецептор: Любая молекула, которая связывает любой карбогидрат. Обычно молекула представляет такую молекулу как протеин или ДНК.

Гликоконъюгат: Любое соединение или молекула, которые ковалентно связываются с гликозидным остатком.

Гликозиды: Любой сахар, содержащий по крайней мере один остаток пентозы или гексозы, в котором аномерный углерод несет неводородный заместитель. Обычно, неводородный заместитель представляет гетероатом, такой как азот, кислород, фосфор, кремний или серу.

Гликозильный акцептор: Любое соединение, которое содержит по крайней мере одну нуклеофильную группу, которая в условиях одностадийного способа настоящего изобретения оказывается способной образовать ковалентную связь с аномерным углеродом гликозильного донора. Как отмечают здесь, гликозильный акцептор представляет любой сахар или гликоконъюгат, который содержит незащищенную гидроксильную, амино или меркапто группы или такие группы, которые могут быть удалены in situ, т.е. в условиях одностадийного способа настоящего изобретения.

Гликозильный донор: Сахар или гликозидный остаток, который несет сульфоксидную группу у аномерного углерода, группу, которая при активировании превращает аномерный углерод в способный к атаке нуклеофильной группой гликозильного акцептора с образованием гликозидной связи.

Гликозидные библиотеки: Смеси олигосахаридов различающихся последовательностей, которые могут быть подвергнуты процедуре испытаний для идентификации соединений или молекул, которые обнаруживают биологическую активность. Такие библиотеки могут также включать различные гликоконъюгаты.

Монофункциональный гликозильный акцептор: Гликозильный акцептор как он определен выше, с дополнительным условием, что способность выступать в качестве гликозильного донора в одно и то же время (т.е. в условиях одностадийного процесса настоящего изобретения) полностью исключается.

Монофункциональный гликозильный донор: Гликозильный донор, как он определен выше, с дополнительным условием, что способность выступать в качестве гликозильного акцептора в то же самое время (т.е. в условиях одностадийного процесса настоящего изобретения) полностью исключается.

Монофункциональная гликозильная единица: Сахар, который представляет либо гликозильный акцептор, либо гликозильный донор, но не обладает способностью выступать в обоих качествах при активации в условиях одностадийного процесса настоящего изобретения.

Олигосахариды: Гликозильный остаток, содержащий три или более моносахаридные единицы, соединенные гликозидными связями.

Потенциальный гликозильный акцептор: Любое соединение, содержащее по крайней мере одну нуклеофильную группу, которая потенциально способна к образованию ковалентной связи с аномерным углеродом гликозильного донора.

Одностадийная реакция: Одностадийную реакцию определяют как химическое превращение или набор превращений, проведенных в "одном" реакционном сосуде без необходимости выделения промежуточных соединений или стадий очистки (т. е. одностадийная или однореактивная реакция).

Временная защищающая группа: Блокирующая или защищающая группа, которая может быть удалена in situ, предпочтительно, но не обязательно, при тех же условиях, использованных для активации аномерной сульфоксидной группы.

Общие способы.

Следующие общие способы были разделены на две основных категории: первая касается реакций в растворе, включающих образование множества гликозидных связей, и вторая относится к синтезам олигосахаридов, в которых растущий олигомер связывают с твердой подложкой.

Образование множества гликозидных связей в растворе.

Один или более гликозильных доноров, содержащих алкильные или арильные сульфоксиды в аномерном положении и один или более гликозильных акцепторов, содержащих одну или более свободных гидроксильных групп и/или других нуклеофильных групп (например, амины) и/или гидроксильные группы, защищенные простым силильным эфиром, соединяют в реакционном сосуде. Полученная смесь может включать как монофункциональные гликозильные доноры и гликозильные акцепторы, так и бифункциональные гликозильные звенья, т.е. сахариды, которые могут одновременно выступать и как гликозильные доноры и как гликозильные акцепторы. Однако для того, чтобы получить больше чем одну гликозильную связь (т.е. для получения трисахарида или более длинного продукта), по крайней мере одно из реагирующих веществ должно быть бифункциональным гликозильным звеном.

Гликозильные акцепторы и доноры могут быть блокированы соответствующей защищающей группой, включающей, но не ограничивающейся ею, простой эфир, сложный эфир, ацетамидо, или тиоэфир защищающие группы, в одном или более положениях. Однако понятно, что сложноэфирная (или ацетамидо или тиоэфирная) защищающая группа в C-2 положении гликозильного донора будет влиять на стереохимический выход гликозилирования, давая 1,2-транс гликозидную связь.

Смесь гликозильных доноров и акцепторов растворяют в безводных условиях в ненуклиофильном растворителе, включающем, но не ограничивающимся им, толуол, эфир, тетрагидрофуран (ТГФ), метиленхлорид, хлороформ, пропионитрил или их смеси. Было найдено, что выбор растворителя влияет на стереохимический выход реакции гликозилирования, в которой не включается соседняя участвующая группа. В общем для данной пары донор/акцептор используют неполярный растворитель, такой как толуол, приводя к образованию с высоким выходом альфа изомера, в то время как использование более полярного растворителя, такого как пропионитрил, приводит к образованию с более высоким выходом бета аномера.

Реакцию инициируют добавлением эффективного количества активирующего агента. В данном варианте настоящего изобретения к реакционной смеси добавляют 0,5 эквивалента трифликового ангидрида, плюс 1,5 эквивалента основания (в качестве акцептора кислоты).

(Эквиваленты представляются относительно гликозильного сульфоксида). Каталитическое количество трифликовой кислоты (например, меньше 0,05 эквивалента) также может быть использовано предпочтительно вместе с избытком акцептора сульфоновой кислоты (например, около 20 эквивалентов метилпропиолата). Было найдено, что каталитическая трифликовая кислота является предпочтительной, если реакционная смесь содержит 2-деоксигликозильные доноры или если один из гликозильных акцепторов в реакции представляет силильный эфир. С другой стороны, трифликовый ангидрид является предпочтительным, если важным является максимальная реакционная способность гликозильных доноров. Однако необходимо отметить, что умеренно основные условия, которые получают с использованием трифликового ангидрида являются неэффективными для снятия защиты некоторых силильных эфиров (например, трет-бутилсилильных эфиров).

Однако хотя использование трифликового ангидрида плюс 2,6-дитретбутил-4-метилпиридин будет приводить к снятию защиты in situ триметилсилильных эфиров, использование трифликового ангидрида плюс более сильное основание (такое как основание Хаггиса) не будет приводить к снятию защиты. Таким образом, оба активирующих агента могут быть использованы в реакциях, включающих бифункциональное гликозильное звено, содержащее гидроксильную группу, защищенную силильным эфиром, хотя трифликовый ангидрид работает только при определенном наборе условий (выбор основания, выбор силильной защищающей группы). Иначе говоря оба способа активирования являются обычно взаимозаменяемыми.

Метилпропиолат или другой акцептор сульфеновой кислоты и/или активированные молекулярные сита могут быть добавлены к реакции либо до либо после добавления активирующего агента. Акцепторы сульфеновой кислоты значительно улучшают выход реакции гликозилирования, если в качестве активирующего агента используют каталитическую трифликовую кислоту.

Реакцию обычно проводят при низкой температуре (предпочтительно в области около -78^oC до такой низкой, как -100^oC), но реакция может протекать и при более высоких температурах, в некоторых случаях таких высоких, как при комнатной температуре.

Реакцию гасят добавлением водного бикарбоната и экстрагируют. Затем реакционную смесь подвергают процедуре очистки и/или снятию защиты с продукта если необходимо. Процедура может быть использована для конструирования определ