Гуманизированное антитело и способ его получения, полинуклеотид (варианты), гибридомная клеточная линия (варианты)

Гуманизированное антитело и способ его получения, полинуклеотид (варианты), гибридомная клеточная линия (варианты)

Реферат

 

Изобретение представляет моноклональное антитело, которое специфически иммунореактивно с протеином ВИЧ-1 gpl20 или gpl60 и характеризуется способностью нейтрализовать in vitro инфицирование клеток Н9 живыми штаммами ВИЧ-1. Антитела выделяются гибридомными клеточными линиями. Фармацевтические композиции этого изобретения будут применяться при лечении людей, инфицированных ВИЧ-1, с помощью пассивной иммунизации. 10 с. и 6 з.п.ф-лы, 30 ил, 5 табл.

Предпосылки создания изобретения Настоящее изобретение относится в основном к материалам и методам для предупреждения и лечения инфекций, вызванных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-1). Более конкретно, изобретние относится к моноклональным антителам, пригодным для пассивной иммунизации восприимчивых к или инфицированных ВИЧ-1 животных, особенно людей.

Инфекционный процесс, вызванный ВИЧ-1 in vivo недавно был темой обзорной статьи McCune, Cell 64, pp.351-363 (1991). Вкратце, Вич-1 инфицирует ряд линий клеток, таких как Т-клетки, моноциты/макрофаги и нейроны, которые экспрессируют рецептор CD4. Поскольку подавляющее большинство клеток CD4⁺ в организме являются "отдыхающими" или покоящимися и делятся только в ответ на специфические сигналы, инфицирование ВИЧ-1 приводит к тому, что клетки CD4⁺ включают транскрипционно неактивный вирус. Стимуляция иммунной системы инфицированных животных, включая активную иммунизацию, может приводить к поликлональной активации и сигналу для покоящихся клеток CD4⁺ перейти в S фазу клеточного цикла. Реплицирующиеся клетки затем активно продуцируют вирусные частицы, вызывая распространенные инфекции. Принимая во внимание этот отрицательный эффект стимуляции иммунной системы инфицированного ВИЧ-1 животного, возможно, что наиболее эффективным методом предупреждения и лечения инфекции ВИЧ-1 является пассивная иммунизация, то есть введение анти-ВИЧ-1 антител восприимчивому или инфицированному животному.

Jackson et al., Lancet, 2, pp. 647-652 (1988) сообщает, что однократное введение анти-ВИЧ-1 антител в форме плазмы больным людям, страдающим развитием синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД, синдром прогрессирующей деградации иммунной системы, связанной с инфекцией ВИЧ-1), временно приводило к уменьшению симптомов, кратковременному повышению числа Т-лимфоцитов, снижению частоты инфекций, вызванных условно-патогенными микроорганизмами и к снижению степени, с которой ВИЧ-1 мог выделяться из плазмы или лимфоцитов больных. См. также Karpas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,85, pp. 9234-9237 (1988). Кроме того, Emini et al., Nature, 355, pp. 728-730 (1992) сообщает, что введение шимпанзе антител, специфически реагирующих с ВИЧ-1, перед заражением животного ВИЧ-1 приводило к тому, что у шимпанзе не проявлялись признаки вирусной инфекции. Эти исследования показывают, что антитела, способные к нейтрализации ВИЧ-1, могут быть полезны при предупреждении/лечении инфекции ВИЧ-1.

Главный гликопротеин оболочки ВИЧ-1, gp 120, связывается с клеточным рецептором CD4 и облегчает внедрение вируса. С разработкой нейтрализующих антител связано несколько эпитопов гликопротеина. Но et al., Science, 239, pp. 1021-1023 (1988) сообщает, что аминокислоты 254 - 274 gp 120 вызывают образование поликлональной антисыворотки, способной к группоспецифической нейтрализации трех различных штаммов ВИЧ-1. Конформационно зависимые эпитопы, составляемые не первичными последовательностями аминокислот, на gp 120 также включены в индукцию синтеза антител, которые нейтрализуют разные штаммы вируса, согласно Haigwood et al., Vaccines 90, pp. 313-320 (1990) и Ho et al., J. Virol, 65(1), pp, 489-493 (1991). Так называемая "главная нейтрализующая детерминанта" (PND) gp 120 ВИЧ-1 локализована на "V₃ петле" gp 120. См. Puthey et al., Science, 234, pp 1392-1395 (1986), Pusche et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 3198-3202 (1988), Coudsmit et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 4478-4482 (1988), Palker et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 85, pp. 1932-1936 (1988), Holley et al., Froc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 6800-6804 (1991). Петля V₃ состоит из гипервариабельной области, которая формируется с помощью дисульфидной связи между цистеиновыми остатками, фланкирующими домен. Петля V₃ ВИЧ-1_MN, например, образуется с помощью дисульфидной связи между цистеиновыми остатками в позициям 320 и 336 gp 120.

