Н- и l-цепи моноклонального антитела рм1 (монат) к рецептору il-6r человека и их v-области, модифицированная монат, его н- и l-цепи и их v-области, cdr- последовательности, днк-последовательности

Н- и l-цепи моноклонального антитела рм1 (монат) к рецептору il-6r человека и их v-области, модифицированная монат, его н- и l-цепи и их v-области, cdr- последовательности, днк-последовательности

Реферат

 

Изобретение представляет V-область L-цепи мышиных моноклональных антител к человеческим IL-6R и Н-цепь V-области мышиных моноклональных антител к человеческим IL-6R. Также представлены модифицированные антитела к человеческим IL-6R. Представлена также ДНК-последовательность, кодирующая вышеназванные антитела или их части. Антитела к рецепторам человеческого IL-6R применимы в качестве терапевтического средства для лечения миеломы. 18 с. и 6 з.п.ф-лы., 24 ил., 11 табл.

Изобретение относится к вариабельной области (V-области) мышиных моноклональных антител к рецепторам человеческого интерлейкина-6 (IL-6R), человеческим/мышиным химерным антителам к человеческим IL-6R и измененным человеческим антителам, включающим человеческие антитела, в которых области, определяющие комплементарность (CDRS) V-области человеческих легких цепей (L-цепей) и V-области человеческих тяжелых цепей (H цепей) перенесены в CDRS мышиных моноклональных антител к человеческим IL-6R. Кроме того, настоящее изобретение представляет ДНК, кодирующую вышеупомянутые антитела или их части. Настоящее изобретение к тому же представляет векторы, особенно векторы экспрессии, содержащие вышеназванную ДНК, и клетки-хозяева, трансформированные или трансфицированные вышеназванным вектором. Настоящее изобретение дополнительно еще представляет способ получения химерных антител к человеческому IL-6R и способ получения измененных человеческих антител к человеческому IL-6R.

Интерлейкин-6 (IL-6) является полифункциональным цитокином, который продуцируется рядом клеток. Он регулирует иммунный ответ, реакции острой фазы и гематопоэз и может играть центральную роль в механизмах защиты организма-хозяина. Он действует на широкий ряд тканей, оказывая вызывающее рост, подавляющее рост и вызывающее дифференциацию воздействие зависимости от природы клеток-мишеней. Специфические рецепторы для IL-6 (IL-6R) экспрессируются на лимфоидных, так же как и на нелимфоидных клетках в соответствии с полифункциональными свойствами IL-6. Было высказано предположение, что ненормальная экспрессия IL-6 гена включена в патогенез многих заболеваний, особенно аутоиммунных заболеваний, мезангиального пролиферативного гломерулонефрита и плазмацитомы/миеломы (смотрите обзор Hirdno et al., Immunol. Today 11, 443-449, 1990). Наблюдается, что человеческие миеломные клетки продуцируют IL-6 и экспрессируют IL-6R. В экспериментах антитела против IL-6 подавляли in vitro рост миеломных клеток, показывая таким образом, что аутокринный регуляторный замкнутый контур управляет онкогенезом человеческих миелом (Kawano et al., Nature, 332, 83, 1988).

IL-6R присутствуют на поверхности различных животных клеток и специфически связываются с IL-6, и о числе молекул IL-6R на клеточной поверхности сообщалось (Taga et al, J. Exp. Med. 196, 967, 1987). Кроме того, кДНК, кодирующая человеческий IL-6R была клонирована, и о первичной структуре IL-6R сообщалось (Yamasaki et al., Science 241, 825, 1988).

Мышиные антитела высоко иммуногенны у людей и по этой причине их терапевтическое значение для людей ограничено. Полупериод присутствия мышиных антител in vitro у людей относительно короток. Кроме того, мышиные антитела невозможно применить с многократным дозированием без образования иммунного ответа, который не только препятствует ожидаемой эффективности, но также создает риск побочной аллергической реакции у пациента.

Чтобы разрешить эти проблемы были разработаны методы получения очеловеченных мышиных антител. Мышиные антитела могут быть очеловечены двумя путями. Более простым методом является создание химерных антител, когда V-области происходят из первоначальных мышиных моноклональных антител и C-области происходят из подходящих человеческих антител. Получаемые в результате химерные антитела содержат целые V-области исходных мышиных антител, и можно ожидать связывания антигена с той же самой специфичностью, что и у исходных мышиных антител. Кроме того, химерные антитела имеют существенное снижение процентного содержания белковой последовательности, происходящей из нечеловеческого источника, и поэтому ожидается, что они будут менее иммуногенны, чем исходные мышиные антитела. Хотя химерные антитела, как предсказано, хорошо связываются с антигеном и менее иммуногенны, иммунный ответ на мышиные V-области может все же присутствовать (Lo Buglio et al, Proc. Natl. Acad. Scl, USA 84, 4220-4224, 1989).

