Способ лечения, антитела, гибридома

Способ лечения, антитела, гибридома

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии и иммунологии, и касается лечения В-клеточной лимфомы. Предложено новое иммунологически активное химерное антитело - анти- СД 20, в том числе радиоактивное меченое, а также гибридома, секретирующая специфическое в отношении СД 20-антигена антитело. Способ лечения заключается во введении препаратов указанного антитела, в том числе поэтапно в три стадии при использовании различных терапевтически эффективных количеств этих антител. Изобретение приводит к повышению специфичности воздействия на злокачественные клетки. 8 с. и 7 з.п. ф-лы, 27 ил., 3 табл.

Уведомление об авторском праве 37 C.F.R. 1.74 (d) / (e) Часть заявленного в этом патентном документе содержит материал, который является предметом защиты авторского права. Автор не возражает против воспроизведения кем бы то ни было этого патентного документа или материала, заявленного в нем, в том виде, в каком он появляется в картотеках патентов или регистрационных протоколах Patent and Trademark office, но во всех других случаях оговаривает все авторские права.

Заявки, касающиеся предмета данной заявки Эта заявка является частичным продолжением заявки United States Serial N 07/978891, представленной 13 ноября 1992, ожидающей решения. Этот патентный документ близок к United States Serial N 07/977691 с заголовком "ПОВРЕЖДЕННАЯ ДОМИНАНТНАЯ СЕЛЕКТИРУЕМАЯ МАРКЕРНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДЛЯ УСИЛЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ПРОДУКТА СОЕДИНЕННОГО С НЕЙ ГЕНА И СОДЕРЖАЩИЕ ЕЕ ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ ВЕКТОРНЫЕ СИСТЕМЫ" (ожидающей решения, представленной 13 ноября 1992) и "ПОВРЕЖДЕННАЯ ДОМИНАНТНАЯ СЕЛЕКТИРУЕМАЯ МАРКЕРНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ И СТРАТЕГИИ ИНТРОННЫХ ВСТАВОК ДЛЯ УСИЛЕНИЯ ЭКСПЕРССИИ ГЕННОГО ПРОДУКТА И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ ВЕКТОРНЫЕ СИСТЕМЫ" U. S. Serial N (представленной одновременно с данной заявкой). Эти близкие по теме патентные документы включены здесь в виде ссылки.

Содержание A. Область изобретения B. Предпосылки изобретения C. Краткое изложение сущности изобретения D. Краткое описание рисунков E. Детальное описание предпочтительных вариантов F. Примеры I. РАДИОАКТИВНО МЕЧЕННОЕ АНТИ-CD 20 АНТИТЕЛО 2B8 A. Получение анти-CD20 моноклональных (мышиных) антител ("288") B. Получение конъюгата 2B8-MX-DPTA i. MX - DTPA ii. Получение 2B8 iii. Конъюгировании 2B8 с MX-DTPA iv Определение включения MX-DTPA v Иммунореактивность 2B8-MX-DTPA vi Получение меченного индием-[III] 2B8-MX-DTPA ("12B8") vii Получение меченного иттрием-[90]-2B8-MX-DTPA ("Y2B8") C. Исследования на животных (не человеке) i Распределение радиоактивного меченного 2B8-MX-DTPA ii Локализация 12B8 в опухоли iii Исследования биораспределения и локализации опухоли с применением 2B8-MX-DTPA D Исследования на человеке i 2B8 и 2B8-MX-DTPA: иммуногистологические исследования с тканями человека ii Клинический анализ 12B8 (томография) и Y2B8 (терапия) a. Клиническое исследование фазы I/II: Исследование терапии с применением однократной дозы.

Клиническое исследование фазы I/II: исследование терапии с применением многократных доз II. ПОЛУЧЕНИЕ ХИМЕРНЫХ АНТИ-CD20 АНТИТЕЛ ("C2B8") A. Конструирование химерных экспрессирующих анти-CD20 иммуноглобулин векторов ДНК B. Создание химерных продуцирующих анти-CD20 CHOB и SP 2/0 трансфектом C. Определение иммунологической активности химерных анти-CD20 антител i Анализ с человеческим C1q ii Комплемент - зависимый клеточный лизис iii Эффекторный анализ зависимой от антител клеточной цитотоксичности III. ИСТОЩЕНИЕ B-КЛЕТОК IN VIVO ПРИ ПОМОЩИ ХИМЕРНЫХ И АНТИ-CD20 АНТИТЕЛ A. Исследование на приматах B. Клинический анализ C2B8 i Клиническое испытание фазы I/II C2B8: исследование терапии с применением однократной дозы ii Клиническое испытание фазы I/II C2B8: исследование терапии с применением многократных доз IV. КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ: C2B8 и Y2B8 A. Получение Y2B8 B. Получение C2B8 C. Результаты V. АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ СТРАТЕГИЙ ТЕРАПИИ VI. ИНФОРМАЦИЯ О ДЕПОНИРОВАНИИ G. ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ H. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ A. Область изобретения Ссылки, обсуждаемые в тексте данного документа, изложены лишь для информации, описанной до даты представления этого документа, и ничто здесь не должно быть истолковано как допущение, выраженное определенно или в виде намека, что эти ссылки являются "предшествующими работами" или что эти заявители не имеют права датировать задним числом такие описания посредством прежних изобретений или приоритета, основанного на раньше представленных заявках.

