Способы определения разрушения коллагена in vivo и наборы для осуществления способов, гибридома, моноклональное антитело и его фрагмент, пептиды, происходящие из коллагена, и способ анализа

Способы определения разрушения коллагена in vivo и наборы для осуществления способов, гибридома, моноклональное антитело и его фрагмент, пептиды, происходящие из коллагена, и способ анализа

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано для определения разрушения коллагена in vivo. Определение и регистрацию разрушения коллагена осуществляют путем контактирования иммунологически связывающих партнеров к сшитым телопептидам, происходящим из коллагена типа I, II, III и содержащим раскрытое или нераскрытое пиридиниевое кольцо 3-гидроксипиридиниевой сшивки с биологической жидкостью. Сшивка представляет собой гидроксилизилпиридинолин или лизилпиридинолин. Изобретение позволяет проводить диагностику заболеваний, связанных с разрушением коллагена. 15 с. и 14 з.п.ф-лы, 14 ил.

Настоящая заявка является частичным продолжением заявки на патент США NN 444881, поданной 1 декабря 1989 г, которая в свою очередь является частичным продолжением заявки на патент США N 118234, поданной 6 ноября 1987 г.

Настоящее изобретение осуществленно при поддержке правительства по программам AR37318 и AR36794, финансируемым Национальными институтами здоровья. Правительство имеет определенные права на данное изобретение.

Настоящее изобретение относится к способам обнаружения и регистрации разрушения коллагена in vivo. Более конкретно, изобретение относится к способам количественного определения сшитых телопептидов, образованных in vivo при разрушении коллагена типа II и III.

К настоящему времени описано три класса коллагенов. Известно, что коллагены класса I, подразделяемые на типы I, II, III, V и IX, образуют фибрилы. Коллагены всех этих типов синтезируются в виде молекул предколлагена (проколлагена), состоящих из N-концевых и C-концевых предпептидов (пропептидов), присоединенных к центральной молекуле коллагена. После удаления этих предпептидов, что в природе происходит in vivo в ходе синтеза коллагена, и оставшаяся центральная часть молекулы коллагена в основном состоит из трехспирального домена, обладающего концевыми телопептидными последовательностями, не являющимися трехспиральными. Такие телопептидные последовательности играют важную роль в качестве участков межмолекулярного сшивания вне клеток фибрилл коллагена.

Настоящее изобретение относится к способам обнаружения разрушения коллагена, основанным на анализе конкретных сшитых телопептидов, образованных in vivo в ходе разрушения коллагена. В прошлом были созданы методы анализа с регистрацией разрушения коллагена in vivo путем определения различных биохимических маркеров, некоторые из которых являются продуктами разрушения коллагена. Например, деформацию костей, связанную с болезнью Педжета, регистрируют путем определения небольших пептидов, содержащих гидроксипролин и выделяемых в мочу после разрушения костного коллагена. Russell и др. Metab.Bone Dis. and Rel.Res. 4 и 5, 255 - 262 (1981), Singer F.R. и др. Метаболические костные заболевания, т. II (ред. Aviol, L.V и Kane S.M.), 489 - 575 (1975), Академик Пресс, Нью-Йорк.

Другими исследованиями определялось в моче такое соединение с поперечными связями (сшитое), как пиридинолин в качестве показателя разрушения коллагена при заболеваниях суставов. См. например, в качестве прототипа Wu и Eyre, Biochemistry, 23 1850 (1984), Black и др. Annals of the Rheumatic Diseases 48 641 - 644 (1989), Robins и др. Annals of the Rhevmatic Diseases 45 969-973 (1986), Seibel и др. The Jovrnal of Rhevmatology, 16 964 (1989). В отличие от настоящего изобретения некоторыми прежними исследователями пептиды в биологических жидкостях подвергались гидролизу, после чего проводился анализ на присутствие отдельных гидроксипиридиниевых остатков. Ни одним из этих исследователей не сообщалось об определении телопептида, содержащего первичную связь и образовавшегося естественным путем in vivo при разрушении коллагена, что характерно для настоящего изобретения.

В заявке на патент Великобритании CB 2205643 сообщается, что разрушение в организме коллагена типа III определяют количественно путем определения в биологической жидкости концентрации II-концевого телопептида из коллагена типа III. в той же ссылке утверждается, что сшитые области телопептида нежелательны. В самом деле, в ссылке говорится, что для получения телопептида необходимо использовать несшитый источник коллагена. Пептиды настоящего изобретения имеют поперечные связи (сшиты) во всех случаях. Поперечные связи в коллагене более подробно рассматриваются ниже в разделе "Сшивание коллагена".

