Модифицированный субтилизин, днк, кодирующая модифицированный субтилизин, вектор экспрессии, кодирующий днк, и штамм культуры клетки хозяина

Модифицированный субтилизин, днк, кодирующая модифицированный субтилизин, вектор экспрессии, кодирующий днк, и штамм культуры клетки хозяина

Реферат

 

Изобретение характеризует модифицированную карбонилгидролазу. В аминокислотной последовательности субтилизина заменены 76 аминокислотный остаток и по меньшей мере еще один аминокислотный остаток. Модификация позволяет повысить протолитическую активность фермента. 4 с. и 7 з.п. ф-лы, 10 ил., 7 табл.

Настоящее изобретение относится к новым вариантам карбонилгидролазы с аминокислотными последовательностями, в которых многочисленные аминокислотные остатки предшественника карбонилгидролазы, особенно в положении, соответствующем или эквивалентном +760, в сочетании с одним или более аминокислотным остатком, выбранным из группы, включающей положения +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204,- +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 и/или +274 в последовательности субтилизина Bacillus amyloliquefaciens замещены другими аминокислотами. Такие мутанты/варианты карбонилгидролазы в основном получают путем модификации in vitro последовательности ДНК, кодирующей предшественник природной или рекомбинантной карбонилгидролазы, так что в соответствующей аминокислотной последовательности предшественника карбонилгидролазы происходят замещения многочисленных аминокислотных остатков сами по себе или в сочетании с другими замещениями в других положениях, а также с другими инсерциями и делециями.

Предпосылки создания изобретения.

Сериновые протеиназы относятся к подгруппе карбонилгидролаз. Они составляют отдельный класс ферментов, обладающих широкой специфичностью и многочисленными биологическими функциями (см. Stroud.R. Sci.Amer., 131:74-88). Несмотря на функциональную разнородность, механизм каталитического расщепления сериновых протеиназ свойственен по крайней мере двум генетически различным семействам ферментов: субтилизинам и химотрипсину млекопитающих, родственным и гомологичным бактериальным сериновым протеиназам (например, трипсину и трипсину S. gresius). Эти два семейства сериновых протеиназ обнаруживают значительное сходство механизмов катализа (Kraut.J. (1977), Ann.Rev.Biochem. , 46: 331-358. Более того, несмотря на различие первичной структуры, третичную структуру ферментов этих двух семейств объединяет наличие каталитическиактивной триады аминокислот, состоящей из серина, гистидина и аспартата.

Субтилизин представляет собой сериновую эндопротеиназу (м.масса 27,500), которая в больших количествах секретируется многими видами Bacillus и другими микроорганизмами. Белковая последовательность субтилизина определена по крайней мере у четырех различных видов Bacillus. (Markland.F.S., et al., Honne-Seyler's Z. Physiol. Chem., 364:1537-1540). Опубликована и трехмерная кристаллографическая структура субтилизина Bacillus amyloliquefaciens при разрешении 2,5 A. (Wright, C.S., et al., (1969), Nature, 221:235- 242: Drenth. J., et al.,(1972), Eur.J.Biochem., 26:177-181. Эти исследования показывают, что несмотря на отсутствие генетического родства субтилизина с сериновыми протеиназами млекопитающих, указанные ферменты имеют сходное строение активного центра. Кристаллические структуры субтилизина (полученные при использовании рентгеновских лучей), содержащие ковалентно-связанные пептидные ингибиторы (Robertus. J.D., et al., (1972), Biochemistry, 11:2439-2449) или комплексы продукта (Robertus. J. D. , et al., (1976), J.Biol. Chem., 251: 1097-1103) также позволяют судить об активном центре и предполагаемой субстратсвязывающей "щели" субтилизина. Кроме того, опубликовано множество исследований, посвященных кинетической активности и химическим модификациям пневмолизина (Philipp, М., et а1. (1983), Mol.Cell.Biochem., 51:5-32; Svendsen, В. (1976), Carlsberg Res.Comm., 41;237-291; Markland, F.S., Id.). По крайней мере в одной работе описан субтилизин, у которого боковая цепь метионина в положении 222 под действием перекиси водорода превращена в метионинсульфоксид (Stauffer, D.C., et al., (1965), J.Biol.Chem., 244: 5333-5338), а боковая цепь серина в положении 221 путем химической модификации преобразована в цистеин (Polgar, et al., (1981), Biochimica et Biophysica Acta, 667:351-354.) В патенте США N 4,760,025 (RE 34,606) описывается субтилизин, содержащий модифицированные аминокислотные остатки, соответствующие следующим аминокислотам субтилизина Bacillus amyloliquefaciens: тирозин -1, аспартат +32, аспарагин +155, тирозин +104, метионин +222, глицин +166, гистидин +64, глицин +169, фенилаланин +189, серин +33, серин +221, тирозин +217, глутамат +156 и аланин +152. В патенте США N 5,182,204 описан пневмолизин, содержащий модифицированный аминокислотный остаток в положении +224 субтилизина Bacillus amyloliquefaciens и других субтилизинов, причем модификацию осуществляют путем замещения, инсерции или делеции, и она может быть скомбинирована с модификациями аминокислотных остатков, указанных в патенте США 4,760,025 (RE 34,606), что приводит к получению полезных мутантных форм или вариантов субтилизина. В патенте США N 5,155,033 описываются сходные мутантные формы субтилизина, имеющие модифицированный аминокислотный остаток в положении +225 В. amyloliquefaciens. В патентах США N 5,185,258 и 5,204,015 описываются мутантные формы субтилизинов, имеющие модифицированные аминокислотные остатки в положениях+123 и/или +274. Указанные документы приведены здесь в качестве ссылок, так же как и заявка на патент США SN 07/898,382, в которой охарактеризован субтилизин, имеющий модифицированные аминокислотные остатки в положениях +99, +101, +103, +107, +126, +128, +135, +197 и +204. Все указанные патенты и заявки легко доступны. В патенте США N 4,914, 031 описываются некоторые аналоги субтилизина, включая субтилизин с модифицированным аминокислотным остатком в положении +76. Данный патент также приведен здесь в качестве ссылки. Однако аминокислотные остатки, модифицированные согласно настоящему изобретению, и/или особые их комбинации, заявленные в формуле, в указанных выше источниках информации не раскрыты.

