Способ стандартизации химического анализа (варианты), набор для проведения стандартизации атф биолюминесцентного анализа

Способ стандартизации химического анализа (варианты), набор для проведения стандартизации атф биолюминесцентного анализа

Реферат

 

Облучают фоточувствительное производное анализируемого вещества вспышкой видимого света определенной длины и интенсивности. При этом измеряют количество выделившегося анализируемого вещества. Измеренное количество используют в качестве стандарта. Использование изобретения позволяет повысить точность анализа. 4 с. и 19 з.п.ф-лы, 4 ил., 2 табл.

Изобретение относится к способам калибровки химических анализов и, в частности, но не исчерпываясь этим, к способу калибровки анализов особоважных веществ в аналитической микробиологии, например, калибровки анализа на аденозин 5'-трифосфат (АТР).

Точное обнаружение и количественное определение отдельных веществ или микроорганизмов в аналитических целях являются необходимыми лабораторными методами. Определение и измерение количества загрязняющих веществ или загрязняющих микроорганизмов в целях контроля продукта или процесса или безопасности пищевых продуктов имеют первостепенную важность в пищевой промышленности и при производстве напитков. Оценка микробиологической массы важна также в ряде других прикладных областей, включая переработку отходов, мониторинг процессов стерилизации и контроль качества воздуха. В многих случаях целесообразно иметь возможность оценивать степень микробиологического или химического загрязнения за возможно более короткий период времени.

Для определения и измерения количеств интересующих веществ пригодны многочисленные методы анализа, например ферментативные анализы, анализы ферментов, связывающих иммуносорбент (ELISA), спектрофотометрические анализы, люминесцентные анализы, флуоресцентные анализы, хроматографические анализы, анализы, основанные на измерении изменения плоскости поляризации света, производимой испытуемым образом, ион-селективные анализы (включая титриметрические анализы) и колориметрические анализы. Конкретный способ анализа, используемый в том или ином случае, зависит от аналитического вещества, которое необходимо определить и количественно измерить.

Существенным является то, что конкретный выбранный способ анализа должен быть настолько точным и воспроизводимым, насколько это возможно. Для достижения максимальной точности таких анализов важным является стандартизация или калибровка этого анализа. Целый ряд факторов может влиять на анализируемую реакцию и может порождать источники ошибок, поэтому влияние этих факторов должно быть минимизировано или учтено.

Известны способы стандартизации, в которых используют радиоактивные изотопы для стандартизации скорее контрольно-измерительной аппаратуры, чем собственно анализа (per se). Примером такой стандартизации с помощью радиоактивных изотопов является световой эталон Biolink Light Standard [1]. Такие эталоны основаны на активированных газообразным тритием люминофорах, испускающих свет в определенном спектральном диапазоне и обладающих предсказуемым послесвечением при длительном хранении. Такие приборы служат только как вспомогательные при калибровке самих фотометров.

В равной степени важно то, что анализ per se также откалиброван или стандартизован так, что могут быть учтены отклонения в образце и в составе реагентов.

Например, аденозин 5'-трифосфат (АТФ) является важным аналитическим веществом в микробиологических анализах. АТФ находят в живых клетках, но не в мертвых, и его присутствие в образце может быть индикатором микробиологического загрязнения.

Одним широко используемым способом проведения анализа на присутствие АТФ является способ биолюминесценции. В присутствии очищенного фермента (люциферазы), полученного от американского жука-светлячка, Photinus pyralis, подложки, D-люциферина и достаточного количества ионов магния и растворенного кислорода имеет место следующая реакция (АТФ = аденозин 5'-трифосфат; Mg - ионы магния; O₂ -кислород; АМФ = аденозин 5'- монофосфат; PP_i - неорганический фосфат; CO₂ - двуокись углерода).

При соответствующих условиях количество света, испущенного во время реакции, прямо пропорционально концентрации АТФ и может быть зарегистрировано чувствительным фотодетектором. Это является основой АТФ-биолюминесцентного анализа.

Анализы на присутствие АТФ, использующие реакцию с люциферазой жука-светлячка, могут быть калиброваны двумя способами [2].

