Способ получения кобаламинов, плазмида (варианты), микроорганизм

Способ получения кобаламинов, плазмида (варианты), микроорганизм

Реферат

 

Изобретение относится к получению новых полипептидов, задействованных в биосинтезе кобаламинов. Клетки штамма продуцента кобаламинов трансформируют плазмидой, содержащей либо гены cob F - cob M оперона биосинтеза кобаламинов Pseudomonas, либо гены cob A и cob E названного оперона, либо комбинацию этих генов. Клетки культивируют в условиях, обеспечивающих биосинтез кобаламинов. Выделяют целевой продукт. Плазмида pXL 368 содержит гены cob A и cob E оперона биосинтеза кобаламинов. Плазмида pXL 367 содержит гены cob F - cob M. Плазмида pXL 525 содержит гены cob A и cob E и гены cob F - cob M. Микроорганизм Pseudomonas denitrificans SC 510 RifR несет плазмиду pXL 525 и продуцирует кобаламины. Способ позволяет повысить продуктивность штамма, осуществляющего биосинтез кобаламинов. 5 с. и 9 з.п. ф-лы, 23 табл., 54 ил.

Настоящее изобретение относится к новым полипептидам задействованных в биосинтезе кобаламинов и/или кобамидов и, в частности, коэнзима /кофермента/ B₁₂. Оно относится также к генетическому материалу, ответственному за экспрессию этих полипептидов, а также к способу, позволяющему проводить их получение. Наконец, оно относится к способу увеличения производства кобаламинов и, в частности, коэнзима B₁₂ методами рекомбинантной ДНК.

Витамин B₁₂ является одним из витаминов группы B. Речь идет о водорастворимом витамине, который был идентифицирован в качестве фактора, позволяющего лечить больных, страдающих злокачественной анемией. Он обычно предписывается для стимулирования кроветворения у пациентов, подверженных усталости, но он также используется в многочисленных других случаях, к которым относятся нарушения печени, недостаточности нервной системы, или в качестве средства, стимулирующего аппетит, тонизирующего средства, а также в дерматологии /Beck, 1982, Fraser et al., 1983/. В промышленном разведении нежвачных животных, где питание в основном базируется на протеинах растительного происхождения, необходимо вводить в питательный рацион витамин B₁₂ в количествах от 10 до 15 мг на тонну пищи /Barrere et al., 1981/.

Витамин B₁₂ относится к классу молекул, называемых кобаламинами, структура которых представлена на фиг. 1. Кобамиды отличаются от кобаламинов основанием нижнего нуклеотида, которое больше не является 5,6-диметилбензимидазолом, а представляет собой другое основание, например, 5-гидркосибензимидазол для витамина B₁₂-фактора III, синтезированного среди прочих при помощи Clostridium thermoaceticum и Methanosarcina barkeri / Iron et al., 1984/. Это структурное сходство объясняет то, что пути метаболизма при биосинтезе кобаламинов и кобамидов по большей части являются общими.

Кобаламины синтезируются почти исключительно при помощи бактерий в соответствии со сложным и еще плохо изученным способом, который может быть разделен на четыре стадии /фиг. 2/: I/ синтез уропорфириногена III /или уро'ген III/; потом II/ превращение уро'гена III в кобириновую кислоту; затем III/ превращение последней в кобинамид; и IV/ построение нижнего нуклеотидного витка с введением специфичного основания /5,6-диметилбензимидазола в случае кобаламинов/.

Для кофермента B₁₂ является вероятным то, что присоединение 5'-деокси-5'-аденозильной группировки происходит вскоре после того, как синтезируется корриновое кольцо /Huennekens et al., 1982/.

В случае кобамидов только стадия синтеза и внедрения нижнего основания является отличной.

Первая стадия биосинтеза кобаламинов очень хорошо известна, потому что она является общей как для синтеза гемов, так и для синтеза хлорофиллов /Battersby et al., 1980/. В ней последовательно принимают участие -аминолевулинатсинтаза /EC 2.3.137/, -аминолевулинатдегидраза /EC 4.2.1.24/, порфобилиногендеаминаза /EC 4.3.1.8/ и уро'ген III-косинтаза /EC 4.2.1.75/, которые трансформируют сукцинил-CoA и глицин в уро'ген III. Однако у некоторых микроорганизмов /например, E. coli (Avissar et al., 1989) и у метаногенных бактерий (Kannangara et al. , 1989), например, первая стадия осуществляется путем превращения, благодаря мультиферментному комплексу глутаминовой кислоты в -аминолевулиновую кислоту.

