Ингибиторы hiv протеазы

Ингибиторы hiv протеазы

Реферат

 

Описываются новые соединения формулы (I) или фармацевтически приемлемая соль такого соединения, в которой представляет собой устойчивый 8-10 членный бициклический гетероцикл, каждое из колец которого может быть насыщенным или ненасыщенным, и указанный гетероцикл состоит из углеродных атомов и 1-3 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, S или O, причем указанный гетероцикл может быть незамещенным или замещенным галогеном или низшим C_1-4 алкилом, при условии, что не является группами (А). Соединения являются ингибиторами протеазы, закодированной вирусом иммунодефицита человека. Описываются также фармацевтическая композиция на основе соединений формулы (I) и способ ингибирования HIV протеазы. 3 с. и 11 з.п. ф-лы.

Изобретение является частичным продолжением заявки Мерк 191391А, поданной 15 декабря 1993 г. Настоящая заявка относится к заявке Мерк 18996 с U. S-S-N. 08/059038 от 7 мая 1993 г., которая является частично продолженной заявкой заявки Мерк 185971В, которая в свою очередь является частично продолженной заявкой заявки Мерк 185971А, которая является частичной продолженной заявкой заявки США с серийным номером 07/7895 08 от 8 ноября 1991 г. Настоящая заявка относится к следующим патентным документам: заявке США с серийным номером 595913 от 11 октября 1990 г (дело Мерк 18236); заявке США с серийным номером 746460 от 16 августа 1991 г. (дело Мерк 18466); заявке Мерк, поданной 23 октября 1991 г., и заявке Мерк 18416.

Изобретение относится к соединениям, которые ингибируют протеазу, закодированную вирусом иммунодефицита человека, или их фармацевтически приемлемым солям, и такие соединения используются для профилактики инфицирования HIV, лечения инфицирования HIV и лечения приобретенного в результате синдрома иммунодефицита (AIDS). Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим такие соединения, и способу применения настоящих соединений и других агентов для лечения AIDS и вирусного инфицирования HIV.

Область техники, к которой относится изобретение.

Ретровирус, обозначенный как вирус иммунодефицита человека (HIV), представляет собой этиологический агент комплексного заболевания, которое заключается в прогрессирующем разрушении иммунной системы (синдром приобретенного иммунодефицита) и вырождении центральной и периферической нервной системы. Такой вирус ранее был известен, как LAV, HTLV-111 или ARY. Общим признаком ретровирусной репликации является экстенсивная посттрансляционная обработка полипротеинов-предшественников вирусно закодированной протеазой, в результате чего вырабатываются зрелые вирусные белки, требующиеся для сборки и функционирования вируса. Ингибирование такого процесса предотвращает образование инфекционного в обычных условиях вируса. Так например, Kohl, N.E. с сотр., в Proc. Natl Acad. Sci.. 85, 4686 (1988) показали, что генетическая инактивация протеазы, закодированной HIV, приводит в результате к образованию незрелых, неинфекционных вирусных частиц. Эти результаты показывают, что ингибирование HIV протеазы представляет собой жизнеспособный способ лечения AIDS и профилактики или лечения заражения HIV.

Нуклеотидная последовательность HIV обнаруживает наличие ро1 гена в одной открытой рамке считывания (Rather, Z, с сотр., Nature, 313, 277 (1985)). Гомология аминокислотной последовательности обеспечивает доказательство того, что pol последовательность кодирует обратную транскриптазу, эндонуклеазу и HIV протеазу (Toh, H. с сотр., EMBO J., 4, 1267 (1985); Power M.D, с сотр. , Science, 231, 1567 (1986); Pearl, L.H. с сотр., Nature, 329, 351, (1987)). Заявители продемонстрировали тот факт, что соединения настоящего изобретения являются ингибиторами HIV протеазы.

Краткое изложение сущности изобретения.

Соединения формулы I, указанной в тексте описания, могут использоваться для ингибирования HIV-протеазы, профилактики инфицирования HIV, лечения инфицирования HIV и для лечения AlDS, причем они могут применяться как таковые, в виде фармацевтически приемлемых солей, ингредиентов фармацевтической композиции, необязательно в комбинации с другими антивирусными агентами, иммуномодуляторами, антибиотиками или вакцинами. Раскрываются также способы лечения AIDS, способы профилактики инфицирования HIV и способы лечения инфицирования HIV.

В заявке могут использоваться сокращения, представленные в конце описания.

Описание изобретения и предпочтительных реализаций.

