Способ получения растений с цитоплазматической мужской стерильностью и способ получения гибридных семян с мужской фертильностью

Способ получения растений с цитоплазматической мужской стерильностью и способ получения гибридных семян с мужской фертильностью

Реферат

 

Способы предназначены для использования в сельском хозяйстве. Система цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС-система) включает три трансгена: ген пластидной мужской стерильности (pms), регулируемый геном ядерной мужской стерильности (nms), и ген-восстановитель мужской фертильноcти (rmf). Ген pms либо является неактивным геном, кодирующим токсичный генный продукт, либо является активно экспрессируемым геном, кодирующим основной генный продукт. Ген nms контролируется специфичным для пыльника промотором и кодирует плаcтид-ориентированный полипептид, который регулирует ген pms либо путем активации экспрессии неактивного токсичного гена pms, либо путем подавления экспрессии основного гена pms, что приводит к повреждению пластид и клеток или их гибели в ткани пыльника, предотвращая тем самым образование жизнеспособной пыльцы. Ген rmf кодирует генный продукт, который препятствует регуляции гена pms геном nms. 2 c. и. 29 з.п.ф-лы, 18 ил.

Изобретение относится к способам улучшения растений, имеющих важное сельскохозяйственное и коммерческое значение, и в частности к новым трансгенным системам, основанным на использовании пластид, для получения растений с цитоплазматической мужской стерильностью и к применению таких растений для получения гибридных семян.

Открытие того факта, что скрещивание двух инбредных линий растений дает гибриды, имеющие повышенную продуктивность, вызвало большой интерес у селекционеров растений с точки зрения разработки экономичных способов получения гибридных семян. Обычно гибриды оказываются более продуктивными и более эффективными при утилизации питательных веществ, таких, как удобрения и вода. Гибриды первого поколения (F₁) также имеют тенденцию проявлять повышенную устойчивость к стрессовым ситуациям в окружающей среде по сравнению с родительскими инбредными линиями и также могут проявлять желаемые характеристики устойчивости к болезням. Получая гибриды двух инбредных линий, также представляется возможным объединить характеристики, которые трудно или невозможно объединить другими путями.

Гетерозис является общим явлением у растений и животных и в течение многих лет находит промышленное применение при селекции растений. Промышленные гибриды в настоящее время являются доступными для многих важных в сельскохозяйственном отношении культурных видов, и разработки в этой области продолжаются в отношении тех культурных растений, получать гибриды которых можно надежным и экономически выгодным образом.

Чтобы получить гибридное потомство двух инбредных линий, должно произойти перекрестное опыление. Оно является препятствием для получения гибридов многих культурных растений, которые в естественных условиях являются самоопыляемыми, часто давая и пыльцу и яйцеклетку в одном и том же цветке. Для предотвращения самооплодотворения необходимо удалить или разрушить вырабатывающий пыльцу орган у одного из родителей. Это может быть осуществлено вручную путем эмаскуляции, т.е. удаления целого мужского цветка или удаления пыльников цветков, имеющих как мужские, так и женские функциональные органы в одном и том же цветке. Ручная эмаскуляция требует больших затрат труда и вследствие этого является дорогостоящей.

Родительские линии с мужской стерильностью для получения гибридных семян также могут быть получены при использовании химических веществ ("гаметоцидов"), которые предотвращают образование жизнеспособной пыльцы. Эти химические вещества также дороги и не являются полностью надежными вследствие различных ограничений при обработке растений химическими веществами.

Единообразное перекрестное опыление может также осуществляться при использовании растений с генетической мужской стерильностью в качестве материнских родительских растений, выращенных рядом с отцовскими родительскими растениями, производящими пыльцу. При использовании этого способа все семена, собранные с делянки материнских растений, получены в результате перекрестного опыления.

