Трансфекционная композиция для высших эукариотных клеток, комплекс нуклеиновой кислоты, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции, конъюгат, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции, эндосомолитический пептид, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции

Трансфекционная композиция для высших эукариотных клеток, комплекс нуклеиновой кислоты, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции, конъюгат, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции, эндосомолитический пептид, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции

Реферат

 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть применено для переноса нуклеиновых кислот в высшие эукариотные клетки. Охарактеризована трансфекционная композиция, содержащая комплекс нуклеиновой кислоты, вещества со сродством к нуклеиновой кислоте и эндосомолитический пептид. Использование изобретения позволит облегчить процесс введения нуклеиновых кислот в клетки. 4 с. и 71 з.п. ф-лы, 54 ил., 1 табл.

Изобретение относится к генной инженерии, более конкретно к трансфекционной композиции для высших эукариотных клеток, комплексу нуклеиновой кислоты и эндосомолитическому пептиду в качестве компонентов композиции, конъюгату в качестве компонента комплекса.

В особенности в терапии генами требуется эффективная система для введения нуклеиновой кислоты в живые клетки. Гены переводят в клетки с тем, чтобы достигнуть синтеза терапевтических активных генетических продуктов в живом организме, например, с целью замены дефектного гена в случае генетического дефекта. "Стандартные" терапии генами основаны на принципе достижения длительного лечения путем осуществления одного единственного приема. Однако также существует потребность в методах лечения, в которых терапевтически активную ДНК (или мРНК) дают в качестве лекарства ("терапевтического генного агента") раз или же в случае необходимости повторно. Примерами генетически вызываемых заболеваний, при которых терапия генами представляет многообещающий подход, являются гемофилия, -талласемия и "серозная комбинированная иммунная слабость", синдром, вызываемый генетически индуцированным отсутствием энзима деаминазы аденозина. Другой областью применения является иммунная регуляция, при которой гуморальный или внутриклеточный иммунитет обеспечивается дачей функциональной нуклеиновой кислоты, кодирующей выделяемый протеиновый антиген или не выделяемый протеиновый антиген, который можно рассматривать как вакцинацию. Другими примерами генетических дефектов, при которых можно давать нуклеиновую кислоту, кодирующую дефектный ген, например, в согласованной в каждом конкретном случае форме, включают мышечную дистрофию (ген дистрофина), фиброзно-кистозную дегенерацию (регуляторный ген трансмембранной проводимости висцидозы), гиперолестиролемию (ген рецептора липопротеина низкой плотности). Терапия генами также включает метод, согласно которому гормоны, факторы роста или белки цитотоксичной или проявляющей модуляцию иммунной системы активностью должны синтезироваться в теле.

Терапия генами также рассматривается как многообещающий метод лечения рака путем дачи так называемых "раковых вакцин". Для повышения иммуногенности опухолевых клеток раковым вакцинам сообщают либо большую антигенность либо способность к производству определенных веществ, способных к модуляции иммуносистемы, например, цитокинов, с тем, чтобы вызвать иммунную реакцию. Этот метод осуществляется путем трансфекции клеток ДНК, кодирующей цитокин, например, IL-2, IL-4, -интерферон, -фактор опухолевого некроза. Вплоть до настоящего времени введение гена в аутогенные опухолевые клетки осуществлялось через ретровирусные векторы.

Известна трансфекционная композиция для гепатоцитов, представляющая собой конъюгат поликатиона, обладающего способностью к модифицированию, например, полилисина, и гликопротеина, обладающего способностью к модифицированию, причем конъюгат связывается рецепторами на поверхности гепатоцитов (см. Г.И. Ву, С.Н. Ву, J. Biol. Chem. 263, 29, стр. 14621 - 14624, 1988).

Недостаток известной композиции заключается в том, что она может использоваться только для переноса нуклеиновых кислот в гепатоциты. Поэтому эксплуатационные возможности известной композиции ограничены.

Задачей изобретения является расширение эксплуатационных возможностей трансфекционных систем с помощью композиции, позволяющей перенос нуклеиновых кислот в высшие эукариотные клетки.