Данное изобретение касается лечения B-клеточной лимфомы при помощи химерных и радиоактивно меченных антител к антигену Bp 35 ("CD20") поверхности B-клеток.

B. Предпосылки изобретения Иммунная система позвоночник (например, приматов, включающих в себя человека, обезьян, мартышек и т.д.) состоит из ряда типов органов и клеток, которые развиваются, чтобы: точно и специфически узнавать чужеродные микроорганизмы ("антиген"), которые заселяют позвоночное - хозяина; специфически связываться с такими чужеродными микроорганизмами, элюминировать/разрушать такие чужеродные микроорганизмы.

Лимфоциты, среди других, являются решающими для иммунной системы. Лимфоциты продуцируются в тимусе (вилочковой железе), селезенке и костном мозгу (взрослых особей) и составляют приблизительно 30% общего числа лейкоцитов, присутствующих в сердечно-сосудистой системе человека (взрослого). Существуют две основные субпопуляции лимфоцитов: T-клетки и B-клетки. T-клетки ответственны за клеточно-опосредованный иммунитет, тогда как B-клетки ответственны за продуцирование антител (гуморальный иммунитет). Однако T-клетки и B-клетки могут рассматриваться как зависимые в типичном иммунном ответе, поскольку T-клетки активируются при связывании рецептора T-клеток с фрагментами антигена, связанными с гликопротеинами главного комплекса гистосовместимости ("MHC") на поверхности несущих антиген клеток; такая активация вызывает выделение биологических посредников (медиаторов), "интерлейкинов"), которые, при их накоплении, стимулируют дифференциацию B-клеток и образование антител ("иммуноглобулинов") против этого антигена.

Каждая B-клетка внутри хозяина экспрессирует отличающиеся антитела на ее поверхности: так, одна B-клетка будет экспрессировать антитела, специфические против одного антигена, тогда как другая B-клетка будет экспрессировать антитела, специфические для другого антигена. Таким образом, B-клетки очень разные, и это разнообразие является критическим для иммунной системы. У человека каждая B-клеток может продуцировать огромное количество молекул антител (приблизительно 10⁷ - 10⁸). В наиболее типичных случаях такое продуцирование антител прекращается (или существенно уменьшается) при нейтрализации чужеродного антигена. Однако иногда пролифтерация определенной B-клетки не ослабляется; такая пролиферация может привести к раку, называемому "B-клеточной лимфомой".

T-клетки и B-клетки содержат поверхностные клеточные белки, которые могут использованы в качестве "маркеров" для дифференциации и идентификации. Одним из таких маркеров человеческих B-клеток является консервативный (эволюционно стабильный) дифференцировочный антиген Bp 35 B-лимфоцитов человека, называемый "C20". CD20 экспрессируется во время раннего развития предшественников B-клеток и остается до дифференциации клеток плазмы. В частности, молекула CD20 может регулировать стадию в процессе активации, которая необходима для инициации клеточного цикла и дифференциации, и обычно экспрессируется на очень высоких уровнях на неопластических ("опухолевых") B-клетках. CD20, по определению, присутствует как на "нормальных" B-клетках, так и на "злокачественных" - клетках, т.е. тех B-клетках, неослабленная пролиферация которых может приводить к B-клеточной лимфоме. Таким образом, поверхностный антиген CD20 может потенциально быть кандидатом для "нацеливания" на B-клеточную лимфону.

В сжатом виде такое нацеливание можно обобщить следующим образом: антитела, специфические для поверхностного антигена CD20 B-клеток, инъецируют в больного. Эти антитела CD20 специфически связываются с поверхностным антигеном CD20 как нормальных, так и злокачественных B-клеток, анти-CD20 антитела, связанные с поверхностным антигеном CD20, могут приводить к разрушению и истощению неопластических B-клеток. Дополнительно с анти-CD20 антителами могут быть конъюгированы химические агенты или радиоактивные метки, потенциально разрушающие опухоль, так что такой агент специфически "доставляется", например, к неопластическим (опухолевым) B-клеткам. Независимо от подхода первичной задачей является разрушение опухоли: особый подход может определяться определенными анти-CD20 антителами, которые применяют. Таким образом, подходящие подходы для нацеливания на антиген C20, могут значительно отличаться один от другого.