Второй способ очеловечивания мышиных антител более сложен, не более интенсивно снижает потенциальную иммуногенность мышиных антител. При этом методе области, определяющие комплементарность (CDRS) из V-областей мышиных антител пересаживаются в человеческие области для создания "видоизмененных" человеческих V-областей. Эти измененные человеческие V-области затем соединяются с человеческими C-областями. Единственными частями конечных измененных человеческих антител, образованными нечеловеческими протеиновыми последовательностями, являются CDRS, CDRS состоит из высоковариабельных протеиновых последовательностей. В них не обнаружено видоспецифических последовательностей. По этим причинам преобразованные человеческие антитела, несущие мышиные CDRS, не должны быть более иммуногенны, чем естественные человеческие антитела, содержащие человеческие CDRS.

Как видно из вышеприведенного, предполагается, что измененные человеческие антитела будут применяться для терапевтических целей, но преобразованные человеческие антитела к человеческим IL-6R неизвестны. Более того, не существует способа получения видоизмененных человеческих антител, универсально применимого для любых конкретных антител. Поэтому, чтобы получить вполне активные видоизмененные человеческие антитела к конкретному антигену, необходимы различные способы. Даже хотя и были получены мышиные моноклональные антитела к человеческому IL-6R, т.е. PM1 и MT18 (Японская патентная заявка N 2-189420), и авторы настоящего изобретения получили мышиные моноклональные антитела к человеческому IL-6R, т.е. AUK 12-20, AUK 64-7 и AUK 146-15, авторы настоящего изобретения не знают публикаций, которые представляют создание видоизмененных человеческих антител к человеческому IL-6R.

Авторы настоящего изобретения обнаружили также, что когда мышиные моноклональные антитела к человеческим IL-6R вводили безволосым мышам, которым трансплантировались миеломные клетки человеческой линии, рост опухоли заметно подавлялся. Это дает основание полагать, что антитела к рецепторам человеческого IL-6 применимы в качестве терапевтического средства для лечения миеломы.

Поэтому настоящее изобретение направлено на получение менее иммуногенных антител к человеческим IL-6R. Соответственно настоящее изобретение представляет видоизмененные человеческие антитела к человеческим IL-6R. Настоящее изобретение также представляет часть видоизмененного человеческого антитела, так же как и системы экспрессии для продукции видоизмененных человеческих антител и их частей и химерные антитела.

Более конкретно, настоящее изобретение представляет V-область L-цепи мышиных моноклональных антител к человеческим IL-6R и H-цепь V-области мышиных моноклональных антител к человеческим IL-6R.

Настоящее изобретение также представляет химерные антитела к человеческим IL-6R, включающие: (1) L-цепь, содержащую человеческую C-область L-цепи и V-область L-цепи мышиного моноклонального антитела к IL-6R, и (2) H-цепь, содержащую человеческую C-область H-цепи и V-область H-цепи мышиного моноклонального антитела к человеческому IL-6R.

Настоящее изобретение также представляет CDR V-области L-цепи мышиного моноклонального антитела к человеческому IL-6R, и CDR V-области H-цепи мышиного моноклонального антитела к человеческому IL-6R.

Настоящее изобретение, сверх того, представляет видоизмененную человеческую V-область L-цепи антитела к человеческому IL-6R, включающую: (1) остовные области (FRS) человеческой V-области L-цепи и (2) CDRS V-области L-цепи мышиных моноклональных антител к человеческим IL-6R и видоизмененную человеческую V-область H-цепи антител к человеческим IL-6R, включающую: (1) FRS человеческой V-области H-цепи и (2) CDRS V-области H-цепи мышиных моноклональных антител к человеческим IL-6R.

Настоящее изобретение также представляет видоизмененную человеческую цепь антител к человеческим IL-6R, включающую: (1) человеческую C-область L-цепи и (2) V-область L-цепи, включающую человеческие FRS, и CDRS мышиных моноклональных антител к человеческим IL-6R и видоизмененную H-цепь антитела к человеческим IL-6R, включающую: (1) человеческую C-область H-цепи и (2) V-область H-цепи, содержащую человеческие FRS и CDRS из мышиного моноклонального антитела к человеческим IL-6R.

Настоящее изобретение к тому же еще представляет видоизмененное человеческое антитело к человеческому IL-6R, содержащее: (A) L-цепь, включающую (1) человеческую C-область L-цепи и (2) V-область L-цепи, включающую человеческие FRS L-цепи и CDRS L-цепи мышиных моноклональных антител к человеческим IL-6R, и (B) H-цепь, содержащую (1) человеческую C-область H-цепи и (2) V-область H-цепи, включающую FRS H-цепи и CDRS H-цепи мышиного моноклонального антитела к человеческим IL-6R.