Под термином "перенос" понимается в рамках данного изобретения не только введение комплексов нуклеиновой кислоты в клетку через клеточную мембрану, но и транспорт выделяющихся из них комплексов или нуклеиновой кислоты внутри клетки до достижения подлежащего экспрессии подходящего сайта. Высшие эукариотные клетки общеизвестны. Они не включают дрожжей.

Множество вирусов входят в эукариотный хозяин на основании механизмов, которые в принципе соответствуют механизму эндоцитоза, осуществляемого с участием рецептора. Основанная на этом механизме вирусная инфекция обычно начинается с того, что частицы вируса связываются с рецепторами на клеточной мембране, после чего вирус входит вовнутрь клетки. Процесс захода вовнутрь клетки осуществляется тем же образом, что и заход физиологических лигандов или макромолекул в клетку. Сначала рецепторы на поверхности клетки классифицируют себя по группам и мембрана инвертируется во внутрь и образует везикулу, снабженную сетчатым покрытием. После того, как везикула освободилась от сетчатого покрытия, в ней имеет место окисление при помощи пропонного насоса в мембране. Это приводит к отделению вируса от ядрышка. В зависимости от того, снабжен ли вирус липидным покрытием или нет, возможны два вида отделения вируса от ядрышка. В случае так называемых "голых" вирусов (таких, как, например, аденовирус, полиовирус, риновирус) полагалось, что низкое значение pH вызывает изменение конфигурации белков вируса, что приводит к разделению гидрофобных доменов, которые не доступны при физиологическом значении pH. Таким образом эти домены приобретают способность к взаимодействию с мембраной ядрышка и тем самым обуславливают отделение генома вируса от ядрышка и его заход в цитоплазму. Для вирусов с липидным покрытием (таких, как, например, вирусы везикулярного стоматита, вирус Semliki Forest, вирус гриппа) предполагают, что низкая величина pH модифицирует структуру или конфигурацию некоторых белков вируса, в результате чего имеет место слияние мембраны вируса с мембраной ядрышка. Вирусы, которые проникают в клетку с помощью этого механизма, имеют определенные молекулярные способности, которые сообщают им способность к разрушению мембраны ядрышка с тем, чтобы зайти в цитоплазму.

Другие вирусы, как, например, покрытые вирусы Sendai, вирус СПИДа и некоторые штаммы вируса лейкоза Молонея, или непокрытые вирусы SV40 и полиомы, не требуют низкого значения pH для проникновения в клетку. Либо они могут вызывать слияние с мембраной непосредственно на поверхности клетки (вирус Sendai, возможно вирус СПИДа), либо они способны к осуществлению механизмов по разложению мембраны клетки или прохода через нее. Предполагают, что вирусы, которые не зависят от конкретной величины pH, могут также использовать механизм эндоцитоза. Исходной точкой решения проблемы изобретения являлось использование механизма, по которому некоторые вирусы проникают в эукариотные клетки с тем, чтобы достичь эффективной передачи комплексов нуклеиновой кислоты в клетку и тем самым повышения экспрессии.

В рамках данного изобретения неожиданно было найдено, что определенные агенты (например, вирусы, компоненты вирусов или другие соединения), которые проявляют способность определенных вирусов к заходу в эукариотные клети, обеспечивают существенное повышение степени экспрессии нуклеиновой кислоты, вводимой в клетку в качестве части комплекса. Решение по изобретению является неожиданным из-за того, что ассортимент комплексов нуклеиновой кислоты, способных к проникновению в клетку, является очень широким.

Таким образом, данное изобретение относится к трансфекционной композиции для высших эукариотных клеток, включающей комплекс нуклеиновой кислоты и вещество со сродством для нуклеиновой кислоты, при этом она дополнительно содержит эндосомолитический агент в эффективном количестве.

Эндосомолитический агент представляет собой вещество, способное к поглощению клеткой и к переносу в цитоплазму содержащего ядрышек, в которых они находятся после захода в клетку. Такая способность эндосомолитического агента далее обозначается как "поглотительная функция". Эта поглотительная функция включает способность к активному включению клеткой, то есть при помощи зависящего от рецептора механизма эндоцитоза, либо к пассивному включению клеткой, то есть при помощи жидкой фазы или в качестве компонента комплекса нуклеиновой кислоты, и способность к разрушению ядрышек, которая обычно обозначается как эндосомолиз ядрышка.

