Вакцинная композиция, способ стимулирования иммунной системы

Вакцинная композиция, способ стимулирования иммунной системы

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, оно обеспечивает вакцинные композиции аттенуированного респираторно-синцитиального вируса (RSV). Более конкретно, аттенуированный вирус может быть производным RSV, который был неполностью аттенуирован пассированием на холоду или введением мутаций, которые создают вирус, имеющий чувствительный к температуре (ts) или адаптированный к холоду (са) фенотип. Изобретение относится также к способу стимулирования иммунной системы индивидуума для индуцирования защиты против респираторно-синцитиального вируса путем введения аттенуированного RSV. Изобретение обеспечивает также чистые культуры аттенуированного RS вируса, в которых этот вирус более полно аттенуирован путем дальнейшей дериватизации (дальнейшего получения производных) идентифицированных ранее неполностью аттенуированных ts и ср мутантов. Изобретения обеспечивают высокие уровни защитного иммунитета. 2 с. и 27 з.п. ф-лы, 7 табл.

Инфекция человека респираторно-синцитиальным вирусом (RSV) варьирует от бессимптомного до тяжелого заболевания дыхательных путей. У младенцев и детей респираторно-синцитиальный вирус (RSV) рассматривается как одна из наиболее важных причин заболевания нижних дыхательных путей во всех географических зонах мира. RS вирус превосходит все другие микробные патогены в качестве причины пневмонии и бронхиолита у младенцев до 1 года и является главной причиной летального заболевания дыхательных путей у таких младенцев. Фактически все дети инфицируются в возрасте двух лет. Реинфекция имеет место с заметной частотой у детей старшего возраста и у молодых взрослых людей (Chanock et al. , in Viral Infection of Humans, 3d ed., A.S. Evans. ed., Plenum Press, N.Y. (1989)). Хотя большая часть взрослых людей не имеет серьезных заболеваний, вызываемых инфекцией RS вирусом, пожилые больные и индивидуумы с нарушенной иммунной системой могут иметь тяжелые и, возможно, угрожающие жизни инфекции.

Лечение RSV инфекции было проблематичным. Маленькие дети имеют ответные реакции в виде образования сывороточных и секреторных антител на антигены RSV и поэтому страдают от более тяжелых инфекций, тогда как кумулятивный иммунитет, по-видимому, защищает более старших детей и взрослых от серьезных форм этой инфекции. Было показано, что одно антивирусное соединение, рибавирин, может быть перспективным в лечении инфицированных младенцев в тяжелом состоянии, хотя не получены доказательства того, что оно сокращает продолжительность или уменьшает необходимость поддерживающей терапии.

Механизмы иммунитета к инфекции RSV недавно стали центром внимания исследователей. По-видимому, секреторные антитела являются наиболее важными в защите верхних дыхательных путей, тогда как высокие уровни сывороточных антител, возможно, играют главную роль в устойчивости к инфекции RSV в нижних дыхательных путях. Очищенный человеческий иммуноглобулин, содержащий высокий титр нейтрализующих антител к RSV, может оказаться применимым в иммунотерапевтических подходах к лечению тяжелого заболевания нижних дыхательных путей у младенцев и детей младшего возраста. Однако препараты иммуноглобулина имеют серьезные недостатки, такие как возможность передачи находящихся в крови вирусов и трудности и большие расходы при их приготовлении и хранении.

Несмотря на настоятельную потребность в эффективной вакцине против RS вируса, в частности, для младенцев и детей младшего возраста, прежние попытки получения надежной и эффективной вакцины были неудачными. Вакцина с инактивированным формалином вирусом, исследованная в середине 1960-х годов, не давала защиты против инфекции RS вирусом или заболеванием. Вместо этого заболевание обострялось при последующей инфекции RS вирусом. Kim et al., Am. J. Epidemiol 89:422-434; Chim et al., Am.J. Epidemiol. 89: 449-463 (1969); Kapikian et al., Am. J. Epidemiol. 89:405-421 (1969).