В соответствии со способом внешней калибровки выход света, испущенного в реакции реагента на основе люциферазы жука-светлячка с образцом, может быть сравнен со светом, полученным от реакции реагента на основе люциферазы жука-светлячка с известным количеством АТФ, с помощью калибровочной кривой.

Хотя этот способ удобен и требует минимума манипуляций с реагентами, он также подвержен ошибкам. Это происходит вследствие того, что вывод света от реакций с люциферазой жука-светлячка непосредственно связан со скоростью реакции. Несмотря на то, что концентрация АТФ действительно дает основной вклад в управление скоростью реакции, она не является единственным определяющим фактором. Ингибиторы, присутствующие в образце (например, ионы металлов, ионы водорода) могут уменьшать скорость реакции, а стимуляторы, такие как очищающие вещества (детергенты), могут увеличивать скорость реакции [3]. Кроме этого, активность, присущая самому реагенту на основе люциферазы жука-светлячка, сможет варьироваться из-за непостоянных условий при производстве или в процессе работы. Даже тогда, когда на скорость реакции ничто не влияет, в реакционной смеси могут присутствовать вещества, которые в значительной степени поглощают произведенный свет, приводя, таким образом, к ошибке. Некоторые вещества, особенно Zn²⁺, в дополнение к уменьшению каталитической активности люциферазы жука-светлячка изменяют также длину волны света, произведенного в реакции. Это может вызывать уменьшение количества детектируемого некоторыми типами фотометров света [4], испускаемого в реакции.

Все эти источники ошибок могут быть устранены, если отказаться от подхода, связанного с эталонной кривой, в пользу способа внутренней стандартизации. В своем простейшем виде этот способ включает добавление известного количества АТФ, содержащегося в малом объеме жидкости, к инициированной реакции с люциферазой жука-светлячка. Выход света от образца с одной люциферазой и от образца с люциферазой и АТФ сравнивается и затем рассчитывается содержание АТФ в образце. Этот способ освобождает оператора от анализа ошибок, связанных с непостоянным составом образца.

Например, в заявке ЕР 0309429 A2, C 12 Q 1/66, 1984 предложен способ химического анализа, включающий измерение величины исследуемой в анализе характеристики, связанной с количеством анализируемого вещества, в частности, предложен способ АТФ-биолюминесцентного анализа, включающий смешивание исследуемого образца, содержащего АТФ, с реагентом, содержащим люциферазу-люциферин жука-светлячка, и измерение света, испускаемого полученной смесью. Предложен также набор для проведения АТФ-биолюминесцентного анализа.

Основой этого способа, однако, является использование стабильного эталонного раствора АТФ. Ведется много споров относительно стабильности таких эталонных растворов АТФ. Некоторые исследователи заявляют, что такие разбавленные растворы АТФ нестабильны и не должны подвергаться воздействию света и/или храниться во льду. Проблемы также могут возникнуть из-за плохого обращения с раствором. Несомненно наибольшую угрозу стабильности эталонных растворов АТФ представляет присутствие загрязняющих микроорганизмов в растворе. АТФ быстро утилизируется многими микроорганизмами [5], и, следовательно, их устранение из эталонных растворов АТФ является существенным. Стерильность оборудования является обязательной. Хотя предварительно взвешенные ампулы с АТФ могут быть куплены у некоторых производителей, специализирующихся на выпуске люминесцентных реагентов, их использование не является широко распространенным вследствие этих отмеченных ограничений. Эти проблемы становятся еще более важными, когда АТФ-биолюминесцентные анализы применяются в критических с точки зрения безопасности областях, таких как контроль чистоты продуктов и качества воздуха.

Несмотря на то, что проблемы стандартизации анализа проиллюстрированы с помощью АТФ-биолюминесцентного способа, они в равной степени относятся и к другим способам анализа.

Задачей настоящего изобретения является решение проблем стандартизации химических анализов, в частности, путем использования способа внутренней фотостандартизации.