Например, сообщалось о попытках такого нацеливания на поверхностный антиген CD20. Сообщалось, что мышиные моноклональные антитела IF5 (анти-CD20 антитела) вводили непрерывным внутривенным вливанием больным с B-клеточной лимфомой. Сообщалось, что чрезвычайно высокие уровни (более 2 граммов) IF5 требовались для истощения циркулирующих опухолевых клеток, и результаты были описаны как "временные". Press et al., Monoclonal Antibody IF5 (Anti-CD20) Serotherapy of Human B-Cell Lymphoma". Blood 69/2: 584 - 591 (1987).

Потенциальной проблемой при этом подходе является то, что нечеловеческие моноклональные антитела (например, мышиные моноклональные антитела) не имеют функциональности человеческого эффектора, т.е. они не способны медиировать зависимый от комплемента лизис или лизировать человеческие клетки мишени через зависимую от антител клеточную токсичность или опосредованный с - рецептором фагоцитоз. Кроме того, нечеловеческие моноклональные антитела могут узнаваться человеком - хозяином как чужеродный белок; поэтому повторные инъекции таких чужеродных антител могут приводить к индукции иммунных ответных реакций, ведущих к опасным реакциям гиперчувствительности. В случае мышиных антител это часто называют человеческой ответной реакцией на анти- мышиные антитела, или "НАМА". Дополнительно, эти "чужеродные" антитела могут быть атакованы иммунной системой хозяина таким образом, что они фактически нейтрализуются до того, как они достигнут их целевого сайта.

Лимфоцита и лимфомные клетки всегда чувствительны к радиотерапии по нескольким причинам: локальная эмиссия ионизирующей радиации радиоактивно меченных антител может убивать клетки с целевым антигеном или без него (например, с CD20 или без CD20) вблизи антитела, связанного с антигеном, проникающая радиация может устранять проблему лимитированного доступа к антителам в объемных или слабо васкуляризованных опухолях; общее количество требуемых антител может быть уменьшено. Радионуклиды испускают радиоактивные частицы, которые могут разрушать клеточную ДНК до такой степени, когда клеточные механизмы репарации не способны обеспечить продолжение жизни клетки; поэтому, если целевые клетки - мишени являются опухолевыми, радиоактивная метка убивает опухолевые клетки. Радиоактивно меченные антитела, по определению, включают применение радиоактивного вещества, что может требовать соблюдения мер предосторожности как для больного (то-есть возможной трансплантации костного мозга), так и для человека, обеспечивающего медико-санитарную помощь (т. е. необходимости соблюдения высокой степени осторожности при работе с радиоактивностью).

Поэтому подход для улучшения способности мышиных моноклональных антител быть эффективными в лечении B-клеточных нарушений состоял в том, чтобы конъюгировать радиоактивную метку или токсин с этими антителами таким образом, чтобы метка или токсин локализовались в месте опухоли. Например, упомянутое выше антитело IF5 "метили" иодом - 131 ("¹³¹1") и оценивали биораспределение метки в двух больных. См. Eary J.F.et.al "Imaging and Treatment of B-Cell Lymphoma" J. Nuc.Med. 31/8: 1257 - 1268 (1990); см. также, Press.O.W.et. al. "Treatment of Refractory Non-Hodgkin's Lymphoma with Radiolabeled MB-1 (Rufi-CD37) Antibocly" J.Clin.Onc.7/8 1027 - 1038 (1989) (показано, что один больной, получивший ¹³¹1 - меченый IF - 5, давал частичную ответную реакцию"); Goldenberg. D.M. et.al. "Targeting, Dosimetry and Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphomas with Iodine-131-Labeled LL2 Monoclonal Antibody" J.Clin. Onc. 9/4: 548 - 564 (1991) (сообщено, что 3 из 8 больных, получающих многократные инъекции, развили НАМА - ответную реакцию); Appelbaum, F.R. "Radiolabeled Monoclonal Antibodies in the Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma "Hem.Onc.Clinics of N. A. 5/5: 1013-1025 (1991) (обзорная статья): Press, O.W. et al. "Radiolabeled-Antibody Therapy of B-Cell Lymphoma with Antologous Bone Marrow Support" New England Journal of Medicine 329/17: 1219-1223 (1993) (меченные иодом-131 анти-CD20 антитела 175 и B1) и Kaminiski, M.G.et.al. "Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphoma with [¹³¹1]Anti-B1 (Aati-CD20) Antibody", NEYM 329/7 (1993) (меченные иодом - 131 анти-CD20 антитела B1, далее называемые "Kaminski") Токсины (т.е. химиотерапевтические агенты, такие как доксорубцин или митомицин C) также коньюгировали с антителами. См. например PCT (опубликованная заявка) WO 92/07466 (опубликована 14 мая 1992) "Химерные антитела, т. е. антитела, которые содержат части из двух или более различных видов (например, мыши и человека), были разработаны как альтернатива "конъюгированным" антителом. Например, Lin, A.Y.et.al. "Production of a Mouse - Human Chimerice Monoclonal Antibody to CD20 с сильной Fc-зависимой биологической активностью". J. Immun. 139/10: 3521-3526 (1987), описывает химерные антитела мышь/человек, направленные против антигена CD20. См. также PCT Publication 0/88/04936. Однако нет информации о правомочности, эффективности или практичности применения таких химерных антител для лечения B-клеточных нарушений в этой ссылке. Отмечается, что функциональные тесты in vitro (например, комплемент - зависимый лизис ("CDC"); зависимая от антител клеточная цитотоксичность ("ADCC") и т.д.) необязательно могут предсказать способность in vivo химерного антитела разрушать или истощать клетки-мишени, экспрессирующие специфический антиген. См., например, Robinson, R.D. et al. "Chimeric mouse-human anti-cavcinoma antibodies that mediate different anti-tumor cell biological actirities" Hum. Antibol. Hybridomas 2: 84 - 93 (1991) (химерные антитела мышь-человек, имеющие недетектируемую ADCC активность). Таким образом, потенциальную терапевтическую эффективность химерных антител можно оценить правильно только в экспериментах in vivo.

