Производные фактора ингибирования липогенеза и их получение

Производные фактора ингибирования липогенеза и их получение

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Полипептид, являющийся производным фактора, ингибирующего липогенез у человека, получают рекомбинантным способом или расщеплением трипсином. У данного полипептида отсутствуют от 1 до 9 N-концевых аминокислот. Получают вектор экспрессии, содержащий Agif. Данным вектором трансформируют хозяйские клетки. культивируют хозяйские клетки в условиях, разрешающих экспрессию указанного производного Agif. Выделяют указанное экспрессируемое производное Agif из культуры. Слитый белок содержит Аgif с делецией от 1 до 9 аминокислот N-конца, слит с белком, связующим мальтозу. Конструируют вектор экспрессии, содержащий ДНК-последовательность, кодирующую слитый белок. Трансформируют соответствующие хозяйские клетки указанным вектором. Культивируют хозяйские клетки в условиях, разрешающих экспрессию указанного слитого белка. Обрабатывают культуру ферментом, способным расщеплять экспрессируемый слитый белок в специфическом сайте. Выделяют целевой продукт из культуры. Изобретение позволяет получить ингибитор дифференциации адипоцитов, а также новые полипептиды, имеющие активность зрелого Аgif. 6 с. и 6 з.п.ф-лы, 6 ил.

Настоящее изобретение относится к новым производным действующего начала (фактора), ингибирующего липогенез (Agif), также, как и к способам их получения и к их применению. Оно относится также к применению некоторых известных производных Agif.

Agif представляет собой протеин, который, как было показано, ингибирует дифференциацию предадипоцитов в адипоциты. Протеин, который иначе известен как интерлейкин 11 (IL- 11), выделен из стромальной клетки линии KM-102, которая получена из костного мозга человека (Последовательность ID N 4, Kawashima et al. , FEBS Letters, 283 (1991) 13-16). Показано, что выделенный протеин ингибирует дифференциацию предадипоцитной клетки линии H-I/A, которая получена из костного мозга мыши, в адипоциты.

Заявка по договору о патентной кооперации (РСТ) ВОИС 92/13955, опубликованная позднее самой ранней даты приоритета настоящей заявки, описывает слитый протеин между тиоредоксином и производным IL-11 (Agif), в котором происходит делеция N-концевого остатка пролина IL-11. В этой заявке не обсуждается ни производное Agif само по себе, ни активность этого соединения.

Известно, что все гемопоэтические клетки (т.е. клетки, вовлеченные в образование крови), например, эритроциты, нейтрофилы, моноциты, эозинофилы, базофилы, тромбоциты и лимфоциты, образуются из материнских клеток в костном мозге путем дифференциации, известной также как гемопоэз. Эти материнские клетки обычно более известны как полипотентные стволовые клетки. Известно, что гемопоэз и пролиферация полипотентных стволовых клеток регулируются различными гемопоэтическими факторами, а также взаимодействием от клетки к клетке (cell-to-cell) со стромальными клетками костного мозга. Примерами таких гемопоэтических факторов являются колониестимулирующие факторы, например, гранулоцит-макрофаговый колониестимулирующий фактор (GM-CSF), макрофаговый колониестимулирующий фактор (M-CSF) и гранулоцитный колониестимулирующий фактор (G-CSF). Гемопоэз обычно происходит в "гемопоэтической микросреде", как описано в Dexter and Spooncer, Ann. Rev. Cell. Biol. 3 (1987) 423-441.

Известно, что предадипоциты имеют поддерживающую функцию в гемопоэтической микросреде, но когда они дифференцируют в адипоциты, эта поддерживающая функция теряется [Hiroaki Kodama "SOSHIKI BAIYO (Tissue Culture)", 12 (1986) 191-195). Это демонстрируется с использованием мышиных предадипоцитных клеток линии PA 6. Эта клеточная линия способна поддерживать гемопоэз, но эта поддерживающая функция ослабевает, когда клетки PA6 дифференцируют в адипоциты (Kodama et al., Cell. Physiol., 118, (1984) 233-240).