Указанная задача решается тем, что в способе стандартизации химического анализа, включающем измерение величины исследуемой в анализе характеристики, связанной с количеством анализируемого вещества, осуществляют добавление к исследуемому образцу заранее определенного количества фоточувствительного производного анализируемого вещества с последующим измерением величины исследуемой в анализе характеристики, связанной с количеством анализируемого вещества, облучение смеси образец/фоточувствительное производное вспышкой видимого света заранее определенной длительности и интенсивности для освобождения из фоточувствительного производного известного количества анализируемого вещества, повторное измерение величины исследуемой характеристики, расчет изменения в измерениях величины исследуемой характеристики и использование значения в качестве стандарта для определения количества анализируемого вещества, исходно присутствующего в образце.

Задачей настоящего изобретения также является решение проблемы стандартизации химических анализов с помощью процедуры фотокалибрационных серий.

Указанная задача решается тем, что в способе стандартизации химического анализа, включающем измерение величины исследуемой в анализе характеристики, связанной с количеством анализируемого вещества, осуществляют облучение заранее определенного количества фоточувствительного производного анализируемого вещества вспышкой видимого света заранее определенной длительности и интенсивности для освобождения из фоточувствительного производного известного количества анализируемого вещества с последующим измерением величины исследуемой в анализе характеристики, связанной с количеством анализируемого вещества, использование полученного значения в качестве стандарта, с которым сравнивают результаты анализа образца.

Предпочтительно до стадии фотолиза иметь фоточувствительное производное в растворе, хотя при некоторых обстоятельствах может быть желательным использование фоточувствительного производного в высушенном состоянии.

В случаях, когда желательна процедура многоточечной калибровки, интенсивность и/или длительность вспышки видимого света при повторении операции облучения с последующим измерением величины исследуемой характеристики может варьироваться таким образом, чтобы компенсировать уменьшение количества фоточувствительного производного, пригодного для фотолиза.

Кроме того, задачей настоящего изобретения является способ стандартизации АТФ-биолюминесцентного анализа.

Указанная задача решается тем, что в способе стандартизации химического анализа путем смешивания исследуемого образца, содержащего АТФ, с реагентом, содержащим люциферазу-люциферин жука-светлячка, и измерением света, испускаемого полученной смесью, дополнительно осуществляют предварительное введение заранее определенного количества фоточувствительного производного АТФ в реагент люцифераза-люциферин жука-светлячка, измерение света, вызываемого возникающей реакцией, сопровождающейся люминесценцией, облучение смеси образец/реагент вспышкой видимого света заранее определенной длительности и интенсивности для освобождения из фоточувствительного производного известного количества АТФ, повторное измерение света, вызываемое возникающей реакцией, сопровождающейся люминесценцией, расчет изменения в измерениях эмиссии света, и использование рассчитанного значения в качестве стандарта для определения количества АТФ, исходно присутствующего в образце.

Настоящий способ, нерадиоактивный, использующий методику фотостандартизации, обладает преимуществами перед существующими до этого способами стандартизации в отношении (1) точности и правильности результатов; (2) проверки результатов и (3) удобства для пользователя.

Кроме того, задачей настоящего изобретения является набор для проведения стандартизации АТФ-биолюминесцентного анализа.

Указанная задача решается тем, что предложен набор для проведения стандартизации АТФ-биолюминесцентного анализа, включающий фоточувствительное производное АТФ и реагент люцифераза-люциферин жука-светлячка.

Повышенная точность является результатом устранения ошибок, связанных с добавлением стандартного аналитического вещества с помощью пипетки, и компенсации любых изменений в оптическом или каталитическом тушении, связанном с разбавлением образца. Возможность использования простой обоснованной схемы стандартизации должна вероятно дать выигрыш в виде облегчения проверки результатов, что имеет значение в отношении законодательства в области продовольствия и стандартов и некоторых критических с точки зрения безопасности применений. Повышенное удобство для пользователя является результатом того, что для осуществления такого анализа нет необходимости в отдельном стандартном растворе аналитического вещества. Более того, стандартизация анализа может быть полностью независима от способа обнаружения или количественного определения интересуемого аналитического вещества.