Рекомбинантные и синтетические протеиновые фрагменты, включающие ряд аминокислотных остатков петли V₃ из различных изолятов ВИЧ, как сообщалось, вызывают образование изолят- и типоспецифических нейтрализующих антител у грызунов, согласно Lasky et al., Science, 233, pp. 209-212 (1986), Palker et al., выше Matsushita et al., J. Virol., 62, pp. 2107-2114 (1988), Javaherian et al., Proc., Natl. Acad. Sci. USA 86, pp 6768-6772 (1989). Более недавние исследования (Puthey et al., выше и La Posa et al., Science 249, pp. 932-935 (1990) показали, что структура - поворота петли V₃ - это сайт, распознаваемый изолят-специфическими антителами. Scott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 8597-8601 (1990) сообщают, что PND может также индуцировать образование типоспецифических антител у людей. Гипервариабельность PND может объяснить типоспецифическую нейтрализующую активность, генерируемую эпитопом.

Несколько исследований позволяют предположить, что антитела, полученные против рекомбинантного gp 120, очищенного gp 120 или синтетических пептидов из области V₃, могут нейтрализовать различные изоляты ВИЧ-1. Javarian et al. , Science, 250 pp. 1590-1593 (1990) и Weiss et al., Natuve, 324, pp. 572-575 (1986), каждый, описываемый нейтрализацию как MN, так и III_B изолятов поликлональной сывороткой, полученной от кроликов, соответственно иммунизированных пептидом, соответствующим PND из MN изоляторов и рекомбинантным gp 120, полученным из изолята III_B. См. также Haynes et al., US Letters Patent 5019387.

Akerblom et al., AIDS, 4, pp. 953-960 (1990) описывает препараты моноклональных антител, которые нейтрализуют III_B и одиннадцать первичных изолятов ВИЧ-1. См. также Patent Cooperation Treaty (PCT) Publication No. WO 91/11198 of Wahren et al., опубликованную 8 августа 1991 г. Гомология штаммов первичных изолятов Akerblom не определена, однако одиннадцать изолятов могут также быть III_B . Durda et al., AIDS Res. Hum. Retrov., 6, pp. 1115-1123 (1990) сообщают о моноклональных антителах, которые блокируют образование синцития клетками, инфицированными как MN, так и III_B, но не нейтрализуют инфекционности MN, что установлено с помощью "LAV улавливающего иммуноанализа" ("LAV capture immunoassay"), анализ, который имеет целью дать результаты, которые коррелировали бы с активностью обратной транскриптазы. Патентная заявка по договору о патентной кооперации N WO 90/15078 of Scott et al., опубликованная 13 декабря 1990 г., описывает моноклональные антитела, которые подавляют образование синцития клетками, инфицированными вирусом осповакцины, экспрессирующим PND, изолятов MN или "подобных MN". С помощью стандартных исследований на обратную транскриптазу, p24 или МТ-2 показано, что ни одно из антител с подтвержденным "широким нейтрализующим" действием не нейтрализует многочисленные штаммы живых ВИЧ-1. См. также PCТ Publication Nos. WO 88/09181, WO 90/12868, WO 91/09625 of Tanox Biosystems, Inc., опубликованных 1 декабря 1988 г., 1 ноября 1990 г. и 11 июля 1991 г. соответственно, PCT Publication N WO 91/19797 Нью-йоркского университета, опубликованную 26 декабря 1991 г. и Liou et al., J. Immunol., 143 (12), pp. 3967-3975 (1989).

Вышеприведенные публикации показывают, что моноклональные антитела, реагирующие с PND ВИЧ-1, полученные к настоящему времени, проявляют различные уровни групповой реактивности, но могут не обладать широким нейтрализующим действием. Различные примеры типо- и группоспецифической реактивности, показанные при этих исследованиях, могут быть связаны как с аминокислотной последовательностью, так и с конформацией области петли gp 120.

Несколько исследований наводят на мысль, что рецептор CD4 не может представлять собой единственный клеточный рецептор, ответственный за инвазию вируса. Результаты этих исследований увеличивают вероятность того, что введение описанных здесь ранее антител, которые блокируют инфицирование клеток CD4⁺, больному может обеспечить только ограниченную защиту против инфекции ВИЧ-1. Cheng. Mayer et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 84, pp. 3526-3539 (1987) сообщают об инфицировании ВИЧ-1 глиальных клеток, включающих другой рецептор, а не молекулу CD4. Кроме того, Takeda et al., Science, 242, pp. 580-583 (1988) показали, что комплексы антитело/ВИЧ-1 могут инфицировать моноциты путем опосредуемого рецептором эндоцитоза и усиливать репликацию вируса. Сходное зависимое от антител усиление инфекции было описано у Halsted et al., Nature, 265, pp. 739-741 (1977), Peiris et al., Narure, 289, pp. 189-191 (1981) и Schlesihger et al., J. Immunol., 127, pp. 659-665 (1981), Предшествующая работа показала, что определенные вирусы животных инактивируются комплементом, особенно Clg, через антителозависимый механизм. См. Weiss, in Molecular Biology of Tumor Viruses, RNA Tumor Viruses, Wliss et al. , Eds. , Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 1219-1220 (1982), Welsh et al., Virology, 74, pp. 432-440 (1976), Bartholomew et al., J. Exp. Med., 147, pp. 844-853 (1978), Cooper et al., J. Exp. Med., 144, pp. 970-984 (1976) и Sherwin et al., Int. J. Cancer, 21, pp. 6-11 (1978). В то время как Banapour et al., Virology. 152, pp. 268-271 (1986) описывают препараты непрогретой сыворотки, которые не действуют на плотность ВИЧ-1 или его способность инфицировать мононуклеарные клетки периферической крови, Spear et al., J. Virol. , 64 (12), pp. 5869-5873 (1990) сообщают, что ВИЧ-1, обработанный комбинацией комплемента и цельной сывороткой от больных, серопозитивных на ВИЧ-1, проявляет сниженную инфекционность.