Также известно, что культивированные клетки PA6 вместе с клетками костного мозга мыши, т.е. с полипотентными стволовыми клетками, будут приводить в результате к образованию колоний бластных клеток, колоний мегакариоцитов и колоний макрофагов (Hiroaki Kodama, "JIKKEN IGAKU (Eхperimental Medicine)", (1987) 826-830). Считают, что если Agif выделен из клеток костного мозга человека, такой протеин воздействует непосредственно на предадипоциты костного мозга, ингибируя их дифференциацию и позволяя таким образом предадипоцитам поддерживать гемопоэз полипотентных стволовых клеток костного мозга.

Кроме того, эксперименты показали, что предадипоцитные клетки линии H-I/A, которые получают из костного мозга, образуют колониестимулирующий фактор (GSF) - известный гемопоэтический фактор. Количество CSF, образованного предадипоцитами, уменьшается, когда они дифференцируют в адипоциты (Nakamura et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 179 (1985) 283-287).

Поэтому предполагается, что благодаря ингибированию дифференциации предадипоцитов в адипоциты, Agif допускает расширенное образование CSF предадипоцитами, за счет чего промотируется гемопоэз полипотентных стволовых клеток (Ohsumi et al., FEBS Letters, 288, (1991) 13-16).

Возрастание гемопоэза стволовых клеток действительно дает в результате возрастание образования клеточных элементов в крови. Поэтому ожидается, что ингибитор липогенеза будет иметь практическое значение при лечении состояний, в которых снижается число кровяных клеток, по любой причине. Примеры таких состояний включают цитопению (т.е. уменьшение клеточных элементов в крови или в других тканях, возникающее при каком-либо заболевании) и анемию. Кроме того, ингибирование липогенеза будет приводить в результате к уменьшению числа адипоцитов, или жировых клеток, поэтому предполагается, что ингибиторы липогенеза будут иметь значение для лечения таких состояний, как ожирение.

Принимая во внимание преимущества, которые достигаются благодаря ингибированию дифференциации предадипоцитов в адипоциты, существует необходимость в дальнейших разработках таких ингибиторов липогенеза.

Краткое изложение сущности изобретения Следовательно, целью настоящего изобретения является предложить ингибитор дифференциации адипоцитов.

В частности, целью настоящего изобретения является предложить полипептиды, имеющие активность зрелого Agif.

Настоящее изобретение предлагает в качестве новых соединений человеческий полипептид, выбранный из группы, состоящей из производного фактора, ингибирующего липогенез человека, в котором недостает от 2 до 9 N-концевых аминокислот, его функционально эквивалентных производных и его предшественников.

Изобретение также предлагает фармацевтическую композицию для лечения или профилактики цитопении, или для лечения или профилактики паталогического ожирения, и эта композиция содержит эффективное количество соединения, противодействующего цитопении или паталогическому ожирению, в смеси с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем, и упомянутое противодействующее цитопении или паталогическому ожирению соединение представляет собой человеческий полипептид, выбираемый из группы, состоящей из производного фактора, ингибирующего липогенез человека, в котором недостает от 1 до 9 N-концевых аминокислот, его функционально эквивалентных производных и его предшественников.

Изобретение также предлагает способ лечения или профилактики цитопении, или лечения паталогического ожирения у млекопитающего, которое может быть человеком, и этот способ включает введение эффективного количества соединения, противодействующего цитопении или патологическому ожирению, упомянутому млекопитающему, и упомянутое соединение, противодействующее цитопении или паталогическому ожирению, представляет собой человеческий полипептид, выбираемый из группы, состоящей из производного фактора, ингибирующего липогенез человека, в котором недостает от 1 до 9 N-концевых аминокислот, его функционально эквивалентных производных и его предшественников.

Настоящее изобретение также предлагает нуклеотидные последовательности, кодирующие эти полипептиды, векторы, включающие такие нуклеотидные последовательности, и клетки-хозяев, трансформированные такими нуклеотидными последовательностями или векторами, а также способы получения таких полипептидов. Такие варианты осуществления изобретения подробнее описаны далее.

Краткое описание рисунков При дальнейшем описании настоящего изобретения при необходимости будут делаться ссылки на прилагаемые рисунки.

На фиг. 1 показаны результаты вестерн-блоттирования ограниченного расщепления (переваривания) трипсином завершенной формы Agif.

Фиг. 2 демонстрирует биологическую активность супернатанта культуры клеток COS-I, обработанных трипсином.