Между уро'геном III и кобириновой кислотой к настоящему времени были получены в чистом виде только три промежуточных производных; речь идет о факторах PI, PII и PIII, которые являются продуктами окисления соответственно трех промежуточных соединений: прекоррина-1, прекоррина-2 и прекоррина-3, которые соответствуют моно-, ди- и триметилированным производным уро'гена III /фиг. 3/; эти промежуточные соединения получаются в результате последовательных переносов метильных группировок от SAM /S-аденозил-L-метионина/ на уро'ген III в положения C2, C7 и C20 соответственно. Другими реакциями, которые имеют место при образовании кобириновой кислоты, помимо пяти других переносов метильных группировок от SAM в положения C17, C12, C1, C15 и C5, являются отщепление углерода в положении C20, декарбоксилирование в положении C12 и внедрение атома кобальта /фиг. 4/. Эти стадии биосинтеза были установлены исходя из экспериментов, осуществленных in vitro на неклеточных экстрактах Propionobacterium shermanii или Clostridium tetanomorphum. В этих экстрактах кобириновая кислота получается в результате превращения уро'гена III после инкубации в соответствующих условиях при анаэробиозе /Batterby et al., 1982/. К настоящему времени у этих микроорганизмов не было выделено никакого промежуточного соединения между прекоррином-3 и кобириновой кислотой, которое может быть превращено в корриноиды путем дальнейших инкубаций с экстрактами бактерий, производящих кобаламины. Трудности выделения и идентификации этих промежуточных соединений связаны с: - их большой нестабильностью; - их чувствительностью к кислороду; и - их небольшим уровнем накопления in vivo.

На этой части процесса был очищен и изучен только фермент из Pseudomonas denitrificaus; речь идет о SAM: уро'ген III-метилтрансферазе /Blanche et al. , 1989/, называемой SYMT.

При переходе от кобириновой кислоты к кобинамиду осуществляются следующие реакции: - присоединение 5'-дезоксиаденозильной группировки /если речь идет о коферменте B₁₂, который должен быть синтезирован/; - амидирование шести из семи карбоксильных функций путем присоединения аминогрупп; - амидирование последней карбоксильной функции /звено пропионовой кислоты пиррольного кольца D/ путем присоединения P-1-амино-2-пропанола /фиг. 2/.

Не было выяснено, существует ли действительно порядок для реакций амидирования /Herbert et al., 1970/. Наконец, не было описано никакого количественного определения активности на этой части процесса, за исключением того, что касается присоединения 5'-дезоксиаденозильной группировки /Huennekens et al., 1982/.

Последняя стадия биосинтеза кобаламина, например кофермента B₁₂, включает четыре последовательные фазы, описанные на фиг. 5 /Huennekens et al., 1982/, а именно: I/ фосфорилирование гидроксильной группировки аминопропанольного остатка в кобинамиде с образованием кобинамидфосфата, затем II/ присоединение гуанозиндифосфата в результате реакции с гуанозин-5'-трифосфатом; полученное соединение является ГДФ-кобинамидом /Friedmann, 1975/, который III/ реагирует с рибазол-5'-фосфатом, синтезированным, исходя из рибофлавина, с образованием аденозилкобаламин-5'-фосфата /Fiedmann et al., 1968/, который IV/ в результате дефосфорилирования приводит к образованию кофермента B₁₂ /Schneider et Friedmann, 1972/.

Среди бактерий, способных вырабатывать кобаламины, можно указать, в частности: Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter Bacillus megaterium Clostridium sticklandii Clostridium tetanomorphum Clostridium thermoaceticum Corynebacterium XC Eubacterium limosum Methanobacterium arbophilicum Methanobacterium ivanovii Methanobacterium ruminantium Methanobacterium thermoautotrophicum Methanosarcina barkeri Propionobacterium shermanii Protaminobacterium ruber Pseudomonas denitrificaus Pseudomonas putida Rhizobium melitoti Rhodopseudomonas spaeroides Salmonella typhimurium Spirulina platensis Streptomyces antibioticus Streptomyces aureofaciens Streptomyces qriseus Streptomyces olivaceus В промышленном масштабе вследствие большой сложности механизмов биосинтеза производство кобаламинов и, в частности, витамина B₁₂ является исключительно микробиологическим. Оно осуществляется путем культивирования в больших масштабах бактерий Pseudomonas denitrificaus, Propionobacterium chermanii и Propionibacterium freudenreichii /Florent, 1986/. Штаммы, используемые для промышленного производства, происходят из диких штаммов; они могут подвергаться многочисленным циклам случайных мутаций с последующей селекцией улучшенных клонов для производства кобаламинов /Florent, 1986/. Мутации получаются в результате мутагенеза с мутагенными агентами или в результате физических воздействий, таких как обработка ультрафиолетовым излучением /Barrere et al., 1981/. В результате этого эмпирического способа получаются случайные мутации, которые улучшают производство кобаламинов. Например, описано, что исходя из оригинального штамма Pseudomonas denitrificaus, первоначально выделенного Миллером и Розенблюмом /1960, патент США 2938822/, производство этого микроорганизма было постепенно увеличено за десять лет при помощи указанных выше способов от 0,6 мг/л до 60 мг/л /Florent, 1986/. Для бактерий вида Propionibacterium/Propionobacterium shermanii (ПАТСС 13673) и frendenreichii (АТСС 6207)/ в литературе, по-видимому, описаны аналогичные значения производительности; например была описана производительность величиной 65 мг/л /европейский патент 87 920/. Однако еще не было описано никакое сито, позволяющее селекционировать или легко улавливать либо мутантов, перепроизводящих кобаламины, либо мутантов, явно улучшенных в отношении их производства кобаламинов.