В соответствии с вышесказанным, один из заявленных объектов относится к вариантам карбонилгидролазы (предпочтительно субтилизину Bacillus amyloliquefaciens), содержащим многочисленные замены аминокислотных остатков в предшественнике карбонилгидролазы, в том числе +76 в сочетании с одной или более заменами, выбранными из группы, включающей положения + 99, +4101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210,+216, +217, +218, +222, +260, +265 4 и/или +274. Такие варианты в целом имеют по крайней мере одно свойство, отличное от аналогичного свойства предшественника карбонилгидролазы, из аминокислотной последовательности которого получена аминокислотная последовательность данного варианта.

Другими объектами изобретения являются последовательности ДНК, кодирующие варианты карбонилгидролазы, а также векторы экспрессии, содержащие указанные ДНК-последовательности.

Еще одним объектом изобретения являются клетки-хозяева, трансформированные указанными векторами, так же как и клетки-хозяева, способные экспрессировать соответствующие ДНК с образованием вариантов карбонилгидролазы как внутриклеточно, так и внеклеточно.

Указанные выше ссылки приведены здесь исключительно для описания уровня техники, известного на дату подачи заявки, и ничто не может поставить под сомнение право изобретателей использовать с этой целью информацию, основанную на ранее поданных заявках.

Краткое описание изобретения.

Изобретение относится к неприродным вариантам карбонилгидролаз, имеющим измененные протеолитическую активность, стабильность, субстратную специфичность, pH-профиль и/или физико-химические свойства по сравнению с предшественником карбонилгидролазы, из аминокислотной последовательности которого получают аминокислотную последовательность того или иного варианта. Предшественник карбонилгидролазы может быть природной или рекомбинантной карбонилгидролазой. Указанные варианты карбонилгидролазы имеют аминокислотную последовательность, которая не обнаруживается в природе, и образована в результате замещений многочисленных аминокислотных остатков в предшественнике- карбонилгидролазы другими аминокислотами. Эти многочисленные аминокислотные остатки в ферменте-предшественнике соответствуют положению +76 в сочетании с одним или более следующими положениями: +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 и/или +274, причем данная нумерация соответствует порядку аминокислот в природном субтилизине Bacillus amyloliquefaciens или эквивалентным аминокислотным остаткам в других карбонилгидролазах или субтилизинах, например в субтилизине Bacillus lentus. Варианты карбонилгидролазы, заявленные в настоящем изобретении, содержат замещение аминокислотного остатка в положении +76 в сочетании с одной или более другими модификациями. Предпочтительные варианты ферментов, заявленные в настоящем изобретении, содержат замещения, делеции или инсерции аминокислотных остатков в следующих комбинациях: 76/99; 76/101; 76/103; 76/104; 76/107; 76/123; 76/99/101; 76/99/103; 76/99/104; 76/101/103; 76/101/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/104/123; 76/107/123; 76/99/101/103; 76/99/101/104; 76/99/103/104; 76/101/103/104; 76/103/104/123; 76/104/107/123; 76/99/101/103/104; 76/99/103/104/123; 76/99/101/103/104/123; 76/103/104/128; 76/103/104/260; 76/103/104/265; 76/103/104/197; 76/103/104/105; 76/103/104/135; 76/103/104/126; 76/103/104/107; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265 и/или 76/103/104/222. Наиболее предпочтительные варианты ферментов, заявленные в настоящем изобретении, содержат замещения, делеции или инсерции аминокислотных остатков в субтилизине В. amyloliquefaciens в следующих комбинациях: 76/99; 76/104; 76/99/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104 и 76/101/104.