Для использования в физиологических исследованиях было создано множество биологически интересных синтетических соединений, в которых присутствует фоточувствительная химическая связь. Когда одно из этих соединений подвергается действию короткой вспышки света большой интенсивности, освобождается продукт реакции. Фоточувствительное соединение, из которого может освободиться интересующая молекула или ион, называется соединением - "иммобилизатором". Следовательно, АТФ освобождается из "Иммобилизатора" АТФ, Ca²⁺ освобождается из "иммобилизатора" Ca²⁺ и так далее. Такие фоточувствительные производные аналитического вещества удобны для целей настоящего изобретения, и их использование вместе с лампой-фотовспышкой высокой интенсивности или лазера, работающего в режиме модулированной добротности и удаления частоты, обеспечивает удобные и не требующие вторжения способы стандартизации и химического анализа. Обнаружение того, что коммерчески доступные лампы-фотовспышки могут давать эффективное освобождение молекул аналитического вещества из исходного вещества-"иммобилизатора", было ранее неизвестно.

В соответствии с первым предпочтительным способом осуществления настоящего изобретения предварительно определенное количество соединения-иммобилизатора может быть добавлено к анализируемому образцу или к буферному раствору, используемому для разбавления исследуемого образца. Затем измеряют конкретную анализируемую характеристику. Измеряемая в ходе анализа тестовая характеристика зависит от рассматриваемого анализа, это может быть, например, излучаемый свет, выделенное тепло, изменение цвета или другие характеристики.

Затем заранее заданное количество свободного соединения освобождается из иммобилизованного соединения путем экспозиции смеси вспышкой света заранее определенной интенсивности и длительности. Тестируемая характеристика может быть измерена повторно, и изменение значений тестируемой характеристики может быть рассчитано. Рассчитанное значение может быть затем использовано в качестве стандарта для определения количества аналитического вещества, изначально присутствующего в образце.

Альтернативно, в другом предпочтительном способе настоящего изобретения интервал стандартных концентраций рассматриваемого соединения может быть получен варьированием степени фотолиза в одном концентрированном растворе иммобилизованного соединения. Таким образом могут быть приготовлены калибровочные серии, например, на микротитровой пластине без использования пипетки для приготовления различных объемов стандартных растворов аналитического вещества. В соответствии с этой схемой для тестовых анализов можно было бы следовать общепринятой процедуре анализа, однако в отдельных анализах стандартизацию можно осуществить путем фотолиза иммобилизатора аналитического вещества перед проведением самого анализа.

Соответственно, этот общий метод фотостандартизации может быть использован с широким набором методов анализа, включая анализы фермента, связывающего иммуносорбент (ELISA), ферментативные анализы, спектрофотометрические анализы, флуоресцентные анализы, анализы, основанные на измерении изменений вращения плоскости поляризации света тестируемого образца, ион-селективные анализы (включая титриметрические анализы) и колориметрические анализы.

В случаях, когда требуется максимально возможная точность и тщательность тестовых процедур, может потребоваться выполнение многоточечной калибровки, а не одноточечной калибровки. Это может быть достигнуто получением калибровочных серий путем проведения раздельного фотолиза в различных концентрированных растворах одного иммобилизованного соединения (в идеальном случае на микротитровой пластине или ее эквиваленте). Варьируя степень фотолиза, например, применяя одну, две, три или четыре вспышки заранее определенной интенсивности и длительности, получают набор калибровочных стандартов.

Однако этот подход не пригоден там, где измерение и калибровка должны осуществляться в одной и той же пробирке, не влияя друг на друга, и где аналитическое вещество должно присутствовать на особом шаге проведения анализа, таким как начало процедуры анализа. Возможно, однако, осуществление многоточечной калибровки некоторых анализов, в которых используется одна пробирка, таких как АТФ-биолюминесцентный анализ. Эта возможность появляется в результате того, что такие процедуры анализа пригодны до момента, когда аналитическое вещество освобождается в тестируемый раствор. При некоторых обстоятельствах многоточечная калибровка анализов с одной пробиркой может превосходить с точки зрения правильности и точности одноточечную калибровку этих тестов.