На генетическом уровне к настоящему времени было осуществлено мало работ, Клонирование генов cob /кодирующих ферменты, задействованные в способе биосинтеза/ было описано у микроорганизмов Bacillus megaterium /Brey et al., 1986/. Одиннадцать групп комплементации было идентифицировано в результате комплементации мутантов cob микроорганизмов Bacillus megaterium с плазмидами, несущими различные фрагменты ДНК Bacillus megaterium. Эти гены группируются на одном и том же локусе, несущем фрагмент величиной 12 ко.

Проводились также исследования на генах cob Salmonella typhimurium. Без описания клонирования последних было показано, что почти все гены для биосинтеза кобаламинов перегруппировываются между минутами 40 и 42 хромосомы /Jeter et Roth, 1987/. Только локус cys G, который должен разрешать превращение уро'гена III в прекоррин-2-, не входит в эту группу генов. Однако активность, кодируемая этим локусом, а также его биохимические свойства не были описаны.

Кроме того, фенотипы были связаны с мутациями cob. У микроорганизмов Salmonella typhimurium и Bacillus megaterium мутанты cob больше не показывают роста на минимальной среде с этаноламином в качестве источника углерода или в качестве источника азота /Roof et Roth, 1988/. Это обусловлено тем, что фермент катаболизма этаноламина, т.е. этаноламин-аммиаколиаза /EC 4.3.1.7/ имеет в качестве кофактора кофермент B₁₂; причем мутанты cob больше не синтезируют кофермент B₁₂, они не могут больше расти с этаноламином в качестве источника углерода и/или в качестве источника азота. Мутанты met E Salmonella typhimurium имеют только гомоцистеинметилтрансферазу /EC 2.1.1.13/, являющуюся метилкобаламинзависящей. Мутанты cob Salmonella typhimurium met E являются ауксотрофами для метионина /Jeter et al., 1984/.

У микроорганизмов Pseudomonas denitrificaus и Agrobacterium tumefaciens фенотипы, связанные с полной дефективностью при синтезе кобаламинов, не были описаны к настоящему времени.

Наконец, работы с микроорганизмами Pseudomonas denitrificaus /Camecon et al., 1989/ привели к клонированию фрагментов ДНК, несущих гены cob этих бактерий. Последние гены разделяются на четыре группы комплементации, имеющих по меньшей мере 30 ко ДНК. По меньшей мере четырнадцать групп комплементации были идентифицированы в результате гетерологической комплементации мутантов cob Agrobacterium tumefaciens и Pseudomonas putida с фрагментами ДНК Pseudomonas denitrificaus несущих гены cob.

Однако до настоящего времени никакой из этих генов не был очищен и никакая нуклеотидная последовательность не была описана. Аналогично, не были описаны никакая идентификация протеинов и никакая каталитическая функция, приписываемая продукту этих генов. Кроме того, не смогли получить никакого улучшения производства кобаламинов методами рекомбинантной ДНК. Увеличение генов cob Bacillus megaterium не обеспечивает у штамма, исходя из которого они были клонированы, улучшения производства кобаламинов /Brey et al., 1986/. Для Salmonella typhimurium были проведены физиологические исследования с целью определить условия, при которых наблюдается большая транскрипция изучаемых генов cob /Escalante et Roth, 1987/. В этих условиях не происходит улучшение производства кобаламинов, хотя гены этого пути биосинтеза являются более выраженными, чем в стандартных условиях культивирования.

Настоящее изобретение исходит из точной идентификации последовательностей ДНК, кодирующих полипептиды, задействованные в биосинтезе кобаламинов и/или кобамидов. Следовательно, предметом настоящего изобретения являются последовательности ДНК, кодирующие полипептиды, задействованные в биосинтезе кобаламинов и/или кобамидов. В частности, предметом изобретения являются гены cobA, cobB, cobD, cobE, cobF, cobG, cobH, cobI, cobJ, cobK, cobL, cobM, cobN, cobO, cobP, cobQ, cobS, cobT, cobU, cobV, cobW, cobX, и corA, причем любая гомологичная последовательность ДНК этих генов обусловлена вырождением генетического кода; а также последовательности ДНК любого происхождения /природного, синтетического, рекомбинантного/, которые гибридизируются и/или которые имеют значительную гомологию с этими последовательностями или с фрагментами последних и которые кодируют полипептиды, задействованные в биосинтезе кобаламинов и/или кобамидов. Предметом изобретения являются также гены, содержащие эти последовательности ДНК.