Для того чтобы обойти проблемы, связанные с инактивированными вакцинами и возможным изменением вируснейтрализующей антигенной детерминанты, усилия были направлены на получение аттенуированных RS мутантов. Friedewald et al., J. Amer. Med. Assoc. 204:690-694 (1968) сообщили о получении низкотемпературного пассированного мутанта RS вируса, который, по-видимому, обладал достаточной аттенуацией для того, чтобы быть кандидатом на вакцину. Этот мутант проявлял слегка увеличенную эффективность роста при 26^oC по сравнению с родительским вирусом дикого типа, но его репликация была нечувствительной к температуре и не была адаптирована к холоду. Однако пассированный на холоду мутант был аттенуированным (ослабленным) для взрослых. Хотя этот мутант был достаточно аттенуированным и иммуногенным для младенцев и детей, ранее инфицированных RSV (например, серопозитивных индивидуумов), он сохранял низкий уровень вирулентности для верхних дыхательных путей серонегативных младенцев. Этот мутант был пассирован в культуре клеток почки быка при низкой температуре (26^oC) и в результате приобрел аттенуирующие мутации круга хозяев. Приобретение этих мутаций позволяло мутанту эффективно реплицироваться в бычьих тканях, тогда как те же самые мутации ограничивали рост мутанта в дыхательных путях человека по сравнению с родительским штаммом A2 RVS.

Подобно этому Garpure et al. , J. Virol. 3:414-421 (1969) сообщили о выделении чувствительных к температуре (ts) мутантов, которые также были перспективными кандидатами на вакцины. Один мутант, ts-1, был подвергнут детальному исследованию в лаборатории и на добровольцах. Мутант вызвал бессимтомную инфекцию у взрослых добровольцев и устойчивость к введению вируса дикого типа через 45 дней после иммунизации. Опять-таки, в то время как серопозитивные младенцы и дети подвергались бессимптомной инфекции, серонегативные младенцы обнаруживали признаки ринита и другие легкие симптомы. Кроме того, была обнаружена нестабильность ts фенотипа, хотя вирус, проявляющий частичную или полную потерю чувствительности к температуре, представлял небольшую часть извлекаемого из вакцин вируса и не был ассоциирован с иными признаками заболевания, чем легкий ринит.

Таким образом, эти исследования выявили, что пассированные на холоду и чувствительные к температуре штаммы были недостаточно аттенуированы и вызывали легкие симптомы заболевания у некоторых вакцинированных индивидуумов, в частности у серонегативных младенцев, тогда как другие штаммы избыточно аттенуированы и не реплицируются в достаточном количестве для индуцирования защитных иммунных ответных реакций. (Wright et al., Infect. Immun. 37:397-400 (1982)). Генетическая нестабильность, позволяющая мутантам-кандидатам на вакцины терять их устойчивый к температуре фенотип, также была нарушающим планы открытием. См. Hodes et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 145:1159-1164 (1974). Mc Intosh et al., Pediatr. Res. 8: 689-696 (1974) и Belshe et al., J. Med. Virol. 3:101-110 (1978).

Оставив подход, предусматривающий применение вакцин с аттенуированным RS вирусом, исследователи испытали потенциальные субъединичные вакцины, основанные на гликопротеинах оболочки RS вируса, очищенных из лизатов инфицированных клеток. Эти гликопротеины индуцировали устойчивость к инфекции RS вирусом в легких хлопковых (cotton) крыс, Walsh et al., J. Infect. Dis. 155: 1198-1204 (1987), но индуцированные антитела имели очень слабую вируснейтрализующую активность и иммунизация грызунов очищенной субъединичной вакциной приводила к усилению заболевания (Murphy et al., Vaccine 8: 497-502 (1990)).

Исследовались такие вакцины, основанные на рекомбинантном вирусе осповакцины, который экспрессирует гликопротеин оболочки F или G. Эти рекомбинанты экспрессируют гликопротеины RVS, которые неотличимы от аутентичной вирусной копии, и мелкие грызуны, инфицированные внутрикожно рекомбинантными вирусами осповакцины, экспрессирующими F- и G-RSV, обнаружили высокие уровни специфических антител, которые нейтрализовали инфекционность вируса. Действительно, инфицирование хлопковых крыс рекомбинантами вируса осповакцины-F стимулировала почти полную устойчивость к репликации RSV в нижних дыхательных путях и значительную устойчивость в верхних дыхательных путях. Olmsted et al. , Proc. Natl. Asad. Sci. USA. 83:7462-7466 (1986). Однако иммунизация шимпанзе рекомбинантами вирус осповакцины -F и вирус осповакцины -G почти не давала защиты против введения RSV/Collins et al., Vaccine 8: 164-168 (1990)). Это привело к заключению, что этот подход, по-видимому, не сможет обеспечить удачной вакцины.

В то время как исследователи испытывали несколько различных подходов для получения эффективной и надежной RS вакцины в течение ряда лет. RS вирус оставался наиболее обычной причиной тяжелого вирусного заболевания нижних дыхательных путей у младенцев и детей. В результате остается настоятельная потребность в надежной вакцине, которая способна предотвращать серьезное заболевание в этой популяции, требующее часто госпитализации, и предотвращать заболевание у других индивидуумов. Совершенно удивительно, данное изобретение решает эти и близкие к ним проблемы.