Отсутствие образования пыльцы (т.е. мужская стерильность) у растений может быть следствием ядерных мутаций или быть связано с цитоплазматическими факторами наследственности. Для получения гибридных семян цитоплазматическая мужская стерильность (ЦМС) является предпочтительной по сравнению с генетической ядерной мужской стерильностью, потому что характеристики ЦМС не подвергаются менделевскому расщеплению. См. Handson & Conde, Int'l. Rev. Cytol., 94:213-267 (1985). Например, генетическая ядерная мужская стерильность обычно кодируется одним рецессивным геном, поэтому для экспрессии мужского стерильного фенотипа требуется гомозиготность. Для распространения растений с генетической ядерной мужской стерильностью гомозиготные рецессивные стерильные мужские растения должны быть скрещены с изогенной мужской фертильной линией, гетерозиготной по гену мужской стерильности. Такие скрещивания приводят к образованию определенного процента мужских фертильных растений (50% в системе с одним геном), которые должны быть удалены с поля сразу же, как только может быть идентифицирована их фертильность, чтобы поддержать эффективность желаемой популяции с мужской стерильностью. Так же как и ручная эмаскуляция, удаление с поля мужских фертильных растений представляет собой тяжелый и дорогостоящий труд. Таким образом, расщепление ядерных генов сильно ограничивает пригодность генетической ядерной мужской стерильности для получения гибридных семян.

Недостатком генетической ядерной мужской стерильности является менделевское расщепление. В противоположность этому цитоплазматическая мужская стерильность экспрессируется во всем потомстве гибридного скрещивания между родителями ЦМС-инбредной линии и линии с мужской фертильностью. По этой причине для получения гибридных семян предпочтителен способ, основанный на использовании ЦМС- характеристик.

Встречающаяся в естественных условиях цитоплазматическая мужская стерильность обусловлена мутациями в митохондриальном геноме. Взаимосвязи между этими митохондриальными мутациями и цитоплазматической мужской стерильностью варьируют от вида к виду и до сих пор недостаточно хорошо поняты. У кукурузы, для которой наиболее хорошо охарактеризованы митохондриальные ЦМС-системы, цитоплазматическая мужская стерильность техасской линии с цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС-Т) вероятно связана с экспрессией 13-кДа-полипептида. См. Hansen, Ann. Rev. Genet., 25:461-486 (1991); Leving & Siedov, Plant. Molec. Biol., 19: 135-147 (1992). Было установлено, что этот полипептид представляет собой трансмембранный протеин, увеличивающий проницаемость клеточных мембран. Этот полипептид не оказывает выраженного вредного воздействия при нормальном делении вегетативных клеток, но в силу пока неизвестного механизма вызывает усиленную проницаемость мембран клеток тапетума (выстилающего слоя) и последующее нарушение образования пыльцы. Образование 13-кДа- полипептида кореллировало с чувствительностью кукурузы линии ЦМС-Т к патогенам растений, таким, как Bipolaris maydis и Phyllosticta maydis.

В программах по селекции растений, в которых используют ЦМС-цитоплазму естественного происхождения, для получения семян необходимы три инбредные линии: (1) линия с мужской цитоплазматической стерильностью, имеющая ЦМС-цитоплазму; (2) фертильная инбредная линия с нормальной цитоплазмой, изогенная ЦМС-линии по ядерным генам ("линия поддержания"); и (3) фертильная инбредная линия с нормальной цитоплазмой, несущая ген восстановления фертильности ("линия восстановления", которая не обязательно должна быть изогенной ЦМС- линии). ЦМС-линия рапространяется путем опыления растениями линии поддержания. Все растения, полученные от этого скрещивания, будут обладать мужской стерильностью, поскольку ЦМС-цитоплазма имеет происхождение от родительской материнской линии. Гибридные семена получают путем опыления второй инбредной линией, несущей ген-восстановитель фертильности (Rf). Если нет гена-восстановителя, то стерильные гибриды все же могут быть получены путем опыления различными инбредными линиями, не имеющими гена- восстановителя фертильности. Такие гибриды полезны для культурных растений, у которых используется вегетативная ткань (например, листья табака или цветки петуньи). Однако у большинства культурных растений полезной частью урожая являются семена, поэтому фертильность гибридов этих культур должна быть восстановлена.

Хотя цитоплазматическая мужская стерильность полезна для получения гибридных семян, ее полезность часто ограничена многочисленными практическими проблемами, связанными с естественной цитоплазматической мужской стерильностью. Эти проблемы включают невозможность идентифицировать ЦМС-цитоплазму или ядерные восстанавливающие аллели, а также сопряжены с нежелательными характеристиками, такими, как восприимчивость к болезням (как описано выше), пониженная фертильность и т.п. Каждая из этих проблем возникает из-за отсутствия понимания митохондриального механизма цитоплазматической мужской стерильности и восстановления фертильности.

Очевидно, что уровень цитоплазматической мужской стерильности мог бы быть существенно увеличен, если бы были разработаны ЦМС-системы, компоненты которых были бы полностью понятны и охарактеризованы и которыми можно было бы уверенно оперировать без риска получения вредных побочных эффектов.