Последовательности ДНК по настоящему изобретению были выделены, исходя из различных штаммов: промышленного штамма, Pseudomonas denitrificaus SC510, производного штамма МВ580 /патент США 3018225/, путем комплементации мутантов cobA. tumefaciens и P. putiola; и Methanobacterium ivanovii. Полученные клоны удалось точно проанализировать, в частности, путем картографирования при помощи включений производного транспозона тп5. Эти генетические исследования позволили локализовать гены cob и cor на карте рестрикции и провести сборку их последовательностей. Анализ открытых фаз позволил затем выявить кодирующие участки этих фрагментов ДНК.

Предметом настоящего изобретения является также применение этих нуклеотидных последовательностей для клонирования генов cob других бактерий. Действительно, известно, что для протеинов, катализирующих одни и те же процессы, последовательности сохраняются с /в качестве дивергенции/ эволюционной дивергенцией /wein-Hsiung et al., 1985/. В настоящем изобретении показано, что имеется значительная гомология между нуклеотидными последовательностями генов различных микроорганизмов, кодирующих полипептиды, задействованные в биосинтезе кобаламинов и/или кобамидов. Появляющиеся различия обусловлены эволюционным перерождением и перерождением генетического кода, которое связано с содержанием GC в геноме изучаемого микроорганизма /wein-Hsiung et al., 1985/.

В соответствии с настоящим изобретением зонд может быть изготовлен при помощи одной или нескольких последовательностей ДНК, в частности, Pseudomonas denitrificaus или при помощи фрагментов последних или при помощи аналогичных последовательностей, имеющих специфичную степень перерождения, на уровне применения кодонов и содержания CC в ДНК бактерии, которую хотят изучить. В этих условиях возможно осуществить детектирование сигнала специфичной гибридизации между зондом и фрагментами геномной ДНК изучаемой бактерии; этот сигнал специфичной гибдизации соответствует гибридизации зонда с изофункциональными генами cob бактерии. Гены cob, а также их продукты могут затем выделяться, очищаться и описываться. Таким образом, изобретение предоставляет способ, позволяющий путем гибридизации получить доступ к нуклеотидным последовательностям и к полипептидам, задействованным в биосинтезе кобаламинов и/или кобамидов, любого микроорганизма.

Предметом настоящего изобретения является также рекомбинантная ДНК, содержащая по меньшей мере одну последовательность ДНК, кодирующую полипептид, задействованный в биосинтезе кобаламинов и/или кобамидов и, в частности, рекомбинантная ДНК, в которой одна или несколько указанных последовательностей попадают под контроль сигнала экспрессии.

В связи с этим можно, в частности, поместить в положение 5' последовательности ДНК промотирующие участки. Такие участки могут быть гомологичными или гетерологичными по отношению к последовательности ДНК. В частности, сильные бактериальные промоторы, такие как промотор оперона триптофана Ptrp или оперона лактозы Plac микроорганизма E.coli, левый или правый промотор бактериофага лямбда, сильные промоторы фагов бактерий, таких как corynebacteries, функциональные промоторы у грам-отрицательных бактерий, такие как промотор Ptac микроорганизма E.coli, промотор PxyIS генов катаболизма ксилола плазмиды TOL, промотор амилазы Bacillus subtilis Pamy, смогут использоваться. Можно указать также промоторы, производные гликолитических генов дрожжей, такие как промоторы генов, кодирующих фосфоглицераткиназу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, лактазу или энолазу, которые смогут использоваться, когда рекомбинантная ДНК будет введена эукариоту-хозяину. Сайт связывания рибосом также будет находиться в положении 5' последовательности ДНК, и он будет являться гомологичным или гетерологичным, например, сайт связывания рибосом гена cП бактериофага лямбда.

Сигналы, необходимые для завершения транскрипции, смогут находиться в положении 3' последовательности ДНК.

Рекомбинантная ДНК по настоящему изобретению может затем вводиться непосредственно в клетку-хозяин, совместимую с выбранными сигналами экспрессии, или может клонироваться на плазмидном векторе, чтобы дать возможность ввести стабильным образом рассматриваемую последовательность ДНК в клетку-хозяин.

Другим предметом изобретения являются полученные таким образом плазмиды, содержащие последовательность ДНК, кодирующую полипептид, задействованный в биосинтезе кобаламинов и/или кобамидов. В частности, эти плазмиды содержат также функциональную систему репликации и маркер селекции.