Что необходимо и что было бы большим успехом в этой области, это терапевтические подходы к нацеливанию на антиген CD20 для лечения B-клеточных лимфом в приматах, в том числе (но не только) в человеке.

C. Краткое изложение сущности изобретения Здесь описаны терапевтические способы, предназначенные для лечения B-клеточных нарушений и, в частности, B-клеточных лимфом. Эти протоколы основаны на введении иммунологически активных химерных анти-CD20 антител для истощения периферических B-клеток крови, в том числе B-клеток, ассоциированных с лимфомой; введении радиоактивно меченных анти-CD20 антител для направления на локализованные и связанные с периферическими B-клетками опухоли; введении химерных анти-CD20 антител и радиоактивно меченных анти-CD20 антител в кооперативной терапевтической стратегии.

D. Краткое описание рисунков Фиг. 1 представляет схему тандемного экспрессирующего химерное антитело вектора, применимого в получении иммунологически активных химерных анти-CD20 антител ("TCAE 8"); Фиг. 2A - 2E представляют последовательность нуклеиновой кислоты вектора фиг. 1; Фиг. 3A - 3F представляют последовательность нуклеиновой кислоты вектора 1, содержащую дополнительно мышиные вариабельные области легкой и тяжелой цепей ("анти-CD20 в TCAE 8") Фиг. 4 представляет последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотную последовательность (в том числе CDR и каркасный районы) мышиной вариабельной области легкой цепи, происходящей из мышиного анти-CD20 моноклонального антитела 2B8; Фиг. 5 представляет последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотную последовательность (в том числе CDR и каркасный районы) мышиной вариабельной области тяжелой цепи, происходящей из мышиного анти-CD20 моноклонального антитела 2B8; Фиг. 6 представляет результаты проточной цитометрии, свидетельствующие о связывании флуоресцентно меченого человеческого CIq с химерным анти-CD20 антителом, причем в качестве контролей использованы меченый CIq; меченый CIq и мышиное анти-CD20 моноклональное антитело 2B8; и меченый CIq и человеческий IgG1, : к : Фиг. 7 представляет результаты связанного с комплементом лизиса, сравнивающие химерное анти-CD20 антитело и мышиное анти-CD20 моноклональное антитело 2B8; Фиг. 8 представляет результаты опосредованной антителами клеточной цитотоксичности с человеческими эффекторными клетками in vivo, сравнивающие химерное анти-CD20 антитело и 2B8; Фиг. 9A, 9B и 9C представляют результаты истощения B - лимфоцитов периферической крови примата (не человека) после инфузии 0,4 мг/кг (A); 1,6 мг/кг (B) и 6,4 мг/кг (C) иммунологически активного химерного анти-CD20 антитела; Фиг. 10 демонстрирует результаты, inter alia, истощения B - лимфоцитов периферической крови примата (не человека) после инфузии 0,01 мг/кг иммунологически активного химерного анти-CD20 антитела; Фиг. 11 показывает результаты уничтожающего опухолевые клетки действия У2В8 в мышиной модели ксенотрансплантата, использующей B-клеточную лимфобластную опухоль; Фиг. 12 показывает результаты уничтожающего опухолевые клетки действия C2B8 в мышиной модели ксенотрансплантата, использующей B-клеточную лимфобластную опухоль; Фиг. 13 показывает результаты уничтожающего опухолевые клетки действия комбинации У2В8 и C2B8 в мышиной модели ксенотрансплантата, использующей B-клеточную лимфобластную опухоль; Фиг. 14A и 14B показывают результаты клинического анализа фазы 1/11 C2B8, свидетельствующие об истощении B-клеточной популяции с течением времени у больных, что свидетельствует о частичной ремиссии заболевания (14A) и небольшой ремиссии заболевания (14B).