Таким образом сохраняется потребность в новых препаратах моноклональных антител (включая, например, мышиные антитела, "очеловеченные" антитела и иммунологически активные фрагменты антител), которые являются специфически иммунореактивными с ВИЧ-1. В идеале такие антитела должны характеризоваться способностью осуществлять нейтрализацию многочисленных штаммов ВИЧ-1 (например, III_B и MN), что определяется с помощью стандартных исследований на обратную транскриптазу, p24, MT-2 и образование синцития, включающих подходящие культивируемые клетки-хозяева (например, клетки H9). Ввиду предполагаемого применения для пассивной иммунизации инфицированных и неинфицированных пациентов, такие моноклональные антитела должны оптимально быть способны к участию в (т.е. опосредовании) комплемент-зависимости виролизе частиц ВИЧ-1 и антитело-зависимом цитолизе клеток, инфицированных ВИЧ-1.

Краткое изложение изобретения Настоящее изобретение представляет моноклональные антитела, которые специфически реактивы с той частью белка gp 120 или gp 160 ВИЧ-1, которая включает аминокислотную последовательность глицинпролин-глицин-аргинин (G-P-G-R), показанную в ПОСЛ ИД N 1, и характеризуются способностью нейтрализовать инфицирование клеток H9 в культуре штаммами MN и III_B живого ВИЧ-1, что определяется с помощью исследований на обратную транскриптазу, p24, MT-2 и образование синцития. Продукты этого изобретения могут, кроме того, характеризоваться своей способностью опосредовать комплемент-зависимый виролиз частиц ВИЧ-1 и/или антитело-зависимую клеточную цитотоксичность инфицированных ВИЧ-1 клеток.

Моноклональные антитела настоящего изобретения могут использоваться в диагностических методах и/или наборах для определения наличия ВИЧ-1 в жидкости (например, в крови). Моноклональные антитела по настоящему изобретению, предпочтительно IgG-антитела, также особенно пригодны для использования при противо-ВИЧ-1 лечении животных, особенно людей, восприимчивых к или инфицированных ВИЧ-1. Иммунологически эффективные количества моноклональных антител вводятся пациенту, инфицированному ВИЧ-1, или при риске инфицирования этим вирусом для создания пассивного иммунитета к инфекции ВИЧ-1 и предпочтительно осуществляют комплемент-зависимый виролиз частиц ВИЧ-1 и/или антитело-зависимую цитотоксичность для инфицированных ВИЧ-1 клеток у больного.

Химерные или "очеловеченные" антитела (включая CDR-трансплантированные антитела), фрагменты антител и особенно биспецифические антитела на основе заявляемых моноклональных антител включены в рассмотрение настоящего изобретения так же, как и рекомбинантные, имеющие отношение к антителам продукты, продуцируемые в прокариотических и эукариотических клетках. Например, фрагменты антител, такие как Fab и F(ab')₂ фрагменты, могут продуцировать в культуре клеток-хозяев, таких как E.coli, дрожжи, клетки насекомых и клетки млекопитающих на основе определения информации о структуре (последовательности) для вариабельных областей антител этого изобретения. Информация о последовательности вариабельных областей также дает возможным получение CDR-трансплантированных антител. Кроме того, химерные антитела (например, мышино/человеческие антитела) могут быть получены при использовании трансформированных клеток мышиной миеломы или гибридных клеток, и биспецифические антитела могут продуцироваться гибридными гибридомными клетками. Особому рассмотрению подлежат антитела, которые состоят по существу из вариабельных областей человеческих антител, включающих последовательность аминокислот из по крайней мере одной определяющей комплементарность области антител, характеризующегося способностью специфически связываться с последовательностью аминокислот gp 120 или gp 160 ВИЧ-1, состоящую по существу из последовательности, показанной в последовательности ПОСЛ ИД N 1, и способностью нейтрализовать in vitro инфицирование клеток H9 живыми штаммами MN и III_B ВИЧ-1 при определении по обратной транскриптазе, p24, MT-2 и образованию синцития. Подлежат рассмотрению последовательности ДНК, кодирующие такие антитела, клетки-хозяева, продуцирующие такие антитела, и рекомбинантные методы для получения таких антител.