Предметом изобретения являются также клетки-хозяева, в которые были введены одна или несколько последовательностей ДНК, таких как определено перед этим, или плазмида, такая как определено выше.

Другой предмет изобретения относится к способу получения полипептидов, задействованных в биосинтезе кобаламинов и/или кобамидов. В соответствии с этим способом в клетку- хозяин вводит последовательность ДНК, такую как описано перед этим, культивируют эту рекомбинантную клетку в условиях экспрессии указанной последовательности, затем извлекают полипептидные продукты.

Клетки-хозяева, которые смогут использоваться для этой цели, являются как прокариотами, так и эукариотами, клетками животного происхождения или клетками растительного происхождения. Они будут выбираться предпочтительно среди бактерий и, в частности, бактерий вида E.coli, P. denitrifians, A. tumefaciens или R. melitoli.

Другое применение последовательностей ДНК по настоящему изобретению основано на способе увеличения производства колабаламинов и/или кобамидов или их предшественников по биосинтезу методами рекомбинантной ДНК. Действительно, если ограничение метаболического выделения при биосинтезе кобаламинов и/или кобамидов или их предшественников обусловлено ограничением активности фермента в ходе биосинтеза, то увеличение этой активности в результате увеличения экспрессии этого же самого фермента при помощи методов рекомбинантной ДНК /генное увеличение, замена сигналов транскрипции-трансляции на более эффективные сигналы.../приведет к увеличению выхода биосинтеза кобаламинов и/или кобамидов. Возможно также, что ограничение производства кобаламинов и/или кобамидов обусловлено биохимической регуляцией. В этом случае один или несколько генов cob, соответствующих ферменту регуляции, могут подвергаться мутагенезу in vitro специфичным образом с целью получения мутантных генов, продукты которых будут теряться, причем регуляция будет противиться улучшению производства.

Способ по настоящему изобретению заключается во введении в микроорганизм, являющийся производителем кобаламинов и/или кобамидов или только потенциальным производителем этих соединений /т.е. который не прошел одной или нескольких стадий биосинтеза/, последовательности ДНК, такой как определено выше, затем в культивировании этого микроорганизма в условиях экспрессии указанной последовательности и синтеза кобаламинов и/или кобамидов и, наконец, в извлечении полученных кобаламинов и/или кобамидов. Такой способ применим, в частности, для всех производящих микроорганизмов, указанных на странице 6, а в более частном случае для микроорганизмов вида P. denitrificaus, Rhizobium militoti или Agrobacterium tumifaciens. По предпочтительному варианту осуществления микроорганизмом является P. denitrificaus и, в частности, штамм SC510. Что касается микроорганизмов, являющихся потенциальными производителями, то используемыми последовательностями ДНК будут такие, которые соответствуют тем стадиям биосинтеза, которые микроорганизм не может осуществить.

При помощи настоящего изобретения и в результате различных изложенных выше стратегий биосинтеза можно будет получить улучшение производства кобаламинов и/или кобамидов или их предшественников для любого микроорганизма, являющегося производителем или потенциальным производителем кобаламинов и/или кобамидов. Достаточно будет провести культивирование этого рекомбинированного микроорганизма в условиях, подходящих для производства кобаламинов и для экспрессии введенных последовательностей ДНК. Это культивирование можно будет осуществлять периодическии или же непрерывным способом, а очистку кобаламинов можно будет осуществлять уже используемыми в промышленности методами /Florent, 1986/. Эти методы включают, среди прочего: I/ солюбилизацию кобаламинов и их превращение в их цианоформу /например, путем обработки ферментативного сусла при нагревании цианидом калия в присутствии нитрата натрия/, затем II/ очистку цианокобаламинов за несколько различных стадий, которыми могут быть, например: a/ адсорбция на различных субстратах, таких как амберлит IRC50, Дауэкс IХ2 или амберлит XAD 2 с последующим элюированием смесью вода-спирт или вода-фенол, затем b/ экстракция в органическом растворителе и, наконец, c/ осаждение или кристаллизация из органической фазы либо в результате прибавления реагентов или разбавления в соответствующем растворителе, либо в результате выпаривания.

Настоящее изобретение, кроме того, показывает, что возможно методами рекомбинантной ДНК улучшить производство кобаламинов бактерий, производящей кобаламины, накапливая улучшения. Это сводится к достижению первого улучшения, как это описано выше, потом к улучшению этого улучшения все время при помощи методов рекомбинантной ДНК, т.е. например, увеличивая гены для биосинтеза кобаламинов.

Другой предмет настоящего изобретения относится к полипептидам, задействованным в биосинтезе кобаламинов и/или кобамидов. В частности, предметом настоящего изобретения являются все полипептиды или производные или фрагменты этих полипептидов, которые кодируются описанными перед последовательностями ДНК и которые являются задействованными в ходе биосинтеза кобаламинов и/или кобамидов. Последовательность из аминокислот этих полипептидов описана, также как и некоторые из их физико-химических характеристик. Ферментативная активность или специфичные свойства также были связаны с каждым из них.