E. Детальное описание предпочтительных вариантов Обычно антитела состоят из двух легких и двух тяжелых цепей; эти цепи образуют общую "Y" форму, в которой как легкая, так и тяжелая цепи образуют плечи Y, а тяжелые цепи образуют основание Y. Легкие и тяжелые цепи разделены на домены структурной и функциональной гомологии. Вариабельные домены легкой ("U₂") и тяжелой ("U_н") цепей определяют узнавание и специфичность. Домены константной области легкой ("CL") и тяжелой ("C_H") цепей ответственны за важные биологические свойства, например, за ассоциацию цепей антител, секрецию, трансплацентарную мобильность, связывание F_c рецептора, связывание комплемента и т.д. Ряд событий, ведущих к экспрессии гена иммуноглобулина в продуцирующих антитела клетках, является комплексным. Генные последовательности района вариабельного домена локализованы в отдельной линии генных сегментов, называемых "U_н", "D" и "Y_H" или "U_L" и "Y_L". Эти генные сегменты соединены путем реаранжировок ДНК с образованием полных районов U, экспрессируемых, соответственно, в тяжелых и легких цепях. Реаранжированные соединенные U сегменты (U_L-Y_L и U_H-D-Y_H) затем кодируют полные вариабельные области или антиген-связывающие домены легких и тяжелых цепей, соответственно.

Серотерапия B-клеточных лимфом человека при помощи анти-CD20 мышиных моноклональных антител (IF5) описана Press et al. (69 Blood 584, 1987, Supra); сообщенные терапевтические ответы, к сожалению, были временными. Кроме того, 25% обследованных больных развили ответную реакцию человека против мышиных антител (HAMA) в ответ на серотерапию. Press et. al., предполагают, что эти антитела, конъюгированные с токсинами или радиоактивными изотопами, могут бать более длительную клиническую пользу, чем неконъюгированные антитела.

Благодаря истощающим действием B-клеточной лимфомы и реальной необходимости обеспечения действенных подходов лечения для этого заболевания мы предприняли различные подходы с применением определенного антитела, 2B8, в качестве общего звена между этими подходами. Один из таких подходов выгодно использует способность систем млекопитающих легко и эффективно восстанавливать B-клетки периферической крови, при помощи такого подхода мы пытаемся избавиться от B-клеток или истощить B/ клетки в периферической крови и лимфатической ткани как средство устранения также и B/ клеточных лимфом. Мы выполняем это путем применения, inter alia иммунологически активных, химерных анти-CD20 антител. В другом подходе мы пытаемся разрушать опухолевые клетки, направляя в них радиоактивные метки.

В применении здесь, термин "анти-CD20 антитела" обозначает антитела, которые специфически узнают негликозилированный фосфопротеин 35000 дальтон клеточной поверхности, обычно обозначаемый как консервативный (эволюционно стабильный) дифференцировочный антиген Bp 35 B-лимфоцитов человека, обычно называемый CD 20. В применении здесь, термин "химерный" при использовании его относительно анти-CD20 антител охватывает антитела, которые наиболее предпочтительно произведены при помощи технологии рекомбинантных ДНК и которые содержат компоненты как человека (в том числе иммунологически "близких" видов, например, шимпанзе), так и не человека : константная область химерного антитела наиболее предпочтительно по существу идентична константной области природного антитела человека; вариабельная область химерного антитела наиболее предпочтительно произведена из источника, не являющегося человеком и имеет желаемую антигенную специфичность в отношении CD20 антигена клеточной поверхности. Источником иным, чем человек, может быть любое позвоночное животное, которое можно использовать для генерирования антител к CD20 поверхностному антигену человека, или материал, содержащий поверхностный антиген CD20 клеток человека. Таким источником могут быть (но не только) грызуны (например, кролик, крыса, мышь и т.д.) и приматы (не человек) (например, низшие узконосые обезьяны (мартышки), человекообразные обезьяны и т. д.). Наиболее предпочтительно, нечеловеческий компонент (вариабельную область) получают из мышиного источника. В применении здесь, фраза "иммунологически активны" при применении к химерным анти-CD20 антителам обозначает химерные антитела, которые связывают человеческий C1q, медиируют комплемент - зависимый лизис ("CDC") линий B - лимфоидных клеток человека и лизируют клетки - мишени человека вследствие зависимой от антител клеточной цитотоксичности ("ADCC"). В применении здесь, фразы "непрямое мечение", "подход непрямого мечения" означают, что к антителу ковалентно присоединен хелатирующий агент и по меньшей мере один радионуклид встроен в этот желатирующий агент. Предпочтительные хелатирующие агенты и радионуклиды описаны в Srivagtara, S.C. and. Mease, R.C. "Progress in Research on Ligands, Nuclides and Technigues for Labeling Monoclonal Antibodies", Nucl. Med. Bio. 18/6: 589-603/1991) ("Srivagtava") - включено здесь в виде ссылки. Особенно предпочтительным хелатирующим агентом является 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилен- триаминопентауксусная кислота ("MX-DTPA"); особенно предпочтительными радионуклидами для непрямого мечения являются индий [111] и иттрий [90] . В применении здесь, фразы "прямое мечение" и "подход прямого мечения" обозначают, что радионуклид непосредственно ковалентно присоединен к антителу (обычно через остаток аминокислоты). Предпочтительные радионуклиды описаны Srivagtara, особенно предпочтительным радионуклидом для прямого мечения является иод [131], ковалентно соединенный через остатки тирозина. Особенно предпочтительным является подход непрямого мечения.