Согласно одному варианту изобретения в качестве эндосомолитического агента используют вирус или компонент вируса. Далее вирус или компонент вируса обозначается как "свободный" вирус (компонент).

В рамках настоящего изобретения исследовалось действие повышающихся доз свободного аденовируса на степень передачи постоянного количества конъюгата-трансферина и полилизина в клетках HeLa с использованием в качестве репортерного гена люциферазы. Повышение степени передачи гена путем добавления свободного аденовируса достигло максимума 1 10⁴ частиц вируса на клетку, то есть числа, которое соответствует примерному числу рецепторов аденовируса на клетку HeLa. Повышение экспрессии люциферазы, которая составляет до 2000 раз по сравнению с экспрессией, достигаемой одним конъюгатом трансферина и полилизина, обусловлено большей дозой вируса. Другая серия опытов была направлена на выявление действия ограничения количеств комплексов конъюгата и ДНК в присутствии постоянной дозы свободного аденовируса. Было найдено, что поглощение клеткой аденовирусов привело к повышению степени передачи гена с помощью трансферина/полилизина в широких пределах количества ДНК. Максимальная интенсивность экспрессии гена, достигаемая при помощи комплекса коньюгата и ДНК, соответствовала интенсивности, достигаемой при 100 раз меньшем количестве ДНК в случае использования аденовируса для повышения эффективности трансфекции.

Действие эндовирусной инфекции на передачу гена исследовалось с применением как некомплексированной ДНК, так и комплексов ДНК и полилизина или конъюгата трансферина и полилизина. В этих экспериментах установлено, что аденовирусная инфекция не привела к существенному увеличению передачи некомплексированной ДНК во время трансфекции. В противоположность этому, передача ДНК в виде комплекса с полилизином или в виде комплекса с конъюгатом трансферина и полилизина в значительной степени улучшалась аденовирусной инфекции. Максимальное действие достигается в случае применения конъюгата трансферина и полилизина. Так как поликатионная часть конъюгата не только служит для связывания трансферина с ДНК, но и вызывает существенные структурные изменения внутри ДНК, эти эксперименты сначала не позволяли установить, являлось ли обнаруженное действие результатом улучшенного жидкостного транспорта конденсированной поликатионом ДНК или улучшенной вирусом доставки связанного с рецептором комплекса конъюгата и ДНК. Поэтому проводились опыты по связыванию и определению последовательности с тем, чтобы выявить причину обнаруженного действия. Связывание комплекса конъюгата трансферина и полилизина и ДНК или комплекса полилизина и ДНК при низкой температуре позволяла удаление избыточного комплекса в жидкой фазе перед инфекцией аденовирусом. Когда поступали указанным образом, отдача связанных с рецептором комплексов конъюгата трансферина и полилизина и ДНК значительно увеличивалась в результате добавления аденовируса. В случае применения комплексом полилизина и ДНК такого эффекта не наблюдалось. Таким образом то, что существенно улучшается, это заход ДНК с помощью способствующего рецептором механизма эндоцитоза.

Кроме того, проводился анализ специфичной функции аденовируса, который вызывает улучшенный перенос гена при помощи рецептора. Слабая термообработка вирионов не меняет их способность к связыванию с соответствующими клеточными мембранами, но влияет на их свойство разрушать ядрышка после поглощения клеткой.

Таким образом различные эффекты по связыванию вируса и заходу вируса в клетку можно было выявлять в отдельных экспериментах. При этом было также установлено, что термическая инактивация аденовирусов привела к полному уничтожению их способности к улучшению переноса гена при помощи рецептора в качестве посредника. Это позволяет предполагать, что вызываемое аденовирусами разрушение ядрышек является частью их механизма захода в клетку, который специфично обуславливает улучшение отдачи гена при помощи конъюгата трансферина или полилизина. Тот факт, что штамм дефектного в отношении репликации вируса мог обеспечивать улучшение экспрессии гена, подтверждает предположение о том, что этот феномен обусловлен не функцией репликацией, а поглотительной функцией вириона.