Изобретение также относится к вариантам ДНК-последовательностей, кодирующим указанные варианты карбонилгидролаз или субтилизина. Такие варианты ДНК-последовательностей происходят из ДНК-последовательности предшественника, которая кодирует природный или рекомбинантный фермент.

Для получения вариантов ДНК-последовательностей последовательность предшественника модифицируют так, что новая последовательность кодирует замещения одного или более специфических аминокислотных остатков, соответствующих положениям: 76, 99, 101, 103, 104, 107, 123,27, 105, 109, 126, 128, 135, 156, 166, 195, 197, 204, 206, 210, 216, 217, 218, 222, 260, 265 и/или 274 или их комбинациям в субтилизине Bacillus amyloliquefaciens. Несмотря на то, что аминокислотные остатки, подлежащие модификации, соответствуют таковым В. amyloliquefaciens (нумерация остатков подходит и для всех других субтилизинов), предпочтительной ДНК-последовательностью предшественника, используемой для осуществления настоящего изобретения, является ДНК-последовательность субтилизина Bacillus lentus, приведенная на фиг.6 (SEQ ID N 11).

Варианты ДНК-последовательностей, заявленные в настоящем изобретении, кодируют инсерции или замещения аминокислот в положении +76 в сочетании с одной или более другими модификациями. Предпочтительные варианты ДНК-последовательностей кодируют замещения или инсерции аминокислотных остатков в следующих сочетаниях: 76/99; 76/101; 76/103; 76/104; 76/107; 76/123; 76/99/101; 76/99/103; 76/99/104; 76/101/103; 76/101/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/104/123; 76/107/123; 76/99/101/103; 76/99/101/104; 76/99/103/104; 76/101/103/104; 76/103/104/123; 76/104/107/123; 76/99/101/103/104; 76/99/103/104/123; 76/99/101/103/104/123; 76/103/104/128; 76/103/104/260; 76/103/104/265; 76/103/104/197; 76/103/104/105; 76/103/104/135; 76/103/104/126; 76/103/104/107; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265 и/или 76/103/104/222. Наиболее предпочтительные варианты ДНК- последовательностей кодируют следующие модифицированные комбинации аминокислотных остатков: 76/99; 76/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104 и 76/101/104. Указанные рекомбинантные ДНК-последовательности кодируют варианты карбонилгидролазы, имеющие новые последовательности аминокислот и, в целом, по крайней мере одно свойство, существенно отличающееся от аналогичного свойства предшественника карбонилгидролазы. К таким свойствам относятся протеолитическая активность, субстратная специфичность, стабильность, измененный pH-профиль и/или другие физико-химические признаки.

Настоящее изобретение относится к замещениям любой из 19 природных L-аминокислот в установленных положениях аминокислотной последовательности. Такие замещения могут осуществляться в любом предшественнике субтилизина (прокариотическом, эукариотическом, субтилизине млекопитающих и т.д.). Предпочтительно замещения осуществляют в каждом из идентифицированных положений аминокислотных остатков, которые не ограничиваются указанными: замещения в положении 76 включают D, H, E, G, F, K, P и N; замещения в положении 99 включают D, Т, N, Q, G, и S; замещения в положении 101 включают G, D, К, L, A, E, S и R; замещения в положении 103 включают Q, Т, D, E, Y, К, G, R, S и A; замещения в положении 104 включают все девятнадцать природных аминокислот; замещения в положении 107 включают V, L, М, Y, G, E, F, Т, S, A, N и I; замещения в положении 123 включают N, Т, I, G, A, C и S; замещения в положении 27 включают К, N, С, V и Т; замещения в положении 105 включают A, D, G, R и N: замещения в положении 107 включают A, L, V, Y, G, F, Т, S, и A; замещения в положении 109 включают S, К, R, A, N и D; замещения в положении 126 включают A, F, I, V и G: замещения в положении 128 включают G, L и А; замещения в положении 135 включают A, F, I, S и V; замещения в положении 156 включают D, E, A, G, Q, и K; замещения в положении 166 включают все девятнадцать природных аминокислот; замещения в положении 195 включают E; замещения в положении 197 включают E; замещения в положении 204 включают A, G, C, S и D; замещения в положении 206 включают L, Y, N, D и E; замещения в положении 210 включают L, I, S, С и F; замещения в положении 216 включают V, E, Т и К; замещения в положении 217 включают все девятнадцать природных аминокислот; замещения в положении 218 включают S, A, G, Т и V; замещения в положении 222 включают все девятнадцать природных аминокислот; замещения в положении 260 включают P, N, G, A, S, С, К и D; замещения в положении 265 включают N, G, A, S, С, К, Y и H; и замещения в положении 274 включают A и S. Особенно предпочтительные аминокислотные остатки, которые подлежат замещению в каждом из указанных положений, приведены в табл. 1. (см.в конце описания). Несмотря на это, следует понимать, что в каждом положении можно произвести замену на любую аминокислоту.