Настоящее изобретение, кроме того, представляет ДНК, кодирующую полипептиды любого из вышеупомянутых антител или его части.

Настоящее изобретение также представляет векторы, например векторы экспрессии, включающие вышеназванную ДНК.

Настоящее изобретение к тому же представляет клетки-хозяева, трансформированные или трансфицированные вышеназванными векторами.

Настоящее изобретение еще представляет процесс получения химерных антител к человеческим IL-6R и процесс получения видоизмененных человеческих антител к человеческим IL-6R.

Фиг. 1 представляет векторы экспрессии, включающие промоторно/энхансерную систему человеческого цитомегаловируса (HCMV), применимую для экспрессии пептида настоящего антитела.

Фиг. 2 является графиком, показывающим результаты ELISA для подтверждения способности настоящего химерного антитела AUK 12-20 связываться с человеческим IL-6R.

Фиг. 3 является графиком, показывающим результат определения способности настоящего химерного антитела AUK 12-20 подавлять связывание IL-6R с человеческим IL-6R.

Фиг. 4 является графиком, показывающим результат ELISA по связыванию настоящих химерных антител PM-1a и PM-1b с человеческим IL-6R.

Фиг. 5 является графиком, показывающим определения по ELISA способности настоящих химерных антител PM-1a и PM-1b подавлять связывание IL-6 с человеческим IL-6R.

Фиг. 6 является диаграммой строения первого варианта видоизмененной V-области H-цепи человеческого PM-1.

Фиг. 7 является диаграммой строения первого варианта видоизмененной человеческой V-области L-цепи PM-1.

Фиг. 8 представляет процесс создания плазмиды экспрессии HEF-12h-gI, включающей человеческий промотор/энхансер фактора элонгации I (HEF-I ), применимого для экспрессии H-цепи.

Фиг. 9 представляет процесс создания плазмиды экспрессии HEF-12k-gk, включающей систему промотора/энхансера HEF-I, применимую для экспрессии L-цепи.

Фиг. 10 представляет процесс создания плазмиды экспрессии DHFR-RMh-gI, включающей промотор/энхансер HCMV и ген дигидрофолатредуктазы (dhfr), связанный с дефектной SV40 промоторной/энхансерной последовательностью для амплификации, применимой для экспрессии H-цепи.

Фиг. 11 представляет процесс создания плазмиды экспрессии DHFR-E-RVh-PM-1f, содержащей промотор/энхансер EFI и ген dhfr, связанный с дефектной SV40 промоторной/энхансерной последовательностью для амплификации, применимую для экспрессии H-цепи.

Фиг. 12 является графиком, показывающим способность вариантов "a" и "b" видоизмененной V-области L-цепи человеческого PM-1 на связывание с человеческим IL-6R.

Фиг. 13 является графиком, показывающим способность варианта "f" видоизмененной V-области H-цепи человеческих PM-1 плюс варианта "a" видоизмененной V-области L-цепи PM-1 к связыванию с человеческим IL-6R.

Фиг. 14 является графиком, показывающим способность варианта "f" видоизмененной V-области H-цепи PM-1 плюс варианта "a" видоизмененной V-области L-цепи PM-1 подавлять связывание IL-6 с человеческим IL-6R.

Фиг. 15 представляет плазмиды экспрессии HEF-V_L-gk и HEF-V_H-gI, включающие промотор/энхансер человеческого EFI-, применимые для экспрессии L-цепи и H-цепи соответственно.

Фиг. 16 показывает процесс создания ДНК, кодирующей видоизмененную V-область L-цепи человеческих антител AUK12-20.

Фиг. 17 является графиком, показывающим результаты ELISA для подтверждения способности видоизмененной V-области L-цепи человеческих антител AUK 12-20 связываться с человеческими IL-6R. На фигуре "стандарт" AUK 12-20 (химерн. ) означает результат для химерных антител AUK 12-20, продуцируемых клетками CHO и очищенных в большом количестве.

Фиг. 18 является графиком, показывающим результат ELISA на способность видоизмененных человеческих антител AUK 12-20 (вариант "a" L-цепи + вариант "b" H-цепи) связываться с человеческими IL-6R.

Фиг. 19 является графиком, показывающим результат ELISA на способность видоизмененных человеческих антител AUK 12-20 (вариант "a" L-цепи + вариант "d" H-цепи) связываться с человеческими IL-6R.

Фиг. 20 показывает процесс химического синтеза видоизмененной V-области H-цепи человеческих антител sle 1220 H.

Фиг. 21 является графиком, показывающим результат ELISA на способность видоизмененных человеческих антител sle 1220 (вариант "a" L-цепи + вариант "a" H-цепи) подавлять связывание IL-6 с человеческими IL-6R.

Фиг. 22 является графиком, показывающим результат ELISA на способность видоизмененных человеческих антител sle 1220 (вариант "a" L-цепи + вариант "b" H-цепи) подавлять связывание IL-6 с человеческими IL-6R.