Также в рассмотрение настоящего изобретения включается применение, при противо-ВИЧ-1 лечении, комбинации продуктов настоящего изобретения и других иммунологических средств и/или химиотерапевтических средств. Потенциальные средства для комбинированного применения включают комплемент, антитела, которые связываются с различными нейтрализующими и ненейтрализующими областями белков ВИЧ-1 и химические средства, такие как AZT.

Как излагается в последующем детальном описании, моноклональные антитела настоящего изобретения получали путем иммунизации подходящего хозяина живыми ВИЧ-1, представляя таким образом gp120 в его природной конформации.

Конкретно иллюстрируют настоящее изобретение мышиные моноклональные антитела (обозначенные NM-01), продуцируемые линией гибридомных клеток HB 10726, которая была получена на хранение American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, 9 апреля 1991 и обозначена АТСС, поступление N HB 10726, и очеловеченные варианты антител NM-01, обозначенные NM-01 HuVH/HuVK, MN-01 HuVH/HuVKF, NM-01 HuVHМ/HuVK, NM-01 HuVHS/HuVK, NM-0,1 HuVHS/HuVKF и NМ-01 HuVHM/HuVKF, продуцируемые линиями клеток, которые приняты на хранение European Collection of Animal Cell Cultures (ЕСАСС) 20 августа 1993 г., PHLS Centre for Applied Microbiology & Research, Porten Down, Salisbury, Creat Britain SP4 PJG и были обозначены ЕСАСС поступления NN 93082022, 93082019, 93082020, 93082023, 93082018 и 93082021 соответственно.

Многочисленные аспекты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны при рассмотрении иллюстрирующих примеров и описаний практических осуществлений настоящего изобретения в последующем его детальном описании, причем ссылки даются на фигуры, где фиг. 1 является сложной ауторадиограммой неинфицированных клеток H9, белков ВИЧ-1_MN и подвергнутых иммуноблоттингу с моноклональными антителами этого изобретения и иммунной сыворотки от сероположительных больных СПИД.

Фиг. 2 графически представляет результаты определения иммунореактивности антител этого изобретения с пептидами, соответствующими области петли V₃ из разных штаммов ВИЧ-1.

Фиг. 3 является "столбчатой" диаграммой, показывающей действие пептидов, соответствующих области петли V₃, на связывание антител этого изобретения и двух других антител анти-ВИЧ с gp120.

Фиг. 4A-4C, 5, 6A по 6B, 7A по 7B 8, 9A, 9B графически представляют результаты скрининга по исследованиям на обратную транскриптазу, p24, MT-2 и образование синцития соответственно, моноклональных антител этого изобретения на способность нейтрализовать инфицирование клеток H9 живыми штаммами ВИЧ-1.

Фиг. 10 графически представляет результат исследования по определению пептидной блокады нейтрализации инфекционности антителами этого изобретения.

Фиг. 11A, 11B, 12A-12F и 13A-13F являются электронными микрофотографиями частиц ВИЧ-1, которые были обработаны комбинацией моноклональных антител этого изобретения и комплемента.

Фиг. 14 и 15 - это выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей соответственно, моноклональных антител этого изобретения, NM-01, с аминокислотными последовательностями легких и тяжелых цепей трех различных анти-ВИЧ-1 моноклональных антител.

Фиг. 16 и 17 представляют выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей соответственно, мышиных моноклональных антител NM-01 с аминокислотными последовательностями легкой и тяжелой цепей гуманизированных антител NM-01 этого изобретения, обозначенных HuVH/HuVKF.

Фиг. 18, 19, 20, 21 и 22 графически представляют результаты проверки по исследованиям на обратную транскриптазу, p24, MT-2 и образование синцития соответственно, биологической активности химерных и гуманизированных антител этого изобретения.

Примеры Следующие примеры иллюстрируют практическое осуществление этого изобретения при получении линии клеток гибридомы HB 10726, выделение из нее моноклональных антител, иммунореактивных с белками gp120 (или его предшественников gp160) ВИЧ-1 так же, как и с пептидами, включающими аминокислотную последовательность G-P-G-R, представленную в ПОСЛ ИД N 1, определение характеристик таких моноклональных антител.

Более конкретно, пример 1 предназначен для демонстрации получения линии гибридомных клеток HB 10726 и выделение из нее моноклональных антител NM-01. Пример 2 имеет отношение к картированию вирусного этипота, распознаваемого антителом NM-01. Пример 3 описывает характеристики реактивности моноклональных антител с разными изолятами ВИЧ-1. Пример 4 связан с проверкой антител NM-01 на способность нейтрализовать инфицирование клеток H9 различными живыми штаммами ВИЧ-1, что демонстрируется анализами обратной транскрипазы и p24. Пример 5 посвящен дальнейшей проверке антител на их способность нейтрализовать инфекционность живых изолятов ВИЧ-1, что демонстрируется определением МТ-2 и образования синцития. Пример 6 относится к пептидному блокированию свойств нейтрализации инфекционности ВИЧ-1 моноклональных антител NM-01. Пример 7 описывает анализ способности моноклональных антител NM-01 опосредовать комплект-зависимый лизис ВИЧ-1. Пример 8 относится к определению действия комбинации моноклональных антител NM-01 и комплемента на инфицирование ВИЧ-1 восприимчивых клеток в культуре. Пример 9 описывает ДНК и выведенные аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелых и легких цепей моноклональных антител NM-01. Пример 10 относится к получению химерных или гуманизированных вариантов моноклональных антител NM-01 и определению им иммунологической и биологической активности.