Данное изобретение обеспечивает вакцинные композиции аттенуированного респираторно-синцитиального вируса. Аттенуированный вирус обеспечен в количестве, достаточном для индуцирования иммунного ответа в хозяине-человеке, в соединении с физиологически приемлемым носителем и может иногда содержать адъювант для усиления иммунного ответа хозяина. Изобретение рассматривает несколько различных антигенных подгрупп аттенуированного RS вируса, которые произведены из неполностью ослабленного RS вируса и обладают свойствами, до сих пор не обнаруживаемыми аттенуированными RS вирусами, описанными ранее в литературе. В одном из вариантов изобретения аттенуированный вирус содержит RS вирус с ограниченным кругом хозяев, неполностью ослабленный пассированием на холоду (cp RSV), в который введены по меньшей мере одна или несколько дополнительных мутаций для получения вируса и его потомства, имеющих чувствительный к температуре фенотип (ts), обозначаемый далее cpts RSV. В другом варианте RS вирус с ограниченным кругом хозяев, неполностью ослабленный пассированием на холоду (cp RSV), адаптируют к холоду (ca) пассированием при более пониженных температурах для введения дополнительных ограничивающих рост мутаций. Еще в одном варианте неполностью ослабленные ts мутанты RSV, такие как ts-4 и ts-1 NGI RSV, ослаблены далее введением дополнительных мутаций. Аттенуированные производные ts или cp штаммов получают несколькими путями, но предпочтительно введением дополнительных чувствительных к температуре мутаций при помощи химического мутагенеза, дальнейшим пассированием в культуре при ослабляющих температурах 20-24^oC или введением мутаций малых бляшек (Small plaque) (cp) и отбором производных, которые более ограничены в репликации, чем неполностью аттенуированный родительский мутантный штамм. Этот аттенуированный вирус изобретения принадлежит к антигенной подгруппе либо A, либо B и вирус из обеих подгрупп может быть объединен в вакцинных препаратах для большего охвата преобладающих RSV инфекций. Вакцину обычно готовят в дозе 10³ - 10⁶ бляшкообразующих единиц (PFU) или в более высокой дозе для максимальной эффективности.

В других вариантах изобретение обеспечивает способы стимулирования иммунной системы индивидуума для индуцирования защиты против респираторно-синцитиального вируса. Способы предусматривают введение индивидууму иммунологически достаточного количества RSV, аттенуированного введением мутаций, которые придают характер ts, ca и (или) sp фенотипа RSV, исходно неполностью аттенуированному ts мутацией (мутациями) или пассированием при низкой температуре, например, при 26^oC. Ввиду потенциальных тяжелых последствий инфекции RSV у новорожденных, серонегативных и серопозитивных младенцев и детей младшего возраста, а также у пожилых людей, иммунизация в соответствии с данными способами обычно наиболее полезна для этих индивидуумов. В большинстве случаев аттенуированный вирус вводят в дыхательные пути индивидуума, предпочтительно интраназально в виде аэрозоля или капель.

В дальнейших вариантах изобретение обеспечивает чистые культуры аттенуированного RS вируса, в которых вирус был более полно аттенуирован дальнейшей дериватизацией идентифицированных ранее ts или cp мутантов. Этот аттенуированный вирус способен вызывать защитный иммунный ответ в инфицированном хозяине-человеке, но в то же время достаточно ослаблен, так что не вызывает нежелательных симптомов тяжелого респираторного заболевания в иммунизированном хозяине. Аттенуированный вирус может находиться в супернатанте клеточной культуры, может быть выделен из культуры или частично, либо полностью очищен. Вирус может быть лиофилизирован и может быть соединен со множеством других компонентов для хранения или доставки хозяину, по желанию.

Описание характерных вариантов Данное изобретение обеспечивает RS вирус, пригодный для применения в качестве вакцины для человека. RS вирус, описанный здесь, получают введением дополнительных мутаций в штаммы во время роста вируса в клеточных культурах, к которым добавляют химический мутаген, отбором вируса, подвергнутого пассированию при субоптимальной температуре для введения ограничивающих рост мутаций, или отбором подвергнутого мутагенезу вируса, который продуцирует малые бляшки в клеточной культуре.