Имеется целый ряд сообщений о том, что разрушение коллагена может быть определено количественным анализом определенных предколлагеновых пептидов. В настоящем изобретении речь идет о телопептидах, а не о предпептидах, отличающихся друг от друга их расположением в молекуле коллагена, а также временем их отщепления in vivo См. патент США 4504587, патент США 4312853, Pierard и др. Analytical Biochemistry 141, 127 - 136 (1984), Niemela, Clin, Chem. 31(8), 1301 - 1304 (1985), Rohde, и др. European Jovrhal of Clinical Investigation, 9 451 - 459 (1979), WO 89/04491.

Патент США 4778768 относится к способу определения изменений, происходящих в хряще артикулятора, путем количественного анализа мономера протеогликана или его антигенных фрагментов в образце синовиальной жидкости. Данный патент не относится к обнаружению сшитых телопептидов, происходящих из разрушенного коллагена.

В работе Dodge, J.Clin., Unvest. 83, 647 - 661 (1981) раскрываются способы анализа разрушения коллагена типа II с применением поликлональной антисыворотки, специфично реагирующей с нераспленными альфа-цепями и пептидами, происходящими из коллагенов типа II человека и коровы под воздействием бромистого циана. Пептиды, о которых идет речь, не являются сшитыми телопептидами, как в настоящем изобретении.

Исследователями нескольких групп исследованы и определены аминокислотные последовательности коллагена человека типа III, преда l (II) коллагена человека и всей цепи полностью предшественника преда l (III) коллагена человека, а также соответствующих клоны кДНК. См. Loidl и др. Nucleic Acids Research 12, 9383 - 9394 (1984) Sangiorgi и др. Nucleic Acids Research, 13, 2207 - 2225 (1985), Baldwin и др. Biochem. J. 262 521 - 528 (1989), Ala-Kokko и др. Biochem. J. 260, 509 - 516 (1989) Ни в одной из приведенных ссылок не указано строение конкретных телопептидов в качестве продуктов разрушения, анализом которых можно определить in vivo количество разрушенного фибриллярного коллагена.

Несмотря на вышеприведенные прототипы, сохраняется необходимость в простых и эффективных методах анализа для определения разрушения коллагена in vivo. Подобные методы анализа могут быть использованы для обнаружения и регистрации протекания заболевания, такого как остеоартрит (разрушения коллагена типа II) и различные воспалительные нарушения, такие как васкулитный синдром (разрушение коллагена типа III).

Методы анализа разрушения коллагена типа I раскрыты в первичной заявке на патент США N 118234 и могут быть использованы для обнаружения и оценки костной резорбции. Обнаружение костной резорбции может представлять интерес для обнаружения и регистрации таких заболеваний, как остеопороз. Остеопороз - это наиболее обычное костное заболевание человека. Первичный остеопороз с повышенной склонностью к переломам возникает в результате прогрессирующей общей потери скелетной костной массы. Установлено, что в США им поражено 15 - 20 миллионов людей. Причиной заболевания является дисбаланс в реконструкции костей, т.е. в скоростях синтеза и разрушения костной ткани.

Ежегодно для пожилых людей отмечается около 1,2 миллиона случаев перелома, связанных с остеопорозом, в том числе: примерно 538000 случаев компрессионного перелома позвоночника, примерно 22700 случаев перелома бедра и значительное число преждевременных переломов периферических костей. В случае перелома бедра 12 - 20% заканчиваются фатально вследствие тяжких травм и кровотечения, а половина выживших больных требует ухода в домашних условиях. Общие потери от связанных с остеопорозом травм в настоящее время достигают по меньшей мере 7 миллионов долларов (Barnes O.M. Science, 236, 914 (1987).

Остеопороз наиболее обычен для женщин в состоянии менопаузы, которые в среднем теряют 15% костной массы в течение 10 лет после наступления менопаузы. Это заболевание характерно также и для мужчин по мере их старения и для молодых спортсменок с аменореей. Несмотря на большие и все более возрастающие социальные и экономические последствия остеопороза, метода определения скорости костной резорбции у больных и нормальных субъектов не существует. Основная трудность в регистрации заболевания заключается в отсутствии специфического анализа для определения скорости костной резорбции.