Для выяснения того, что улучшение экспрессии гена можно приписывать к возможной трансактивации введенного гена вирусом, проводились опыты с применением клеточной линии, которая по своей структуре способна к экспрессии гена люциферазы RSV-LTR. В этой клеточной линии аденовирусы не проявляют действия, тогда как в родительской клеточной линии, в которой ген был введен при помощи конъюгата трансферина и полилизина, наблюдалось существенное повышение экспрессии гена. Результаты этих опытов показывают, что аденовирус влияет на событие, которое имеет место до транскрипции, и что его улучшающее перенос гена действие проявляется не на уровне экспрессии гена, а на уровне переноса гена.

В рамках данного изобретения также проводились исследования, направленные на выявление действия свободного аденовируса на перенос гена при помощи конъюгатов трансферина и полилизина в подобранных клеточных линиях. Было найдено, что присутствие рецепторов трансферина на целевой клетке является необходимым, но недостаточным в каждом случае с тем, чтобы обеспечить перенос гена при помощи конъюгата трансферина и полилизина. Предполагают, что специфичные у клетки факторы, относящиеся к результату находящихся в ядрышке комплексов конъюгата и ДНК, представляют собой крайне важный определяющий фактор для уровня передачи гена, достигаемого указанным путем. В этом отношении проводились опыты на подобранных клеточных линиях, направленные на исследование как переноса гена при помощи конъюгатов трансферина и полилизина, так и улучшение переноса гена при помощи аденовирусов. Клетки клеточной линии мукофисцидоза (CFT1) показывали небольшой уровень экспрессии гена люциферазы после обработки комплексами ДНК и конъюгата трансферина и полилизина. Этот уровень экспрессии существенно повысился в результате обработки адновирусом d1312. В противоположность этому клетки KB, обработанные комплексами ДНК и конъюгата трансферина и полилизина, показывали уровень экспрессии гена люциферазы лишь немного выше уровня фона, несмотря на присутствие рецептора трансферина. Однако в результате обработки аденовирусом d1312 сразу же обнаруживалась активность люциферазы в этих клетках. Обработка аденовирусами клеток HeLa имела подобный эффект, хотя этот эффект был значительно сильнее в этих клетках. Так как клетки HeLa и KB обладают примерно тем же числом рецепторов для аденовируса, различие в улучшении переноса гена может быть обусловлено числом рецепторов для трансферина, характерным для каждого типа клеток. В явную противоположность этим результатам клеточные линии WI-38 и MRC5), которые, как известно, лишь слабо поддерживают аденовирусную инфекцию, показывали в присутствии d1312 лишь незначительное улучшение экспрессии гена после обработки комплексом ДНК и конъюгата. Поэтому обработка свободным вирусом, например, аденовирусом, очевидно приводит к улучшению переноса гена при помощи комплексов ДНК и конъюгата в таких случаях, где перенос гена возможен за счет осуществляемого в присутствии рецептора в качестве посредника эндоцитоза, как, например, в случае клеток CFT1, а также в некоторых случаях, где перенос гена этим путем оказывается неэффективным, как, например, в случае клеток HeLa и КВ. Уровень достигаемого улучшения значительно меняется среди различных целевых клеток, так что можно предполагать, что этот эффект является функцией как числа рецепторов вируса, например, рецепторов аденовируса, у определенной клетки, так и числа рецепторов трансферина.

В случае применения свободного вируса вещество со сродством для нуклеиновой кислоты, предпочтительно органический поликатион, предпочтительно связано с фактором, содействующим поглощению клеткой. Однако в рамках данного изобретения было также найдено, что ДНК в виде комплекса с одним веществом со сродством для нуклеиновой кислоты, то есть без содействующего поглощению клеткой фактора, в определенных условиях может вводиться в клетку в присутствии свободного вируса. Кроме того, было найдено, что в случае некоторых клеточных линий комплексы, состоящие из нуклеиновой кислоты и вещества со сродством для нуклеиновой кислоты, могут вводиться через жидкую фазу при условии достаточно высокой концентрации комплекса. Опыты, которые проводились в рамках данного изобретения, показывали, что существенным признаком для поглотительной способности комплексов нуклеиновой кислоты является их компактность, которую можно приписывать к конденсации нуклеиновой кислоты веществом со сродством для нуклеиновой кислоты. Если вещество со сродством нуклеиновой кислоты имеет достаточную способность к связыванию с поверхностью клетки с тем, чтобы проникнуть в клетку вместе с вирусом, а также к сообщению комплексу в основном больной электронейтральности и конденсации нуклеиновой кислоты до компактной структуры, то может отпадать необходимость в улучшении способности к проникновению в клетку за счет ковалентного связывания содействующего поглощению клеткой фактора с веществом со сродством для нуклеиновой кислоты с тем, чтобы обеспечить перенос комплекса в клетку при помощи эндоцитоза, осуществляемого в присутствии рецептора в качестве посредника. Много клеток проявляет относительно большое сродство для определенных веществ со сродством для нуклеиновой кислоты, так что конъюгаты нуклеиновой кислоты и факторы связывания переносятся в клетку без потребности в наличии содействующего поглощению клеткой фактора. Это является действительным, например, для гепатоцитов, которые поглощают комплексы ДНК и полилизина.