Фиг. 23 является графиком, показывающим результат ELISA на способность видоизмененных человеческих антител sle 1220 (вариант "a" L-цепи + вариант "c" H-цепи) подавлять связывание IL-6 с человеческими IL-6R.

Фиг. 24 является графиком, показывающим результат ELISA на способность видоизмененных человеческих антител sle 1220 (вариант "a" L-цепи + вариант "d" H-цепи) подавлять связывание IL-6 с человеческими IL-6R.

Наилучший способ осуществления изобретения Клонирование ДНК, кодирующей мышиные V-области Говоря точнее, чтобы клонировать ДНК, кодирующую V-области мышиных моноклональных антител к человеческим IL-6R, необходимо создание гибридомы как источника генов, которая продуцирует моноклональные антитела к человеческим IL-6R. В качестве такой гибридомы японская патентная заявка N 2-189420 описывает мышиную гибридому PM-1, которая продуцирует моноклональные антитела PM-1, и ее свойства. В справочных примерах 1 и 2 настоящей спецификации описывается процесс создания гибридомы PM-1. Авторы настоящего изобретения создали гибридомы AUK 12-20, AUK 64-7 и AUK 146-15, причем каждая продуцирует мышиные моноклональные антитела к человеческим IL-6R. Процесс создания этих гибридом описан в справочном примере 3 этой спецификации.

Чтобы клонировать желаемую ДНК, кодирующую V-области мышиных моноклональных антител, гибридомные клетки гомогенизируются и суммарную РНК получают по общепринятому методу, описанному Chirgwin et al, Biochemistry 18, 5294, 1977. Затем вся РНК используется, чтобы синтезировать одноцепочечные ДНК по методу, описанному J. W. Larrick et al., Biotechnology 7, 934, 1989.

Затем проводится специфическая амплификация соответствующей части кДНК по методу полимеразной цепной реакции (PCR). Для амплификации V-области к L-цепи мышиных моноклональных антител используются 11 групп олигонуклеотидных праймеров (мышиных каппа вариабельных; MKV), представленных в SEQ ID N: с 1 по 11 и олигонуклеотидный праймер (мышиных каппа константных; МКС), представленный в SEQ ID N: 12, в качестве 5'-терминальных праймеров и 3'-терминальных праймеров соответственно. MKV праймеры гибридизируются с ДНК-последовательностью, кодирующей лидерную последовательность мышиной L-цепи, и МКС праймер гибридизируется с ДНК последовательностью, кодирующей константную область мышиной L-цепи. Для амплификации V-области H-цепи мышиных моноклональных антител используются 10 групп олигонуклеотидных праймеров (мышиных тяжелых вариабельных; MHV), представленных в SEQ ID N: с 13 по 22, и олигонуклеотидный праймер (мышиных тяжелых константных; MHC), представленный в SEQ ID N: 23 в качестве 5'-терминальных праймеров и 3'-терминального праймера соответственно.

Заметим, что 5'-терминальные праймеры содержат нуклеотидную последовательность GTCGAC ближе к его 5'-концу, последовательность, которая представляет сайт расщепления рестрикционного фермента sal 1, и 3'-терминальный праймер содержит нуклеотидную последовательность, которая представляет сайт расщепления рестрикционного фермента Xma 1. Эти сайты расщепления рестрикционных ферментов используются для субклонирования фрагментов ДНК, кодирующих вариабельную область, в клонирующие векторы.

Затем продукт амплификации расщепляется рестрикционными ферментами sal 1 и Xma 1, чтобы получить фрагмент ДНК, кодирующий желаемую область V-мышиных моноклональных антител. С другой стороны подходящий клонирующий вектор, такой как плазмида pUC19, расщепляется теми же самыми рестрикционными ферментами sal 1 и Xma 1, и вышеуказанный фрагмент ДНК связывается с расщепленной pUC19, чтобы получить плазмиду, включающую фрагмент ДНК, кодирующий желаемую V-область мышиных моноклональных антител.

Секвенирование клонированной ДНК может быть осуществлено с помощью общепринятых методов.

Клонирование желаемой ДНК и ее секвенирование детально описаны в примерах от 1 до 3.

Области, определяющие последовательность (CDR_S) Настоящее изобретение представляет гипервариабельные или определяющие комплементарность области (CDR_S)каждой V-области настоящего изобретения, V домены каждой пары L- и H-цепей из сайта связывания антигена. Домены L- и H-цепей имеют ту же самую структуру, и каждый домен содержит четыре основные области (FR_S), чьи последовательности относительно сохранны, соединенные тремя CDR_S (смотрите Kabat, E.A. Wu, T.T., Bilofsky, H, Reid-Miller, M. and Perry, H. , in "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1983). Четыре FR главным образом принимают -плоскую конформацию и CDR образуют петли, соединяющие FR и, в некоторых случаях, образующие часть - плоской структуры. CDR удерживается в непосредственной близости к FR и CDR из другого домена, содействуют формированию сайта, связывающего антиген. CDR описаны в примере 4.