Изобретение относится к соединениям формулы I, их комбинациям или их фармацевтически приемлемым солям, предназначенным для ингибирования HIV протеазы, профилактики или лечения заражения HIV и лечения приобретенного в результате синдрома иммунодефицита (AIDS). Соединения формулы I определены следующим образом: или их фармацевтически приемлемые соли где представляет собой устойчивый 8-10-членный бициклический гетероцикл, каждое из колец которого может быть насыщенным или ненасыщенным, причем указанный гетероцикл состоит из атомов углерода и 1-3 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, S или O, и указанный гетероцикл может быть незамещенным или замещенным OH, галогеном, C_1-4алкилом, оксогруппой; при условии, что не является следующими группами: Одна из реализаций настоящего изобретения представляет собой соединения формулы I или их фармацевтически приемлемые соли, в которых представляет собой устойчивый 8-10-членный бициклический гетероцикл, любое из колец которого может быть насыщенным или ненасыщенным, и указанный гетероцикл состоит из атомов углерода и 2-х гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N или O, причем гетероатомы находятся в различных кольцах.

Вторая реализация изобретения представляет собой соединения формулы I, в которой ограничен значениями: X представляет собой O или S, или их фармацевтически приемлемые соли.

Третья реализация изобретения представляет собой соединения формулы I, в которой ограничен значением: или их фармацевтически приемлемые соли.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет собой соединение A: которое представляет собой N-(2(R)-гидрокси-1(S)-инданил)- 2(R)-фенилметил-4(S)-гидрокси-5(1-(4-(3-фуро[2.3-b] пиридил- метил)-2(S)-N'-(трет. -бутилкарбоксамидо)пиперазинил)пентанамид, или его фармацевтически приемлемую соль.

Соединения настоящего изобретения имеют хиральные центры и существуют в виде рацематов, рацемических смесей и индивидуальных диастереомеров или энантиомеров, причем все изомерные формы входят в настоящее изобретение. Рацемическая смесь охватывает смеси стереоизомеров в соотношении 50:50 и в других соотношениях.

В том случае, когда любая переменная (например, ) встречается более одного раза в любой составляющей части соединения или в формуле I, ее обозначение в каждом случае не зависит от обозначения в любом другом случае. Кроме того, комбинации заместителей и/или переменных фрагментов допустимы лишь в тех случаях, когда такие комбинации обеспечивают в результате устойчивые соединения.

Используемый в тексте описания термин "алкил", если не указано особо, включает как разветвленные, так и прямоцепные (нормального строения) насыщенные алифатические углеводородные группы, содержащие указанное число углеродных атомов (Me - метил, Et - представляет собой этил, Pr - пропил, Bu - бутил); используемый в тексте термин "галоген" обозначает фтор, хлор, бром и иод.

Фармацевтически приемлемые соли соединений формулы I (в виде водо- или маслорастворимых или диспергируемых продуктов) включают традиционные нетоксичные соли или соли четвертичного аммония, которые получают, например, из неорганических или органических кислот или оснований. Примеры таких солей присоединения кислот включают ацетат, адипинат, альгинат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат, бисульфат, бутират, цитрат, камфорат, камфорсульфонат, циклопентанпропионат, диглюконат, дигидрохлорид, дифосфат, додецилсульфат, этансульфонат, фумарат, глюкогептаноат, глютамат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, 2-гидрокси- этансульфонат, лактат, малеат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, нитрат, оксалат, памоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, фосфат, пикрат, пивалат, пропионат, сукцинат, тартрат, тиоцианат, тозилат и ундеканоат. Основные соли включают соли аммония, такие соли щелочных металлов, как соли натрия и калия; такие соли щелочноземельных металлов, как соли кальция и магния, соли с органическими основаниями, такие как соли дициклогексиламина, N-метил-D-глюкамина, а также соли с такими аминокислотами, как аргинин, лизин и т.п. Кроме того, основные азотсодержащие группы могут быть четвертичными с помощью таких агентов, как низшие алкилгалогениды, такие как метил, этил, пропил и бутил хлорид, бромиды и иодиды; такие диалкилсульфаты, как диметил-, диэтил-, дибутил- и диамилсульфаты, такие длинноцепные галогениды, как децил, лаурил, миристил и стеарил хлориды, бромиды и иодиды, такие аралкилгалогениды, как бензил- и фенетилбромиды и т.п. Другие фармацевтически приемлемые соли включают этанолятсульфат и сульфатные соли.

Схемы I-II (см. в конце описания) показывают получение новых соединений изобретения. Примеры специально иллюстрируют приложение следующих ниже схем к конкретным соединениям.

Реакции амидного сочетания, используемые для получения соединений настоящего изобретения, обычно осуществляют карбодиимидным методом с помощью таких реагентов, как дициклогексилкарбодиимид или 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид. Другие методы получения амидной или пептидной связи включают; но не ограничиваются ими, синтетические маршруты через хлорангидрид кислоты, азид, смешанный ангидрид или активированный сложный эфир. Обычно осуществляют реакцию жидкофазного амидного сочетания, однако вместо нее можно использовать твердофазный синтез с помощью классического метода Мэррифилда. Присоединение или удаление одной или более защитных групп является общепринятой процедурой.