Описанные здесь терапевтические подходы основаны на способности иммунной системы приматов быстро восстанавливать или омолаживать B-клетки периферической крови. Кроме того, поскольку основной иммунный ответ приматов осуществляется T-клетками, то в том случае, когда иммунная система имеет недостаток B-клеток периферической крови, необходимость "чрезвычайных" мер предосторожности (т.е. изоляции больного и т.д.) не является обязательной. Вследствие этих и других нюансов иммунных систем приматов наш терапевтический подход к B-клеточным нарушениям позволяет удалять B-клетки периферической крови при помощи иммунологически активных химерных анти-CD20 антител.

Поскольку нарушения B-клеток периферической крови, по определению, могут свидетельствовать о необходимости доступа к крови для ее обработки, путь введения иммунологически активных химерных анти-CD20 антител и радиоактивно меченных анти-CD20 антител предпочтительно является парентеральным, в применении здесь термин "парентеральный" включает в себя внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное или внутрибрюшинное введение. Из них наиболее предпочтительно внутривенное введение.

Иммунологически активные химерные анти-CD20 антитела и радиоактивно меченные анти-CD20 антитела обычно получают стандартными способами в фармацевтически приемлемом буфере, например, стерильном солевом растворе, стерильной забуференной воде, пропиленгликоле или их комбинации и т.д. Способы получения парентерально вводимых агентов описаны в Pharmaceutical Carriers and Formulations, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15 th Ed (Mack. Pub. Co. Easton, PA. 1975), включено здесь в виде ссылки.

Специфическое терапевтически эффективное количество иммунологически активных химерных анти-CD20 антител, применимое для получения уникального терапевтического эффекта в любом больном, можно определить стандартными способами, хорошо известными специалистам, с обычной квалификацией в данной области.

Эффективные дозы (т.е. терапевтически эффективные количества) иммунологически активных химерных анти-CD20 антител находятся в диапазоне приблизительно от 0,001 до 30 мг/кг веса тела, более предпочтительно приблизительно от 0,01 до 25 мг/кг веса тела и наиболее предпочтительно приблизительно от 0,4 до 20,0 мг/кг веса тела. Другие дозы возможны; факторы, влияющие на дозу, включают в себя (но не лимитируются ими) серьезность, тяжесть заболевания, предшествующие подходы лечения; общее здоровье больного, другие присутствующие заболевания и т. д. Квалифицированный специалист легко оценит конкретного больного и определит подходящую дозу, находящуюся внутри указанных диапазонов, и, если необходимо, вне этих диапазонов.

Введение иммунологически активных химерных анти-CD20 антител в этих диапазонах доз можно проводить в виде единственного введения или в виде серии введений. В случае химерных антител предпочтительно, чтобы такое введение проводили в виде ряда введений, этот предпочтительный подход прогнозирован методологией лечения этого заболевания. Не желая быть связанными с какой бы то ни было конкретной теорией, отметим, что поскольку иммунологически активные анти-CD20 антитела иммунологически активны и связываются с CD20, при исходном введении иммунологически активных химерных анти-CD20 антител индивидууму начинается истощение B-клеток периферической крови, и мы наблюдали почти полное удаление в пределах приблизительно 24 часов после инфузии. Поэтому последующее введение (введение иммунологически активных химерных анти-CD20 антител) (или радиоактивно меченных анти-CD20 антител) больному предположительно: a) удаляет оставшиеся B-клетки периферической крови; b) начинает удалять B-клетки из лимфатических узлов; c) начинает удалять B/ клетки из других источников ткани, например, из костного мозга, опухоли и т. д. В результате повторных введений иммунологически активных химерных анти-CD20 антител ряд событий имеет место, каждое из которых рассматривается нами как важное для эффективного лечения этого заболевания. Первое "событие" может рассматриваться как направленное главным образом на истощение B-клеток в периферической крови больного; последующие события могут рассматриваться как направленные в основном на одновременное или последовательное удаление оставшихся B-клеток из системы, путем выведения B/-клеток из лимфатических узлов или из других тканей.