Фиг. 3 представляет схему получения плазмиды M13 mp19 (20-2) , содержащей кДНК, кодирующей завершенный Agif (последовательность ID N 9, последовательность ID N 10, последовательность ID N 13).

Фиг. 4 изображает основную последовательность вблизи участка (сайта) рестрикции StuI M13 mp19 (20-2) (последовательность ID N 12, последовательность ID N 13).

Фиг. 5 представляет собой диаграмму экспрессии плазмиды pMAL -c-20-2 Pro, содержащей последовательность Agif Pro (последовательность ID N 14, последовательность ID N 15).

На фиг. 6 проводится сравнение ДНК-последовательностей, содержащихся в M13 mp19 (20-2) и M13 mp19 (20-2) Pro (последовательность ID N 18, последовательность ID N 19).

На фиг. 1 проход (Iane) 1 относится к супернатанту культуры необработанных клеток COS-I, проход 2 относится к супернатанту культуры клеток COS-I, обработанных трипсином, и проход 3 относится к супернатанту культуры клеток COS-I, в которых реакция остановлена ингибитором трипсина вслед за обработкой трипсином. Величины молекулярно-массовых маркеров указаны с правой стороны.

На фиг. 2 сплошная полоса относится к супернатанту культуры клеток COS-I, трансфектированных негативной управляющей плазмидой (pcDL-SR 296), полоса, заштрихованная пунктиром , относится к тому случаю, когда к супернатанту культуры клеток COS-I, трансфектированных pcDL-SR 296, добавлен ингибитор трипсина, заштрихованная полоса представляет супернатант культуры клеток COS-I, трансфектированных pSR -20-2, и полоса, заштрихованная косыми линиями , представляет супернатант культуры клеток COS-I, трансфектированных pSR -20-2, в который добавлен ингибитор трипсина. Чистая полоса представляет супернатант культуры, к которой ингибитор трипсина добавлен вслед за обработкой трипсином супернатанта культуры клеток COS-I, трансфектированных pSR -20-2.

Активность липопротеина липазы (LPL) выражается в процентах, причем за 100%-ную активность принимается величина, получающаяся в результате добавления среды Дульбекко, модифицированной средой Игла, без образца.

Подробное описание изобретения Полипептиды настоящего изобретения предпочтительно выбирают из группы, состоящей из полипептидов, содержащих аминокислоты 3-178 и до аминокислот 10-178 с последовательность ID N 2 (см. в конце текста описания) их эквивалентов, мутантов и вариантов, их предшественников и их производных.

В качестве иллюстрации вышесказанного настоящее изобретение предлагает производные Agif, причем в каждом производном недостает специфических аминокислот N-концевой зрелой формы Agif. Из представленной выше последовательности можно видеть, что настоящее изобретение предлагает производные Agif, имеющие последовательности, включающие аминокислоты с номерами с 3 по 178, с 4 по 178, с 5 по 178, с 6 по 178, с 7 по 178, с 8 по 178, с 9 по 178 и с 10 по 178 вышеприведенной последовательности, а также их эквиваленты, мутанты, производные и варианты, и их предшественников.

Полипептиды настоящего изобретения, таким образом, содержат в своей активной форме от 169 до 176 аминокислотных остатков. Полипептиды настоящего изобретения имеют приблизительную молекулярную массу в области от 22000 до 23000 дальтон, при измерении с помощью электрофореза в системе додецилсульфат натрия - полиакриламидный гель в условиях восстановления.

Настоящее изобретение предлагает производные Agif, как описано выше, а также их функционально эквивалентные производные и их предшественников.

Использованные здесь термины "функционально эквивалентные производные" и "эквиваленты" означают любое производное Agif настоящего изобретения, в котором одна или более аминокислот из последовательности модифицированы либо искусственно, либо естественным путем, и в котором модифицированный полипептид еще сохраняет по крайней мере значительную часть биологической активности немодифицированного производного. Биологическая активность полипептидов настоящего изобретения подробнее описана далее. Коротко, такая биологическая активность включает одно или все из следующих положений: способность подавлять активность липопротеина липазы адипоцитов, способность индуцировать образование колониестимулирующего фактора предадипоцитами, способность промотировать образование антител B-клетками, способность промотировать образование колоний мегакариоцитов и тромбоцитов и способность уменьшать G_o-фазу гемопоэтических стволовых клеток.