Кроме того, в настоящее изобретение включены векторы экспрессии, содержащие указанные варианты ДНК-последовательностей карбонилгидролазы, а также клетки-хозяева, трансформированные такими векторами и способные продуцировать указанные варианты. Изобретение относится также к детергентным композициям, в состав которых входят заявленные в настоящем изобретении варианты карбонилгидролазы.

Краткое описание рисунков.

На фиг. 1A-С приведены последовательности аминокислот и ДНК для субтилизина Bacillus amyloliquefaciens и частичная рестрикционная карта гена (SEQ ID N 6).

На фиг. 2 приведены консервативные аминокислотные остатки субтилизинов Bacillus amyloliquefaciens (BPN') и Bacillus lentis (дикий тип).

На фиг. 3A и 3B приведены аминокислотные последовательности четырех субтилизинов. Верхняя строка соответствует аминокислотной последовательности субтилизина Bacillus amyloliquefaciens (иногда обозначаемого как субтилизин BPN') (SEQ ID N 7). Вторая строка соответствует аминокислотной последовательности субтилизина Bacillus subtilis (SEQ ID N 8). Третья строка соответствует аминокислотной последовательности субтилизина B.licheniformis (SEQ ID N9). Четвертая строка соответствует аминокислотной последовательности субтилизина Bacillus lentis (также обозначаемого как субтилизин 309 в заявке PCT W089/06276) (SEQ ID N 10). Звездочка означает отсутствие специфических аминокислотных остатков в сравнении с субтилизином BPN'.

На фиг.4 приведена схема конструирования плазмиды GGA274.

На фиг. 5 приведена схема конструирования плазмиды GGT274, которая является промежуточной плазмидой по отношению к некоторым плазмидам экспрессии, используемым при осуществлении изобретения.

На фиг. 6A и 6B приведена аминокислотная последовательность субтилизина Bacillus lentis (SEQ ID N 11). Зрелый белок субтилизина кодируется последовательностью, начинающейся с кодона GCG (334-336), соответствующего аминокислоте аланину.

На фиг.7A и 7B приведены последовательности аминокислот и ДНК для субтилизина в случае предпочтительного варианта осуществления изобретения (N76D/S103A/V104I) (SEQ ID N 12). ДНК была модифицирована описанными способами, чтобы в положении 76 был закодирован аспартат, в положении 103 -аланин и в положении 104 - изолейцин. Вариант зрелого белка субтилизина кодируется последовательностью, начинающейся с кодона GCG (334-336), соответствующему аминокислоте аланину.

На фиг.8 приведена схема конструирования вектора pBCDAICAT.

На фиг.9 приведена схема конструирования вектора pUCCATFNA.

Фиг.10 иллюстрирует стабильность предпочтительной мутантной формы фермента по сравнению с формой дикого типа в жидкой среде с детергентом.

Подробное описание изобретения.

Обнаружено, что полученные in vitro мутации в субтилизине B.lentus, затрагивающие аминокислотный остаток, эквивалентный таковому в положении +76 субтилизина Bacillus amyloliquefaciens, обеспечивают образование вариантов субтилизина, проявляющих измененную стабильность (например, измененную стабильность к аутопротеолизу) по сравнению с предшественником субтилизина. (cм. табл.IV и VI в конце описания).

Кроме того, обнаружено, что полученные in vitro мутации в аминокислотных остатках в положениях +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 и/или +274 аминокислотной последовательности субтилизина Bacillus amyloliquefaciens как по отдельности, так и в комбинации друг с другом и в любом сочетании с мутациями в положении +76 приводят к образованию вариантов субтилизина с измененной протеолитической активностью, термостабильностью, субстратной специфичностью, а также с измененными профилем pH и физико-химическими свойствами.