Предлагая такие процедуры важно оптимизировать соотношения между общим количеством иммобилизованного материала, принимающего участие в фотолизе, и интенсивностью источника света. В случае анализов, которые стандартизируются с помощью одноточечной процедуры калибровки, желательно использовать в реакции как можно меньшее количество материала-иммобилизатора и максимизировать превращение иммобилизованного материала в аналитическое вещество, используя свет с интенсивностью, достаточной для освобождения > 50% аналитического вещества из иммобилизованного материала. Однако в случае анализов, которые следует стандартизировать посредством многоточечной калибровки, важно ограничить превращение иммобилизатора аналитического вещества в свободное аналитическое вещество к первой стадии фотолиза, используя свет с интенсивностью, способной привести к освобождению только 1-2% аналитического вещества при облучении. Следовательно, чтобы быть уверенным, что освобождено достаточное количество аналитического вещества, полная концентрация иммобилизованного материала, участвующего в анализе, должна быть выше, чем в случае реагентов, созданных для использования с одноточечными калибровками.

При использовании световых вспышек фиксированной интенсивности и длительности количество аналитического вещества, освобожденного с каждой последующей вспышкой, уменьшается. Варьируя интенсивность и/или длительность вспышки, возможно компенсировать уменьшение количества иммобилизованного материала, участвующего в фотолизе, что приводит тем самым к образованию одинаковых количеств аналитического вещества на каждой стадии и дает линейные калибровочные серии.

На практике количество аналитического вещества, освобождаемого при стандартных условиях фотолиза, может быть определено с помощью отдельно приготовленной стандартной кривой, полученной с использованием непроизводной формы аналитического вещества. Концентрация фоточувствительного аналитического вещества в реакции может быть выбрана такой, чтобы высвободить определенное количество аналитического вещества, или для получения того же результата может быть выбрана интенсивность и/или длительность световой вспышки.

Некоторые материалы фосфоресцируют при облучении вспышкой света высокой интенсивности, такие как полученные с применением ламп вспышек. Интенсивность такой фосфоресценции зависит от материала. В анализах, в которых оценки концентрации аналитического вещества производятся с помощью измерения испущенного света (например, анализы, основанные на биолюминесцении, хемилюминесценции и флуоресценции), фосфоресценция является источником помех. Способы минимизации или корректировки такого вмешательства включают в себя следующие (заметим, что одновременно может быть использовано более одного пути).

Первый путь состоит во введении запаздывания по времени между временем фотолиза и временем измерения. Логарифм интенсивности фосфоресценции уменьшается пропорционально логарифму прошедшего времени. В результате оказывается достаточным промежутка времени в несколько секунд для уменьшения измеренной эмиссии света до значения, которое приемлемо для многих типов анализов.

Второй путь состоит или в фильтрации света, используемого для облучения образца (или использование монохроматического света, такого, например, как от лазерного источника), или в фильтрации света, испущенного материалом кюветы. Оба пути могут быть одинаково эффективными в зависимости от используемых материалов.

Третий путь заключается в отборе материалов, которые обладают низким потенциалом возбуждения фосфоресценции при их облучении в соответствии с процедурой фотостандартизации.

Материалы, используемые в обычной лаборатории, значительно различаются по своим характеристикам при облучении стандартым источником полихроматического света в виде лампы фотовспышки.

Еще одним путем является корректировка результата, полученного после фотолиза для света, испускаемого в результате фосфоресценции. Это может быть достигнуто с использованием электронного вычислительного устройства при условии, что (1) известна собственная фосфоресценция материала, (2) материалы отобраны так, чтобы удовлетворить стандартным требованиям спецификации, и (3) стандартизировано время, в которое проводятся измерения после облучения светом.

Большинство иммобилизованных материалов, коммерчески доступных, либо произведенных в лаборатории с использованием известных способов, загрязнены в большей или меньшей степени "неиммобилизованными" продуктами. Присутствие "неиммобилизованных" продуктов должно быть уменьшено до технически незначительных уровней для того, чтобы оптимальным образом реализовать методику фотостандартизации. В случае иммобилизатора АТФ загрязняющие молекулы АТФ должны быть устранены (превращены в АДФ и АМФ, которые не реагируют с люциферазой жука-светлячка) путем осуществления взаимодействия иммобилизатора АТФ с ферментом расщепления АТФ, таким как апираза в растворенной или фиксированной форме. Иначе, реагент люциферин-люцифераза, содержащий АТФ-иммобилизатор, может выдерживаться в течение 8-10 часов или больше при 4^oC. В течение этого времени люцифераза жука-светлячка катализирует гидролиз АТФ, но не влияет на уровень мобилизованного АТФ. АТФ также может быть удален с использованием любого из известных в настоящее время способов препаративной химии, включая хроматографию, избирательное осаждение или экстракцию. Сходные способы могут быть использованы для обработки иммобилизованных форм других аналитических веществ перед использованием их для фотостандартизирующих анализов, в которых часто применяются методы, которые в большинстве случаев известны.