Создание химерного антитела Перед разработкой видоизмененных человеческих V-областей антител к человеческим IL-6R необходимо подтвердить, что CDR, которые будут использованы на деле, образуют эффективную область связывания антигена. С этой целью создавались химерные антитела. Кроме того, аминокислотные последовательности V-областей мышиных против человеческих IL-6R антител, предсказанные исходя из нуклеотидных последовательностей клонированных ДНК 4 мышиных моноклональных антител, описанных в примерах 1 и 2, сравнили друг с другом и с V-областями из известных мышиных и человеческих антител. Для каждого из 4 мышиных моноклональных антител был клонирован набор типичных функциональных V-областей L- и H-цепей. Все четыре мышиные анти-IL-6R антитела, однако, имели относительно различные V-области. Четыре антитела не были просто незначительными вариациями одно другого. При использовании клонированных мышинах V-областей были созданы 4 химерных анти-IL-6R антитела.

Основной метод создания химерных антител включает соединение мышиных лидерной последовательности и последовательности V-области, как обнаружено при клонировании с применением PCR кДНК, с последовательностью, кодирующей человеческие C-области, уже присутствующей в векторах экспрессии клеток млекопитающих. Среди вышеуказанных 4 моноклональных антител создание химерных антител из моноклональных антител AUK 12-20 описано в примере 5.

Создание химерных антител из моноклональных антител PM-1 описывается в примере 6. кДНК, кодирующая лидерную и V-область L-цепи мышиных PM-1, была субклонирована с PCR в вектор экспрессии, содержащий геномную ДНК, кодирующую человеческую каппа C-область. кДНК, кодирующая лидерную и V-области H-цепи мышиных PM-1 была субклонирована с PCR в вектор экспрессии, содержащий геномную ДНК, кодирующую человеческую гамма-I C-область. При использовании специально разработанных праймеров PCR кДНК, кодирующие V-область мышиных PM-1, были адаптированы на их 5'- и 3'-концах (1) так, чтобы они легко встраивались бы в векторы экспрессии и (2) так, чтобы они функционировали бы соответствующим образом в этих векторах экспрессии. Модифицированные PCR V-области мышиных PM-1 затем встраивались в векторы экспрессии HCMV, уже содержащие желаемые человеческие C-области (фигура 1). Эти векторы пригодны для или кратковременной или постоянной экспрессии генетически разработанных антител в ряде линий клеток млекопитающих.

В дополнение к созданию химерных антител PM-1 с V-областями, идентичными V-областям, присутствующим в мышиных антителах PM-1 (вариант a), был создан второй вариант химерных антител PM-1 (вариант b). У химерных антител PM-1 (вариант b) аминокислота в положении 107 V-области L-цепи была заменена с аспарагина на лизин. При сравнении V-области L-цепи мышиных антител PM-1 с другими V-областями L-цепей было замечено, что появление аспарагина в положении 107 было необычным явлением. В V-областях L-цепей мыши наиболее типичной аминокислотой в положении 107 является лизин. Чтобы оценить значение наличия атипичной аминокислоты аспарагина в положении 107 V-области L-цепи мышиных антител PM-1, положение 107 изменялось на типичную аминокислоту лизин в этой позиции. Это изменение достигалось при использовании метода мутагенеза с PCR (M. Kamman et al., Nucl. Acids Res. (1989) 17:5404), чтобы произвести необходимые изменения в последовательностях ДНК, кодирующих V-область L-цепи.

Вариант (a) химерных антител PM-1 проявлял активность по связыванию с человеческими IL-6R. Вариант b химерных антител PM-1 связывается с человеческими IL-6R так же, как и вариант (a). Подобным же образом из 2 других моноклональных антител AUK 64-7 и AUK 146-15 были созданы химерные антитела. Все 4 химерных антитела хорошо связываются с человеческими IL-6R, показывая таким образом в функциональном исследовании, что нужные мышиные V-области были правильно клонированы и секвенированы.

Из 4 мышиных против-IL-6R антител антитела PM-1 были выбраны в качестве первого кандидата для разработки и создания видоизмененных человеческих антител к человеческим IL-6R. Выбор мышиных антител PM-1 основывался главным образом на результатах, полученных при изучении действия мышиных против-IL-6R антител на человеческие опухолевые миеломные клетки, трансплантированные безволосым мышам. Из 4 мышиных против-IL-6R антител антитела PM-1 показали наивысшую активность против опухолевых клеток.