В связи с этим, предметом изобретения являются полипептиды, участвующие в превращении прекоррина-3 в a, c-диамид кобириновой кислоты и, в частности, в переносе метильной группировки от SAM в положения C5, C11, C15 и C17.

Предметом изобретения являются также полипептиды: - участвующие в превращении кобировой кислоты в кобинамид, или - обладающие активностью S-аденозил-L-метионин: прекоррин-2-метилтрансферазы /SП2МТ/, или - обладающие активностью кобириновой кислоты и/или гидробириновой кислоты a, c-диамидсинтазы, или - обладающие активностью прекоррин-8х-мутазы, или - обладающие активностью никотинат-нуклеотид:диметилбензимидазолфосфорибозилтрансферазы, или - обладающие активностью кобаламин-/5'-фосфат/синтазы, или - обладающие активностью кобировая кислота-синтазы, или - обладающие активностью коб/1/аламинаденозилтрансферазы, или - обладающие активностью прекоррин-6х-редуктазы, или - участвующие в превращении a, c-диамида гидробириновой кислоты в a, c-диамид кобириновой кислоты.

Преимущественно предметом изобретения является полипептид, выбираемый среди протеинов COBA, COBB, COBC, COBD, COBE, COBF,COBG, COBH, COBI, COBJ, COBK, COBL, COBM, COBN, COBO, COBP, COBQ, COBS, COBT, COBU, COBV, COBW, COBX и CORA, представленных на фиг. 15, 16, 40, 41 и 47.

Кроме того, применение описанных выше зондов гибридизации позволяет, исходя из генов, выделенных в других микроорганизмах, охарактеризовать и выделить изофункциональные полипептиды других микроорганизмов. Тем самым, настоящее изобретение показывает, что последовательность протеина COB микроорганизма Pseudomonas denitrificaus является значительно гомологичной с последовательностями протеинов других микроорганизмов, обладающих одним и тем же типом активности. Среди этих протеинов COB, катализирующих одну и ту же реакцию для различных микроорганизмов, только эволюционные промежутки вызвали изменения /Wein - Hsinng et al., 1985/. Предметом настоящего изобретения являются также эти изофункциональные полипептиды.

Приписывание особой ферментативной активности является результатом анализа, который может быть осуществлен в соответствии с различными стратегиями. В частности, исследования сродства in vitro по отношению к SAM/S-аденозил-L-метионину/ позволяют приписать протеину, способному связывать SAM, активность метилтрансферазы и, следовательно, его участие в стадиях переноса метильных группировок, которые происходят между уро'геном III и кобириновой кислотой. Другой способ оценки активности этих полипептидов заключается в количественном определении промежуточных продуктов в ходе биосинтеза кобаламинов, которые накапливаются у мутантов, не способных выражать эти полипептиды /идентифицированные в результате исследований по комплементации/. Эти анализы позволяют сделать вывод, что рассматриваемый полипептид имеет в качестве субстрата накопленный промежуточный продукт, что позволяет классифицировать и определить его активность в ходе биосинтеза. Настоящее изобретение описывает также способ количественного определения ферментативной активности в ходе биосинтеза, применимый для любого штамма, производящего кобаламины и/или кобамиды. Это количественное определение позволяет выделять в чистом виде, исходя из любого штамма, производящего эти соединения, определяемую ферментативную активность. Исходя из этой очищенной активности, может быть осуществлена NH₂-оканчивающаяся последовательность рассматриваемого протеина COB или же аналогичная последовательность составных единиц этого протеина, что позволяет идентифицировать один или несколько структурных генов, которые кодируют рассматриваемую активность. Для микроорганизмов Pseudomonas denitrificaus структурные гены, которые кодируют активности в ходе биосинтеза, идентифицированы путем нахождения для каждой NH₂-оканчивающейся последовательности протеина COB, имеющего ту же самую NH₂-оканчивающуюся последовательность.

Настоящее изобретение описывает также способ, позволяющий провести для штаммов, производящих кобаламины, или для непроизводящих мутантов идентификацию и количественное определение промежуточных продуктов в ходе биосинтеза кобаламинов или других корриноидов. Эти промежуточные продукты могут быть определены как в культивируемых суслах, так и в самих клетках. Промежуточными продуктами, которые могут быть количественно определены, являются все корриноиды, которые встречаются в ходе биосинтеза после кобириновой кислоты, а именно /помимо кобириновой кислоты/: моноамид кобириновой кислоты, диамид кобириновой кислоты, триамидкобириновой кислоты, тетраамидкобириновой кислоты, пентаамид кобириновой кислоты, кобировая кислота, кобинамид, кобинамидфосфат, ГДФ-кобинамид, кофермент B₁₂-фосфат и кофермент B₁₂. Циано- и коферментные формы этих продуктов могут количественно определяться этим методом.