Карбонилгидролазы относятся к ферментам, которые гидролизуют соединения, содержащие связи, в которых X представляет собой кислород или азот. Известны карбонилгидролазы природного происхождения и рекомбинантные. К природным карбонилгидролазам относятся собственно гидролазы, например пептидные гидролазы, такие как субтилизины или металлопротеиназы. Пептидные гидролазы включают альфа-аминоацилпептидную гидролазу, пептидиламинокислотную гидролазу, ациламиногидролазу, сериновую карбоксипептидазу, металлокарбоксипептидазу, тиоловую протеиназу, карбоксилпротеиназу и металлопротеиназу. К сериновым, тиоловым, аминокислотным и металлопротеиназам относятся как эндо-, так и экзопротеиназы.

К рекомбинантной карбонилгидролазе относится карбонилгидролаза с модифицированной последовательностью ДНК, для получения которой в ДНК природной карбонилгидролазы генерируют мутации, определяющие замену, инсерцию или делецию одного или более аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности природной карбонилгидролазы. Соответствующие способы модификации описаны в настоящей заявке, а также в патентах США N 4,760,025 (RE 34,606), N 5,204,015 и 5,185,258, которые приведены здесь в качестве ссылок.

Субтилизины представляют собой бактериальные или грибные карбонилгидролазы, которые в основном расщепляют пептидные связи в белках и пептидах. Используемое здесь понятие "субтилизин" относится как к природному, так и к рекомбинантному субтилизину. Известно, что различные виды микроорганизмов продуцируют и во многих случаях секретируют определенные природные субтилизины. Их аминокислотные последовательности не полностью гомологичны. Однако указанные субтилизины обнаруживают сходный тип протеолитической активности. Этот класс сериновых протеиназ имеет общий аминокислотный участок, а именно каталитическую триаду аминокислот, которая отлична от таковой у родственного химотрипсину класса сериновых протеиназ. Субтилизины и родственные химотрипсину сериновые протеиназы имеют каталитическую триаду аминокислот, включающую аспартат, гистидин и серин. В родственных субтилизину протеиназах относительный порядок указанных аминокислот в направлении от аминотерминального к карбокситерминальному концу следующий: аспартат, гистидин, серин. В родственных химотрипсину протеиназах аминокислоты расположены в следующем порядке: гистидин, аспартат, серин. Таким образом, описываемый здесь субтилизин относится к сериновым протеиназам, имеющим каталитическую триаду родственных субтилизину протеиназ. Примеры относятся к субтилизинам, приведенным на фиг.3, но не ограничиваются указанными ферментами.

К "рекомбинантному субтилизину" относится субтилизин с модифицированной последовательностью ДНК (вариант ДНК-последовательности или мутантная ДНК-последовательность), которая включает замещение, делецию или инсерцию одной или более аминокислот по сравнению с аминокислотной последовательностью природного субтилизина. Подходящие способы получения таких модификаций раскрыты в настоящем описании и в патентах США N 4,760,025 (RE 34,606), N 5,204,015 и 5,185,258.

"Карбонилгидролазы не человеческого происхождения" и кодирующие их последовательности ДНК могут быть получены из многих прокариотических и эукариотических организмов. Примерами соответствующих прокариотических организмов служат грамотрицательные бактерии, такие как E.coli или Pseudomonas, и грамположительные бактерии, такие как Micrococcus или Bacillus. Примерами эукариотических организмов, из которых могут быть получены карбонилгидролазы и кодирующие их гены, являются дрожжи, например Saccharomyces cerevisiae, грибы, например Aspergillus sp. и млекопитающие, например бык (получение гена, кодирующего карбонилгидролазу химозин). Так же, как и в случае субтилизинов, определенные карбонилгидролазы могут быть получены из различных родственных видов, причем аминокислотные последовательности таких карбонилгидролаз не полностью гомологичны, но ферменты обнаруживают одинаковый или сходный вид биологической активности. Таким образом, описываемые здесь карбонилгидролазы не человеческого происхождения имеют функциональную активность карбонилгидролаз, которая непосредственно или опосредованным образом ассоциируется с активностью карбонилгидролаз из прокариотических и эукариотических источников.