Сравнение V-областей из мышиных моноклональных антител PM-1 с V-областями из известных мышиных и человеческих антител Для того чтобы создать видоизмененные человеческие антитела, причем CDR мышиных моноклональных антител пересаживаются в человеческие моноклональные антитела, желательно, чтобы существовала высокая гомология между FR мышиных моноклональных антител и FR человеческих моноклональных антител. Поэтому аминокислотные последовательности V-областей L- и H-цепей из мышиных антител PM-1 сравнивались со всеми известными мышиными V-областями, какие находятся в базе данных OWL (или Leeds) белковых последовательностей.

Что касается V-областей мышиных антител, V-область L-цепи антитела PM-1 была наиболее подобна V-области L-цепи мышиного антитела musigkcko (Chen, H. -T. et al. , J. Biol. Chem. (1987) 262:13579-13583) с идентичностью 93,5%. V-область H-цепи антител PM-1 была наиболее подобна V-области H-цепи мышиных антител musigvhr 2 (F.J. Grant et al., Nucl. Acids Res. (1987) 15: 5496) с идентичностью 84,0%.

V-области мышиных PM-1 показывают высокий процент идентичности с известными мышиными V-областями, свидетельствуя таким образом, что V-области мышиных PM-1 являются типичными мышиными V-областями. Это представляет дополнительное непрямое доказательство, что клонированные последовательности ДНК являются правильными. Присутствует, обычно, более высокий процент идентичности между V-областями L-цепи, чем между V-областями H-цепи. Возможно это связано с меньшим числом различий, обычно наблюдаемым в V-областях L-цепи по сравнению с V-областями H-цепи.

Что касается V-областей человеческих антител, V-область L-цепи антител PM-1 была наиболее сходна с V-областью L-цепи человеческих антител Klhure, также упоминаемых как REI (W. Palm et al., Physiol. Chem. (1975) 356: 167-191) с идентичностью 72,2%. V-область H-цепи антител PM-1 была наиболее сходна с V-областью H-цепи человеческого антитела humighvap (VAP) (H.W. Schroeder et al. , Science (1987) 238: 791-793) с идентичностью 71,8%. Сравнение с человеческими V-областями наиболее важно для рассмотрения того, как разработать видоизмененные человеческие антитела исходя из мышиных антител PM-1. Процент идентичности с человеческими V-областями меньше, чем процент идентичности с мышиными V-областями. Это является непрямым доказательством того, что V-области мышиных PM-1 сходны с мышиными V-областями и не похожи на человеческие V-области. Эти данные также указывают на то, что для исключения проблем иммуногенности у больных людей наилучшим решением будет очеловечить V-области мышиных PM-1.

V-области мышиных антител PM-1 также сравнили с соответствующими последовательностями различных подгрупп человеческих областей, как определено E.A. Kabat et al. ((1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Forth Edition, U.S. Department of Health and Humman servides, U.S. Government Printing (Office). Проведено сравнение FR-областей. Результаты представлены в таблице 1.

FR V-области L-цепи мышиных PM-1 наиболее похожи на FR из соответствующей последовательности V-областей человеческих L-цепей подгруппы I (HSG I) с идентичностью 70,1%. FR V-области H-цепи мышиных PM-1 наиболее сходны с FR соответствующих последовательностей V-областей человеческих H-цепей из подгруппы II (HSG II) с идентичностью 52,9%. Эти результаты подтверждают результаты, полученные при сравнении с известными человеческими антителами. V-область L-цепи в человеческих REI принадлежит к подгруппе I V-областей L-цепей и V-области H-цепи в человеческих VAP относятся к подгруппе II человеческих V-областей H цепи.

Исходя из этого сравнения с V-областями человеческих антител можно выбрать человеческие V-области, которые будут основой для разработки видоизмененных V-областей человеческих PM-1. Наилучшим было бы использование V-области человеческой L-цепи, которая принадлежит к подгруппе I (HSG II) для разработки видоизмененной V-области L-цепи преобразованных человеческих PM-1 и V-области человеческой H-цепи, которая относится к подгруппе II (HSG II) для разработки V-области H-цепи видоизмененных человеческих PM-1.

Разработка вариабельных областей видоизмененных человеческих PM-1 Первой стадией в разработке областей видоизмененных человеческих PM-1 был выбор человеческих V-областей, которые были бы основой разработки. FR V-области L-цепи мышиных PM-1 были наиболее сходны с FR V-областей человеческой L-цепи, относящихся к подгруппе I (таблица 1). Как обсуждалось выше, при сравнении V-области L-цепи мышиных PM-1 с известными V-областями L-цепи человека, они были наиболее сходны с V-областью REI L-цепи человека, члена подгруппы I V-областей человеческих L-цепей. При разработке V-областей L-цепи видоизмененных человеческих PM-1 были использованы FR из REI. Кроме того, FR REI использовались как стартовый материал для создания V-области L-цепи видоизмененных человеческих PM-1.