Таким образом, вакцина данного изобретения содержит аттенуированный RS вирус и физиологически приемлемый носитель. Вакцину вводят в иммуногенно достаточном количестве индивидууму, нуждающемуся в иммунологической защите против RS вируса, например, младенцу, ребенку, пожилым людям или взрослым для иммуносупрессивной терапии. Вакцина вызывает иммунный ответ, защищающий против серьезного заболевания нижних дыхательных путей, например, пневмонии и бронхиолита, при последующем инфицировании индивидуума RS вирусом дикого типа. Хотя циркулирующий в природе вирус еще способен вызывать инфекцию, в частности, в верхних дыхательных путях, в результате вакцинации очень сильно снижается возможность ринита и возможно повышение устойчивости при последующей инфекции вирусом дикого типа. После вакцинации образуются детектируемые уровни сывороточных и секреторных антител у хозяина, которые способны нейтрализовать гомологичный (той же самой подгруппы) вирус дикого типа in vitro и in vivo. Во многих случаях антитела хозяина будут также нейтрализовать вирус дикого типа другой, невакционной подгруппы. Для достижения более высоких уровней перекрестной защиты, т.е. защиты против гетерологичных штаммов другой подгруппы, предпочтительно вакцинировать индивидуумов аттенуированным вирусом по меньшей мере из одного предпочтительного штамма как подгруппы A, так и B.

Аттенуированный вирус, являющийся компонентом вакцины, находится в ней в выделенном и обычно очищенном виде. Под словом "выделенный" имеют ввиду, что аттенуированный модифицированный RS вирус находится в другой среде по сравнению с обычной природной средой обитания вируса дикого типа, такой как носоглотка инфицированного индивидуума. Более конкретно, "выделенный" обозначает, что аттенуированный вирус находится в виде гетерологичного компонента в клеточной культуре или иной системе. Например, аттенуированный RS вирус данного изобретения может быть продуцирован инфицированной клеточной культурой, отделен от нее и добавлен к стабилизатору, содержащему другие, не встречающиеся в природе RS вирусы, например, вирусы, которые выбраны как аттенуированные по устойчивости к нейтрализующим моноклональным антителам к F-белку, как описано в одновременно представленном U.S. patent application attorney docket 15280-11-2, даваемом здесь в виде ссылки.

Аттенуированный RS вирус данного изобретения обнаруживает очень заметное уменьшение вирулентности при сравнении с вирусом дикого типа, циркулирующего природно в людях. Аттенуированный вирус достаточно ослаблен, так что симптомы инфекции не наблюдаются в большинстве иммунизированных индивидуумов. В некоторых случаях аттенуированный вирус еще способен диссеминировать к невакционированным индивидуумам. Однако его вирулентность достаточно подавлена, так что в вакцинированном или случайном хозяине не бывает серьезных инфекций нижних дыхательных путей.

Уровень аттенуации можно определить, например, определением количества вируса, присутствующего в дыхательных путях иммунизованного хозяина и сравнением этого количества с количеством, продуцируемым RS вирусом дикого типа или другими аттенуированными RS вирусами, которые оценивались как кандидаты вакцинных штаммов. Например, аттенуированный вирус данного изобретения имеет более высокую степень ограничения репликации в верхних дыхательных путях высокочувствительного хозяина, такого как шимпанзе, по сравнению с уровнями репликации вируса дикого типа, например, в 10-1000 раз меньше. Также уровень репликации аттенуированного вакцинного штамма RSV в верхних дыхательных путях шимпанзе был ниже, чем уровень репликации неполностью аттенуированного мутанта A2ts-1RSV. Для дальнейшего снижения развития ринореи, связанной с репликацией вируса в верхних дыхательных путях, идеальный вакцинный вирус-кандидат должен проявлять пониженный уровень репликации как в верхних, так и в нижних дыхательных путях. Однако аттенуированные вирусы данного изобретения должны быть достаточно инфекционными и иммуногенными в человеке для выработки защиты в вакцинированных индивидуумах. Способы определения уровней RS вируса в носоглотке инфицированного хозяина хорошо известны в литературе. Пробы получают аспирацией или вымыванием носоглоточных секреций (выделений) и количество вируса определяют при помощи лабораторного способа. См., например, Belshe et al., J. Med. Virology 1:157-162 (1977). Friedewald et al., J. Amer Med. Assoc. 204: 690-694 (1968); Gharpure et al., J. Virol. 3: 414-421 (1969) и Wright et al., Arch. Ges Virusforsch. 41: 238-247 (1973). Вирус может быть измерен пригодным для этого способом в носоглотке хозяев-животных, таких как шимпанзе.