Пример 1.

Линия клеток гибридом HB 10726 была получена с использованием стандартных иммунологических методик, таких, которые описаны у Oi и Herzenberg, Selected Methods Cell Immunology, pp. 351-372 (1979) и Godding, J. Immunol. Meth., 39, pp. 285-308 (1980) и конкретно представлены ниже.

A. Очистка живых ВИЧ-1_MN 300 мл культуры клеток H9, инфицированных ВИЧ-1_MN, центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут, чтобы осадить клетки. Содержащий вирус супернатант удаляли и сохраняли, тогда как осадок повторно центрифугировали при 2100 об/мин в течение 20 минут. Второй супернатант собирали и объединяли с первым и этот супернатант подвергали ультрацентрифугированию в роторе SW 27 при 25000 об/мин в течение 90 минут при 4^oC, чтобы осадить вирусные частицы. Полученный в результате супернатант отбрасывали. Осадок вирусов ресуспендировали в примерно 10 мл буфера ТНЭ (100 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl, pH 7,7, 1 мМ ЭДТА). Готовили ультрацентрифужную пробирку, содержащую нижний слой из 10 мл ТРЭ с 50% сахарозы, средний слой на 10 мл ТРЭ с 25% сахарозы и верхний слой из 10 мл образца вирусов, и центрифугировали в ультрацентрифуге при 25000 об/мин при 4^oC в течение 90 минут. Вирус осаждался в виде белой полосы между слоями ТРЭ с сахарозой и собирался пастеровской пипеткой. К вирусам добавляли двадцать мл ТРЭ/15 мМ ЭДТА (100 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl, pH 7,7, 15 мМ ЭДТА) и образец вирусов снова центрифугировали при 25000 об/мин при 4^oC в течение 90 минут. Полученный в результате осадок содержал очищенный живой ВИЧ-1_NM.

В. Иммунизация и получение гибридомы Для иммунизации каждой из трех двухмесячных мышей Balb/ с путем внутрибрюшинной инъекции использовали 100 мкг живого вируса ВИЧ-I_NM. Вторичную инъекцию 30 мкг вируса мышам делали через 3 недели и еще через 3 недели опять, 100 мкг вирусного препарата. Мышей забивали через 3 дня после второй реиммунизации и получали линии клеток гибридомы путем слияния спленоцитов с клетками РЗ-Х63-Ag8-U1 (АТСС CRL 1597). Линии гибридомных клеток получали также из селезенок мышей, иммунизированных хронически инфицированными клетками H9 (10 мышей), остро инфицированными клетками H9 (9 мышей) и мембранами инфицированных клеток H9 (3 мыши). Хронически инфицированные клетки H9 - это клетки спустя 2-3 недели после инфицирования, имеющие значения при исследовании на обратную транскриптазу (ОТ) от 100 000 до 150 000 имп/мин, в то время как остро инфицированные клетки H9 - это клетки спустя 10-12 дней после инфицирования, имеющие значения ОТ от 200 000 до 250 000 имп/мин.

Линии гибридомных клеток получали следующим способом.

Смесь клеток селезенки от иммунизированных мышей центрифугировали при 800 g в течение 5 минут. Супернатант отсасывали с осадка клеток и добавляли 1 мл теплого (37^oC) 50% PEG-1500 на 10⁸ клеток к осадку в течение периода в 1 минуту (добавить 0,25 мл, осторожно перемешать кончиком пипетки в течение 15 секунд и повторить). Смесь перемешивали дополнительно в течение минуты концом той же самой пипетки, не разбивая комочки клеток. В течение 1 минуты таким же путем (0,25 мл каждые 15 секунд) затем добавляли один мл "неполной среды" (RPMI 1640 (JRH Biosciences), дополненной 25 мМ HEPES (Sigma Co.), 10 000 ЕД/мл пенициллина и 10 000 мг/мл стрептомицина) и еще 1 мл добавлялся в течение еще 1 минуты. Затем 7 мл неполной среды подмешивали в течение 2-3 минут (1 мл каждые 20 секунд), что давало в результате суспензию с мелкими комочками клеток. Окончательную суспензию центрифугировали при 500 g на клинической центрифуге в течение 5 минут и супернатант удаляли. Осадок ресуспендировали вращением пробирки (не взвихривая или пепетируя раствор вверх и вниз) в "полной среде" ("неполная среда", которая описана выше дополненная 15% плодной телячьей сывороткой (FBS) до концентрации 210⁶ клеток на мл среды. Затем 0,1 мл этой суспензии (210⁵ клеток всего) на ячейку заполняли 96-ячеичные платы. Платы инкубировали при 37^oC в атмосфере с 7% CO₂. День слияния считался днем 0.