У этих человеческих FR на основе REI существует пять различий с FR первоначальных человеческих REI (положения 39, 71, 104, 105 и 107 по Kabat et al., 1987; см. таблицу 2). Три изменения в FR4 (положения 104, 105 и 107) базировались на J-области из другой человеческой каппа L-цепи и поэтому не представляют отклонения от человеческого (L. Riechmann et al., Nature (1988), 322: 21-25). Два изменения в положениях 39 и 71 были изменениями обратно к аминокислотам, которые присутствуют в FR V-области L-цепи крыс САМРАТН-1 (Riechmann et al., 1988).

Были разработаны два варианта V-области L-цепи видоизмененных человеческих антител PM-1. В первом варианте (вариант "a") человеческие FR были идентичны FR на основе REI, присутствующим в видоизмененных человеческих САМРАТН-1H (Riechmann et al., 1988) и мышиные CDR были идентичны CDR в V-области L-цепи мышиных PM-1.

Второй вариант (вариант "b") базировался на варианте "a" с заменой только одной аминокислоты в положении 71 человеческой FR3. Остаток 71 является частью канонической структуры CDR 1 V-области L-цепи, как определено C.Chothia et al., (J. Mol. Biol (1987) 196 : 901-917). Предсказывается, что аминокислота в этом положении непосредственно влияет на строение петли CDR 1 V-области L-цепи и поэтому может значительно влиять на связывание антигена.

В V-области L-цепи мышиных PM-1 в положении 71 находится тирозин. В модифицированных FR REI, использованных при разработке варианта "a" V-области L-цепи видоизмененных человеческих PM-1 находился фенилаланин. В варианте "b" V-области L-цепи видоизмененных человеческих PM-1 фенилаланин в положении 71 был заменен на тирозин, который обнаружен в V-области L-цепи мышиных PM-1. Таблица 2 показывает аминокислотные последовательности V-области L-цепи мышиных PM-1, FR REI которых модифицированы для использования в видоизмененных человеческих антителах CAMPATH-1H (Richmann et al., 1988) и двух вариантов V-области L-цепи видоизмененных человеческих PM-1.

FR V-области H-цепи мышиных PM-1 были наиболее сходны с FR V-областей H-цепи человека, принадлежащих к подгруппе II (таблица 1). Как обсуждалось выше, при сравнении V-области H-цепи мышиных PM-1 с известными V-областями H-цепей человека она наиболее сходна с V-областью VAP человеческой H-цепи, члена подгруппы II V-областей человеческих H-цепей. Последовательности ДНК, кодирующие FR V-области NEW человеческой H-цепи, другого члена подгруппы II V-областей человеческой H-цепи были использованы в качестве исходного материала для построения V-области H-цепи видоизмененных человеческих PM-1 и как основа для разработки V-области H-цепи видоизмененных человеческих PM-1.

Было разработано шесть вариантов V-области H-цепи видоизмененных человеческих PM-1. Во всех шести вариантах человеческие FR имели в основании FR NEW, присутствующие в видоизмененных человеческих CAMPATH-1H (Riechmann et al. , 1988), и мышиные CDR были идентичны CDR V-области H-цепи мышиных PM-1. Смесь аминокислотных остатков в человеческих FR (положения 1, 27, 28, 30, 48 и 71, см. таблицу 3), как было определено, имеют возможное побочное влияние на связывание антигена. B модели V-областей мышиных PM-1 остаток I V-области H-цепи является поверхностным остатком, который располагается близко к петлям CDR. Остатки 27, 28, 29 и 30 являются или частью канонической структуры CDR1 V-области H-цепи, как предсказано C.Chothia et al., Nature (1989) 34: 877-883, и/или, как наблюдается на модели V-областей мышиных PM-1, образуют часть первой структурной петли V-области H-цепи (Chothia, 1987). Остаток 48, как замечено на модели V-области мышиных PM-1, является спрятанным остатком. Изменения спрятанного остатка могут разрушать структуру V-области в целом и ее антиген-связывающий сайт. Остаток 71 является частью канонической структуры CDR2 V-области H-цепи, как предсказано Chothia et al., (1989). Шесть вариантов видоизменного человеческого антитела PM-1 включают различные комбинации изменений аминокислот в этих семи положениях человеческих FR NEW (см. таблицу 3).

Создание видоизмененных V-областей человеческих PM-1.

Первые варианты V-областей L- и H-цепей видоизмененных человеческих PM-1 каждый создавали, используя новый метод, основанный на PCR. В основном плазмидную ДНК, кодирующую видоизмененную V-область человека, которая уже содержала подходящие человеческие FR, модифицировали, используя праймеры PCR, чтобы заменить CDR, присутствующие в изначальной видоизмененной человеческой V-области CDR из мышиных антител PM-1. Исходный материал для построения видоизмененной V-области L-цепи человеческих PM-1 является плазмидной ДНК, видоизмененную V-область человеческой D1.3L-цепи. Видоизмененная V-область человеческой D1.3L-цепи создавалась на основе FR, присутствующих в V-области человеческой L-цепи REI. Исходным материалом для построения видоизмененной области H-цепи человеческих PM-1 была плазмидная ДНК, содержащая видоизмененную человеческую область D1.3H-цепи. Видоизмененная человеческая область D1.3H-цепи создавали на основе FR, присутствующих в V-области человеческой H-Цепи NEW (M.Verhoeyen et al., Science (1988) 239:1534-1536).