Для получения удовлетворительно аттенуированного производного вируса данного изобретения мутации вводят в родительский вирусный штамм, который неполностью или частично аттенуирован, такой как ts-1 или ts-4 мутант или cp RSV. Для вируса подгруппы A предпочтительным неполностью аттенуированным родительским вирусом является ts-1 или ts-1 NG-1 или cp RSV, которые представляют собой мутанты штамма A2 подгруппы A или их производные или субклоны.

Частично ослабленные мутанты вируса подгруппы B моно получить биологическим клонированием вируса подгруппы B дикого типа в приемлемом клеточном субстрате и получением из него мутантов пассированием на холоду, а также при помощи химического мутагенеза с образованием ts мутантов или отбором мутантов, образующих малые бляшки. Различные способы отбора можно также комбинировать для получения частично аттенуированных мутантов подгрупп A или B, пригодных для дальнейшей описанной здесь дериватизации.

Как только отобран (отобраны) желаемый частично аттенуированный родительский штамм (штаммы), дальнейшее аттенуирование, достаточное для получение вакцины, приемлемой для применения в человеке, согласно данному изобретению выполняется несколькими путями, как описано здесь.

Согласно данному изобретению, cp мутант может быть подвергнут дальнейшему мутагенезу различными путями. В одном из вариантов способ предусматривает пассирование частично ослабленного вируса в клеточной культуре при прогрессивно более низких, ослабляющих температурах. Например, в то время как вирус дикого типа в типичном случае культивируют приблизительно при 34-35^oC, частично аттенуированные мутанты получают пассированием в клеточных культурах (например, в первичных клетках почек быков) при субоптимальных температурах, например, при 26^oC. Эти мутанты имеют слабое, но четко выраженное доказательство адаптации к холоду (ca), т.е. повышенную эффективность роста при 26^oC по сравнению с родительским вирусом дикого типа, но обычно не ts. Так, в одном способе данного изобретения cp мутант или другой частично ослабленный штамм, например, ts-1 или sp, адаптируют для эффективного роста при пониженной температуре пассированием в клетках MRС-5 или Vero до температуры приблизительно 20-24^oC, предпочтительно 20-22^oC. Этот отбор мутантного RS вируса во время холодного пассирования в основном исключает какую-либо остаточную вирулентность в производных штаммах по сравнению с частично аттенуированным родителем.

В другом варианте изобретения неполностью аттенуированные штаммы подвергают химическому мутагенезу для введения ts мутаций или, в случае вирусов, которые уже ts (чувствительны к температуре), дополнительные ts мутации достаточны для увеличения стабильности ts фенотипа аттенуированного производного. Способы для введения ts мутаций в RS вирус предусматривают репликацию вируса в присутствии мутагена, такого как 5-фторуридин или 5-фторурацил в концентрации приблизительно 10^-3 - 10^-5 М, предпочтительно приблизительно 10^-4 М, или экспонирование вируса с нитрозогуанидином при концентрации приблизительно 100 мкг/мл в соответствии с общим способом, описанным, например, в Gharpure et al., J. Virol. 3: 414-421 (1969) и Richardson et al. , J. Med. Virol. 3: 91-100 (1978). Можно использовать и другие химические мутагены. Аттенуирование может быть результатом ts мутации почти в любом гене RS вируса. Уровень температурной чувствительности репликации аттенуированного RS вируса изобретения определяют сравнением его репликации при разрешающей температуре с репликацией при нескольких ограничивающих температурах. Самая низкая температура, при которой репликация вируса снижается в 100 раз или более по сравнению с его репликацией при пермиссивной температуре, названа температурой выключения (shutoff). В экспериментальных животных и людях как репликация, так и вирулентность RS вируса коррелируют с температурой выключения мутанта. Репликация мутантов с температурой выключения 39^oC умеренно ограничена, тогда как мутанты с температурой выключения 38^oC размножаются менее хорошо и симптомы болезни в основном ограничиваются верхними дыхательными путями. Вирус с температурой выключения 35-37^oC должен быть полностью ослаблен в человеке. Так, аттенуированный RS вирус изобретения, который чувствителен к температуре, имеет температуру выключения в диапазоне приблизительно 35-39^oC, предпочтительно 35-38^oC. Добавление свойства чувствительности к температуре частично аттенуированному штамму создает полностью аттенуированный вирус, применимый в вакцинных композициях данного изобретения.