Согласно предпочтительному варианту изобретения в качестве эндосомолитического агента используют вирус, связанный с веществом со сродством для нуклеиновой кислоты и имеющий способность к заходу в клетку в качестве части комплекса конъюгата и нуклеиновой кислоты и к переносу в цитоплазму содержимого ядрышек, в котором комплекс находится после захода в клетку.

Согласно другому предпочтительному варианту изобретения в качестве эндосомолитического агента используют компонент вируса, связанный с веществом со сродством для нуклеиновой кислоты и имеющий способность к заходу в клетку в качестве части комплекса конъюгата и нуклеиновой кислоты и к переносу в цитоплазму содержимого ядрышек, в которых комплекс находится после захода в клетку. Вирусы и компоненты вирусов, которые связаны с доменом связывания нуклеиновой кислоты, далее обозначаются как "вирусные конъюгаты" (несмотря на тип связывания).

Вирусные конъюгаты, которые также являются объектом данного изобретения, содержат вирус или компоненты вируса в качестве интегральной части функционального конструкта. Они объединяют преимущества векторных систем на основе конъюгатов содействующего поглощению клеткой фактора с преимуществами, которые вирусы вносят в эти системы.

Кроме того, вирусные конъюгаты согласно изобретению имеют то преимущество, что в отличие от известных конъюгатов, которые можно применять для переноса генов при помощи эндоцитоза в присутствии рецепторов в качестве посредника, они обладают специфичным механизмом, обеспечивающим их выделение из системы везикул клетки.

Векторная система, использующая вирусные конъюгаты, представляет собой качественно новый подход по сравнению с рекомбинантными вирусными векторами, который заключается в том, что транспортируемая чужеродная ДНК находится на наружной стороне вириона. Следовательно, вирусные конъюгаты согласно изобретению могут транспортировать в клетку очень большие генные конструкты без каких-либо ограничений в части последовательности.

Пригодность вируса, который можно применять в качестве свободного или связанного вируса или части вируса в качестве вирусного компонента в рамках данного изобретения, определена вышеупомянутой поглотительной функцией. Подходящими вирусами являются, например, такие вирусы, которые способны к заходу в клетку при помощи эндоцитоза в присутствии рецептора в качестве посредника во время трансфекции клеток комплексом нуклеиновой кислоты и к осуществлению своего выделения и тем самым выделения нуклеиновой кислоты из ядрышка в цитоплазму. Такими вирусами являются те вирусы, которые упоминаются в рамках данной заявки, а также другие вирусы, способные к поглощению определенной клеткой, и те вирусы, которые могут осуществлять выделение содержимого ядрышка в цитоплазму.

Восприимчивость клеточной линии к трансформации вирусом в качестве средства содействия заходу конъюгата в качестве "свободного вируса" зависит от присутствия и числа рецепторов на поверхности целевой клетки.

В число подходящих вирусов входят такие вирусы, которые способны к проникновению в клетку при помощи эндоцитоза в присутствии рецептора в качестве посредника во время трансфекции клеток комплексом нуклеиновой кислоты и к осуществлению своего выделения и тем самым выделения нуклеиновой кислоты из ядрышка в цитоплазму. Без претензий в части этой теории можно сказать, что в случае применения свободного вируса эта активность эндосомолиза могла бы оказать благотворное влияние на переносимый в клетку комплекс нуклеиновой кислоты, заключающееся в том, что эти комплексы транспортируются вместе с вирусами из ядрышка в цитоплазму, при этом предполагают, что они заходят в эти ядрышка, что и вирусы. Если комплексы содержат вирус в связанном виде, то они получают пользу от эндосомолитической активности вируса и транспортируются из ядрышек в цитоплазму. Этим достигается слияние между ядрышками и лизосомами и таким образом энзиматическая деградация, которая обычно имеет место в этих органеллах клетки.