Настоящее изобретение относится к новой ЦМС-системе, основанной на модификации пластидного генома, а не митохондриального генома, и применении трех трансгенов: гена пластидной мужской стерильности и двух ядерных генов, регулирующих экспрессию гена пластидной мужской стерильности.

Одним предметом настоящего изобретения является следующий способ получения цитоплазматически стерильных мужских растений. Сначала выбирают родительскую линию растения. Родительскую линию растения с трансгенной пластидой получают путем стабильной трансформации пластид в клетках родительской линии с помощью гена пластидной мужской стерильности (pms) и регенерации растения. Ген pms обладает способностью регулироваться кодируемым в ядре пластид-ориентированным регуляторным полипептидом. Когда подобная регуляция происходит в ткани пыльника, нарушается образование жизнеспособной пыльцы. В одном примере осуществления изобретения, названном в данном описании способом "убивания пыльцы", ген pms является неактивным геном, включающим кодирующую область, которая кодирует вещество, способное лишать нормальных функций или убивать пластиды, нарушая тем самым образование жизнеспособной пыльцы, соединенную для функционирования с нуклеотидной последовательностью-мишенью для активации экспрессии гена. В другом примере осуществления изобретения, названном в данном описании способом "истощения пыльцы", ген pms содержит основной ген пластидного генома, соединенный для функционирования нуклеотидной последовательностью-мишенью для предотвращения экспрессии гена. Этот ген замещает нативный пластидный ген и, предотвращая экспрессию гена, вызывает повреждение или гибель пластид, нарушая тем самым образование жизнеспособной пыльцы. Растения с трансгенными пластидами, содержащими ген pms, являются фертильными. Далее различные клетки родительской линии растения подвергают стабильной ядерной трансформации с помощью гена ядерной мужской стерильности (nms), который содержит специфичную для пыльника 5'-регуляторную нуклеотидную последовательность, соединенную для функционирования с кодирующей нуклеотидной последовательностью, которая кодирует вышеуказанный пластид-ориентированный "регуляторный" полипептид, способный проникать в пластиды и регулировать ген pms путем взаимодействия с нуклеотидной последовательностью-мишенью, либо путем активации экспрессии (способ "убивания пыльцы"), либо путем предотвращения экспрессии (способ "истощения пыльцы"). Растения регенерируют из клеток растения-родителя с трансформированными ядрами. Такие растения также являются фертильными. Цитоплазматически стерильные, мужские растения получают путем скрещивания родительского растения с трансгенными пластидами с родительским растением с трансгенными ядрами, получая таким образом полную систему для лишения функциональных способностей или уничтожения специфичных для пыльника пластид, что нарушает образование жизнеспособной пыльцы.

Другим предметом настоящего изобретения является способ получения гибридных семян с мужской фертильностью от двух родительских линий растения, одна из которых представляет собой описанную выше линию растения с цитоплазматической мужской стерильностью. В соответствии с этим способом получают родительские растения с цитоплазматической мужской стерильностью, как описано выше. Затем выбирают вторую родительскую линию растения. Из этой линии получают родительское растение, восстанавливающее мужскую фертильность, подвергая клетки второй родительской линии растения стабильной ядерной трансформации геном-"восстановителем мужской фертильности" (rmf). Ген rmf содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую генный продукт-"восстановитель", способный к взаимодействию с геном nms либо путем блокирования экспрессии самого гена nms, либо путем блокирования экспрессии способного к активации токсичного гена pms. Растение регенерируют из клеток со стабильно трансформированными ядрами. Линию с цитоплазматической мужской стерильностью затем скрещивают с линией, восстанавливающей фертильность, вследствие чего экспрессия гена rmf предотвращает вышеуказанную регуляцию гена pms регуляторным полипептидом, восстанавливая тем самым мужскую фертильность в гибридных растениях.

Следующими предметами настоящего изобретения являются конструкции ДНК и трансгенные растения для практической реализации изобретения. Предложены растение с трансгенными ядрами, содержащими ген nms, и растение с трансгенными пластидами, содержащими ген pms, от одной и той же родительской линии. Также предложено растение с цитоплазматической мужской стерильностью, полученное путем скрещивания растения с трансгенными ядрами с растением с трансгенными пластидами. Предложено растение с трансгенными ядрами, содержащими ген rmf, являющееся растением второй родительской линии. Также предложены гибридные растения с мужской фертильностью, полученные путем скрещивания родительского растения с цитоплазматической мужской стерильностью с растением второй родительской линии, содержащим ген rmf.