В некоторых случаях может быть желательной более высокая степень чистоты материала-иммобилизатора. Например, в случае 1-(2-нитрофенил)этилового эфира АТФ коммерчески доступный материал состоит из пары диастереоизомеров, так как нитрофенильная группа, используемая в качестве фотонеустойчивого "иммобилизатора", может присоединиться к АТФ с образованием двух различных конфигураций. Хотя эти два стереоизомера обладают идентичными фотохимическими свойствами, в некоторых применениях использование только одного из них может дать преимущество. Например, взаимодействие каждого стереоизомера или, точнее, его способность образовывать комплексы с включениями компонентов реагентов, участвующих в анализе, таких как -,-,- циклодекстрин, будет различным для каждого стереоизомера. Некоторые коммерчески доступные реагенты люциферазы жука-светлячка содержат циклодекстрины (см. , например, [6]). Стереоизомеры иммобилизованных веществ могут быть отделены друг от друга с использованием известных способов.

Предполагается, что при некоторых обстоятельствах фиксированное количество иммобилизованного соединения может быть высушенным путем вымораживания на предметах, используемых для проведения анализа. Примеры таких предметов включают кончики пипеток одноразового пользования, одноразовые кюветы для образцов и одноразовые бумажные диски и ленты. Используемое иммобилизованное соединение, которое было высушено вымораживанием на этом предмете, растворяется при контакте с жидкостью, например исследуемым образцом или реагентом для анализа. Заранее заданное количество аналитического вещества может освободиться из молекулы-иммобилизатора в любое время под действием фотолиза как в случае, когда иммобилизованное соединение находится в высушенном состоянии, так и в случае, когда оно находится в растворе. Этот путь стандартизации особенно важен в случаях, когда иммобилизованное соединение не обладает требуемой стабильностью в водном растворе. В высушенном состоянии стабильность большинства иммобилизованных соединений по отношению к окислению заметно увеличивается.

В ферментативных анализах, таких, в которых аналитическое вещество превращается в другое соединение в результате ферментативной реакции, превращение аналитического вещества может сочетаться с уменьшением флавин нуклеотида, такого как никотинамид аденин динуклеотида, или с возникновением соединения, такого как АТФ. Иммобилизованная форма "вторичного" аналитического вещества (например, NADH или АТФ) может быть введена в реакционную смесь и высвобождена, при желании, с помощью фотолиза. В результате стандартизация таких анализов достигается без необходимости приготовления отдельных растворов стандартных материалов, позволяя экономить время и усилия оператора.

Примеры аналитических веществ, которые могут быть стандартизированы одним или большим числом вышеупомянутых путей, включают в себя АТФ, аденозин монофосфат (АМФ), циклический аденозин монофосфат (ЦАМФ), аденозин дифосфат (АДФ), гуанозин тифосфат (ГТФ), субстраты (подложки) для люминогенных реакций (такие, как D-люциферин), ингибиторы люминогенных реакций (такие, как L-люциферин), органические кислоты (такие, как щавелевая кислота), жирные кислоты (такие, как араходоновая кислота), аминокислоты (такие, как фенилаланин), сахара (такие, как глюкоза), фосфаты сахара (такие, как глюкоза-6-фосфат), пестициды (такие, как атразин), природные токсиканты (такие, как охратоксин А), антибиотики (такие, как бензилпенициллин) и фармакологически интересные соединения (такие, как допамин, норепинефрин, серотонин, тестостерон и интерферон). Этот перечень не претендует на то, чтобы быть исчерпаемым, и приведен с целью иллюстрации.