"Вариант карбонилгидролазы" имеет аминокислотную последовательность, которая получена на основе аминокислотной последовательности "предшественника карбонилгидролазы". Предшественник карбонилгидролаз (например субтилизин) включает как природные карбонилгидролазы (субтилизин), так и рекомбинантные карбонилгидролазы (субтилизин). Аминокислотная последовательность варианта карбонилгидролазы "происходит" из аминокислотной последовательности предшественника гидролазы в результате замещения, делеции или инсерции одной или более аминокислот в последовательности предшественника. Такие модификации затрагивают последовательность ДНК предшественника, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность (субтилизина) в противовес манипуляциям карбонилгидролазным предшественником (субтилизином) per se (т.е. на уровне белка). Подходящие способы модификаций последовательности ДНК предшественника описаны здесь, а также известны специалистам в данной области исследований (см., например, ЕР 0328299, WO 89/06279 и патенты и заявки США, указанные ранее).

Мутациям подвергаются специфические аминокислотные остатки субтилизина Bacillus amyloliquefaciens, соответствующие положению +76 в сочетании с одним или более аминокислотными остатками в следующих положениях: +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 и/или +274. Предпочтительными комбинациями модифицированных остатков являются следующие: 76/99; 76/101; 76/103; 76/104; 76/107; 76/123; 76/99/101; 76/99/103; 76/99/104; 76/101/103; 76/101/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/104/123; 76/107/123; 76/99/101/103; 76/99/101/104; 76/99/103/104; 76/101/103/104; 76/103/104/123; 76/104/107/123; 76/99/101/103/104; 76/99/103/104/123; 76/99/101/103/104/123; 76/103/104/128; 76/103/104/260; 76/103/104/265; 76/103/104/197; 76/103/104/105; 76/103/104/135; 76/103/104/126; 76/103/104/107; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265 и/или 76/103/104/222; наиболее предпочтительными являются сочетания 76/99; 76/104; 76/99/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104 и 76/101/ 104. Указанные аминокислотные остатки пронумерованы в соответствии с их положением в молекуле зрелого субтилизина Bacillus amyloliquefaciens, чья аминокислотная последовательность приведена на фиг.1. Однако данное изобретение не ограничивается получением только этого мутантного субтилизина, но относится и к предшественнику карбонилгидролазы, содержащему мутантные аминокислотные остатки в положениях, которые эквивалентны положению специфических аминокислотных остатков в субтилизине Bacillus amyloliquefaciens. В предпочтительном варианте осуществления изобретения предшественником субтилизина является субтилизин Bacillus lentus, и замещения, делеции или инсерции осуществляются по отношению к аминокислотным остаткам В.lentus, эквивалентным указанным выше.

Аминокислотный остаток (аминокислота) в предшественнике карбонилгидролазы считается эквивалентным остатку субтилизина Bacillus amyloliquefaciens, если он гомологичен (т.е. соответствует по положению в первичной или третичной структуре) или аналогичен специфическому остатку или его части в субтилизине Bacillus amyloliquefaciens (т.е. имеет ту же самую или сходную функциональную способность к химическому комбинированию, реагированию или взаимодействию).

Для установления гомологии по первичной структуре аминокислотную последовательность предшественника карбонилгидролазы непосредственным образом сравнивают с первичной аминокислотной последовательностью субтилизина Bacillus amyloliquefaciens и в особенности с набором аминокислотных остатков, про которые известно, что они инвариантны в установленных последовательностях субтилизинов. На фиг.2 показаны консервативные аминокислотные остатки в субтилизинах В.amyloliquefaciens и В.lentus. После установления порядка расположения консервативных последовательностей, что необходимо для поддержания определенного характера инсерций и делеций (т.е. для исключения элиминации консервативных аминокислотных остатков в результате случайной делеций или инсерций), выявляют остатки, эквивалентные специфическим аминокислотам в первичной последовательности субтилизина Bacillus amyloliquefaciens. При сопоставлении аминокислотных остатков предпочтительным считается совпадение консервативных остатков на 100%. Однако совпадение более чем на 75% и даже на 50% является адекватным для идентификации эквивалентных аминокислотных остатков. При этом следует поддерживать консервативность каталитической триады Asp32/His64/Ser221.

В качестве примера на фиг.3 приведен порядок расположения аминокислотных остатков в молекуле субтилизинов Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis (carlsbergensis) и Bacillus lentus для выявления гомологии между аминокислотными последовательностями. Сравнение их показывает, что в каждой последовательности имеются многочисленные консервативные аминокислотные остатки. Эти остатки (в сравнении BPN' с субтилизином В.lentus) приведены на фиг.2.