В частности вирусами, которые пригодны для осуществления изобретения и поглотительная функция которых в начале инфекции осуществляется за счет эндоцитоза в присутствии рецептора в качестве посредника, являются вирусы без липидного покрытия, такие, как, например, аденовирус, полиовирус, риновирус, а также вирусы с оболочкой, такие как, например, вирус везикулярного стоматита, вирус Semliki Forest, вирус гриппа. Подходящими являются также зависящие от pH штаммы вируса Молонея. В частности, предпочитаются вирусы из группы, включающей аденовирус, подгруппу С, тип 5, вирус Semliki Forest, вирус везикулярного стоматита, полиовирус, риновирусы и вирус лейкоза Молонея.

Применение в рамках данного изобретения вирусов РНК, которые не имеют обратную транскриптазу, имеет то преимущество, что трансфекция в присутствии такого вируса не приводит к образованию вирусной ДНК в трансфектированной клетке. В результате опытов по изобретению было выявлено, что риновирус HRV2, представитель групп пикорнавируса, проявляет повышенную экспрессию репортерного гена. Эффективность риновируса проявлялась как в свободной форме, так и в виде конъюгатов.

В рамках данного изобретения под термином "вирус "(при условии, что он поглощается клеткой и высвобождает содержимое ядрышек, в которые он заходит) понимаются в дополнение к диким типам мутанты, которые в результате одной или больше мутаций потеряли определенные функции дикого типа (отличные от поглотительной функции), в частности способность к репликации.

Мутанты образуются в процессах обычного мутагенеза за счет мутаций в белковых областях, которые ответственны за репликационные функции и которые могут дополняться упаковочной линией. В случае аденовируса такими мутантами являются ts-мутанты (термочувствительные мутанты), мутанты Е1А и Е1В, мутанты, которые показывают мутации в стимулированных MLP генах, и мутанты, которые проявляют мутации в областях определенных капсидных белков. Также подходящими являются вирусные штаммы, которые имеют соответствующие естественные мутации. Способность вирусов к репликации можно исследовать известными из литературы методами. Так, например, на культуры клеток подают суспензии с различными концентрациями вируса и число растворенных клеток, которые можно видеть в виде пятен, регистрируют.

Другими вирусами, которые можно применять в рамках данного изобретения, являются так называемые дефектные вирусы, то есть вирусы, которые не обладают функцией, требуемой для автономной репликации вируса в одном или больше генах, для которых они требуют наличие вируса-помощника. Примерами такого типа вируса являются дефектные интерферирующие частицы, которые являются производными инфекционного стандартного вируса, имеют те же структурные белки, что и стандартный вирус, имеют мутации и нуждаются в стандартном вирусе в качестве вируса-помощника для осуществления репликации. Примерами такой группы вируса также являются сателлитные вирусы. Другой группой является класс парвовирусов, которые обозначаются как аденоассоциированные вирусы.

Так как циклы проникновения в клетки многих вирусов полностью не характеризованы, по-видимому, есть и другие вирусы, которые будут проявлять эндосомолитическую активность, требуемую для их пригодности в рамках данного изобретения. В рамках данного изобретения также пригодны живые вакцины или вакцинальные штаммы.

Под термином "вирус" понимаются в рамках данного изобретения и инактивированные вирусы, например, вирусы, инактивированные химической обработкой, такой, как, например, обработка формальдегидом, облучение УФ-лучами, химическая обработка в сочетании с облучением УФ-лучами, например, обработка псораленом и облучение УФ-лучами, облучение -лучами, бомбардировка нейтронами. Инактивированные вирусы, например, такие, которые также применяются для вакцин, можно получать известными из литературы методами, после чего их можно исследовать на пригодность повышения переноса комплексов ДНК. В рамках данного изобретения проводились опыты, в которых препараты аденовируса инактивировались при помощи стандартной УФ-стерилизационной лампы или обработкой формальдегидом. При этом неожиданно было найдено, что степень инактивации вирусов намного повышает степень снижения переноса гена, который достигается при добавлении аденовируса к среде трансфекции. В этих опытах применялись препараты инактивированного обработкой псораленом и облучением УФ-лучами биотинированного аденовируса, связанного с полилизином, связанным с стрептавидином. Эти опыты показывали, что инактивация привела к снижению титра вируса, который значительно превышает снижение способности к переносу гена. Это является четким указанием на то, что механизмы, связанные с нормальной репликацией в активном вирусе, можно разрушать без отрицательного влияния на эффект, необходимый для переноса гена.