Дополнительная родственная информация по сущности синтетических методов содержится в EPO 0337714 и EPO 0541168.

Один из методов получения соединений формулы I представлен Схемой I. Дигидро-5(S)-(трет. -бутилдиметилсилилоксиметил)- 3(2H)-фуранон (соединение 1, указанное ниже) получают стандартными методами, известными в данной области, из коммерчески доступного дигидро-5(S)-(гидроксиметил)-2(3H)-фуранона. После алкилирования соединения 1 с образованием соединения 2 защитную группу лактона 2 удаляют с помощью водного раствора HF с получением соединения 3.

Спиртовую группу соединения 3 активируют превращением в такую уходящую группу, как мезилат, тозилат или трифлат, в результате обработки спирта хлористым сульфонилом или (предпочтительно) серным ангидридом, например ангидридом трифторметансульфокислоты, в присутствии такого затрудненного аминного основания, как триэтиламин, диэтилизопропиламин или 2,6-лутидин, с получением такого соединения, как Соединение 4. Уходящую группу Соединения 4 замещают на амин 5, например 4-(1,1- диметилэтоксикарбониламино)-пиперазин-2(S)-карбоксамид, в таком растворителе, как DMF или ксилол, с получением такого соединения, как соединение 6. Трифторметансульфонилокси-группу можно замещать на амин при комнатной температуре в таком растворителе, как изопропанол или хлористый метилен, в результате обработки N,N- диизопропилэтиламином.

Соединение 6 гидролизуют с помощью водного раствора гидроксида лития или натрия и полученную в результате гидрокси кислоту 7 превращают в защищенную гидрокси кислоту 8. Гидроксильную группу для удобства защищают такой стандартной силил-защитной группой, как трет.-бутилдиметилсилил или трет-бутилдифенилсилил.

Защищенную гидрокси-кислоту 8 далее сочетают с желаемым R¹² амином с образованием соединения 9, а силильную защитную группу удаляют с помощью фторид-иона с получением соединения 10.

Одним из предпочтительных методов является синтез эпоксида 12 по реакции 11 в присутствии сильного основания. В качестве сильного основания может использоваться металлсодержащее основание, причем реакцию проводят в среде такого инертного безводного органического растворителя, как например циклические или ациклические углеводороды, включающие гексан, пентан, циклогексан и т.п. Подходящие сильные основания включают: LiN/(CH₃)₃Si/2, KN(CH₃)₃Si/2, NaN/(CH₃)₃Si/2, н-бутиллитий (н-BuLi), втор.-BuLi, трет.-BuLi, трет.-бутилат калия, диизопропиламид лития (LDA), изопропилциклогексиламид лития, пирролидид лития, тетраметилпиперидид лития, фениллитий, хлорид изопропилмагния, хлорид изобутилмагния, и другие аналогичные сильные основания, известные в данной области. Предпочтительными сильными основаниями являются н-BuLi, втор. -BuLi, LiN/(CH₃)₃Si/2 и LDA, причем н-BuLi и LiN/(CH₃ )₃Si/2 являются наиболее предпочтительными.

Предпочтительно на 1 молярный эквивалент соединения 11 используют 1-2 молярных эквивалента сильного основания.

Соединение 13 получают по реакции соединения 12 с N-трет.- бутил-4-(1, 1-диметилэтоксикарбониламино)пиперазин-2(S) карбоксамидом (5). Предпочтительно 1-3 молярных эквивалента амина (5) используют на молярный эквивалент эпоксида 12, причем более предпочтительным является соотношение V:IV, равное 1,05:1 молярному эквиваленту.

Эту реакцию можно проводить в любом подходящем растворителе, например в растворителе, выбранном из таких углеводородов, как толуол, таких простых эфиров, как диэтиловый эфир, таких спиртов, как метанол, этанол или изопропанол, таких нитрилов, как ацетонитрил, и таких сложных эфиров, как этилацетат, или их комбинаций, причем спирты являются наиболее предпочтительными растворителями, а изопропанол - наиболее предпочтительным растворителем. Температура реакции может поддерживаться в интервале от окружающей до температуры дефлегмации используемого растворителя, однако предпочтительно проводить реакцию при повышенной температуре, например в интервале 80- 90^oC, наиболее предпочтительно при 83-85^oC.

Активированные глицидолы могут быть получены способами, известными в данной области, как это описано, например, в статье J. Klunder с сотр., J. Org. Chem., 1989, 54, 1295-1304, и в ссылках, цитированных в данной работе.

Амидные соединения, такие как соединение 11, могут быть получены согласно стандартным методикам, известным специалистам в данной области, например по методике примера 10, с использованием соответствующих исходных материалов.

Защитные группы, например азот-защищающие группы, могут использоваться, когда это необходимо, для практической реализации настоящего изобретения. Так например, азот в положении 4 2-трет.- бутилкарбоксамид пиперазина может быть защищен такой группой, как BOC, CBZ, бензил, 4-метоксибензил, 2,4-диметоксибензил, трифторацетамид, триалкилсилил, и другими группами, известными в данной области.