Вообще, следует принять во внимание, что активность любого данного протеина зависит от некоторых сохранившихся участков молекулы, пока другие участки имеют небольшое значение, связанное с их конкретной последовательностью, и может быть совершенно или полностью избыточной. Соответственно, настоящее изобретение включает также любые варианты или мутанты с последовательностью производного Agif, которые еще сохраняют достаточную активность Agif-типа. Такие варианты и мутанты включают, например, делеции, присоединения, вставки, инверсии, дупликации и типа замещения (например, замещение одного гидрофильного остатка на другой, за исключением, как правило, того случая, когда остаток является сильно гидрофильным или сильно гидрофобным). Небольшие изменения обычно будут иметь небольшое действие на активность, тем не менее, они являются существенной частью молекулы и могут представлять побочный продукт генетического воздействия. Примеры таких небольших изменений включают генерацию дополнительных сайтов рестрикции, как желательных. Следует принять во внимание, что кодирующая последовательность для полипептидов настоящего изобретения может быть модифицирована любым желательным способом, при условии, что при этом отсутствует вредное воздействие на активность образующегося полипептида. Местные мутации и другие изменения могут быть осуществлены, например, для того, чтобы содействовать генетической манипуляции, путем добавления или делеции сайтов рестрикции, или иным способом, чтобы увеличить или модифицировать молекулу.

Например, уже известно, что во многих полипептидах остатки цистеина могут быть превращены в остатки серина без существенной потери активности. Это продемонстрировано по отношению к интерлейкину 2 (IL - 2) в Wang et al., Science 224 (1984) 1431-1433.

Варианты производных Agif настоящего изобретения включают встречающиеся в природе производные Agif, которые разделяют последовательность зрелого Agif при нехватке от 2 до 9 N-концевых остатков аминокислот, но которые, как ожидается, разнятся с ними до некоторой степени в пределах широкой совокупности. В рамках этого определения лежат аллельные вариации и пептиды других видов, показывающие подобный тип активности и имеющие родственную последовательность.

Предшественники Agif производных настоящего изобретения включают, например, предшественников, имеющих N-концевые заместители, а также слитые белки. N-концевые заместители, предпочтительно, выбираются таким образом, чтобы быть расщепленными, разложившимися или удаленными иными способами до или по достижении места назначения (мишени) в теле. Такие заместители могут самопроизвольно разлагаться или расщепляться в телесной среде, например, вследствие изменения pH или концентрации ионов и т.д., или они могут быть активно расщеплены при воздействии, например, ферментов или до, или после введения.

Подходящие N-концевые заместители включают лидирующие последовательности и группы, такие как сложноэфирные, а также остатки метионина или формилметионина.

Заместители, такие как лидирующие последовательности, а также слитые белки, в основном будут представлять собой побочные продукты любой системы экспрессии, использованной для получения производного Agif. Такие лидирующие последовательности или слитые белки будут нормально расщепляться в системе экспрессии, но, альтернативно, они могут расщепляться в теле, например, в месте назначения. Такие последовательности имеют склонность обслуживать не конкретную функцию, касающуюся активности производных Agif, но скорее имеют склонность быть преимущественно вовлеченными в экспрессию полипептида.

В настоящем изобретении, где используется лидирующая последовательность, может оказаться подходящим использование лидирующей последовательности, встречающейся в природе, например, такой, которая иллюстрируется аминокислотами с номерами с -21 до 0 в вышеупомянутой последовательности (последовательность ID N 2). Однако, может быть использована любая подходящая последовательность, особенно если она разработана для данной системы экспрессии.

Производное Agif настоящего изобретения может быть получено в виде слитого белка, что желательно, и обычно в качестве вспомогательного средства в экспрессии полипептида. Такие слитые белки обычно расщепляются в системе экспрессии или самопроизвольно, или после добавления, например, подходящего фермента, что приводит в результате к образованию производного Agif. Выбор партнера для слияния не существеннен для настоящего изобретения, но имеется некоторая тенденция к зависимости его от выбора системы экспрессии. Так, для экспрессии в некоторых прокариотических клетках, таких как Е. coli, что далее дается в качестве примера, может оказаться подходящим использование протеина, связывающего мальтозу, или его производного, в качестве партнера для слияния с производным Agif настоящего изобретения.