Способы оценки костной массы зачастую основаны на определении кальция во всем организме в анализе с активацией нейтронами или определении минеральной массы в данной кости по поглощению фотонов. Подобные определения способны создать лишь долговременные впечатления о возможном уменьшении костной массы. Определение кальциевого равновесия путем сравнения его поглощения с расходом утомительно, ненадежно и позволяет всего лишь косвенно оценить возможные потери костных минералов за длительный период. Другие применяемые в настоящее время методы оценки костной массы и затрудненного костного метаболизма включают количественную сканирующую радиометрию в избранных месторасположениях костной (запястье, пяточная кость и т.д.) и гистоморфометрию подвздошного гребня.

В первом случае дается грубая мера содержания минеральной части в специфичном участке единственной кости. Гистоморфометрия дает полуколичественную оценку равновесия между вновь осажденным костным швом и резорбированными поверхностями.

Анализ мочи на объем разрушения кости во всем организме за 24 часа мог бы оказаться гораздо более полезным. Изучением минеральной части (например, кальциевого равновесия) не позволяет сделать этого надежно или просто. Поскольку костная резорбция включает разрушение минеральной и органической матрицы, идеальным показателем мог бы оказаться специфичный биохимический маркер в биологических жидкостях для вновь образовавшихся продуктов разрушения кости. Испытаны некоторые потенциальные органические метки. Например, гидроксипролин-аминокислота, сильно ограниченная в коллагене, и основной структурный белок в костной и прочих соединительных тканях, экстретируются в мочу. Как известно, степень его экскреции возрастает при определенных условиях, особенно в случае болезни Педжета - нарушение костного метаболизма, при котором, как указано выше, резко возрастает деформация костей. По этой причине гидроксипролин интенсивно использовался в качестве аминокислотного маркера разрушения коллагена (Singer F.R. и др. 1978, см. выше).

В патенте США N 3600132 раскрыт способ определения гидроксипролина в биологических жидкостях, таких как моча, сыворотка, поясничная жидкость и другие межклеточные жидкости, с целью регистрации отклонений в метаболизме коллагена. В частности, создатель этого патента отмечает, что в патологических состояниях, таких как болезнь Педжета, синдром Марфана, остеопсатароз, рост непластов в коллагеновых тканях и различные формы карликовости, может быть определен путем анализа содержания гидроксипролина повышенный анаболизм или катаболизм коллагена. Изобретатель определяет гидроксипролин его окислением перекисью водорода и N-хлор-п-толуолсульфонамидов в производное пиррола с последующим колориметрическим определением в п-диметиламинобензальдегиде.

В случае болезни Педжета повышенное содержание в моче гидроксипролина вероятно в основном является результатом разрушения костей, однако, гидроксипролин не может быть, как правило, в качестве специфического показателя. Большая часть гидроксипролина в моче может возникать в результате синтеза нового коллагена (значительные количества вновь образованного белка разрушаются и экскретируются, даже не войдя в состав ткани) и в результате оборота определенных белков крови, а также и других белков, содержащих гидроксипролин. Более того, примерно 80% свободного гидроксипролина, происходящего в результате разрушения белка, подвергается метаболизму в печени и вовсе не попадает в мочу.

Kivirko K.I.Int. Rev. Connect. Tissue Res. 5 93 (1970) и Weis P.H. Klein L. Clin. Invest 48 I (1969) Гидроксилизин и его гликозидные производные, принадлежащие к коллагеновым белкам, считаются более действенными в качестве маркеров разрушения коллагена, чем гидроксипролин. Однако по тем же причинам, приведенным выше для гидроксипролина, гидроксилизин и его гликозиды, вероятно в равной степени не могут служить специфическими маркерами резорбции кости. Krane S.M. Simon L. S.Develop. Biochem. 22, 185 (1981).

Помимо уникальных для коллагена аминокислот различные неколлагеновые белки костной ткани, такие как остеокальцин, или продукты разрушения таких белков создали основу иммуноализа, направленного на определения костного метаболизма. Pvice P.A. и др. J. Clin. Invest, 66 878 (1980) и Gundber C.M. т др. Meth. Enzymol, 107 516 (1984). Однако сейчас очевидно, что неколлагеновые белки костного происхождения, являясь потенциально полезными метками костной метаболической активности, вряд ли сами по себе способны служить количественной мерой костной резорбции. Например, концентрация остеокальцина в сыворотке крови колеблется в довольно широких пределах как при отсутствии, так и при наличии метаболического костного заболевания. Концентрация остеокальцина повышена в состоянии повышенного разрушения скелета, однако, неясно является ли это следствием возросшего синтеза или разрешения костей. Krane S.M. и др. Develop. Biochem, 22 (1981), Price P.A. и др. j. Clin. Invest, 66 878 (1980) и Gundber C.M. и др. Meth. Enzymol, 107, 516 (1984) Полимеры типа, принадлежащего к коллагену позвоночных, для нормального функционирования требуют образования за счет альдегидных групп поперечных связей. Альдегиды коллагена происходят от нескольких специчных лизиновых или гидроксилизиновых боковых цепей под действием лизилоксидазы. Различные ди-, три- и тетрафункциональные сшивающие аминокислоты образуются в спонтанных внутри- и межмолекулярных реакциях таких альдегидов в пределах вновь образованных коллагеновых полимеров, при этом тип сшивающего остатка меняется специфично в зависимости от типа ткани (см. Eyre D.R. и др. Ann. Rev. Biochem, 53 717 - 748 (1984).