Под термином "компоненты вируса" подразумеваются части вирусов, например, белковая часть свободного от нуклеиновой кислоты (пустой капсид вируса, который можно получать рекомбинантными способами), белки, получаемые фракционированием, или пептиды, которые имеют эндосомолитические функции интактного вируса. Эти компоненты вируса можно получать синтетическим путем, либо пептидным синтезом, либо рекомбинантными способами в зависимости от их размеров. В результате опытов в рамках данного изобретения было установлено, что белки аденовируса, связанные через биотин/стрептавидин с полилизином, позволяют улучшение переноса гена. Примером фрагментов или белков, отличных от аденовируса вирусов, которые являются существенными для обеспечения включения клеткой, является гемагглютинин (HA) вируса гриппа. N-концевая последовательность подединицы НА2 гемагглютинина вируса гриппа является ответственной для выделения вируса из ядрышка. Было установлено, что пептиды, состоящие из 20 аминокислот этой последовательности, способны к слиянию липидных мембран и к их частичному разрушению. В рамках данного изобретения с успехом применялись аутентичные и модифицированные пептиды вируса гриппа. Другим примером являются белки оболочки ретровирусов, например, gp41 HIV или части таких белков.

Применение вирусов, которые как таковые способны к проникновению в клетки и таким образом действуют в качестве содействующего поглощению клеткой фактора, является дальнейшим аспектом данного изобретения.

Вирусы или компоненты вирусов, которые сами по себе не могут связаться с клеткой и проникать в нее, предпочтительно используются в качестве вирусных конъюгатов в соответствии с вышеприведенным определением. В результате связывания с доменом, связывающим ДНК, например, с поликатионом, вирусу или компоненту вируса сообщается большое сродство к молекулам ДНК, так что он образует комплекс с ними и переносится в клетку в качестве компонента комплекса нуклеиновой кислоты, которая также содержит конъюгат содействующего поглощению клеткой фактора и связывающий ДНК домен. Кроме достигаемого при этом эффекта переноса связывание вируса или компонента вируса со связывающим нуклеиновую кислоту доменом может также привести к улучшению его эндосомолитических свойств.

Путем подбора другого содействующего поглощению клеткой фактора практически любая высшая эукариотная клетка может трансфектироваться предлагаемой системой.

В результате простого скрининга можно определять, проявляет ли данный вирус или компонент вируса поглотительную функцию и можно ли ее применять для осуществления данного изобретения. Такой анализ, например, для исследования вируса на его пригодность в качестве свободного вируса, целевые клетки приводят в контакт с комплексом ДНК в присутствии или отсутствии вируса. Количество комплекса ДНК, которое переносится в цитоплазму, можно затем простым образом определять путем выявления маркерного генного продукта, например, люциферазы. Если присутствие вируса приводит к тому, что комплекс ДНК поглощается и вводится в цитоплазму на большем уровне чем без вируса, то это можно приписывать поглотительной функции вируса. Также возможно сравнивать уровень поглощения комплекса ДНК в присутствии исследуемого вируса с другим вирусом, о котором известно подходящая поглотительная функция, например, с подгруппой С, типом 5, аденовируса. Таким опытам можно также подвергать вирусные конъюгаты. В этих опытах можно также исследовать дополнительные параметры, такие, как, например, конъюгаты с различным содействующим поглощению клеткой фактором в различных количествах. Кроме того, специалист в данной области может без труда проводить такого вида опыты, в случае необходимости в сочетании с другими опытами, например, с опытами по определению утечки липосома, с тем, чтобы исследовать компоненты вируса и другие компоненты с потенциальной эндосомолитической активностью на их способность к улучшению экспрессии гена.