В дополнение к критериям жизнеспособности, ослабленности и иммуногенности свойства производного, которое отбирают, должны также быть несколько возможно стабильными, так чтобы желаемые признаки сохранялись. Генетическая нестабильность ts фенотипа после репликации in vivo была правилом для ts вирусов (Murphy et al., Infect. and Immun. 37: 235-242 (1982)). Затем идеально, если вирус, применяемый в вакцинах данного изобретения, сохраняет жизнеспособность, ослабленность, способность размножаться в иммунизированном хозяине (хотя и с низкими уровнями) и способность эффективно индуцировать иммунный ответ в вакцинированных индивидуумах, достаточный для защиты против серьезного заболевания, вызываемого последующей инфекцией вирусом дикого типа. Очевидно, что известные до сих пор и описанные мутанты RS вируса не отвечают всем этим критериям. Действительно, вопреки ожиданиям, основанным на результатах, сообщенных для известных аттенуированных RS вирусов, некоторые из вирусов данного изобретения, имеющие минимально две-три разные мутации, не только жизнеспособны и более ослаблены, чем прежние мутанты, но и более стабильны генетически in vivo, чем исследованные ранее мутанты, и сохраняют способность стимулировать защитный иммунный ответ и в некоторых случаях расширять защиту, полученную в результате множественных модификаций, например, индуцировать защиту против различных вирусных штаммов или подгрупп или защиту на различной иммунологической основе, например, на основе секреторных, а не сывороточных иммуноглобулинов, на основе клеточного иммунитета и т.п.

Аттенуированный вирус данного изобретения может быть размножен в ряде клеточных линий, которые пригодны для роста RS вируса. RS вирус растет во многих человеческих и животных клетках. Предпочтительными клеточными линиями для размножения аттенуированного RS вируса для применения в вакцинах являются клетки DBS-FRhL-2, MRC-3 и Vero. Наибольшие выходы вируса обычно достигаются в гетероплоидных линиях, таких как клетки Vero. Обычно клетки инокулируют вирусом при множественности заражения в диапазоне 0,001-1,0 или более. Клетки культивируют при условиях, разрешающих репликацию вируса, например, при 30-37^oC в течение 3-5 дней или так долго, как это необходимо для достижения требуемого титра. Вирус удаляют из клеточной культуры и отделяют от клеточных компонентов, обычно хорошо известными способами, например, центрифугированием, и, если нужно, очищают далее при помощи способов, известных специалистам данной области.

Вирус, аттенуированный, как описано здесь, может быть испытан в моделях in vitro и in vivo для подтверждения адекватного аттенуирования, генетической стабильности и иммуногенности для применения в вакцинах. В тестах in vitro модифицированный вирус тестируют на sp фенотип. Далее модифицированные вирусы тестируют в животных моделях RS инфекции. Описаны многие животные модели, которые суммированы в Meignier et al., eds., Animal Models of Respiratory Synсytial Virus Infection, Merieux Foundation Publication, (1991), даваемой в виде ссылки. Модель инфекции RSV хлопковых крыс описана в U.S. 4800078 и Prince et al., Virus Res. 3: 193-206 (1985), включенных в ссылки. Эта модель, как считают, предсказывает аттенуирование и эффективность в человеке. Модель RS инфекции приматов с применением шимпанзе предсказывает аттенуирование и эффективность в человеке и описана в деталях в Richardson et al. , J. Med. Virol. 3: 91-100 (1978); Wright et al., Infect. Immun. 37: 397-400 (1982); Crowe et al. , Vaccine (1993) (in press), включенных в ссылки.

Например, было показано, что терапевтическое действие RSV нейтрализующих антител в инфекционных крысах было очень близким к последующему опыту с иммунотерапией обезьян и человека, инфицированных RSV. Действительно, хлопковая (cotton) крыса, по-видимому, является надежным экспериментальным заменителем для изучения ответа инфицированных обезьян и людей на иммунотерапию RSV нейтрализующими антителами. Например, количество RSV нейтрализующих антител, дающих терапевтический эффект на крысах, измеренный по уровню таких антител в сыворотке обработанных животных (т.е. титр RSV нейтрализующей сыворотки 1: 302 - 1:518) лежит в том же самом диапазоне, который продемонстрирован для обезьян (т.е. титр 1:539) или младенцев человека или детей младшего возраста (т.е. 1:877). Терапевтическое действие в крысах проявлялось в виде 100-кратного или большего снижения титра вируса в легком (Prince et al. , J. Virol. 61: 1851-1854), тогда как в обезьянах терапевтическое действие проявлялось в виде 50-кратного снижения титра легочного вируса. (Hemming et al., J. Infect. Dis. 152: 1083-1087 (1985)). Наконец, терапевтическое действие в младенцах и детях младшего возраста, госпитализированных с тяжелым RSV бронхиолитом или пневмонией, проявлялось в виде значительного увеличения оксигенации в подвергнутой лечению группе и значительном снижении количества RSV, извлекаемого из верхних дыхательньых путей прошедших лечение больных. (Hemming et al. , Antimicrob. Agents _ Chemother. 31: 1882-1886 (1987)). Следовательно, на основе этих исследований видно, что хлопковая крыса представляет собой удобную модель для предсказания успеха RSV вакцины у младенцев и детей младшего возраста. Другие грызуны, в том числе хомяки и мыши, должны быть также применимыми, поскольку эти животные могут допускать репликацию в них RSV и имеют температуру внутри тела, подобную температуре человека (Wight et al. , J. Infect. Dis. 122: 501-512 (1970) и Anderson et al., J. Gen. Virol. 71: (1990)).