Можно отличить два основных пути сшивания для полосатого (повтор в 67 нм) фибриллярного коллагена, один из которых основан на лизиновых альдегидах, а другой - на гидроксилизиновых альдегидах. Путь с участием лизиновых альдегидов доминирует в коже взрослого субъекта, роговице, склере и сухожилие крысиного хвоста, а также часто протекает в других мягких соединительных тканях. Путь с участием гидроксилизиновых альдегидов доминирует в костях, хрящах, связках, большинстве сухожилий и большинстве внутренних соединительных тканей организма (Eyre D.R. и др. (1974) см. выше). Выбор пути зависит от того, гидроксилированы или нет лизиновые остатки в тех участках телопептида, в которых позднее под действием лизилоксидазы будут образованы альдегидные остатки (Barnes M.J. и др. Biochem. J. 139 461 (1974) Химическое строение зрелых сшитых аминокислот, образованных на пути с участием лизиновых альдегидов, неизвестно, однако остатки гидроксипиридиния идентифицированы в качестве зрелых продуктов на пути с участием гидроксилизиновых альдегидов. На обоих путях и в большинстве тканей промежуточные, восстанавливаемые боргидридом остатки исчезают по мере вызревания вновь образованного коллагена, указывая на то, что они являются сравнительно короткоживущими промежутками образования (Bailey, A.J. и др. FEBS Lett, 16 86 (1971). Исключения составляют кости и дентин, в которых способные восстанавливаться остатки сохраняются в заметной концентрации в течение всей жизни, что видимо частично связано с быстрой минерализацией вновь образованных коллагеновых фибрилл, которые ингибируют дальнейшее спонтанное сшивающее взаимодействие (Eyre D.R. в книге "Химия и биология минерализованных соединительных" ред. Veis A. , стр. 51 - 55 (1981), Эльзевир, Нью-Йорк, а также Walter S.C. и др. Calc. Tiss Inll, 35 401 - 405 (1983).

Идентифицированы две химические формы 3-гидроксипиридиевой поперечной связи (формулы I и II). Оба соединения характеризуются естественной флуоресценцией с одинаковым характеристическим спектром возбуждения и эмиссии (Fujim oto D. и др. Biochem. Biophys. ReS. Commun, 76 1124 (1977) и Eyre D. P. Develop. Biochem., 22 50 (1981). Данные аминокислоты могут быть разделены и подвергнуты анализу непосредственно в тканевых гидролизатах с хорошей чувствительностью с использованием ВЭЖХ с обращением фаз и флуоресцентного детектирования (Eyre D. R. и др. Analyle. Biochem. 137, 380 - 388 (1984) Необходимо отметить, что настоящее изобретение включает количественное определение конкретных пептидов, а не аминокислот.

Известно, что у растущих животных указанные вызревшие поперечные связи могут концентрироваться в большей степени в неминерализованной части костного коллагена по сравнению с минерализованным коллагеном (Banes A.J. и др. Biochem. Biophys. Res. Commun. 113 (1983) Однако другие исследования, проведенные на костях телят или взрослого человека, не подтверждают данной концепции (Eyre D.R. в книге "Химия и биология минерализованных тканей" (ред. Bullev. W.T.), стр. 105, (1985), Эбско Медиа Инк, Бирмингем, Алабама).