C. Селекция в НАТ и первоначальный скрининг гибридом Через двадцать четыре часа после слияния (день 1) в каждую ячейку добавляли 0,1 мл среды НАТ (10^-4 M гипоксантина, 510^-7 M аминоптерина и 1,610^-5 M тимидина). В дни 2, 3, 5, 8, 11, 14, 17 и 21 0,1 мл среды удаляли из каждой ячейки и заменяли 0,1 мл свежей среды НАТ. В дни со 2 по 5 ячейки, по-видимому, содержат только мертвые клетки. Гибридомы начинают появляться между днем 5 и 10. Гибридомы были легко заметны в виде колоний сильно преломляющих клеток, окруженных клеточными остатками.

D. Скрининг гибридом Для отбора гибридомных супернатантов использовалось несколько исследований. Гибридомы, секретирующие антитела, реагирующие с ВИЧ-1, первоначально идентифицировали путем отбора мембран, полученных из неинфицированных и инфицированных MN клеток H9 с помощью EL ISA с супернатантами культур гибридом. За этим первоначальным отбором следовал отбор по имммунофлюоресцентному и радиоиммунному исследования в дополнение к данным EL ISA с данными по связыванию антител с живыми инфицированными клетками.

Клеточные мембраны для EL ISA получали из инфицированных или неинфицированных клеток H9. Клетки суспендировали в 250 мМ сахарозы/Трис-HCl буфере при pH 7,4, содержащем 1 мМ ЭДТА. Суспензию гомогенизировали в гомогенизаторе Dounce, помещенном на ледяную баню, до тех пор пока не обнаруживалось живых клеток исключением по трипановому синему. Смесь центрифугировали в течение 2 минут при 50 g. Полученный в результате осадок повторно гомогенизировали и центрифугировали. Два супернатанта соединяли и центрифугировали при 20 000 g в течение 20 минут. Осадок опять гомогенизировали в том же самом буфере и центрифугировали в течение 20 минут, и осадок ресуспендировали в 7 мл первоначального буфера 250 мМ сахарозы-ЭДТА. Этот раствор затем наслаивали поверх буфера 2 М сахарозы/10 мМ Трис-HCl, содержащего 1 мМ ЭДТА и центрифугировали в течение 1 часа при 80 000 g. В результате получалась пушистая белая промежуточная поверхность, которая собиралась и ресуспендировалась в 250 мМ сахарозном буфере. Содержание белка определяли методом BCA (Pierce Chemical Company). Суспензию делили на равные образцы и хранили при -70^oC.

Для EL ISA в 96-ячеичную плату добавляли клеточные мембраны при концентрации 400 нг/ячейку и высушивали в течение ночи при 25^oC. Платы промывали 0,5% Тритон X фосфатно-буферным физраствором (PBS), блокировали 5% плодной бычьей сывороткой (FBS)/PBS и снова промывали. Супернатант гибридом (40 мкл) разводили в 50 мкл PBS и добавляли в ячейки, оставляя на ночь при 4^oC. После промывания в ячейки добавляли кроличий антимышиный IgG (H+L), конъюгированный с пероксидазой хрена (HRP) (Zymed) на 2 часа при 25^oC. Ячейки промывали 0,5% Тритон X /PBS и затем инкубировали в присутствии ABTS (Bio-Rad субстратный набор) в течение 20 минут перед контролем оптической плотности при 405 и 650 нм.

Супернанты гибридом, полученных из клеток селезенки мышей, иммунизированных хронически инфицированными клетками и остро инфицированными клетками, отбирали на положительную реакцию как на мембраны неинфицированных клеток, так и на мембраны инфицированных клеток при EL ISA, указывающую на то, что антитела, продуцируемые гибридомами, не являются ВИЧ-1-специфичными. Из 1039 гибридом, полученным из клеток селезенки мышей, иммунизированных мембранами инфицированных клеток, 5 их супернатантов сильно реагировали с мембранами инфицированных клеток и очень слабо реагировали с мембранами неинфицированных клеток. Проводился Вестерн-блоттинг с супернатантами от этих линий клеток гибридом, и было установлено, что три из этих продуцируемых моноклональных антител связывались с p55 ВИЧ-1, одно связывалось с p55 и p24 ВИЧ-1, и последнее не давало полосы при Вестерн-блоттинге (данные не показаны). Результаты EL ISA представлены в таблице 1 в виде отношений значений, полученных для мембран инфицированных клеток в сравнении с мембранами неинфицированных клеток.

Одна тысяча сто восемьдесят семь гибридов были получены из клеток селезенки мышей, иммунизированных живым ВИЧ-1_MN. Четыре линии гибридомных клеток были выбраны для дальнейшего отбора, основанного на результатах EL ISA, показывающих, что антитела в четырех супернатантах сильно реагировали с мембранами инфицированных клеток и очень слабо с мембранами неинфицированных клеток.