Соединение формулы 15 в которой P представляет собой такую азот-защищающую группу, как -BOC или -CBZ, также получают согласно способу, описанному в Схеме I, предпочтительно используя 5-трифторметансульфонилоксиметиловый аналог лактона 4.

Соединение формулы 16 может быть получено различными путями из соединения 14 которое получают после удаления азот-защищающей группы из соединения 15 с использованием способов, хорошо известных в данной области, например путем каталитического гидрирования с целью удаления CBZ группы или обработки триметилсилилтрифлатом и 2,6- лутидином при 0^oC в таком растворителе, как CH₂Cl₂, или обработкой с помощью 6 N HCl в изопропаноле с целью удаления группы BOC.

Азот в положении 4 пиперазинила в соединении 14 может быть проалкилирован соединением формулы R¹-X в таком растворителе, как ДМФ в присутствии Et₃N, при комнатной температуре, в том случае, когда X представляет собой Cl, Br или I. Методики таких процедур хорошо известны специалисту в данной области.

Соединения настоящего изобретения также проиллюстрированы в таблице примера 3, приведенного ниже.

Соединения настоящего изобретения полезны для подготовки и проведения анализов на скрининг антивирусных соединений. Так например, соединения настоящего изобретения весьма полезны для выделения энзимных мутантов, которые являются прекрасными инструментами скрининга на более мощные антивирусные соединения. Кроме этого, соединения настоящего изобретения могут использоваться для установления или определения сайта связывания других антивирусных агентов с HIV протеазой, например методом конкурентного ингибирования. Таким образом, соединения настоящего изобретения представляют собой коммерческие продукты, продаваемые для таких целей.

Соединения настоящего изобретения могут использоваться для ингибирования HIV протеазы, профилактики или лечения заражения вирусом иммунодефицита человека (HIV) и лечения таких последующих патологических состояний, как AIDS. Лечение AIDS или профилактика, либо лечение заражения HIV включает, но не ограничивается этим, лечение большого числа состояний HIV-инфицирования: AIDS ARC (AIDS родственный комплекс), как симптоматического, так и асимптоматического характера, а также острой или потенциальной подверженности действию HIV. Так например, соединения настоящего изобретения могут использоваться для лечения заражения HIV после подозрения на последующую подверженность действию HIV, например при переливании крови, трансплантации органов, замене жидкостной среды тела, наличия следов укуса, случайного укола иглой или воздействия на кровь пациента в ходе хирургического вмешательства.

В этих целях, соединения настоящего изобретения могут применяться орально, парентерально (включая подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, внутриягодичные инъекции или вливания), путем ингаляционного распыления или ректально в рецептурах единичной дозировки, включающей традиционные нетоксичные фармацевтически приемлемые носители, стимуляторы и вспомогательные агенты.

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением дополнительно обеспечивается способ лечения и фармацевтические композиции для лечения заражения HIV и AIDS. Такое лечение включает применение на пациенте, нуждающемся в таком лечении, фармацевтической композиции, содержащей фармацевтический носитель - и терапевтически эффективное количество соединения настоящего изобретения или его фармацевтически приемлемой соли.

Такие фармацевтические композиции могут выпускаться в виде орально применяемых суспензий или таблеток; назальных спрэев; стерильных препаратов для инъекций, например в виде стерильных водных или масляный суспензий для инъекций, или свечей.

При оральном применении в виде суспензий такие композиции готовят согласно методам, широко известным в области приготовления фармацевтических рецептур, и они могут содержать микрокристаллическую целлюлозу для обеспечения массы, альгиновую кислоту или альгинат натрия в качестве суспендирующего агента, метилцеллюлозу в качестве усилителя вязкости и подслащивающие агенты и/или отдушки, известные в этой области. В виде таблеток немедленного выделения такие композиции могут содержать микрокристаллическую целлюлозу, дикальцийфосфат, крахмал, стеарат магния и лактозу и/или другие эксципиенты, связующие вещества, расширители, дезинтеграторы, разбавители и смазывающие вещества, известные в данной области.

При применении в виде назальных аэрозолей или путем ингаляции такие композиции готовят методами, хорошо известными в области фармацевтических рецептур, и они могут выпускаться в виде растворов в физиологическом растворе, с использованием бензилового спирта или других подходящих консервантов, промоторов адсорбции для усиления биоприменимости, фторуглеродов и/или других солюбилизирующих или диспергирующих агентов, известных в данной области.

Растворы или суспензии для инъекций могут формироваться согласно известным методам, с использованием нетоксичных, парентерально применимых разбавителей или растворителей, таких как маннит, 1,3-бутандиол, вода, раствор Рингера или изотонический раствор хлористого натрия или подходящих диспергирующих или смачивающих и суспендирующих агентов, таких как стерильные, мягкие, устойчивые масла, включая синтетические моно- или диглицериды, или жирные кислоты, включая олеиновую кислоту.