О присутствии коллагеновых гидроксипиридиниевых сшивок в моче впервые сообщено Gunja-Smith и Boucek (Gunja-Smith. Z и Boucek R.J., Biochem. J., 187, 759 - 762 (1981), которые использовали длительную процедуру выделения пептидов и обычный минокислотный анализ. В то время им была известна только ГП-форма сшивки. В работе Robins SP, Biochem. J., 207 617 - 620 (1982) сообщается о ферментивно связанном иммуноаналиазе для определения ГП в моче, в котором создают поликлональные антитела к свободной аминокислоте, сопряженной с альбумином бычьей сыворотки. Данный анализ направлен на создание указателя для регистрации повышенного разрушения суставов, происходящего в случае артритных заболеваний, и основан, согласно Robins, на том открытии, что пиридинолин в гораздо большей степени преобладает в хрящах, а не в костном коллагене.

В более поздней работе, относящейся к ферментативно связанному иммуноанализу, Robins сообщает, что лизилпиридинолин нереакционноспособен по отношению к антисыворотке к пиридинолину, ковалентно связанному с альбумином бычьей сыворотки (Robins и др. , Ann. Pheum. Diseases, 45 969 - 973 (1986) Указатель Робинса в моче для разрушения хрящей основан на том открытии, что гидроксилизилпиридинолин, происходящий в первую очередь из хрящей, обнаруживается в моче в концентрациях, пропорциональных степени резорбции (т.е. разрушения) хряща суставов. В принципе этот указатель может быть использован и для определения потерь хряща во всем организме, однако, при этом невозможно получить никакой информации о костной резорбции.

Также представляет интерес международная публикация N WO 89/12824 Исследовательского Института Роуэтта. Данная последняя публикация раскрывает способ регистрации разрушения коллагена, включающий анализ образца биологической жидкости, содержащего фрагмент коллагена, включающий лизилпиридинолин или гидроксилизилпиридинолин, или их замещенную форму и метод определения ткани, из которой происходит разрушенный коллаген.

Таким образом, существует необходимость в методе, позволяющем определить степень костной резорбции во всем человеческом организме. Наиболее полезный метод будет в том случае, если его можно будет применить к биологическим жидкостям, особенно к моче. Метод должен быть чувствительным, т.е. допускающим количественные определения вплоть до 1 пикомоля, и быстр, т.е. позволяющий определять степень костной резорбции за 24 часа, с тем, чтобы можно было оценить эффективность различных видов лечения (например, эстрогеном) Настоящее изобретение основано на открытии присутствия в биологических жидкостях больных и нормальных людей конкретных сшитых телопептидов. Эти телопептиды образуются in vivo в ходе разрушения и регенерации коллагена. Термин "телопептиды" используется здесь в широком смысле для обозначения сшитых пептидов, обладающих последовательностями, которые связаны с телопептидной областью, например коллагена типа II и типа III, и которые могут быть сшиты с остатком или пептидом, относящимся к трехспиральному домену коллагена. Как правило, описываемые здесь телопептиды имеют меньшее число аминокислотных остатков, чем полные телопептидные домены коллагенов типа II и типа III. Обычно телопептиды настоящего изобретения состоят из двух пептидов, соединенных пиридиниевой поперечной связью, и, кроме того, соединенных пиридиниевой поперечной связью с остатком или пептидом трехспирального домена коллагена. Раскрывая здесь строение этих телопептидов, необходимо указать (а для специалиста это очевидно), что они могут быть получены не только in vivo, например синтетически. Указанные пептиды, как правило, получают в очищенном виде, т. е. по существу без примесей, в частности без примесей других пептидов.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам определения in vivo разрушения коллагенов типа II и типа III. Способы включают количественное определение в биологической жидкости концентрации конкретного телопептида, обладающего 3-гидроксипиридиниевой поперечной связью и происходящего от разрушения коллагена. Раскрываемые настоящим изобретением способы аналогичны способам, ранее раскрытым в заявке на патент США N 118234, поданной 6 ноября 1987 г, для определения абсолютной степени костной резорбции in vivo. Данные способы включают количественное определение в биологической жидкости концентрации телопептидов, обладающих 3-гидроксипиридиниевой поперечной связью и возникающих в результате костной коллагеновой резорбции.

В представительном анализе биологическую жидкость пациента контактируют с иммунологическим связывающим партнером, специфичным на телопептид, обладающий 3-гидроксипиридиниевой поперечной связью и происходящий из коллагена типа II и типа III. Биологическая жидкость может быть использована как таковая или же может быть очищена перед стадией контактирования. Такая стадия очистки может быть осуществлена с помощью целого ряда стандартных методик, в том числе: адсорбции и элюирования в патронах, хроматографии на молекулярных ситах, диализа, ионообменной хроматографии, хроматографии на окиси алюминия, хроматографии на гидроксиапатите и сочетании таких методик.