Фиг. 1 - схематическая диаграмма предпочтительного осуществления способа "убивания пыльцы" для получения пластидной мужской стерильности (ПМС) с использованием системы РНК-полимераза фага Т7/lac-репрессор: Фиг. 1А - экспрессия генов мужской стерильности в клетках тапетума или микроспорах стерильных растений. Транскрибируют ядерный ген nms ("Knms"), в цитоплазме рибосом транслируют кодируемый полипептид (РНК-полимеразу фага Т7) и импортируют в пластиды. Последующая транскрипция пластидного гена-киллера ("Kpms") от промотора Т7lac вызывает гибель клеток (символ "+" обозначает положительный регулятор, т.е. РНК-полимеразу фага Т7, специфичную для промотора фага Т7).

Фиг. 1Б - экспрессия генов мужской стерильности в клетках тапетума или микроспорах фертильных гибридных растений.

lac-Репрессор, продукт ядерного гена- восстанавителя фертильности (Krmf), связывается в пластидах с промотором Kpms Т7/lac, предотвращая таким образом транскрипцию токсичного гена с помощью продукта гена Knms (белый символ "X" в черном кружке обозначает специфическое связывание lac-репрессора с lac-оператором на регуляторной последовательности Т7/lac).

Фиг. 2 - схематическая диаграмма предпочтительного осуществления способа "истощения пыльцы" для получения пластидной мужской стерильности с использованием пластид-ориентированного lac- репрессора и ядерно-ориентированного tet-репрессора: Фиг. 2А - экспрессия генов мужской стерильности в клетках тапетума или микроспорах стерильных растений.

Транскрибируют ядерный ген nms ("Snms") и кодируемый lac-репрессор импортируют в пластиды, где он блокирует экспрессию основного гена (Spms), промотор которого содержит сайт связывания lac-репрессора. Отсутствие экспрессии основного гена Spms приводит к гибели клеток (белый символ "X" в черном кружке обозначает специфическое связывание lac- репрессора с последовательностью lac-оператора гена Spms).

Фиг. 2Б - экспрессия генов мужской стерильности в клетках тапетума фертильных гибридных растений.

Ген-восстанавитель фертильности (Srmf) кодирует ядерно-ориентированный репрессор, предотвращая транскрипцию ядерного гена Snms с помощью сайта связывания репрессора, созданного на гене Snms, позволяя тем самым осуществлять экспрессию генов Spms. (Белый символ "-" в черном кружке обозначает специфическое связывание ядерно-ориентированного репрессора с его сайтом связывания репрессора на гене Snms).

Фиг. 3 - полигенные экспрессирующие кластеры гена Kmps в пластидах, применяемые в способе "убивания пыльцы".

Показаны последовательности ДНК промоторов РТ7lac1 (последовательность I.D. N1) и РТ7lac2 (последовательность I.D. N 2) и терминаторов транскрипции ТТ7 (последовательность I.D. N 3) и Trps16T7 (последовательность I.D. N 4). Подчеркнуты места расположения рибосомных сайтов связывания RBS, промотора гена 10 фага Т7 (ф 10), lac-оператора и соответствующие сайты рестрикции. Кодон инициации трансляции, включенный в последовательность узнавания NcoI, выделен жирным шрифтом.

Фиг. 4 - интеграция гена Kpms в транскрипционно молчащую область генома пластиды путем сцепления с геном устойчивости к спектиномицину (aadA). Показаны пластидная область-мишень плазмиды pC8, являющаяся областью узнавания пластидного генома дикого типа (Nt-ptDNA), и область, содержащая интегрированный ген-киллер. Интеграция гена aadA и гена- "пассажира" происходит в результате двух гомологичных процессов рекомбинации, показанных между штриховыми линиями. Условные обозначения: 16SrDNA обозначает ген рРНК 16S; V обозначает ген trnV; В обозначает открытую рамку считывания ORF70B; РТ7 обозначает промотор РТ7lac1; ТТ7 обозначает терминатор ТТ7. Сайты рестрикции: E обозначает EcoRI; В обозначает BamHI; Bg обозначает BglII; H обозначает HindIII; RV обозначает EcoRV.