Предпочтительным полипептидом настоящего изобретения является полипептид, представленный последовательностью ID N 7 (см. в конце текста описания), а также его эквиваленты, мутанты, варианты и его предшественники, как упоминалось выше.

Настоящее изобретение также предлагает нуклеотидные последовательности, кодирующие все или часть производных Agif настоящего изобретения. Такие последовательности могут быть либо ДНК, либо РНК, и они могут быть получены стандартными техническими приемами, например, путем обратной инженерии полипептидной последовательности, как предлагается здесь; путем химического синтеза с применением триэфирфосфитного метода (Hunkapiller et al. Nature 310 (1984) 105-111) или путем синтеза кДНК, с применением фермента обратной транскриптазы, из матрицы РНК, полученной из клеток, экспрессирующих зрелый Agif, с последующей селекцией и амплификацией кДНК полимеразной пенной реакции (PCR), с использованием затравок для смысловых и антисмысловых цепей (нитей), полученных с применением кДНК-последовательности. Последовательность кДНК зрелого Agif описана в литературе (Kawashima et al. FEBS Letters 283 (1991) 199-202). Специалист в этой области техники должен уметь использовать эту опубликованную кДНК последовательность, например, при получении олигонуклеотидных затравок для использования в полимеразной цепной реакции, для того, чтобы получить последовательности, подходящие для применения в настоящем изобретении.

Следует принять во внимание, что любая данная, полученная обратной инженерией последовательность, не будет обязательно хорошо гибридизировать, или вообще, с любой данной комплементарной последовательностью, полученной обратной инженерией из того же самого пептида, благодаря вырождению (дегенерации) генетического кода. Это является фактором, распространенным в расчетах специалистов, и вырождение любой данной последовательности зачастую является настолько широким, что крайне затрудняет синтез даже короткой комплементарной олигонуклеотидной последовательности, чтобы она служила в качестве пробы для олигонуклеотидной последовательности, встречающейся в природе.

Вырождение кода является таковым, что, например, могут существовать четыре, или больше, возможных кодонов для часто встречающихся аминокислот. Соответственно, поэтому, можно видеть, что число возможных кодирующих последовательностей для любого данного пептида может возрастать экспоненциально с числом остатков в этом пептиде. По существу, следует принять во внимание, что число возможных кодирующих последовательностей для производных Agif настоящего изобретения может быть очень большим, и мало возможностей для выбора между последовательностями. Однако, может возникнуть необходимость принять в расчет некоторые факторы, которые могут воздействовать на выбор кодирующей последовательности, например, выбор системы экспрессии и частоты использования кодона этой системой. Также может быть желательным сбалансировать содержание G+C последовательности, соответствующей интересующей системе экспрессии.

Отбор кодонов при конструировании нуклеотидной последовательности может быть осуществлен, до некоторой степени, произвольно, и подходящие кодоны могут быть отобраны с использованием стандартных методов, таких, как методы, описанные в Grantham et al., Nucleic Acids ReS. 9 (1981) r43 - r47. Внимание должно быть уделено, например, частоте использования кодонов в конкретном хозяине.

Предпочтительную кодирующую последовательность выбирают из группы, состоящей из нуклеотидов с номерами 87-614 до нуклеотидов с номерами 108-614 последовательности lD N 1 (см. в конце текста описания), а также из их мутантов, вариантов и комплементарных последовательностей.

Настоящее изобретение, следовательно, включает нуклеотидные последовательности, которые включают нуклеотиды с числами 87-614, 90-614, 93-614, 96-614, 99-614, 102-614, 105-614 и 108-614 вышеупомянутой последовательности.

Термины "мутант" и "вариант", использованные выше, имеют те же значения, которые они имеют в связи с пептидной последовательностью mutatis mutandis. Изменение нуклеотидов в выбранных кодирующих последовательностях может быть осуществлено с использованием стандартных технических приемов, таких, например, как сайтовый специфический мутагенез. Такая техника, которая описана в Mark et al., P.N.A.S. 81 (1984) 5662-5666, включает использование праймера (затравки), составленного из синтезированных олигонуклеотидов, кодирующих желательное изменение.