При ректальном применении в виде свечей такие композиции могут готовиться путем смешивания лекарства с таким нераздражающим эксципиентом, как масло какао, синтетические глицеридные сложные эфиры или полиэтиленгликоли, которые являются твердыми веществами при обычных температурах, но сжижаются и/или растворяются в ректальной полости с выделением лекарства.

Уровни дозировок порядка 0,02-5,0 или 10,0 г/день могут использоваться для лечения или профилактики указанных выше состояний, причем оральные дозировки в 2-5 раз выше. Так например, заражение HIV эффективно лечится путем применения 1,0-50 мг соединения на килограмм веса тела при приеме лекарства 1-4 раза в день. Согласно одному из предпочтительных режимов лечения, дозировки 100-400 мг каждые 6 часов применяли орально на каждом пациенте. Однако следует иметь в виду, что конкретный уровень дозировок и частота приема лекарства для каждого конкретного пациента может изменяться и будет зависеть от большого числа факторов, включая активность конкретного соединения, метаболическую стабильность и длительность действия такого соединения, возраст пациента, вес тела, общее состояние здоровья, пол, тип и время применения, скорость выделения, лекарственной комбинации, тяжести конкретного болезненного состояния и хозяина, подвергаемого терапии.

Настоящее изобретение также относится к комбинации соединений, ингибирующих HIV протеазу, с одним или более агентами, используемыми для лечения AIDS. Так например, соединения настоящего изобретения могут эффективно применяться как в период до воздействия, так и в период после воздействия, в комбинации с эффективными количествами AIDS антивирусных агентов иммуномодуляторами, обеззараживающими агентами или вакцинами, известными специалистам в данной области.

Следует иметь в виду, что сфера комбинаций соединений настоящего изобретения с AIDS антивирусными агентами, иммуномодуляторами, противоинфекционными агентами или вакцинами не ограничивается перечнем, представленным в приведенной в конце описания таблице, но, в принципе, включает любые комбинации с любым фармацевтическим составом, предназначенным для лечения AIDS.

Некоторые соединения, приведенные в таблице, представляют собой следующее: Соединение B представляет собой 6-хлор-4-(S)-циклопропил-3,4- дигидро-4-((2-пиридил)этинил)квиназолин-2(1Н)-он; Соединение C представляет собой(-)-6-хлор-4(S)-трифторметил- 1,2-дигидро-4(Н)-3,1-бензоксазин-2-он; невирапин представляет собой N-циклопропил-5,11-дигидро-4- метил-6H-дипиридо/3,2-b/:2',3'-e//1,4/диазепин-6-он.

Соединения B и С синтезировали согласно способам ЕР 0569083, на содержание которого ссылаются в данном описании. Невирапин синтезирован Klunder J. M. с сотр., Med. Chem., 35, 1887 (1992); Нargrave K.D. с сотр., J. Med. Chem. , 34, 2231 (1991); Cohen K.A. с сотр., J. Biol. Chem., 260, 14670 (1991), причем на все эти три работы ссылаются в настоящем описании.

Предпочтительные комбинации одновременно и поочередно применяются в лечении ингибитора HIV протеазы и ненуклеозидного ингибитора HIV обратной транскриптазы. Необязательный третий компонент в комбинации представляет собой нуклеозидный ингибитор HIV обратной транскриптазы, такой как AZT, ddC или ddI. Предпочтительным ингибитором HIV протеазы является соединение A. Предпочтительные ненуклеозидные ингибиторы HIV обратной транскриптазы включают соединение В, соединение C или невирапин. Такие комбинации могут давать синергетические эффекты на ограничение распространения HIV. Предпочтительные комбинации включают: (1) соединение A, совместно с предпочтительным ненуклеозидным ингибитором HIV обратной транскриптазы, и, необязательно, AZT или ddI, либо ddC; (2) соединение A и любое соединение, выбранное из AZT, ddI или ddC.

Анализ на ингибирование микробиально экспрессированной HIV протеазы Исследование ингибирования реакции экспрессии протеазы в Eschericia coli в присутствии пептидного субстрата (Val - Ser -Gln - Asn-(бетанафтил)Ala-Pro-Ile-Val, 0,5 мг/мл во время инициирования реакции) проводили в 50 мМ ацетата Na, pH 5,5 при 30^oC в течение 1 часа. Различные концентрации ингибитора в 1,0 мкл ДМСО добавляли к 25 мкл пептидного раствора в воде. Реакцию инициировали добавлением 15 мкл 0,33 нМ протеазы (0,11 нг) в растворе 0,133 М ацетата Na, pH 5,5 и 0,1% альбумина бычьей сыворотки. Реакцию прекращали с помощью 160 мкл 5% фосфорной кислоты. Продукты реакции разделяли методом HPLC (VVDAC, широкопористый, 5 см C-18 обратимая фаза, ацетонитрильный градиент, 0,1% фосфорной кислоты). Степень ингибирования реакции определяли из высот пиков продуктов. HPLC независимо синтезированных продуктов, служивших количественными стандартами, подтвердила состав продуктов. Соединение A имело значение IC₅₀ порядка 0,27 нМ.