Фиг. 5 - гены ядерной мужской стерильности Knms (pZS233: нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность I.D. N 5, аминокислотная последовательность представляет собой последовательность I.D. N 6; pZS243: нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность I.D. N 7, аминокислотная последовательность представляет собой последовательность I. D. N 8). Показанные гены Knms экспрессируют как конститутивные гены с промотором вируса мозаики цветной капусты 35S (P35S; Timmermans и др., J. Biotechnol., 14: 333- 344, 1990), с транзитным пептидом, малой субъединицей RuBisCO (TP-SSU; Kanevski & Maliga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 1969-1973, 1994), РНК-полимеразой T7 (T7-RNAP; Studier и др., Meth. Enz. , 185: 60-89, 1990) и терминатором транскрипции вируса мозаики цветной капусты (T35S; Timmermans и др., 1990, см. выше). Также показаны аминокислотная последовательность транзитного пептида (штриховые линии) и слияние N-конца с Т7-РНК- полимеразой. Сайт процессинга обозначен зачерненным треугольником. Процессинг npeT7-RNAP дает T7-RNAP (РНК-полимеразу Т7) без дополнительных аминокислот при экспрессии из показанного вверху гена pZS233 и сохраняет 5 аминокислот зрелой малой субъединицы SSU, слитой с N-концом, при экспрессии из показанного внизу гена pZS243.

Фиг. 6 - ядерные гены-восстановители мужской фертильности Srmf (pZS253: нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность I.D. N 9, аминокислотная последовательность представляет собой последовательность I. D. N 10; pZS263: нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность I. D. N 11, аминокислотная последовательность представляет собой последовательность I.D. N 12). Показан конститутивный тест-ген с промотором вируса мозаики цветной капусты 35S (P35S; Timmermans и др., 1990, см. выше). TP-SSU обозначает транзитный пептид, малую субъединицу RuBisCO (Kanevski & Maliga, 1994, см. выше); lacI обозначает кодирующую область lac-репрессора (Farabaugh, Nature, 274: 765-769, 1978); T35S обозначает терминатор транскрипции вируса мозаики цветной капусты (Timmermans и др., 1990, см. выше). Также показаны аминокислотная последовательность транзитного пептида (штриховые линии) и слияние N-конца с РНК-полимеразой Т7. Сайт процессинга обозначен зачерненным треугольником. Процессинг npeT7-RNAP дает T7-RNAP (РНК-полимеразу Т7) без дополнительных аминокислот при экспрессии из показанного вверху гена pZS253 и сохраняет 5 аминокислот зрелой субъединицы SSU, слитой с N-концом, при экспрессии из показанного внизу гена pZS263.

Фиг. 7 - модифицированные последовательности промотора, применяемые для транскрипции генов Spms в способе "истощения пыльцы". Промоторы Prrnlac1 (последовательность I. D. N 13) и Prrnlac2 (последовательность I. D. N 14) имеют происхождение из промотора оперона pРНК, промотор PtrnVlac2 (последовательность I. D. N 15) имеет происхождение из гена trnV. Выделены подчеркиванием элементы промотора -10 и -35 и последовательность lac-оператора (жирный шрифт). Номера обозначают положение нуклеотида в геноме пластиды табака (Shinozaki и др., ЕМВО J., 5: 2043-2049, 1986).

Фиг. 8 - модифицированная последовательность промотора, применяемая для экспрессии кодирующих протеин генов Spms в способе "истощения пыльцы". Показанные промоторы являются производными промотора оперона pРНК и имеют лидерную последовательность либо лидера гена 10 фага Т7 (PrrnlacL1; последовательность I.D. N 16), либо лидера пластидного гена rbcL (PrrnlacL2; последовательность I. D. N 17). Выделены подчеркиванием элементы промотора -10 и -35 и последовательность lac-оператора (жирный шрифт). Номера обозначают положение нуклеотида в геноме пластиды табака (Shinozaki и др., 1986, см. выше).

Трансгенная ЦМС-система по настоящему изобретению основана на положении, что жизнеспособные функциональные хлоропласты в развивающейся ткани пыльника (в частности, в тапетуме или микроспорах) важны для образования жизнеспособной пыльцы. Трансгенная система из трех составляющих содержит ген пластидной мужской стерильности (pms), который регулируется двумя ядерными генами. Один из двух ядерных регуляторных генов является геном ядерной мужской стерильности (nms), предназначенным для экспрессии только в ткани пыльника. Ген nms кодирует пластид-ориентированный полипептид, регулирующий ген pms либо путем активации, либо путем инактивации гена pms, что приводит к трансформации пластид в выбранной ткани пыльника, у которой необходимо нарушить функцию или которую необходимо убить, предотвратив тем самым образование жизнеспособной пыльцы. Другой ядерный ген, ген-восстановитель мужской фертильности (rmf), кодирует генный продукт, который препятствует регуляции гена pms геном nms.