Другие предметы и преимущества настоящего изобретения будут появляться при чтении последующих примеров и фигур, которые должны рассматриваться в качестве иллюстративных, а не ограничивающих.

Определение используемых терминов и аббревиатуры ДАККС: а,с-диамид кобириновой кислоты-синтаза; рекомбинантная ДНК: совокупность методов, которые позволяют либо ассоциировать внутри одного и того же микроорганизма последовательности ДНК, которые являются чужеродными для него, либо проводить специфический мутагенез фрагмента ДНК АТФ: аденозин-5'-трифосфат БАС: бычья альбуминовая сыворотка ВЭЖХ: высокоэффективная жидкостная хроматография кластер: группа генов cob: соответствует фенотипу уменьшенного уровня /по крайней мере, а 10 раз меньшего, чем контрольный /производства кобиламинов стоп-кодон: кодон, оканчивающий трансляцию корриноиды: производные кобириновой кислоты, обладающие корриновым кольцом ДГТФ: 2'-дезоксигуанозин-5'-трифосфат ДМБИ: диметилбензимидазол ДНТФ: 2'-дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфаты ДТТ: дитиотреитол ген cob: ген, задействованный в биосинтезе кобинамида, исходя из уро'гена III.

ген cor: ген, задействованный в биосинтезе корриноидов, исходя из уро'гена III ко: тысячоснований НН: БМБИ-ФРТ ORF: открытая рамка считывания по: пары оснований протеин СОВ: протеин, участвующий либо как катализатор в ходе биосинтеза кобаламинов, либо как регулирующий протеин в сети регуляции генов cob, либо в качестве того и другого протеин COR: протеин, участвующий либо как катализатор в ходе биосинтеза корриноидов, либо как регулирующий протеин в сети регуляции генов cor, либо в качестве того и другого SAM: S-аденозил-L-метионин ДСН: додецилсульфат натрия SП2MT: SAM-L-метионин: прекоррин-2-метилтрансфераза SYMT: SAM-уро'ген III-метилтрансфераза уро'ген III: уропорфириноген III Описание фигур Фигура 1: Структура кофермента B₁₂; 5'-деоксиаденозильная группировка замещается CH₃-группировкой для метилкобаламина, цианогруппировкой для цианокобаламина, гидроксильной группировкой для гидроксокобаламина.

Фигура 2: Биосинтез кобаламинов и различные стадии этого биосинтеза в соответствии с литературными данными. X: аксиальные лиганды кобальта; лиганд в положении "a" может отличаться от лиганда в положении "b". R: лиганд в положении "a" кобальта, который определяет тип кобаламина /смотри фиг. 1/.

Фигура 3: Структуры уро'генов III, прекоррина-1, прекоррина - 2 и прекоррина-3.

Фигура 4: Развернутые формулы уро'гена III и кобириновой кислоты. Согласно литературным данным, между уро'геном III и кобириновой кислотой происходит 8 SAM-зависящих переносов метильных группировок последовательно в положении C2, C7, C20, C17, C12, C1, C15 и C5, одно декарбоксилирование в положении C12, отщепление углерода в положении C20 и внедрение атома кобальта. X: аксиальные лиганды кобальта; лиганд в положении "a" может отличаться от лиганда в положении "b".

Фигура 5: Последние стадии биосинтеза кобаламинов. Для наглядности схемы были опущены детали корринового кольца. Представлены пять ферментативных стадий: 1 - кобинамидкиназа; 2 - кобинамидфосфатгуанилилтрансфераза; 3 - кобаламин-5'-фосфатсинтаза; 4 - кобаламин-5'-фосфатфосфогидролаза; 5 - никотинатнуклеотид: ДМБИ-фосфорибозилтрансфераза.

Фигура 6: Карты рестрикции фрагментов ClaI-HindIII-HindIII-HindIII личной 5,4 ко /1/; SalI-SalI-SalI-SalI-SalI-BglI величиной 4748 по /2/; EcoRI величиной 8,7 ко /3/ и SstI-SstI-BamHI величиной 3855 по. Фигурируют только 20 ферментов рестрикции, которые реже всего расщепляют ДНК. Сайты расщеплений для каждого фермента указаны вертикальной чертой.

Фигура 7: нуклеотидная последовательность двух цепей фрагмента ClaI-HindIII-HindIII-HindIII величиной 5378 по микроорганизма Pseudomonas denitrificaus. Цепь, расположенную сверху, следует читать от 5' к 3' в направлении слева направо, которое соответствует ориентации слева направо фрагмента на карте рестрикции, приведенной на фиг. 6. Сайт ClaI находится в положении 23 /начало сайта расщепления/, так как на этой последовательности находятся сайты рестрикции PstI, SalI и XbaI, которые появляются в ходе клонирований на мультисайтах, чтобы составить последовательность. Последовательность фрагмента ClaI-HindIII-HindIII-HindIII начинается, следовательно, с положения 23.