Были синтезированы различные фоточувствительные производные АТФ, способные освобождать АТФ. Одним из примеров таких АТФ-производных является нитрофеноловый эфир АТФ, содержащий фотогидролизуемую эфирную связь (фиг. 1). Другие представители этой группы соединений могли бы быть заменены нитрофенолом. Еще одним примером подходящего производного АТФ является 1-(4,5-диметокси-2-нитрофенил)-диазоэтан (ДМНФЭ).

Иммобилизованный АТФ был использован во множестве исследовательских приложений, относящихся к ряду областей, включающих в себя изучение биохимии мышц [7] . Ранее он не был предложен или применен для целей калибровки биохимических или микробиологических анализов.

Выход АТФ из АТФ-иммобилизатора, как было показано, не зависит от pH в диапазоне pH 6-9; более того, было показано, что захватчик АТФ удобен для работы, так как он растворим в воде при нейтральном pH и заметно не участвует в фотолизе под действием неяркого дневного света в течение нескольких минут [8].

Для того, чтобы прокалибровать АТФ биолюминесцентную реакцию в соответствии со способом, предлагаемым в настоящем изобретении, соединение иммобилизованного АТФ вводят в реагент люциферазы жука-светлячка в заранее определенной концентрации. Люцифераза жука-светлячка не проявляет какой-то каталитической активности по отношению к иммобилизованному АТФ (см. Пример 1) и, следовательно, без добавления АТФ не возникает излучения света от такого препарата люциферазы. Реагент может быть использован для проведения высокочувствительных анализов АТФ следующим образом: Образец и реагент смешивают в одноразовой кювете фотометра. Образец может состоять из водной жидкости любого происхождения или может быть специально приготовленным "экстрактом", полученным как результат обработки любым из ряда агентов, созданных для освобождения АТФ из живых организмов. Свет, испускаемый при люминесцентной реакции, измеряют с помощью фотометра. Известное количество АТФ затем освобождается в реакционной смеси при облучении кюветы вместе с ее содержимым вспышкой видимого света высокой интенсивности, создаваемой, например, лампой фотовспышкой. Затем кювету опять помещают в фотометр и еще раз измеряют эмиссию света от реакции с участием люциферазы. Так как вспышка света вызывает освобождение известного количества АТФ из находящегося в кювете клеткообразного АТФ, количество света, отвечающего за присутствие этого известного количества АТФ, может быть рассчитано по разнице. Затем может быть рассчитано количество АТФ, исходно присутствующее в реакционной смеси.

Следующие примеры, не ограничивающие настоящее изобретение, описывают изобретение более подробно.

Пример 1. Использование иммобилизованного АТФ для стандартизации анализов на АТФ.

Иммобилизованный АТФ (Calblochem, США, прод. N 119127, 5 мг) был растворен в 0,5 мл стерильной деионизованной воды. Полученная исходная смесь хранилась охлажденной до - 20^oC до момента использования. Перед использованием раствор разбавили в отношении 1:1000 стерильной деионизованной водой. К 3 мл коммерчески доступного реагента люцифераза-люциферин (реагент Biotrace ХТ, Biotrace Ltd., Bridgend, Великобритания) добавили 200 мкл исходного раствора иммобилизованного АТФ для получения контрольного реагента или 200 мкл концентрированного раствора иммобилизованного АТФ с образованием реагента иммобилизованного АТФ. Затем реагенты выдерживались в термостате при температуре 20^oC в течение 1-6 часов.

В разные моменты времени после приготовления реагентов в чистую одноразовую кювету фотометра помещали стерильную деионизованную воду, к которой затем добавляли 100 мкл контрольного реагента или реагента иммобилизованного АТФ. Свет, испускаемый при протекании реакции, измеряли с помощью фотометра Biotrace M3 (Biotrace Ltd., Bridgend, Великобритания), который интегрировал световой сигнал в течение 10 сек после запаздывания в 2 сек. Затем раствор АТФ (10 мкл, 0,1 мкМ) добавляли к реакционной смеси и световой выход измеряли второй раз. Кювету вместе с ее содержимым подвергали затем действию интенсивной световой вспышки от импульсной лампы Hanimex 325A2 (Hanimex, Великобритания) и световой выход от реакции измеряли третий раз.