Супернатанты четырех гибридом подвергали клонированию методом серийных разведений и производили отбор по радиоиммуноисследованию (РИА). Кроличий против - мышиного IgG меченный ¹²⁵I (R M IgG¹²⁵I) очищали на колонке Sephadex G-50 (NEN-Du Pont). Неинфицированные клетки H9 или клетки H9 (7,510⁵ клеток в 150 мкл), инфицированные ВИЧ-1_MN, помещали в 15 мл пробирки. Пятьдесят мкл супернатанта от каждой гибридомы добавляли в каждую из пробирок, содержащих неинфицированные и инфицированные клетки, и смеси инкубировали в течение ночи при 4^oC. Клетки промывали 2 раза в 2 мл PBS/50% Твин-20 с взбалтыванием между промываниями. Пятьдесят мкл R M IgG¹²⁵I (750 000 имп/мин) в PBS/5% FBS добавляли и смесь снова инкубировали в течение ночи при 4^oC. После инкубации клетки 3 раза промывали PBS/50% Твин-20^oC. Сто мкл PBS/5% Тритон-X добавляли для дезинфекции клеток и 100 мкл 1 M NaOH добавляли, чтобы способствовать перенесению метки в сосуды для сцинтилляции. Образцы были просчитаны, и результаты РИА представлены в таблице 1, как отношения значений имп/мин, полученных для инфицированных клеток в сравнении со значениями для неинфицированных клеток.

Затем четыре линии гибридомных клеток отбирали по иммунофлюоресценции (ИФА). Два мл или неинфицированных или инфицированных ВИЧ-1 клеток H9 (примерно 110⁶ клеток/мл) помещали в 10 мл стерильные центрифужные пробирки с 10 мл PBS (без Ca⁺⁺ или Mg⁺⁺). Клетки один раз промывали 10 мл PBS путем заполнения пробирки, взбалтывания, центрифугирования при 100 об/мин в течение 5 минут и отсасывания всего супернатанта, кроме примерно 100 мкл, оставляя "молочную" клеточную суспензию. При работе под колпаком с ламинарным потоком 51 мм предметные стекла с 10 ячейками (Cel I Line Association) покрывали суспензией клеток, путем заполнения каждой ячейки до краев и затем втягивания суспензии обратно в кончик пипетки. Покрытым суспензией предметным стеклам давали высохнуть на воздухе и затем фиксировали в метаноле при комнатной температуре в течение 10 минут. Супернатант от каждой из четырех гибридом испытывали неразведенными и при титре 1:50 (супернатант разводили в 0,02% снятом молоке) на реактивность с препаратами неинфицированных и инфицированных клеток на предметном стекле. В каждую ячейку предметного стекла добавляли пятнадцать мкл неразведенных или разведенных супернатантов. Предметные стекла инкубировали при 37^oC в течение 30 минут и погружали в PBS при покачивании в течение 5 минут. Предметные стекла затем быстро смывали дистиллированной водой и высушивали на воздухе под колпаком с ламинарным потоком. Шестнадцать мкл фрагмента F(ab)₂(H+L)козьезо-антимышенного IgG (Cappel Biomedical), разбавленного 1: 80 0,02% снятым молоком, добавляли в каждую ячейку. Предметные стекла снова инкубировали при 37^oC в течение 30 минут и затем погружали в PBS. Предметные стекла промывали в 0,01% раствор Эванса-синего в PBS в течение 5 секунд и 2 раза ополаскивали дистиллированной водой. Предметные стекла просматривали на иммунофлюоресценцию, и результаты анализа представлены в таблице 2, причем мышиный IgG (MIgG), антитела 5C6 (анти-III_B) и супернатант грп. 5 (от гибридомы, полученной из селезенок мышей, иммунизированных мембранами инфицированных клеток) являются контрольными антителами.

Гибридомная клеточная линия HB 10726 была выбрана как наиболее обещающая в отношении антител на основании данных РИА и иммунофлюоресценции. Эта линия клеток не обладала наибольшей степенью связывания в EL ISA, но так как результаты РИА и иммунофлюоресценции представляют связывание с живыми инфицированными клетками, тогда как EL ISA представляет связывание с высушенными мембранами клеток, данные РИА более значимы. Эту клеточную линию дважды субклонировали и продуцируемые ей моноклональные антитела обозначили NM-01. Мышам внутрибрюшинно стандартным способом вводили эту клеточную линию и моноклональные антитела из асцитной жидкости концентрировали с помощью очистки на аффинной колонке с протеином А. (Pierce). С помощью специфических антисывороток (Bi O-Rad) было определено, что по изотипу антитела NM-01 являются IgG_2b. Антитела (1,8 мг/мл) разводили в среде RPM1 1640 с 15% FBS и использовали в последующих примерах.

Пример 2.