В сущности, в то время как одиночные дозы обеспечивают пользу и могут эффективно применяться для лечения/ ведения заболевания, предпочтительный протокол лечения осуществляется в виде нескольких стадий, наиболее предпочтительно между 0,4 и 20 мг/кг веса тела иммунологически активного химерного анти-CD20 антитела вводят больному один раз в неделю в течение периода приблизительно 2 - 10 недель, наиболее предпочтительно приблизительно 4 недель.

В случае применения радиоактивно меченных анти-CD20 антител предпочтительно, чтобы антитела не были химерными; это прогнозировано значительно большим периодом полувыведения химерных антител по сравнению с мышиными антителами (т.е. с более длительным периодом полувыведения из крови радионуклид присутствуют в больном в течение длительных периодов). Однако радиоактивно меченные химерные антитела можно с пользой использовать с более низкими дозами милли-Кюри ("мКи") и в сочетании с химерным антителом, связанным с мышиным антителом. Этот сценарий позволяет уменьшить токсичность для костного мозга до приемлемых уровней с сохранением терапевтического действия.

Многие радионуклиды применимы для данного изобретения, и специалисты в данной области способны легко определить, какой радионуклеид наиболее пригоден при множестве обстоятельств. Например, иод [131] является хорошо известным радионуклидом, применяемым для нацеленной иммунотерапии. Однако клиническая применимость иода [131] может быть лимитирована несколькими факторами, в том числе: восьмидневным физическим периодом полувыведения; дегалогенированием иодинированных антител как в крови, так и в месте опухоли; характеристикой излучения (например, большой компонент -излучения), которые могут быть субоптимальными для локализованного депонирования дозы в опухоли. С появлением превосходных хелатирующих агентов возможность присоединения хелатирующих металл групп к белкам повысила возможности использования других радионуклидов, таких как индий [111] и иттрий [90]. Иттрий [90] обеспечивает несколько преимуществ для использования в радиоиммунотерапевтических приложениях: период полураспада 64 часа иттрия [90] достаточно длинен для накопления антител в опухоли и в противоположность иоду [131] иттрий [90] излучает меньше бета-лучей высокой энергии без сопутствующих гамма-лучей при его распаде, с диапазоном в ткани 200 - 1000 диаметров клетки. Кроме того, минимальное количество проникающей радиации делает возможным введение меченных иттрием [90] антител амбулаторным больным. Кроме того, интернализация меченых антител не требуется для убивания клеток, и локальная эмиссия ионизирующей радиации должна быть летальной для соседних опухолевых клеток, не содержащих антигена-мишени.

Одно из нетерапевтических ограничений для иттрия 90 основано на отсутствии значительной - радиации, что делает затруднительным получение изображения. Чтобы избежать этой проблемы, можно использовать диагностический "дающий изображение" радионуклид, такой как индий [111], для определения локализации и относительного размера опухоли перед введением терапевтических доз меченных иттрием [90] анти-CD20 антител. Индий [111] особенно предпочтителен в качестве диагностического радионуклида, поскольку: можно вводить без детектируемой токсичности приблизительно 1 - 10 мКи; данные томографии обычно предсказывают последующее распределение меченных иттрием [90] антител. Большинство исследований по получению изображения используют меченые 5 мКи индия [111] антитела, поскольку эта доза безопасна и имеет увеличенную эффективность в получении изображения по сравнению с более низкими дозами, причем оптимальное изображение получают при 3 - 6 днях после введения антител. См., например, Murray J.L. 26 Y. Nuc. Med. 3326 (1985) и Carraguillo, J. A. et.al. 26 Y. Nuc. Med. 67 (1985) Эффективные дозы единственной обработки (т.е. терапевтически эффективные количества) меченных иттрием [90] анти- CD20 антител лежат в диапазоне между приблизительно 5 и 75 мКи, более предпочтительно между приблизительно 10 и 40 мКи. Эффективные однократные не разрушающие костный мозг дозы меченных иодом [131] анти- CD20 антител лежат в диапазоне между приблизительно 5-70 мКи, более предпочтительно между приблизительно 5 и 40 мКи. Эффективные разрушающие костный мозг дозы для одного введения (т.е. которые могут требовать трансплантации аутологичного костного мозга) меченных иодом [131] анти- CD20 антител лежат в диапазоне между приблизительно 30 и 600 мКи, более предпочтительно между приблизительно 50 и менее 500 мКи. В соединении с химерными анти -CD20 антителами, вследствие более длительного периода полувыведения на крови по сравнению с мышиными антителами, эффективные однократные дозы, не разрушающие костный мозг, меченных иодом [131] химерных анти- CD20 антител лежит в диапазоне между приблизительно 5 и 40 мКи, более предпочтительно менее 30 мКи. Критерии для томографии, например, для индия [III] обычно менее приблизительно 5 мКи.