Если применяют интактные вирусы, то проводят опыты, направленные на выявление способности вируса к репликации. Эти опыты предпочтительно проводят параллельно с предварительными опытами, направленными на выявление способности вируса к улучшению переноса гена. Исследование на способность к репликации проводят известными методами, такими как, например, метод с образованием пятен, метод по определению цитопатогенного действия или метод по определению поздней экспрессии гена в случае цитопатогенных вирусов или вирусов, которые в значительной степени содействуют росту клеток-хозяев. Для других вирусов применяют специфичные для данного вируса методы, например, метод по определению гемагглютинации, или химико-физические методы, например с применением электронного микроскопа.

В рамках данного изобретения в качестве предпочтительных вирусов, в частности таких, которые применяются в качестве свободных вирусов, применяют вирусы, которые можно получать с высоким титром, которые устойчивы, имеют низкую патогенность в нативном состоянии и, в случае необходимости позволяют упразднение способности к репликации. В частности предпочитаются аденовирусы. Если трансфекции подлежит специфичная клеточная популяция, то можно применять вирусы, которые проявляют специфичную способность к этой популяции. Если трансфекции подлежат различного типа клетки, то можно применять вирусы, которые являются инфекционными для широкого круга клеток.

Требования к композициям свободного вируса в основном заключаются в том, что вирус должен иметь наибольшую чистоту и что следует применять стабилизирующий буфер, выбираемый с учетом данного вируса.

В любом случае согласно изобретению можно применять только такие вирусы или компоненты вирусов, у которых риск безопасности является как можно минимальным, в частности риск репликации вируса в целевой клетке и рекомбинации вирусной ДНК с ДНК хозяина.

Преимущественно использовать механизм проникновения в клетки вирусов, инфицирующих животных по-другому, чем людей, для улучшения поглощения и переноса ДНК в высшие эукариотные клетки, в частности людей, пока вирус проявляет активность по разрушению ядрышка в высших эукариотных клетках. Члены семейства аденовирусов были выделены из птиц, амфибий и ряда других животных. Аденовирусы из птиц, амфибий, крупного рогатого скота, собак, мышей, овец, свиней и обезьян, а также аденовирусы человека можно получать от американской коллекции типовых культур в городе Роквиль в штате Мариленд.

Одно возможное преимущество применения вируса, например, аденовируса, из редкого вида может заключаться в уменьшенной токсичности в целевых клетках (например, от аденовируса куриц или лягушек нельзя ожидать репликации или раннего инициирования экспрессии гена в клетках млекопитающих), уменьшенной опасности для лица, занимающегося получением редкого аденовируса, по сравнению с аденовирусом человека, и уменьшенной интерференции в целевом организме от антител против аденовируса человека или мышей. Отсутствие интерференции антителами человека или мышей является особенно важным при применении вирусов в генной терапии на людях и мышах.

Крупный аденовирус CELO не проявляет реактивности в отношении антител, которые распознают основную группу эпитопов аденовирусов, инфицирующих клетки млекопитающих. Кроме того, аденовирус CELO можно выращивать в оплодотворенных яйцах с получением высокого выхода (0,5 мг/яйцо). В экспериментальной части показывается, что конъюгаты CELO и полилизина улучшают перенос ДНК в клетки HeLa, на уровне, который можно сравнивать с уровнем, достигаемым при применении аденовируса d1312 человека. Таким образом, применение конъюгатов CELO для улучшения транспорта ДНК можно рассматривать как многообещающий подход в экспериментах по генной терапии на людях. Вирусы редких видов предпочтительно используются в качестве компонентов вирусных конъюгатов в комбинированных комплексах согласно изобретению.

Связывание вируса со связывающим нуклеиновую кислоту доменом в вируссодержащих конъюгатах согласно изобретению может быть ковалентным или же нековалентным, например, при помощи биотино- стрептавидинового мостика. Возможно также ионное связывание в случае вируса с кислыми участками в поверхностных белках, что позволяет связь с поликатионом.

В рамках данного изобретения образовались комплексы в условиях, позволяющих ионное взаимодействие между аденовирусом и полилизином до образования комплекса с ДНК. При этом также проводились контрольные опыты в условиях, в которых полилизин сначала нейтрализуют ДНК и поэтому он не может