Чтобы охарактеризовать вирусный эпитоп, распознаваемый моноклональным антителом NM-01, сначала проверяли с помощью Вестерн-блот-анализа реактивность антител с очищенными белками вирионов MN и III_B, а затем с помощью EL ISA реактивность с перекрывающими пептидами, соответствующими аминокислотной последовательности области петли V₃ gp120 ВИЧ-1.

A. Вестерн-блот-анализ Вирион MN и III_B, очищенные из супернатантов культуры инфицированных клеток H9, разрушали в 1,3% додецилсульфате натрия (ДСН)/3% - меркаптоэтаноле и затем подвергали электрофорезу в 0,1% ДСН-10% полиакриламидном геле. После перенесения белков на нитроцеллюлозную бумагу полоски инкубировали в течение ночи с моноклональными антителами NM-01 в блокирующем буфере (0,02 М Трис-HCl, pH 7,4, 0,1 M NaCl, 0,05% нормальной козлиной сыворотки и 5% нежирного сухого молока) при 4^oC и затем промывали в 0,02 M Трис-HCl, pH 7,4, 0,1 M NaCl и 0,3% Твин. Полоски затем инкубировали с биотинилированным козьим анти-мышиным IgG (Zymed) в течение 1 часа, промывали и давали прореагировать с ¹²⁵I-стрептавидином (Amersham, Arlington Heights, IL) в течение дополнительного часа при 4^oC, реакционную способность моноклональных антител контролировали с помощью ауторадиографии.

Результаты ауторадиографии представлены на фиг. 1, причем полосы геля 1 и 3 содержали мембраны неинфицированных клеток H9; полоса 4 содержала мембраны инфицированных ВИЧ-1_MN клеток H9; полосы 2 и 5 содержали вирус ВИЧ-1_MN; и полосы 6 и 7 содержали вирус Антитела NM-01 реагировали с белками в полосах 1,2 и 6, тогда как сыворотка больного сероположительного на ВИЧ-1 реагировала с белками в полосах 3-5 и 7.

Моноклональные антитела NM-01 проявляли реактивность с вирусными белками MN и III_B, имеющими примерный молекулярный вес 120 kD, но не реагировали с любыми другими вирусными антигенами, показывая, что антитела распознают эпитоп gp120.

Для сравнения, моноклональные антитела F58/H3 и P4/D10, описанные у Wahren et al. PCT Publication N 91/11198, были получены их ECACC (поступления NN 90011607 и 90011608 соответственно) и были испытаны на связывание с рекомбинантным gp120 ВИЧ-1_MN (Agmed Inc., Bedford, MA), рекомбинантным gp120 (DuPont-NEN, Boston, MA), природным gp120 ВИЧ-1_MN и природным gp120 в Вестерн-блоттинге наряду с моноклональными антителами NM-01. Вестерн-блот выполнялся по существу так же, как описано выше, за исключением того, что кроличьи анти-мышиные вторичные антитела использовались в колориметрическом исследовании для определения связывания антител. Моноклональные антитела NM-01 реагировали с природным gp120 MN и III_B и с рекомбинантными gp120 как MN, так и III_B-производными. Моноклональные антитела F58/H3 и P4/D10, однако, реагировали только с природным gp120 и рекомбинантным gp120, производным от B. Картирование эпитопа с помощью EL ISA Чтобы идентифицировать специфический эпитоп gp120, распознаваемый антителами NM-01, антитела проверяли с помощью EL ISA на реактивность с перекрывающими пептидами, соответствующими области петли V₃ gp120. Пептиды, синтезированные с помощью Multiple Peptide Systems, San Diego, CA, соответствовали аминокислотам 302-316, 312-326 и 322-336 gp120 ВИЧ-1_MN.

Три пептида (250 нг/50 мкл 0,1 M боратного буфера, pH 8,0 на ячейку) инкубировали в течение ночи при 37^oC в платах Immulon 2 (Dynatech). Платы промывали PBS и блокировали PBS/0,1% Твин (0,1%) бычьим сывороточным альбумином (БСА) в течение 1 часа при комнатной температуре. Блокирующий агент удалялся, и различные количества антител NM-01 или мышиного IgG (MIgG), разведенных 100 мкл среды HAT, добавляли в платы. Антителам позволяли прореагировать в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем платы 10 раз промывали водопроводной водой. Конъюгированные с пероксидазой хрена кроличьи анти-мышиные вторичные антитела, разведенные до 1:1000, доводили в PBS/0,05% Твин /0,5% БСА и добавляли по 100 мкл на ячейку. Платы инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре и затем промывали 10 раз водопроводной водой. Субстрат ABTS (Bio-Rad) добавлялся на 20 минут, и платы анализировали при 650 нм. ПОСЛ ИД N 2-4 показывают аминокислотные последовательности пептидов, и таблица 3 представляет результаты исследования с использованием перекрывающих пептидов, причем антитела MIgG и среда HAT были отрицательными контролями.

В то время как не обнаружено реактивности на основе моноклональных антител NV-01 с пептидами, соответствующими аминокислотам 302-316 или 322-336 петли V₃, наблюдалось связывание антител с пептидом, представляющим