Для применения в вакцинах аттенуированный вирус данного изобретения можно использовать непосредственно в препарате вакцины или он может быть лиофилизирован, если желательно, при помощи известных протоколов лиофилизации. Лиофилизированный вирус обычно хранят приблизительно при 4^oC. Перед использованием лиофизилированный вирус воссоздают в стабилизирующем растворе, например, солевом растворе или в растворе, содержащем SPG, Mg⁺⁺ и HEPES, с адъювантом или без него, как описано ниже.

Таким образом, RS вирусные вакцины изобретения содержат в качестве активного ингредиента иммунногенно эффективное количество аттенуированного RS вируса, как описано здесь. Аттенуированный вирус может быть введен в хозяина, в частности человеку, с физиологически приемлемым носителем и(или) адъювантом. Применимые носители хорошо известны в этой области и представляют собой, например, воду, содержащую буфер воду, 0,4%-ный солевой раствор, 0,3%-ный глицин, гиалуроновую кислоту и т.п. Полученные водные растворы могут быть упакованы для применения или лиофилизированы, причем лиофилизированный препарат соединяют со стерильным раствором перед введением, как упомянуто выше. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для создания близких к физиологическим условий, такие как корректоры pH и буферные средства, корректоры тоничности, смачивающие вещества и т.п., например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, сорбитанмонолаурат, олеат триэтаноламина и т.п.

При инокуляции композицией аттенуированного RS вируса, как описано здесь, через аэрозоль, капли, грубый спрей, пероральным, топическим или иным путем, наиболее предпочтительным для интраназальной доставки, иммунная система хозяина отвечает на вакцину образованием антител, как секреторных, так и сывороточных, специфических для белков RS вируса. В результате вакцинации хозяин становится по меньшей мере частично или полностью иммунным к инфекции RS вирусом или устойчивым к развитию умеренной или тяжелой RS вирусной инфекции, в частности, нижних дыхательных путей.

Вакцинные композиции, содержащие аттенуированный RS вирус данного изобретения, вводят лицу, восприимчивому к инфекции RS вирусом или по иной причине подвергающемуся опасности инфекции RS вирусом, для усиления возможностей собственной иммунной системы индивидуума. Такое количество определено как "иммуногенно эффективная доза". При этом точные количества зависят от состояния здоровья больного и его веса, способа введения, природы препарата и т. д. , но находятся в диапазоне приблизительно 10³ - 10⁶ бляшкообразующих единиц (PFU) или более вируса на больного, более типично, приблизительно 10⁴ - 10⁵ PFU вируса на больного. В любом случае вакцинные препараты должны обеспечить количество аттенуированного RV вируса данного изобретения, достаточное для эффективной защиты больного против тяжелой или угрожающей жизни инфекции RS вирусом.

Аттенуированный RS вирус изобретения одной определенной RS подгруппы или одного штамма может быть соединен с аттенуированными вирусами другой подгруппы или других штаммов для получения защиты против множественных RS вирусов. В типичном случае различные модифицированные вирусы должны находиться в смеси и вводиться одновременно, но они могут вводиться и раздельно. Благодаря феномену перекрестной защиты среди определенных штаммов вируса иммунизация одним штаммом может защищать против нескольких различных штаммов той же самой или другой подгруппы.

В некоторых случаях может быть желательным комбинирование вакцин аттенуированного вируса данного изобретения с вакцинами, которые индуцируют защитные ответные реакции на другие агенты, в частности, на другие поражающие детей вирусы. Например, вакцину данного изобретения можно вводить одновременно (в типичном случае раздельно) или последовательно с вакциной против вируса парагриппа, как это описано в Clements et al., J. Clin. Microbiol. 29: 1175-1182 (1991).