Следует принять во внимание, что, пока мутант или вариант пептидной последовательности всегда будут отражаться в кодирующей нуклеотидной последовательности, обратный процесс не является обязательно истинным. Соответственно, может появиться возможность для нуклеотидной последовательности стать существенно измененной (например, как описано выше при рассмотрении дегенерации генетического кода) без воздействия на пептидную последовательность каким-либо путем. Вообще, известно, что такой полиморфизм демонстрируют гены эукариотов например, как это иллюстрируется геном интерферона (Nishi et al., J. Biochem. 97 (1985) 153-159). Полиморфизм может также существовать в зависимости от типа клетки, из которой происходит РНК. Такие мутанты и варианты входят в объем изобретения.

Настоящее изобретение также предлагает нуклеотидные последовательности, которые гибридизируют с последовательностью ID N 1, и предпочтительно такие последовательности должны показывать 50% избыток, предпочтительнее - 70%, и наиболее предпочтительно - 80%, гомологии с последовательностью, упомянутой выше.

Нуклеотидные последовательности настоящего изобретения предпочтительно, представляют собой последовательности ДНК. Такие последовательности могут использоваться одни, например, в качестве проб, но, как правило, предпочтительно, чтобы они образовывали часть системы экспрессии. Таким образом, предпочтительно, чтобы последовательность ДНК составляла часть вектора, подходящего для системы экспрессии.

Природа векторов для применения в соответствии с настоящим изобретением не является существенной для изобретения. Вообще, для специалистов вопрос о подходящих векторах, векторах экспрессии и их строении ясен.

Подходящие векторы экспрессии могут основываться на фагах или плазмидах, которые обычно являются специфическими хозяевами, хотя они часто могут быть сделаны для других хозяев. Другие подходящие векторы включают космиды и ретровирусы и любые другие носители, которые могут или не могут являться специфическими для данной системы. Регулирующие последовательности, такие как распознающие, стимуляторы, операторы, индукторы, терминаторы и другие последовательности, существенные и/или пригодные для регулировки или экспрессии, будут ясны для специалистов, и могут связываться с последовательностью природного Agif или с используемым вектором или могут образовываться из любого другого подходящего источника. Векторы могут быть модифицированы или сделаны любым подходящим способом.

Особенно подходящей нуклеотидной последовательностью, кодирующей производное Agif настоящего изобретения, является последовательность ID N 7 а (см. в конце текста описания) и ее мутанты, варианты и комплементарные последовательности, например, такие, как определено выше.

Настоящее изобретение также предлагает способ получения полипептида, о котором упоминалось выше, и этот способ включает получение носителя экспрессии, содержащего последовательность ДНК, кодирующую производное Agif, как упоминалось выше, трансфекцию соответствующей клетки-хозяина с упомянутым вектором, выращивание упомянутой клетки-хозяина в условиях, в которых возможна экспрессия упомянутого производного Agif, необязательную обработку культуры ферментом, способным расщеплять экспрессированное производное Agif в специфическом сайте, и выделение упомянутого экспрессированного производного Agif из культуры. Этот способ позволяет получать требуемое производное AG1F в промышленном масштабе, достигая как высокого выхода, так и высокой чистоты.

Вообще, существует ряд способов, которые можно использовать для получения пептида и нуклеотидных последовательностей настоящего изобретения.

В одном из вариантов осуществления изобретения встречающийся в природе пептид может быть получен обычным способом и переварен (расщеплен) для удаления желаемого числа аминокислот из N-концов. Такое переваривание может быть облегчено изменением нуклеотидной последовательности, чтобы создать сайт, такой как термо- или хладонеустойчивый, например, или распознаваемый остаток или последовательность в кодированном пептиде, где может быть осуществлено, например, химическое расщепление или ферментное расщепление. Подходящие пептидазы хорошо известны специалистам, и в иных случаях подходящим является использование трипсина.