Подробное описание, приведенное ниже в разделах I-III, включает описание предпочтительных способов получения и применения конструкций ДНК и трансгенных растений по настоящему изобретению и практического применения способов по изобретению. В разделе I приведены общие способы конструирования систем ЦМС по данному изобретению, основанных на применении пластид (в некоторых случаях названных в данном описании как "пластидная мужская стерильность" или системы "пмс"). В разделах II и III приведены два предпочтительных примера применения пластид-трансгенной ЦМС-системы, способ "убивания пыльцы" и способ "истощения пыльцы" и описаны конструкции ДНК и другие компоненты, полезные для практического применения каждого из обоих предпочтительных примеров осуществления. Любые методы молекулярного клонирования или рекомбинантных ДНК, не описанные специально, осуществляют стандартным путем, как это описано в общих чертах, например, у Sambrook и др., в "DNA Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.

I. Общие способы конструирования пластид-трансгенных ЦМС-систем и получения гибридных семян Трансгенные ЦМС-системы по изобретению получают и применяют в соответствии с общими способами, приведенными ниже для ядерной и пластидной трансформации высших растений, хранения родительских линий растений и получения гибридных семян.

A. Конструкции ДНК и способы стабильной трансформации пластид геном pms и регенерации пластид-трансгенных растений Способы и конструкции ДНК для стабильной, высокоэффективной трансформации пластид и экспрессии рекомбинантных протеинов в пластидах известны в данной области техники. Для практического применения настоящего изобретения предпочтительны способы и конструкции, описанные в нижеприведенных ссылках: Svab и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8526-30 (1990); Svab & Maliga, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 913-17 (1993); Carrer и др., Mol. Gen. Genet. , 241: 49-56 (1993); Staub & Maliga, EMBO J., 12: 601-06 (1993); и в заявках на патенты США с регистрационными номерами 08/111398 и 08/189256; во всех вышеуказанных документах описан уровень данной области техники для стабильной, высокоэффективной пластидной трансформации и экспрессии рекомбинантных генов в пластидах.

Определения нижеприведенных понятий предназначены для пояснения способов пластидной трансформации, применяемых в соответствии с настоящим изобретением.

Гетероплазматический: относится к наличию смешанной популяции различных геномов пластид в одной пластиде или в популяции пластид, содержащихся в клетках или тканях растений.

Гомоплазматический: относится к чистой популяции геномов пластид, находящихся либо в пластиде, либо в клетках и тканях.

Трансформация пластид: стабильная интеграция трансформирующей ДНК в геном пластиды, которая передается в семена потомства растений, содержащих трансформированные пластиды.

Вышеупомянутые предпочтительные способы и конструкции для трансформации пластид основаны на использовании нелетальных средств селекции, которые придают селектируемый фенотип клеткам, содержащим трансформированные пластиды. Термины "селективный маркер" или "селектируемый маркер" относятся к фенотипу, который идентифицирует успешно трансформированную органеллу, клетку или ткань, если ген или аллель, кодирующие селективный маркер, включены в чужеродную ДНК, применяемую для трансформации. Обычно применяемые селективные маркеры включают устойчивость к антибиотикам, гербицидам или другим соединениям, которые могут быть летальными для клеток, органелл или тканей, в которых не происходит экспрессия резистентного гена или аллеля. Селекцию трансформантов осуществляют путем выращивания клеток или тканей в условиях давления отбора, т. е. в среде, содержащей антибиотик, гербицид или другое соединение. Если селективный маркер является "летальным" селективным маркером, то клетки, в которых происходит экспрессия селективного маркера, будут выживать, в то время как клетки, лишенные селективного маркера, будут погибать. Если селективный маркер является "нелетальным", то трансформанты (т.е. клетки, в которых происходит экспрессия селективного маркера) можно отличить от нетрансформантов с помощью определенных средств, однако и трансформанты и нетрансформанты будут выживать при воздействии давления отбора.