Фигура 8: Нуклеотидная последовательность двух цепей фрагмента EcoPI величиной по микроорганизмов Pseudomonas denitrificaus Цепь, расположенную сверху, следует читать от 5' и 3' в направлении слева направо, которое соответствует ориентации слева направо фрагмента на карте рестрикции, приведенной на фиг. 6.

Фигура 9: Вероятностный анализ фаз, кодирующих согласно применению кодонов, используя программу Staden et MacLachlan /1982/ чтения последовательности фрагмента ClaI-HindIII-HindIII-HindIII величиной 5378 по для 6 фаз. В случае фаз, которые принадлежат одной и той же кодирующей цепи, наиболее вероятная фаза соответствует той, для которой пунктирная линия, не прерываемая стоп-кодонами, находится ниже линии вероятности этой фазы.

9.1. Последовательность, идущая от нуклеотида 1 до нуклеотида 1200. Благодаря данному анализу идентифицирована открытая фаза 1. Она начинается с ATG в положении 549 и заканчивается на TGA в положении 1011.

9.2. Последовательность, идущая от нуклеотида 1000 до нуклеотида 2200. Благодаря данному анализу идентифицирована открытая фаза 2. Она начинается с ATG в положении 1141 и заканчивается на TGA в положении 1981.

9.3. Последовательность, идущая от нуклеотида 1800 до нуклеотида 3400. Благодаря данному анализу идентифицирована открытая фаза 3. Она начинается с ATG в положении 1980 и заканчивается на TGA в положении 3282.

9.4. Последовательность, идущая от нуклеотида 3000 до нуклеотида 4500. Благодаря данному анализу идентифицирована открытая фаза 4. Она начинается с ATG в положении 3281 и заканчивается на TGA в положении 4280.

9.5. Последовательность, идущая от нуклеотида 3800 до нуклеотида 5378. Благодаря данному анализу идентифицирована открытая фаза 5. Она начинается с GTG в положении 4284 и заканчивается на TGA в положении 5253.

Фигура 10: Вероятностный анализ фаз, кодирующих согласно применению кодонов, используя для 6 фаз программу Staden et MacLachlan /1982/ чтения последовательности фрагмента EcoRI величиной 8753 по. В случае фаз, которые принадлежат одной и той же кодирующей цепи, наиболее вероятная фаза соответствует той, для которой пунктирная линия, не прерываемая стоп-кодонами, находится ниже линии вероятности этой фазы.

10.1. Последовательность, идущая от нуклеотида 650 до нуклеотида 1650. Благодаря данному анализу идентифицирована открытая фаза 6. Она начинается с ATG в положении 736 и заканчивается на TAG в положении 1519.

10.2. Последовательность, идущая от нуклеотида 1400 до нуклеотида 3100. Благодаря данному анализу идентифицирована открытая фаза 7. Она начинается с ATG в положении 1620 и заканчивается на TGA в положении 1997.

10.3. Последовательность, идущая от нуклеотида 2700 до нуклеотида 3700. Благодаря данному анализу идентифицирована открытая фаза 8. Она начинается с ATG в положении 3002 и заканчивается на TGA в положении 3632.

10.4. Последовательность, идущая от нуклеотида 3500 до нуклеотида 4100. Благодаря данному анализу идентифицирована открытая фаза 9. Она начинается с CTG в положении 3631 и заканчивается на TGA в положении 4366.

10.5. Последовательность, идущая от нуклеотида 4150 до нуклеотида 5150. Благодаря данному анализу идентифицирована открытая фаза 10. Она начинается с ATG в положении 4365 и заканчивается на TGA в положении 5127.

10.6. Последовательность, идущая от нуклеотида 5000 до нуклеотида 6000. Благодаря данному анализу идентифицирована открытая фаза 11. Она начинается с ATG в положении 5893 и заканчивается на TAG в положении 5110.

10.7. Последовательность, идущая от нуклеотида 5700 до нуклеотида 7200. Благодаря данному анализу идентифицирована открытая фаза 12. Она начинается с ATG в положении 5862 и заканчивается на TAA в положении 7101.

10.8. Последовательность, идущая от нуклеотида 7000 до нуклеотида 8000. Благодаря данному анализу идентифицирована открытая фаза 13. Она начинается с ATG в положении 7172 и заканчивается на TTG в положении 7931.

Фигура 11: Конструирование плазмид pXL556, pXL545 и pXL723. Фрагмент ClaI-EcoRV величиной 2,4 ко, содержащий гены cobA и cobE, отщепляется от фрагмента величино