Указанные консервативные аминокислотные остатки, таким образом, могут служить для выявления эквивалентных остатков субтилизина Bacillus amyloliquefaciens в других карбонилгидролазах, таких как субтилизин Bacillus lentus (заявка PCT N WO/06279, опубликованная 13.07.89), предпочтительном предшественнике описываемого здесь субтилизина, или же в субтилизине, называемом PB 92 (EP 0328299), который обладает высокой гомологией с предпочтительным субтилизином Bacillus lentus. Аминокислотные последовательности некоторых из указанных субтилизинов приведены на фиг.3A и 3B в сравнении с последовательностью субтилизина Bacillus amyloliquefaciens для выявления максимальной гомологии консервативных аминокислотных остатков. Как можно видеть из рисунков, имеется определенное число делеций в последовательности субтилизина Bacillus lentus в сравнении с субтилизином Bacillus amyloliquefaciens. Так, например эквивалентная аминокислота для Val165 в субтилизине Bacillus aplyloliquefaciens в субтилизинах B.lentus и B.licheniformis является изолейцином.

Таким образом, например, в положении +76 субтилизинов B.amyloliquefaciens и B.lentus находится аминокислота аспарагин (N). Однако в предпочтительном варианте осуществления изобретения аминокислоту, эквивалентную находящейся в положении +76 субтилизина Bacillus amyloliquefaciens, замещают на аспартат (D). Сравнение некоторых аминокислотных остатков, подлежащих замещению, в противоположность наиболее предпочтительным заменам для каждого положения приведены в табл. II в иллюстративных целях (см.в конце описания).

Эквивалентные аминокислотные остатки могут быть также выявлены путем установления гомологии на уровне третичной структуры предшественника карбонилгидролазы, определенной с помощью рентгеновской кристаллографии. Эквивалентными остатками считаются такие, для которых два или более атома в основной цепи специфического аминокислотного остатка в предшественнике карбонилгидролазы и субтилизина Bacillus amyloliquefaciens располагаются в пределах 0,13 нм и предпочтительно 0,1 нм после сопоставления. Сопоставление проводят вслед за определением ориентации и расположения наилучшей модели третичной структуры с целью достижения максимального перекрывания неводородных атомов белка карбонилгидролазы в сравнении с субтилизином Bacillus amyloliquefaciens. Наилучшая модель - это такая кристаллографическая модель, при которой обеспечивается наименьшее значение R-фактора для экспериментальных данных по дифракции при наивысшем возможном разрешении.

Эквивалентные аминокислотные остатки в предшественнике карбонилгидролазы считаются функционально аналогичными специфическому остатку в субтилизине Bacillus amyloliquefaciens, если они влияют на конформацию таким образом, что изменяют, модифицируют или поддерживают структуру белка, а также связывание с субстратом или каталитические свойства так же, как и специфический аминокислотный остаток в субтилизине Bacillus amyloliquefaciens. Более того, к ним относятся такие остатки в предшественнике карбонилгидролазы (для которого путем рентгеновской кристаллографии установлена третичная структура), которые занимают аналогичное положение в заданных пределах так, что, несмотря на то, что атомы основной цепи данного остатка могут и не соответствовать критерию эквивалентности в смысле занимания гомологичной позиции, по крайней мере два атома боковой цепи остатка расположены в пределах 0,13 нм в соответствии с атомами боковой цепи в субтилизине Bacillus amyloliquefaciens. Параметры трехмерной структуры субтилизина Bacillus amyloliquefaciens раскрыты в опубликованной заявке на Европейский патент N 0251446 (эквивалентной заявке на патент США SN 08/212,291 и приведенной здесь в качестве ссылки) и могут быть использованы, как описано выше, для выявления эквивалентных остатков на уровне третичной структуры.

Некоторые аминокислотные остатки, подлежащие замещению, инсерции или делеции, являются консервативными, в то время как другие - нет. В случае неконсервативных остатков замещения одной или более аминокислот ограничиваются теми, которые приводят к образованию варианта с аминокислотной последовательностью, не встречающейся в природе. В случае консервативных остатков такие замещения также не приводят к получению природных последовательностей. Варианты карбонилгидролазы, описанные в настоящей заявке, включают как зрелые формы вариантов карбонилгидролазы, так и их про- и пре-про-формы. Пре-про-формы являются предпочтительными, поскольку в этом случае облегчаются экспрессия, секреция и созревание вариантов карбонилгидролазы.

"Про-последовательность" означает последовательность аминокислот, связанную с N-терминальным участком зрелой формы карбонилгидролазы, удаление которой приводит к образованию свободной зрелой формы карбонилгидролазы. Многие протеолитические ферменты обнаруживаются в природе в виде проферментных продуктов трансляции и в отсутствие посттрансляционного процессинга, экспрессируются именно в такой форме. Предпочтительная последовательность для получения вариантов карбонилгидролазы, в особенности вариантов субтилизина, представляет собой генетическую про-последовательность субтилизина Bacillus amyloliquefaciens, хотя могут быть использованы и другие пропоследовательности субтилизина. В примерах 1 и 2 используется гипотетическая про-последовательность субтилизина Bacillus lentus (ATCC 21536).