Другие представленные воплощения количественного определения концентрации фрагментов пептида, обладающего 3-гидроксипиридиниевой поперечной связью, в биологической жидкости включают электрохимическое титрование, спектроскопию естественной флуоресценции и поглощение в ультрафиолетовой области спектра. Электрохимическое титрование может быть проведено непосредственно на биологической жидкости без ее дополнительной очистки. Однако, если это невозможно из-за большого количества загрязняющих веществ биологическую жидкость перед стадией электрохимического титрования вначале очищают. Приемлемые способы очистки перед электрохимическим детектированием включают: диализ, ионообменную хроматографию, хроматографию на окиси алюминия, хроматографию на молекулярных ситах, хроматографию на гидроксиапатите и ионообменную абсорбцию и элюирование.

Флуорометрический анализ биологической жидкости, содержащей 3-гидроксипиридиниевую поперечную связь, является альтернативным путем количественного определения разрушения коллагена (а следовательно, и костной резорбции, если количественно определяют пептид типа I). Флуорометрический анализ может быть осуществлен непосредственно на биологической жидкости без дополнительной ее очистки. Однако для определенных биологических жидкостей, в частности мочи, рекомендуется перед флуорометрическим анализом проведение очистки. Такая стадия очистки состоит из диализа аликвотного количества биологической жидкости, например мочи, относительно водного раствора с получением в результате частично очищенных фрагментов пептида, удержанных в непродиффундировавшем веществе (Ретентате). Непродиффундировавшее вещество затем лиофилизуют, растворяют в растворе с ионной парой и адсорбируют на колонке для аффинной хроматографии. Такие очищенные фрагменты пептида затем могут быть гидролизованы, а продукты гидролиза могут быть разделены хроматографически. Хроматографическое разделение может быть осуществлено либо с помощью высоко эффективной жидкостной хроматографии, либо с помощью микроканальной высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Изобретение включает пептиды, строение которых идентично строению пептидов, образующихся при разрушении коллагена и по существу несодержащих других пептидов человеческого организма, и которые могут быть получены из биологической жидкости. Такие пептиды имеют по меньшей мере одну 3-гидроксипиридиниевую поперечную связь, в частности лизилпиридинолиновую поперечную связь или гидроксилизилпиридинолиновую поперечную связь, и происходят из телопептидной области коллагена типа II или типа III, связанной с одним или несколькими остатками из трехспирального домена, обычно под воздействием эндогенных протеаз и/или пептидаз.

Строение телопептидов типа II и типа III обсуждается ниже. Кроме того, включена информация о телопептидах типа I, первоначальным источником которой является заявка на патент США N 118234.

Другой аспект настоящего изобретения включает анализ на раскрываемые здесь пептиды, в которых циклы пиридиния интактны и расщеплены. Поскольку подозревают, что некоторые из циклов пиридиния происходят in vivo, анализ, в котором обнаруживают как интактные, так и расщепленные циклы пиридиния, может привести к более тонкой оценке разрушения коллагена. В связи с данным аспектом настоящего изобретения в анализе могут быть использованы специфические связующие партнеры для индивидуальных пептидов, содержащих интактные или расщепленные циклы пиридиния. Могут быть использованы индивидуальные специфичные связующие партнеры, распознающие пептиды обоих типов (пептиды, содержащие как интактные, так и расщепленные циклы пиридиния). Или же могут быть применены специфичные связующие партнеры, различающие пептиды, содержащие интактный цикл пиридиния, и пептиды, в которых цикл пиридиния расщеплен.

Строение сшитых телопептидов, происходящих из коллагена типа I Специфичный телопептид, обладающий 3-гидроксипиридиниевой поперечной связью, происходящей из N-концевого (аминоконцевого) телопептидного домена костного коллагена типа I, характеризуется следующей аминокислотной последовательностью: Формула III где представляет гидроксилизилпиридинолин или лизилпиридинолин и Gln-глутамин или пирролидинкарбоновая кислота.

Изобретение также направлено на пептид, содержащий по меньшей мере одну 3-гидроксипиридиниевую поперечную связь, происходящую из C-концевого (карбоксиконцевого) телопептидного домена костного коллагена типа I. Такая C-концевая телопептидная последовательность сшита либо лизилпиридинолином, либо гидроксилизилпиридинолином. Пример подобной пептидной последовательности представлен формулой: Формула IV где представляет гидроксилизил- или лизилпиридинолин.