Одним из подходящих способов получения полипептидов настоящего изобретения является получение ДНК, кодирующей зрелую форму Agif, с использованием способов, описанных в литературе [Kawashima et al., FEBS. Letters 283 (1991 199-202)] . На эту ДНК затем воздействуют такими техническими приемами, как мутагенез in vitro, для того, чтобы достичь последовательности ДНК, кодирующей желаемый полипептид, т.е., полипептид, который эквивалентен зрелому Agif, но в котором недостает от 2 до 9 N-концевых аминокислотных остатков. Образующаяся в результате последовательность затем может быть выражена непосредственно, или, напротив, слита с другой ДНК-последовательностью, таким образом, чтобы слитый белок являлся результатом экспрессии. Затем, чтобы получить желаемый полипептид, слитый белок может быть переварен стандартным образом, например, путем использования подходящего фермента. К числу партнеров для образования слитого белка с производным Agif настоящего изобретения относятся, например, любые полипептиды, которые включают распознаваемую для специфического энзима последовательность в C-конце. Одним из таких подходящих партнеров является протеин, связывающий мальтозу, или его производные. После образования слитого белка между протеином, связывающим мальтозу, и производным Agif настоящего изобретения и после добавления фактора коагуляции крови Xa слитый белок расщепляют и получают в результате желаемое производное AGIP.

Кодирующая ДНК для производного Agif настоящего изобретения может быть введена в подходящий вектор, и клетки-хозяева прокариотов и эукариотов затем могут быть трансформированы с таким вектором. Используя технические приемы, стандартные для технологии построения вектора и экспрессии протеина в клетке-хозяине, ДНК, кодирующая производное Agif, может быть выражена в клетках-хозяевах.

Культуры, пригодные для получения производных Agif настоящего изобретения, соответственно, могут быть культурами любых живых клеток и могут меняться от прокариотических систем экспрессии до эукариотических систем экспрессии.

Предпочтительные прокариотические хозяева включают, например, Escherichia coli u Bacillus subtilis. Для того, чтобы выразить ген-значения в этих клетках-хозяевах, клетки-хозяева трансформируются с носителем, содержащим ДНК-последовательность, которая выражается, например, вектором плазмиды. Этот вектор обычно будет содержать репликон, который является источником репликации, произведенной из видов, имеющих совместимость с хозяином, и регуляторные последовательности. Кроме того, желательно, чтобы вектор содержал последовательность, придающую селективность характеру экспрессии, или фенотипу, трансформированных клеток.

Выбор вектора и/или клетки-хозяина не является существенным для настоящего изобретения и этот выбор будет зависеть, как обсуждалось выше, от различных факторов. Вообще, мы считаем, что когда в качестве клетки-хозяина используется E. coli, широко доступная линия K12 является подходящей, в то время как в качестве векторов подходящими являются широко доступные плазмиды pBR322 и pUC.

Как обсуждалось выше, часто необходимо, или по крайней мере желательно, включать различные регулирующие последовательности, когда осуществляется экспрессия протеинов, таких как производные Agif настоящего изобретения. При использовании в качестве клетки-хозяина E. coli, подходящие промоторы включают триптофановый промотор (trp), лактозный (lac) промотор, триптофан-лактозный (tac) промотор, липопротеиновый (lpp) промотор, происходящий от бактериофага лямбда ( ) P_L промотор и промотор - фактор T_U, удлиняющий (extending) полипептидную цепь (tufB). Любой из этих промоторов может быть использован при получении производных Agif настоящего изобретения.

При использовании в качестве клетки-хозяина B. subtilis мы обычно предпочитаем применять широко доступную линию 207-25. Подходящим вектором для использования с этой клеткой-хозяином является pTUB228, описанная в Ohmura et al. in J. Biochem. 95 (1984) 87-93. В качестве промотора в этом векторе часто используется регуляторная последовательность -амилазного гена B. subtilis. Если желательна экспрессия вне клетки, т.е., если полипептид должен быть выделен из клетки, кодирующая последовательность ДНК для сигнальной последовательности -амилазы может быть связана с кодирующей последовательностью производного Agif с использованием стандартных технических приемов.

Эукариотические клетки, которые могут быть использованы для экспрессии полипептидов настоящего изобретения, включают клетки позвоночных, насекомых, дрожжей и т.д. Как упоминалось выше, выбор клетки не является существенным для настоящего изобретения. Однако обычно для экспрессии протеинов в клетках позвоночных наиболее часто используют COS клетки, которые получают от обезьян (Gluzman, Cell 23 (1981) 175-182), и лишенную дигидрофолат-редуктазы линию яичниковых клеток китайского хомяка (CHO) (Urlaub and Chasin, P.N.A.S. USA, 77 (1980) 4216-4220, и мы нашли, что они являются особенно подходящими для использования в связи с настоящим изобретением.