"Сигнальная последовательность" или "пре-последовательность" означает какую-либо последовательность аминокислот, связанную с N-терминальным участком карбонилгидролазы или с N-терминальным участком прогидролазы, которая принимает участие в секреции зрелой формы или проформы гидролазы. Такое определение сигнальной последовательности является функциональным и относится ко всем аминокислотным последовательностям, кодируемым N-терминальным участком гена субтилизина или других секретируемых карбонилгидролаз, которые обеспечивают эффективную секрецию субтилизина или других карбонилгидролаз в нативных условиях. В настоящем изобретении такие последовательности используются для обеспечения секреции вариантов карбонилгидролазы. Предпочтительная сигнальная последовательность, используемая в примере 1, содержит первые семь аминокислотных остатков сигнальной последовательности субтилизина Bacillus subtilis, слитых с оставшейся частью сигнальной последовательности субтилизина Bacillus lentus (ATCC 21 536).

"Пре-про-форма" карбонилгидролазы представляет собой зрелую гидролазу, имеющую про-последовательность, функционально соединенную с аминотерминальным участком гидролазы, и "пре" или "сигнальную" последовательность, функционально связанную с аминотерминальным участком про-последовательности. "Вектор экспрессии" представляет собой ДНК-конструкт, содержащий последовательность ДНК, функционально связанную с соответствующей контролирующей последовательностью, способной обеспечивать экспрессию указанной ДНК в соответствующем хозяине. Такие контролирующие последовательности включают промотор, обеспечивающий эффективную транскрипцию, факультативную операторную последовательность для контроля транскрипции, последовательность, кодирующую сайт связывания с рибосомой в молекуле мРНК, и последовательности, контролирующие терминацию транскрипции и трансляции. Вектор может быть плазмидой, фаговой частицей или просто потенциальной геномной вставкой. Введенный путем трансформации в подходящую хозяйскую клетку, вектор может реплицироваться и функционировать независимо от генома хозяина, а может, в некоторых случаях, интегрировать в его геном. В настоящем описании термины "плазмида" и "вектор" иногда используются взаимозаменяемо, поскольку плазмида является наиболее часто используемой формой вектора. Однако для осуществления изобретения могут использоваться и другие формы векторов экспрессии, выполняющие эквивалентные функции и известные специалистам в данной области исследований.

"Клетки-хозяева", используемые в настоящем изобретении, являются прокариотическими или эукариотическими клетками, которые с помощью методов, описанных в патенте США N 4,760,025 (RE 34,606) изменяют таким образом, что они теряют способность к секреции энзиматически активных эндопептидаз.

Предпочтительными клетками-хозяевами для экспрессии субтилизина являются клетки штамма бактерий Bacillus BG2036, дефектного по энзиматически активной нейтральной протеиназе и алкалинпротеиназе (субтилизину). Получение штамма BG2036 подробно описано в патенте США N 5,264,366. Другими клетками-хозяевами для экспрессии субтилизина являются клетки штамма Bacillus subtilis I168 (также описанного в патенте США N 4,760,025 (RE 34,606) и в патенте США N 5,264,366, которые приводятся здесь в качестве ссылки), а также клетки любого другого подходящего штамма Bacillus, например B. licheniformis, B. lentus и т.д.

Клетки-хозяева трансформируют или трансфицируют векторами, полученными с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Такие трансформированные клетки-хозяева способны к репликации векторов, кодирующих варианты карбонилгидролазы, и к экспрессии необходимого варианта. При использовании векторов, кодирующих пре- или пре-проформу варианта карбонилгидролазы, такие варианты после экспрессии обычно секретируются из клетки-хозяина в культуральную среду.

Понятие "функционально-связанный" при описании взаимодействий между двумя участками ДНК просто означает, что они имеют функциональное отношение друг к другу. Например, пре-последовательность функционально связана с пептидом, если ее функции как сигнальной последовательности, принимающей участие в секреции зрелой формы белка, с наибольшей вероятностью включают и отщепление сигнальной последовательности. Промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если он контролирует транскрипцию последовательности: сайт связывания с рибосомой функционально связан с кодирующей последовательностью, если его расположение обеспечивает трансляцию.

Гены, кодирующие природный предшественник карбонилгидролазы, могут быть получены в соответствии с основными методами, известными специалистам в данной области исследований. Такие методы обычно включают синтезирование меченых проб, имеющих предполагаемые последовательности кодирующих участков гена соответствующей гидролазы, получение геномны