В случае радиоактивно меченных анти- CD20 атител терапия с их применением может также осуществляться с использованием однократных обработок или с использованием многократных обработок. Вследствие присутствия радионуклидного компонента предпочтительно брать перед обработкой периферические стволовые клетки ("PSC") или костный мозг ("ВМ") для больных, испытывающих потенциально губительную токсичность для костного мозга, происходящую в результате облучения. ВМ и (или) PSC берут при помощи стандартных способов, затем очищают и замораживают при возможной реинфузии. Кроме того, наиболее предпочтительно проведение перед обработкой диагностической дозиметрии с применением диагностических меченых антител (например, с применением индия [III] на больном. Цель этой проверки состоит в обеспечении гарантии того, что терапевтически меченое антитело (например, меченное иттрием [90] не будет "концентрироваться" в каком-либо нормальном органе или ткани.

Описаны химерные мышь/человек антитела. См., например, Morrison. S.L.et. al. PNAS 11: 6851-6854 (November 1984) European Patent Publication N 172404, Boulianne, C.L.et.al.Nature 312:642 (December 1984); Neubeiger M.S.et.al.Nature 314:268 (March 1985); European Patent Publication N=125023, Tan et.al. J. Immunol.135:8564 (November 1985); Sun L.K.et.al.Hybridoma 5/1:517 (1986); Sanagan et. al, J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986). Cm.Muron.Nature 312:597 (December 1984), Diekson, Genetic Ehgineering News 5/3 (Marck 1985), Marx, Science 229: 455 (August 1985) и Morrison Science 229:1202-1207 (September 1985). Robinson et.al, в PCT Publation N WO88/04936 описывают химерное антитело с человеческой константной областью и мышиной вариабельной областью, специфические для эпитопа CD20; мышиная часть этого химерного антитела произведена из мышиного моноклонального антитела 2H7 (гамма 2, каппа). Хотя автор отмечает, что описанное химерное антитело является "превосходным кандидатом" для лечения B-клеточных нарушений, это утверждение можно рассматривать не более, чем предложение, и специалисты в данной области должны определить, является ли это предположение верным для этого конкретного антитела, особенно потому, что в этой ссылке отсутствуют какие-либо данные, подтверждающие заявление о терапевтической эффективности и, что важно, отсутствуют данные с использованием млекопитающих высшего порядка, таких как приматы или человек.

Методологии для получения химерных антител доступны для специалистов в данной области. Например, легкую и тяжелую цепи можно экспрессировать раздельно при помощи, например, легкой цепи иммуноглобулина и тяжелых цепей иммуноглобулина в отдельных пламидах. Они могут быть очищены и собраны in vitro в полные антитела, способы выполнения подобной сборки были описаны. См. например.Scharff M.Harveg Lectures 69: 125 (1974). Параметры реакции in vitro для образования IgG антител из изолированных легкой и тяжелой цепей также были описаны. См. , например Beychok, S. Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, New York p.69,1979. Совместная экспрессия легких и тяжелых цепей в одних и тех же клетках для достижения внутриклеточной сборки и соединения тяжелых и легких цепей в полные H₂L₂ IgG антитела также возможна. Такая ко-экспрессия может быть выполнена с применением либо одной и той же плазмиды, либо различных плазмид в одной и той же клетке хозяина.

Другой подход, который является нашим наиболее предпочтительным подходом для поучения химерного не- человек/человек, анти- CD20 антитела, основан на использовании экспрессирующего вектора, который содержит, ab initio ДНК, кодирующую константные области тяжелой и легкой цепи из человеческого источника. Такой вектор позволяет введение ДНК, кодирующей нечеловеческую вариабельную область, таким образом, что можно получить множество не- человеческих анти CD20 антител, которые могут быть подвергнуты скринингу, анализированы на различные характеристики (например, на тип связующей специфичности, связующие эпитоп районы и т.п.); после этого в вектор может быть включена кДНК, кодирующая вариабельные районы легких и тяжелых цепей из предпочтительных или желательных анти CD20 антител. Мы называем эти типы векторов тандемными экспрессирующими химерные антитела векторами ("TCAE"). Наиболее предпочтительным TCAE вектором, кото