Если исходные плазмидные ДНК, содержащие желаемые человеческие FR, уже выбраны, праймеры PCR предназначались для того, чтобы сделать возможным замещением CDR мышиных PM-1 CDR мышиных D1.3. Для каждой видоизмененной области человеческих PM-1 были разработаны и синтезированы три праймера, содержащих последовательности ДНК, кодирующие CDR мышиных PM-1, и два праймера, расположенных по краям полной последовательности ДНК, кодирующей видоизмененную человеческую V-область. Используя пять праймеров PCR в серии PCR, получали продукт PCR, который состоял из человеческих FR, присутствующих в исходной видоизмененной человеческой V-области и CDR, присутствующих в V-области мышиных PM-1 (см. пример 7 и фигуры 7 и 8). Продукты PCR клонировали и секвенировали, чтобы убедиться в том, что полная последовательность ДНК варианта "a" видоизмененной V-области L- и H-цепей человеческих PM-1 кодировала правильную аминокислотную последовательность (SEQ ID N 55).

Остальные варианты видоизмененных областей человеческих PM-1 создавались с использованием небольших модификаций опубликованных методик мутагенеза с PCR (Kamman et al., 1989). Как описано для разработки видоизмененных областей человеческих антител PM-1, был создан один дополнительный вариант (вариант b) видоизмененной V-области L-цепи человеческих антител и получены пять дополнительных вариантов (варианты "b", "c", "d", "e" и "f") видоизмененной V-области H-цепи человеческих PM-1. Эти дополнительные варианты содержат серии незначительных изменений по сравнению с первыми вариантами. Разработаны праймеры, которые будут вводить необходимые изменения в последовательность ДНК. После серии PCR продукт PCR клонировали и секвенировали, чтобы убедиться, что изменения в последовательности ДНК такие, как запланировано. Последовательность варианта "f" V-области H-цепи видоизмененных человеческих антител PM-1 показана в SEQ ID N 54.

Если последовательности ДНК различных вариантов V-областей видоизмененных человеческих PM-1 подтверждались секвенированием, V-области видоизмененных человеческих PM-1 субклонировали в векторы экспрессии клеток млекопитающих, уже содержащие человеческие C-области. Видоизмененные V-области L-цепи человеческих антител PM-1 соединяли с последовательностями ДНК, кодирующими человеческую C-область. Видоизмененные V-области H-цепи человеческих PM-1 соединяли с последовательностями ДНК, кодирующими человеческие гамма-1 C-область. Чтобы достичь высоких уровней экспрессии видоизмененных человеческих антител PM-1, векторы экспрессии HCMV, как показано на фигуре 1, модифицировали. чтобы заменить промоторно-энхансерную область HCMV промотором-энхансером человеческого фактора элонгации (HEF-I) (см. фигуру 15).

Затем все комбинации вариантов (a) и (b) видоизмененной человеческой L-цепи с вариантами от (a) до (f) V-области H-цепи испытывали на связанные с человеческими IL-6R и в результате видоизмененные человеческие антитела, включающие вариант (a) L-цепи и вариант (f) H-цепи, показали способность связываться с IL-6R на том же самом уровне, что и химерные PM-1 (a) (фиг. 13), что описано в деталях в примере II.

Модификации последовательностей ДНК, кодирующих области видоизмененных человеческих PM-1 с целью улучшения уровней экспрессии.

При рассмотрении уровней видоизмененных человеческих PM-1 антител, которые продуцируются cos клетками, стало очевидно, что уровни экспрессии видоизмененных человеческих H-цепей были всегда примерно в 10 раз ниже, чем уровни экспрессии видоизмененных человеческих L-цепей или химерных L- или H-цепей. По-видимому существует проблема в кодировании ДНК видоизмененной V-области человеческой H-цепи, что служит причиной низких уровней экспрессии. Чтобы определить были ли низкие уровни экспрессии белка результатом низких уровней транскрипции, получали PHK из cos клеток, трансфицированных одновременно векторами, экспрессирующими видоизмененные L- и H-цепи человеческих PM-1. Первично-цепочечная кДНК синтезировалась как описано для клонирования с PCR V-областей мышиных PM-1. Используя праймеры PCR, разработанные для расположения по концам ДНК, кодирующей V-области видоизмененных L- и H-цепей, продукты PC