Анализ на распространение клеток Ингибирование распространения HIV в клеточной культуре измеряли согласно методу Nunberg J.H, с сотр., J.Virol. 65, 4887 (1991). B этом анализе МТ-4 Т-лимфоидные клетки инфицировали HIV-1 (дикий тип, если не указано особо) с использованием заранее определенного прививочного материала и культуры инкубировали в течение 24 часов. К этому времени 1% клеток были положительными согласно косвенной иммунофлуоресценции. Затем клетки тщательно промывали и распределяли в чашках для культур с 96-ю углублениями. В углубления добавляли серийные двукратные разбавления ингибитора и культуры выдерживали еще в течение 3 дней. Через 4 дня после заражения 100% клеток в контрольной культуре оказались инфицированными. Накопление HIV р24 прямо коррелировало с распространением вируса. Ингибиторную концентрацию клеточной культуры определяли как концентрацию ингибитора, выраженную в наномолях/литр, которая уменьшает распространение инфекции, по крайней мере на 95%, или ее обозначали как CIC₉₅. Значение CIC₉₅ для соединения A составило 25 нМ.

Ингибирование распространения вируса.

A. Приготовление суспензии клеток МТ-4, инфицированной HIV.

МТ клетки инфицировали в день 0 с концентрацией 250,000/ мл 1:1000 разбавлением HIV-1 штамма линии IIIb (конечная концентрация 125 пг p24/мл, что достаточно для образования 1% зараженных клеток на день 1 и 25-100% на день 4). Клетки инфицировали и выращивали в следующей среде: RPMI (Виттакер Био-Продактс), 10% инактивированной плодной телячьей сыворотки, 4 мМ глутамина (Гибко Лабс.) и 1:100 Пенициллин-Стрептомицин (Гибко Лабс.).

Смесь инкубировали в течение ночи при 37^oC в атмосфере, содержащей 5% CO₂.

B. Обработка ингибиторами.

Готовили матрицу наномолярного интервала концентраций парных комбинаций. В день 1 аликвоты в 125 мкл ингибиторов добавляли к равным объемам HIV-инфицированных МТ-4 клеток (50,000 на углубление) в микротитрическую пластину для клеточной культуры с 96-ю углублениями. Инкубацию продолжали в течение 3 дней при 37^oC в атмосфере, содержащей 5% CO₂.

C. Измерение распространения вируса.

С использованием многоканальной пипетки осажденные клетки ресуспендировали и 125 мкл собирали на отдельную микротитрическую пластину. Супернатант анализировали на наличие HIV р24 антигена.

Концентрацию HIV р24 антигена измеряли с помощью энзимного иммуноанализа, описанного ниже. Аликвоты р24, подлежащие измерению, добавляли в микроуглубления, покрытые моноклональным антителом, специфичным на антиген оболочки HIV. На этой и других последующих соответствующих стадиях микроуглубления промывали. Затем добавляли биотинилированное HIV-специфичное антитело, после чего добавляли конъюгат стрептавидин - пероксидаза хрена. При добавлении пероксида водорода и тетраметилбензидинового субстрата протекала цветная реакция. Интенсивность цвета была пропорциональна концентрации HIV р24 антигена.

Расчет степени синергии или усиленного ингибирования.

При наличии синергетического эффекта парные комбинации ингибиторов, как это было обнаружено, проявляют отчетливо усиленное ингибирование распространения вируса по сравнению с действием каждого ингибитора по отдельности или в сравнении с простым аддитивным ингибированием от каждого ингибитора.

Полученные данные обрабатывали следующим образом: фракционные ингибиторные концентрационные соотношения (FIC) рассчитывали согласно статье Elion с сотр. , J. Biol, Chem., 208, 477 (1954). Минимальную сумму FIC, демонстрирующую максимальный синергетический эффект, определяли для различных парных комбинаций. Чем меньше число, тем выше синергетический эффект.

Пример 1. Получение N-(2(R)-гидpoкcи-1(S)-инданил)- 2(R)-фенилметил-4(S)-гидрокси)-5-(1-(2(S)-N-(трет. -бутил- карбоксамидо)пиперазинил)-пентанамида, Соединение 14 Стадия 1: Получение дигидро-5-(S)-((трет.-бутилдифенилсилил)- оксиметил)-3(R)фенилметил-3(2Н)-фуранона.