Со времени подачи заявки на патент США N 118234 изобретателем получены доказательства существования в биологических жидкостях двух дополнительных телопептидов коллагена типа I, имеющих следующее строение: Формула V и Формула VI Данные телопептиды могут также быть количественно определены способом настоящего изобретения Строение сшитого телопептида, происходящего из коллагена типа II Специфичный телопептид, обладающий гидроксилизилпиридинолиновой поперечной связью, происходящей из C-концевого телопептидного домена коллагена типа II, характеризуется следующей аминокислотной последовательностью (далее называемой центральной пептидной структурой): Формула VII где сшивающий остаток, обозначенный как Hyl-Hyl-Hyl, представлен гидроксипиридинолином (ГП)-естественным 3-гироксипиридиниевым остатком, присутствующим в зрелых коллагеновых фибрилах различных тканей.

Аминоконцевые телопептиды из коллагена типа II не обнаружены в биологических жидкостях и подозревают, что потенциальные пептиды, происходящие из N-концевой телопептидной области колагена типа II по существу разрушаются in vivo, возможно с перекрыванием всех путей к свободной ГП сшивающей аминокислоте.

Строение сшитых телопептидов, происходящих из коллагена типа III По аналогии с вышеизложенным в биологических жидкостях могут присутствовать сшитые пептиды, возникающие в результате протеолиза человеческого коллагена типа III. Такие пептиды обладают центральной структурой, отраженной следующими схожими формулами: Формула VIII Формула IX где представляет гидроксилизил- или лизилпиридинолин и Gln - глутамин или пирролидинкарбоновая кислота Скорее всего в биологических жидкостях сшитый пептид, происходящий из коллагена типа III, обладает центральной структурой формулы: Формула X происходящей из двух aI(III)N-телопептидных доменов, связанных с остатком гидроксилизилпиридинолина (Hyl-Hyl-Hyl).

Второй возможный фрагмент C-телопептидного сшивающего домена, если основываться на наблюдаемых в моче пептидах коллагена типа I и II, обладает центральной структурой формулы: Формула XI В биологических жидкостях, кроме того, могут присутствовать и подвергнуться определению меньшие и большие варианты (отличающиеся на одну-три аминокислоту в каждом компоненте цепи) указанных двух пептидов, соответствующих родственным последовательностям, приведенным выше (формулы VIII и IX). Аналогичные меньшие и большие варианты каждого пептида, охарактеризованного здесь, составляют часть настоящего изобретения.

Изобретение в целом включает всех специфичных связующих партнеров для охарактеризованных здесь пептидов. "Специфичные связующие партнеры" - это молекулы, способные связываться с пептидами настоящего изобретения. Этот термин включает иммунологических связующих партнеров, таких как антитела (моноклональные и поликлональные), антиген-связующие фрагменты антител (например, Fab и F(ab')₂ фрагменты), одноцепные антиген-связующие молекулы и т.п., полученные гибридомной или рДНК технологией.

Изобретение включает слитые клеточные гибриды (гибридомы), продуцирующие моноклональные антитела, специфичные к вышеохарактеризованным коллагеновым пептидам, обладающим 3-гидроксипиридиниевыми поперечными связями (как с интактным циклом пиридиния, так и с циклом, который расщеплен).

Изобретение, кроме того, включает моноклональные антитела, продуцированные слитыми клеточными гибридами, и эти же антитела (а также их связующие фрагменты, например Fab) в сочетании с поддающимся обнаружению маркером. Примеры поддающихся обнаружению маркеров включают: ферменты, хромофоры, флуорофоры, коферменты, ингибиторы ферментов, хемилюминесцетные вещества, парамагнитные металлы, спиновые метки и радиозотопы. Или же подобные специфичные связующие партнеры могут быть связаны с одним из членов лиганд-связующего комплекса (например, авидин-биотин), и в этом случае поддающийся обнаружению маркер может поставляться связанным с дополняющим членом комплекса.

Изобретение также включает тест-набор, применимый для количественного определения пептидов, обладающих 3-гидроксипиридиниевыми поперечными связями, возникающими в биологической жидкости в результате разрушения коллагена. Набор может включать специфичный связующий партнер для пептида, происходящего из разрушенного коллагена. Специфичные связующие партнеры могут в тест-наборе находится в сочетании с поддающимся обнаружению маркером или членом лиганд-связующего комплекса (см. выше) На фиг. 1 представлен коллаген типа I и предполагаемый источник телопептида. Не установлено, происходят ли два показанных телопептида из одной молекулы коллагена, как показано на фиг. 1, или же из двух молекул коллагена.