В таблице 1 представлены полученные значения светового выхода. Эти результаты показывают, что: (1) иммобилизованный АТФ не конкурирует с АТФ на активных центрах люциферазы жука-светлячка, как это видно из сходности полученных световых сигналов при добавлении 1 пикомоль АТФ к обоим реагентам (средние значения, n=5): 1302 отн.ед. при добавлении 1 пикомоля АТФ в отсутствие иммобилизованного АТФ и 1304 отн.ед. при добавлении 1 пикомоля АТФ в присутствии 95.2 пикомоля клеткообразного АТФ; (2) вспышка света высокой интенсивности не влияет на скорость реакции с участием люциферазы жука-светлячка, что подтверждает тот факт, что отклик реагента на добавление 1 пикомоля АТФ не меняется после облучения (1308 отн. ед. перед облучением, 1276 отн. ед. после облучения, разница может быть объяснена исключительно естественным уменьшением люминесценции, связанным с такими реакциями); (3) облучение реагента иммобилизованного АТФ вспышкой света высокой интенсивности приводит к увеличению содержания АТФ в анализе, эквивалентному 1.171 пикомоля АТФ на анализ. Анализы могут быть калиброваны на основе этого ответного сигнала. Калибровка анализов этим способом (по отношению к 1 пикомолю АТФ, добавленному к реакции) давала значение 1.000.08 пикомоля АТФ на анализ (среднее значение среднеквадратичное отклонение, n=5) с ошибками, случайно распределенными во времени. В случае контрольных анализов, стандартизованных с помощью стандартной кривой (используя данные, полученные с реагентом, приготовленным за 1 час до этого), было получено значение 0.93 0.06 пикомоля АТФ на анализ с отдельными данными, показывающими заметное уменьшение по отношению ко времени с момента приготовления реагента (вследствие уменьшения каталитической активности люциферазы).

Будучи однажды введенным в реагент люциферазы, иммобилизованный АТФ мог освободить АТФ за счет самопроизвольного гидролиза в результате ферментативного действия, и/или за счет фотолиза. Результаты, приведенные в примере 1, показывают, что освобождение АТФ в соответствии с первыми двумя механизмами пренебрежимо мало и при облучении вспышкой света высокой интенсивности, даваемой лампой-вспышкой, АТФ быстро высвобождается из присутствующего иммобилизатора АТФ.

Замечания к таблице 1 1. Фотовспышка высокой интенсивности (производимая лампой-вспышкой Hanimex 325A2, Hanimex, Великобритания) не вызывает люминесценции ни от пустых кювет, ни от кювет, содержащих тестовые растворы, такие как вода или иммобилизованный АТФ, или реагенты люцифераза-люциферин при отсутствии иммобилизованного АТФ.

2. Из "фотостандарта" АТФ (иммобилизованного АТФ) высвобождалось 1.171 пикомоля АТФ на анализ при облучении фотовспышкой высокой интенсивности.

Это дает скорость превращения иммобилизованного АТФ, присутствующего в анализе, 1,23%.

3. Подобные результаты были получены при проведении анализов в присутствии АТФ экстрактанта на основе детергента (разбавитель красок (растворитель для отмывания кистей) ХТ, Biotrace Ltd., Bridgend, Великобритания) вместо воды в качестве матрицы образца, показывая тем самым, что этот способ стандартизации совместим с использованием таких реагентов.

Пример 2. Во втором эксперименте проводилась аналогичная серия анализов. В этих экспериментах контрольный реагент и реагент люциферин-люциферазы иммобилизованный АТФ перед использованием выдерживали в термостате в течение 6 часов. В качестве испытуемой смеси, к которой добавляли реагент перед введением АТФ и/или облучением светом, использовали стерильную деионизованную воду или смесь воды и 0.1 М буферного раствора натрий 3,3'-диметилглютарата (pH 4.00). Эти условия эксперимента были выбраны для получения ряда значений pH в окончательном анализе. Результаты таблицы 2 показывали, что в присутствии повышенных количеств буферного раствора световой выход от реак