Можно проводить одноразовые или множественные введения вакцинных композиций изобретения. Для новорожденных и младенцев до 2 лет множественное введение может быть необходимым для индуцирования достаточных уровней иммунитета. Введение следует начинать на первом месяце жизни и продолжать с интервалами, например, в 2 месяца, шесть месяцев, один год и два года, что необходимо для поддержания достаточных уровней защиты против нативной (дикого типа) RS вирусной инфекции. Подобным образом, взрослым, которые особенно восприимчивы к повторяющейся или тяжелой RS вирусной инфекции, например, работникам медико-санитарной помощи, дневной медицинской помощи, членам семей с детьми младшего возраста, пожилым людям, индивидуумам с нарушенной кардиолегочной функцией и т.д. могут быть необходимы многократные иммунизации для создания и(или) поддержания иммунных ответных реакций. Уровни индуцированного иммунитета могут прослеживаться путем измерения количеств нейтрализующих секреторных или сывороточных антител, и корректированные дозировки или вакцинации могут повторяться при необходимости для поддержания желаемых уровней защиты.

Для иллюстрации (но не для ограничения) приведены следующие примеры.

Пример I Выделение и характеристика полученных в результате мутагенеза производных пассированного на холоду RSV.

Этот пример описывает химический мутагенез неполностью аттенуированого cp RSV с ограниченным кругом хозяев для получения производных ts и cp штаммов, которые более сильно ослаблены и, следовательно, предпочтительны для применения в вакцинных препаратах RSV.

Был приготовлен родительский исходный запас пассированного на холоду RSV (cp RSV). Вирус Flow Laboratories Lot 3131, родительский cp RSV, который неполностью аттенуировали в человеке, пассировали дважды в клетках MRC-5 при 25^oC, в конце разбавляли в два раза в клетках MRC-5 при 25^oC, затем пассировали три раза в клетках MRC-5 для получения суспензии cp RSV для мутагенеза.

cp RSV подвергали мутагенезу выращиванием родительской исходной популяции в MRC-5 клетках при 32^oC в присутствии 5-фторурацила в среде при концентрации 410^-4 М. В предварительных исследованиях было показано, что эта концентрация является оптимальной, поскольку она вызывала 100-кратное снижение титра вируса на 5-й день роста в культуре клеток по сравнению со средой без 5-фторурацила. Затем подвергнутую мутагенезу исходную популяцию анализировали методом бляшек (пятен) на клетках Vero, которые поддерживались под верхним слоем агара, и после определенного интервала инкубирования бляшки окрашивали красителем нейтральным красным. 854 бляшки извлекали и потомство каждой бляшки отдельно размножали путем выращивания на свежих монослоях клеток Vero. Содержимое каждой из тканевых культур инокулировали потомством одной бляшки подвергнутого мутагенезу cp RSV, собирали отдельно, когда эффекты подтверждения на клетках Vero казались максимальными. Потомство вируса, обнаруживающее чувствительный к температуре (ts) или содержащий малые бляшки (sp) фенотип, находили титрованием пулов бляшек на HEp-2 клетках при 32^oC и 38^oC. Каждый вирус, обнаруживающий sp фенотип (размер бляшек был уменьшен на 50% или более по сравнению с родительским вирусом при 32^oC) или ts фенотип (100-кратное снижение титра при ограничивающей температуре 37^o-40^oC по сравнению с 32^oC) оценивали далее. Эти штаммы биологически клонировали серийной очисткой бляшек на клетках Vero три раза и затем размножали на клетках Vero. Клонированные штаммы титровали при 32^o, 37^o, 38^o, 39^o и 40^o (в тесте эффективности бляшкообразования (ECP)) для подтверждения их sp и ts фенотипов. Поскольку титры некоторых клонированных штаммов были относительно низкими даже при пермиссивной температуре (32^oC), эти вирусы пассировали один раз в HEp-2 клетках, получая вирусные суспензии для анализа in vitro. Фенотипы потомства подвергнутого мутагенезу cp RSV представлены в табл. 1 (табл. 1-17 см. в конце описания).

Одно из мутантных потомств имело фенотип малых бляшек, RSV cpsp-143 (sp обозначает фенотип малых бляшек (sp), остальные мутантные потомства имели ts фенотип. RSV cpts мутанты обнаруживают вариации в способности продуцировать бляшки в монослойных культурах in vitro в диапазоне температур 37^oC - 40^oC. Так, cpts 368 сохраняет способность продуцировать бляшки при 40^oC, тогда как наиболее чувствительный к температуре (ts) вирус, cpts 248, не мог продуцировать бляшки при 38^oC. Таким образом, некоторые из подвергнутых мутагенезу cp RSV потомств обнаруживают заметное отличие от родительского cp RS вируса в отноше