Раствор диизопропиламида лития (LDA) получали добавлением 1,55 мл н-BuLi (2,5 М в гексане) к 0,55 мл (39 ммоля) диизопропиламина в 10 мл ТГФ при -78^oC. Через 30 минут добавляли дигидро-5-(S)-((трет.-бутилдифенилсилил)-оксиметил)- 3(2H)-фуранона (1,38 г, 3,89 ммоля) в 5 мл ТГФ. Еще через 30 минут перемешивания добавляли бромистый бензил (0,68 г, 3,9 ммоля) и перемешивание продолжали в течение 3 часов, после чего реакцию прекращали путем добавления 10% водного раствора лимонной кислоты. Раствор экстрагировали этилацетатом (2 х 50 мл), который подвергали обратной промывке рассолом, сушили, фильтровали и концентрировали с получением масла. Продукт очищали методом хроматографии (SiO₂, 20% EtOAc/ гексан) с получением целевого соединения.

Стадия 2: Получение дигидро-5(S)-(гидроксиметил)-3(R)- фенилметил-3(2H)-фуранона.

К 5,26 г дигидро-5(S)-((трет.-бутилдифенилсилил)оксиметил- 3(R)фенилметил-3(2H)-фуранона в 40 мл ацетонитрила добавляли 1,34 мл 49% водного раствора HF. Через 18 часов при комнатной температуре реакционную смесь концентрировали досуха и остаток распределяли между водой (50 мл) и этилацетатом (50 мл). Органический слой промывали рассолом, сушили, фильтровали и концентрировали с получением продукта в виде желтовато-коричневого твердого вещества (т.пл. 69-72^oC).

Стадия 3: Получение дигидро-5(S)-((трифторметансульфонил)- оксиметил)-3(R)-фенилметил-3(2H)-фуранона.

К раствору 18,4 г (89,2 ммоля) дигидро-5(S)-(гидроксиметил) -3(R)-фенилметил-3(2Н)-фуранона в 350 мл хлористого метилена, охлажденного до 0^oC, добавляли 13,51 мл 2,6-лутидина (115,98 ммоля), после чего прикапывали 16,51 мл трифторметансульфонового ангидрида (98,1 ммоля). Через 1,5 часа при 0^oC реакционную смесь переливали в смесь 300 мл льда с рассолом и перемешивали в течение 0,5 часа. Затем водный слой экстрагировали хлористым метиленом (3 х 150 мл), органические слои промывали 10% HCl (2 х 75 мл), насыщали NaHCO₃ (100 мл), водой (100 мл), сушили над MgSO₄, фильтровали и концентрировали с получением твердого остатка. В результате очистки методом хроматографии однократного испарения (колонка 120 х 150 мм, градиентное элюирование смесями гексаны: EtOAc, 4:1-3:1) получали целевое соединение, т.пл. 53-54^oC.

Стадия 4: Получение 4-(1,1-диметилэтоксикарбониламино)-1- (фенилметилкарбониламино)-пиперазин-2S-карбоновой кислоты Целевое соединение получали, следуя методике, описанной Bigge C.F., Hays S. J., Novak P.M., Drummond J.T., Johnson Y., Bobovski T., Tetrahedron Lett, 1989, 30, 5193; используя в качестве исходного соединения 2(S)-пиперазинкарбоновую кислоту (см. Felder E., Maffei S., Pietra S., Pitre D., Helv, Chim. Acta, 1960, 117, 888.

Стадия 5: Получение N-трет. -бутил-4-(1,1- диметилэтоксикарбонил-амино)-1-(фенилметилкарбониламино) пиперазин-2(S)-карбоксамида.

К 9.90 г (27,16 ммоля) продукта со стадии 4,растворенного в 75 мл ДМФ и охлажденного до 0^oC, добавляли 5,73 г (29,88 ммоля) ЕДС, 4,03 г (29,88 ммоля) HOBt, 3,14 мл (29,88 ммоля) трет.-бутиламина и, наконец, 4,16 мл (29,88 ммоля) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали в течение 18 часов и реакционный объем концентрировали наполовину. Затем смесь разбавляли 600 мл EtOAc и промывали 10% HCl (2 х 75 мл), насыщенным NaHCO₃ (1 х 75 мл), водой (3 х 75 мл) и рассолом (1 х 50 мл), сушили над MgSO₄ и концентрировали с получением твердого вещества. Такое твердое вещество обрабатывали смесью EtOAc:гексан (1:2) и фильтровали с получением целевого соединения в виде белого твердого вещества; т.пл. 134-135^oC.

Стадия 6: Получение N-трет. -бутил-4-(1,1- диметилэтоксикарбониламино)пиперазин-2(S)-карбоксамида.

К 1,20 г (2,86 ммоля) N-трет.-бутил-4-(1,1- диметилэтоксикарбониламино)-1-(фенилметилкарбониламино)пиперазин-2-(S) - карбоксамида и 1,1 г (0,086 ммоля) 10% Pd/C добавляли 15 мл метанола. В реакционный сосуд вводили водород и реакционную смесь перемешивали в течение 2 часов, фильтровали через целит и промывали этанолом. Растворители удаляли в вакууме с получением целевого продукта в виде пены.