Селективный маркер может быть нелетальным на клеточном уровне, но селективным на уровне органелл; как, например, в случае селективного маркера, предпочтительного в данном описании для трансформации пластид. Например, антибиотик спектиномицин ингибирует трансляцию в пластидах, но не в цитоплазме. Чувствительные к спектиномицину пластиды не способны производить протеины, содержащие аппарат для фотосинтеза. В присутствии спектиномицина клетки, содержащие указанные пластиды, сохраняют жизнеспособность при их выращивании в фотогетеротропных условиях (т.е. при выдерживании в атмосфере экзогенного углерода), однако пластиды в этих условиях растут медленнее, и клетки или ткани обесцвечиваются добела, вместо того, чтобы становиться зелеными. Наоборот, пластиды, экспрессирующие селективный фенотип устойчивости к спектиномицину, размножаются с большей скоростью, и клетки, содержащие такие пластиды, имеют зеленый цвет. В смешанной популяции клеток, содержащей трансформированные и нетрансформированные пластиды, чувствительные не трансформированные пластиды будут иметь значительное численное превосходство и должны быть разбавлены в процессе пластидно/клеточного разделения в условиях давления отбора, и популяция пластид будет включать практически только трансформированные пластиды (гомоплазматические клетки или ткани, как определено выше). Таким образом, нелетальность селективного маркера относится к нелетальности на клеточном уровне, в то время как в селективной среде могут быть выращены чувствительные клетки или ткани, но устойчивые ткани легко отличимы от них.

Для пластидной трансформации требуется: (1) способ доставки ДНК через двойную мембрану пластиды; (2) интеграция гетерологичной ДНК без воздействия на нормальную функцию генома пластиды (выполняемой либо путем замещения существующего пластидного гена, либо путем инсерции дополнительных генов в соответствующие места в геноме пластиды); и (3) эффективный отбор трансформированного генома пластиды, предпочтительно путем применения летального селектируемого маркера доминантного типа, как описано выше у Svab & Maliga, 1993 (где описан ген aadA в качестве селектируемого гена-маркера для высокоэффективной трансформации хлоропластов табака).

Для введения ДНК в пластиды цветковых растений пригодны несколько методов, включающих (но не ограниченных ими) использование в качестве векторов Agrobacterium, обработку протопластов полиэтиленгиколем (ПЭГ), бомбардировку клеток или тканей микроснарядами, покрытыми ДНК, трансформирующей пластиду (в некоторых случаях в данном описании названную биобаллистической доставкой ДНК), и вырезание с помощью микропучков УФ-лазера временных отверстий. Другие способы включают применение геминивирусов в качестве векторов, обработку протопластов фосфатом кальция, электропорацию выделенных протопластов и перемешивание клеточной суспензии с микроузлами, покрытыми трансформирующей ДНК. Биобаллистический метод, описанный выше у Svab & Maliga, 1993, является предпочтительным для пластидной трансформации, поскольку он может быть применен в отношении широкого разнообразия растений и их тканей, включая виды или роды растений, не приспособленные к выращиванию в виде культуры клеток или протопластов или к регенерации. В альтернативном варианте примера осуществления, пригодном для растительных систем, где протопласты могут быть получены и регенерированы в целые растения, трансформация пластиды может быть осуществлена путем обработки протопластов полиэтиленгликолем (ПЭГ) в присутствии трансформирующей ДНК. Некоторые методы осуществления стабильной трансформации пластид в обработанных ПЭГ протопластах на растениях табака представлены у Golds и др., Bio/Technology, 11: 95-97, 1993.

Конструкции ДНК, пригодные для стабильной трансформации пластид геном pms (в некоторых случаях в данном описании названные либо как "трансформирующая ДНК", либо как "векторы-вставки"), включают следующие элементы: (1) последовательность ДНК, гомологичную области генома пластиды, подлежащей трансформации (в некоторых случаях в данном описании названной как "сегмент-мишень" или "фрагмент-мишень"), имеющую достаточную длину, чтобы гарантировать гомологичную рекомбинацию, необходимую для введения трансформирующей ДНК в геном пластиды, (2) нелетальный селектируемый ген-маркер, такой, как ген aadA, и (3) ген pms, причем оба гена соединены для функционирования с соответствующими 5'- и 3'- регуляторными областями для экспрессии в пластидах. Такие векторы обычно соединены в виде химерных генов, в которых каждая кодирующая область (т.е. кодирующая область для селектируемого гена-маркера и кодирующая область для гена pms) прилегает к соответствующим 5'- и 3'-регуляторным последовательностям. 5'- и 3'-регуляторные сегменты для кодирующего сегмента селектируемого маркера выбирают так, чтобы экспрессия селектируемого гена-маркера была эффективной, придавая тем самым нелетальный селектируемый фенотип. 5'- и 3'-регуляторные сегменты для гена pms выбирают, как описано выше, так, чтобы ген был способен активироваться и инактивироваться под контролем ядерных генов nms и rmf. К таким химерным генам с обеих сторон примыкают части сегмента-мишени.