Обычно желательно для экспрессии в клетке позвоночного включать стандартные регуляторные последовательности в вектор экспрессии, такие как промоторная последовательность, локализированная из верхней части (upstream) гена, который выражается, сайт стыковки РНК, сайт полиаденилации, последовательность окончания транскрипции, и т.д. Этот вектор также может иметь источник репликации, когда необходимо. Типичным примером такого вектора экспрессии является pSV2dhfr, который имеет раннеспелый (early) промотор SV40 (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1 (1981) 854-864).

Клетки дрожжей также типично используются в качестве эукариотического микроорганизма-хозяина. Виды Saccharomyces, такие как Saccharomyces cerevisiae, являются особенно предпочтительными в качестве хозяев экспрессии. Известны многие векторы, которые являются подходящими для экспрессии протеинов в дрожжевых клетках. Предпочтительно, чтобы такие векторы также включали регуляторные последовательности. Предпочтительно для настоящего изобретения использовать промотор гена спиртовой дегидрогеназы (Bennetzen and Hall, J.Biol. Chem. 257 (1982) 3018-3025) или промотор гена кислой фосфотазы (Miyanohara et al., P.N.A.S. USA 80., (1983) 1-5).

В способе настоящего изобретения особенно предпочтительно выражать полипептиды в клетках COS. Вектор, содержащий последовательность ДНК, которая выражается, в таком случае, как правило, содержит SV40 источник репликации (который дает возможность автономной репликации вектора в клетках COS), а также промотор транскрипции, сигнал окончания транскрипции и сайт стыковки (сращивания) РНК. Такие последовательности являются стандартными в технологии и должны быть известны специалистам.

Вектор экспрессии может быть введен в клетки-хозяева с использованием технических приемов, которые являются стандартными в технологии. Так, например, вектор экспрессии может быть введен в клетки COS с использованием метода с диэтиламиноэтилдекстраном (DEAE - декстран), как описано в Luthman and Magnusson in Nucleic Acids Res. 11 (1983) 1295-1308, метода соосаждения фосфата кальция и ДНК, описанного в Graham and von der Ed in Virology 52 (1973) 456-457, или метода электропунктуры или электропорации, описанного в Neumann et al., in EMBO J., 1 (1982) 841-845. Подходящие технические приемы введения вектора экспрессии в клетки CHO, так, чтобы трансформированные клетки могли стабильно продуцировать производное Agif, включает сотрансфекцию вектора, способного выражать неоген, функционирующий как устойчивый маркер G418, такой как pRSVneo (Sambrook et al., "Molecular Cloning - A Laboratory Manval", Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1989), или pSV2-neo (Sovthern and Berg, J. Mol. Appl. Cenet., 1 (1982) 327-341), вместе с вектором экспрессии, сопровождаемым селекцией устойчивых колоний G418.

В зависимости от выбранной клетки-хозяина выраженное производное Agif будет оставаться внутри клетки или выделяться из клетки в питательную среду. Выбор среды для выращивания и условия выращивания не являются существенными для настоящего изобретения, но в большей степени зависят от выбранной клетки-хозяина. Подходящие среды хорошо известны в технике и являются очевидными для специалистов. Мы вообще считаем, что в настоящем изобретении желаемый полипептид достаточно выражается в клетках COS, когда среда представляет собой либо среду RPMI-1640, либо среду Дульбекко, модифицированную средой Игла (DMEM), к которой, при необходимости, добавляют компонент сыворотки, такой как эмбриональная коровья сыворотка (FBS).

Полипептиды настоящего изобретения могут быть выделены и очищены из клеток или питательной среды с использованием какого-либо одного или сочетания различных известных методик выделения, основываясь, например, на физических и химических свойствах протеина. Специфические примеры таких методов включают обработку обычными осадителями протеина, ультрафильтрацию, различные виды хроматографии, такие как хроматография на молекулярных ситах (гель-фильтрация), адсорбционная хроматография, ионообменная хроматография и высокопроизводительная жидкостная хроматография (HPLC), диализ или сочетания тех или иных методов.

Биологическая активность Настоящее изобретение, кроме того, предлагает также применение вышеописанных производных Agif в качестве фармацев