Спектр ¹H-ЯМР (300 МГц, CDCl₃) : 6,65 (широкая полоса, 1H), 4.10 (мультиплет, 1H), 3.81 (широкая полоса, 1H), 3.21 (двойной дублет, J = 18 и 7 Гц), 3.02-2.70 (мультиплет, 4H), 2.10-2.0 (широкая, 1H), 1.50 (синглет, 9H), 1.41 (синглет, 9H).

Стадия 7: Получение дигидро-5(S)-(4-(1,1- диметилэтоксикарбониламино)-2(S)-N-(трет. -бутилкарбоксамидо) -пиперазинил)метил)-3(R)-фенилметил-3(2Н)-фуранона.

К раствору 22,40 г (0,0662 моля) дигидро-5(S)- ((трифторметансульфонил)оксиметил)-3-(R)-фенилметил-3(2Н)-фуранона (полученного на стадии 3) и 18,0 г (0,063 моля) N-трет.-бутил-4- (1,1-диметилэтоксикарбониламино) пиперазин-2(S)-карбоксамида, растворенного в 180 мл изопропанола, добавляли 11,53 мл (0,062 моля) N,N-диизопропилэтиламина. Через 2,5 часа добавляли еще 1,2 г дигидро-5(S)-(трифторметансульфонил)оксиметил)-3(R)- фенилметил-3(2Н)-фуранона. Реакционную смесь анализировали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) через 3,5 часа и концентрировали до состояния густого масла. В результате обработки смесью EtOAc/гексаны (1:2, 200 мл) получали белое твердое вещество, которое отфильтровывали и отбрасывали. Масло очищали методом колонной хроматографии мгновенного испарения (колонка 120х150 мм, градиентное элюирование смесью EtOAc/гексаны 1:1, 2:1, 3:1 до 100% содержаний EtOAc) с получением целевого соединения.

Спектр ¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) : 7.34-7.17 (мультиплет, 5H), 6.31 (широкий синглет, 1H), 4.38 (широкий мультиплет, 1H), 3.96-3.92 (мультиплет, 1H), 3.79 (широкий мультиплет, 1H), 3.16 (двойной дублет, J = 13,6 и 4,4 Гц, 1H), 3.08-2.99 (мультиплет, 3H), 2.90-2.82 (мультиплет, 1H), 2.80 (двойной дублет, J=13.5 и 8.9 Гц, 1H), 2.78 (мультиплет, 1H), 2.67-2.61 (мультиплет, 1H), 2.58-2.49 (мультиплет, 1Н), 2.38-2.32 (мультиплет, 1H), 2.32-2.04 (мультиплет, 1H), 1.99-1.92 (мультиплет, 1H), 1.45 (синглет, 9Н), 1.29 (синглет, 9H).

Стадия 8: Получение 2(R)-фенилметил-4(S)-(трет.- бутилдиметилсилилокси)-5-(1-(4-(1,1-ди- метилэтоксикарбониламино)))-2(S)-N-(трет. - бутилкарбоксамидо)-пиперазинил)-пентанамида.

К 25,50 г (52,50 ммоля) дигидро-5(S)-(4-(1,1-диметил- этоксикарбониламино))-2(S)-N-(трет. - бутилкарбоксамидо)пиперазанил)-метил-3(R)-фенилметил-3(2Н)- фуранона, растворенного в 120 мл ДМФ, охлажденного до 0^oC, добавляли раствор 60 мл воды и 1,512 г (63,01 ммоля) гидроксида лития. Через 0,5 часа реакцию прекращали добавлением 10% HCl до pH 6 и раствор концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в 50 мл воды и экстрагировали EtOAc (4 х 75 мл) и органические слои промывали водой (1 х 20 мл), рассолом (1 х 20 мл). Водный слой подвергали обратной экстракции EtOAc (2 х 75 мл) и объединенные органические слои сушили над MgSO₄ и концентрировали с получением желтого твердого вещества. Такой сырой продукт растворяли в 100 мл ДМФ и добавляли 17,87 г (0,262 моля) имидазола, охлаждали до 0^oC и затем добавляли 31,50 г (0,21 моля) хлористого трет.- бутилдиметилсилила. Полученную смесь перемешивали в течение часа при 0^oC и затем нагревали до комнатной температуры. Через 20 часов реакцию прекращали с помощью 10 мл метанола и реакционную смесь концентрировали до половины объема. Добавляли 100 мл забуференной воды с pH 7 и водный слой экстрагировали EtOAc (4 х 100 мл), объединенные органические слои промывали 10% HCl (2 х 50 мл), водой (3 х 75 мл) и рассолом (1 х 50 мл), сушили над MgSO₄ и ко