На фиг. 2 показана относительная флуоресценция (возбуждение при 297 нм, эмиссия при 390 нм) относительного номера фракции (4 мл), полученных в ходе очистки сшитых телопептидов хроматографией на молекулярных ситах. Сшитые коллагеновые телопептиды типа II содержатся во фракциях, обозначенных, как II.

На фиг. 3A показана относительная флуоресценция (возбуждение при 330 нм, эмиссия при 390 нм) относительно времени удерживания фракций ионообменной ВЭЖХ (ЕАЕ-5Р). Сшитые коллагеновые телопептиды типа II содержатся во фракции, обозначенной цифрой IV.

На фиг. 3B показано поглощение (297 нм) относительно времени элюирования в минутах для той же хроматографии.

На фиг. 4A показана относительная флуоресценции (возбуждение при 297 нм, эмиссия при 390 нм) по отношению к времени элюирования фракций, полученных в ходе ВЭЖХ с образованием фаз. Сшитые коллагеновые телопептиды типа II элюируются, как показано. Фракции, указанные черточкой (-), свидетельствуют на основании секвенсционного и композиционного анализа указанных пептидов о сохранении или потери в них gly(C) или pro(P) остатков.

На фиг. 4B показано поглощение (220 нм) как функция времени элюирования ВЭЖХ с обращением фаз.

На фиг. 5 приведено сравнение концентрации ГП и ЛП в кортикальном слое и губчатом веществе костей человека в зависимости от возраста.

На фиг. 6 отражено молярное отношение сшивок в ГЛ-ЛП, как функции возроста.

На фиг. 7A показана относительная флуоресценция (возбуждение при 297 нм, эмиссия при > 370 нм) как функция объема элюирования в ходе разделения сшитых N-телопептидов коллагена типа I с помощью ВЭЖХ с обращением фаз.

На фиг. 7B показана относительная флуоресценция (возбуждение при 297 нм, эмиссия при > 370 нм) относительно объема элюирования в ходе разделения сшитых C-телопептидов коллагена типа I с помощью ВЭЖХ с обращением фаз.

На фиг. 8A показана относительная флуоресценция (возбуждение при 297 нм, эмиссия при 380 нм) как функция времени элюирования сшитых коллагеновых телопептидов типа I.

На фиг. 8B показана относительная флуоресценция (возбуждение при 297 нм, эмиссия при 380 нм) как функция времени элюирования сшитых коллагеновых телопептидов типа I.

На фиг. 9 представлены опыты по связыванию представительных моноклональных антител HB 10611 с P1 пептидом (вышеприведенной формулы III, чистые квадратики), a2 (I) N-телопептидом (QYDGKGVGC, черные ромбики) и a1 (I) N-телопептидом (YDEKSTGGC, черные квадратики).

На фиг. 10 показано строение N-телопептидной области декальцинированного костного коллагена человека. P1 пептид (формула III) заключен в рамку, пептид содержит эпитоп, коорелированный с костной резорбцией.

Телопептиды коллагена типа II Центральная пептидная структура пептидов коллагена типа II может быть обнаружена в биологических жидкостях в виде компонента более крупных пептидов, несущих дополнительные аминокислоты или аминокислотные последовательности на одном или нескольких концах трехпептидных последовательностей, соединенных остатком ГП. На фиг. 1 показано, как телопептиды коллагена типа II, соединенные с трехспиральной последовательностью, могут быть образованы in vivo из человеческого источника под воздействием протеолитических ферментов-пепсина и трипсина. В биологических жидкостях могут также присутствовать и фрагменты меньшего размера, потерявшие в центральной пептидной структуре аминокислоты, в частности фрагменты из спиральной последовательности.

Как правило, вставки или делеции аминокислот в центральной пептидной структуре составляют 1-3 аминокислоты. Дополнительные аминокислоты, как правило, будут определяться телопептидной последовательностью коллагена типа II, встречающейся в естественных условиях in vivo. В качестве примеров приведены пептиды следующего строения: Формула XII и формула XIII которые могут быть выделены хроматографически из мочи, и пептид иного строения: формула XIV также может быть выделен из мочи. Кроме того, могут присутствовать гликозилированные варианты центральной структуры и ее большие или меньшие варианты, в которых остаток галактозы или остаток глюкозилгалактозы присоединен к гидроксилу боковой цепи сшивающего ГП остатка. Каждый пик на графиках, приведенных на фиг. 4A и 4B, может соответствовать сшитому фрагменту, конкр