Сегмент-мишень вектора-вставки должен быть достаточно большим для того, чтобы гарантировать гомологичную рекомбинацию между трансформирующей ДНК и геномом пластиды. Для достижения этого сегмент-мишень должен иметь длину по крайней мере 50 оснований и предпочтительно от 500 до 1500 оснований на каждой стороне ДНК, подлежащей включению в геном пластиды.

Сегмент-мишень выбирают так, чтобы трансформирующая ДНК не нарушала экспрессию соседних пластидных генов. Приемлемые сегменты-мишени могут быть идентифицированы специалистом в данной области техники на основе наличия обширной информации о картировании генома и информации о последовательности некоторых пластидных геномов в сочетании с пригодностью этой информации к другим пластидным геномам, что является результатом высокой степени консервативности пластидных геномов (Palmer, Trends in Genetics, 6: 115-120, 1990; Sugiura, Plant Mol. Biol., 19: 149-168, 1992).

В способе "истощения пыльцы" по настоящему изобретению сегмент-мишень содержит ген, который должен быть замещен, и при этом указанный ген полностью замещается без нарушения соседних генов в геноме пластиды. Замещение выполняют путем сцепления селектируемого гена-маркера в прямом направлении от замещаемого пластидного гена и отбора трансформантов, проявляющих селектируемый фенотип (см. Maliga и др., Phil. Trans. R. Soc. Lond. B, 342: 203-208, 1993).

В способе "убивания пыльцы" сегмент-мишень выбирают так, чтобы трансформирующую ДНК встроить в геном пластиды в транскрипционально молчащие области, не нарушая пластидные гены. Учитывая, что 3'-области пластидных генов неэффективны в качестве терминаторов транскрипции (Gruissem & Tonkyn, Critical Review in Plant Sciences, 12: 19-55, 1993), можно ожидать некоторую степень сквозного прочитывания (отсутствия терминации) транскрипции при встраивании трансформирующей ДНК почти в любом месте генома пластиды. Сайт встраивания в области инвертированного повтора между геном trnV и опероном rps12/7 особенно полезен с учетом этого факта, поскольку трансформирующую ДНК транскрибируют без существенного сквозного прочитывания транскрипции при ориентации по направлению к оперону rps12/7. Это отсутствие сквозного прочитывания транскрипции в сайте встраивания trnV-rpsl2/7, вероятно, является следствием того факта, что фланкирующие пластидные гены или опероны транскрибируются дивергентно (т.е. транскрибируются от противоположных цепочек, в противоположных направлениях). Следовательно, сегменты-мишени, ориентированные по направлению к сайтам между другими дивергентно транскрибируемыми генами, также могут быть пригодны для практического применения настоящего изобретения. Они включают сайты между trnL и ORF2280 в области инвертированного повтора и между trnS и ORF168 и trnW и petG в большой малокопийной области, но не ограничены ими. В другом варианте также могут быть пригодны сайты встраивания между двумя любыми генами тРНК, поскольку гены тРНК являются относительно эффективными терминаторами транскрипции (Stern & Gruissem, Cell, 51: 1145-57, 1987). Такой же результат может быть получен путем фланкирования сайтов встраивания терминаторами транскрипции, которые могут быть синтезированы или вырезаны из исходных генов и клонированы.

Селектируемый ген-маркер и ген pms могут быть взяты в виде полигенных экспрессирующих кластеров для встраивания в сегмент-мишень. Полигенный экспрессирующий кластер, как это используется в контексте данного описания, содержит 5'- и 3'-регуляторные сегменты, предпочтительно приспособленные для удобного смешения и перекрестного спаривания с помощью стандартных методик рекомбинантной ДНК. Полигенные экспрессирующие кластеры применяют для получения химерных генов pms и селектируемых генов-маркеров для составления векторов-вставок. Таким образом, векторы- вставки для трансформации пластид геном pms содержат по крайней мере еще один ген, который придает нелетальный селектируемый фенотип.

Полигенные экспрессирующие кластеры содержат 5'- и 3'- регуляторные сегменты для контроля экспрессии различных кодирующих сегментов. 5'- регуляторный сегмент контролирует уровень и специфичность экспрессии в пластидах, 3'-регуляторны