Амплификация системы поглощения витамина b12 при помощи полимеров

Амплификация системы поглощения витамина b12 при помощи полимеров

Реферат

 

Изобретение касается пероральной доставки пептидных и белковых фармацевтических средств с применением системы поглощения витамина В₁₂(VB₁₂), причем доставка усиливается при помощи полимеров. Более конкретно, изобретение касается комплекса, имеющего формулу (У - Q)_n - Р - (Q' - А)_m, где У представляет собой носитель, который будет связываться с природным внутренним фактором (IF), выбранный из витамина В₁₂ или его аналога, n-обозначает коэффициент молярного замещения У в комплексе и представляет собой число от 1,0 до приблизительно 10; Р представляет собой фармацевтически приемлемый полимер; А представляет собой фармацевтически активное вещество; m обозначает коэффициент молярного замещения А в комплексе и представляет собой число от более 1,0 до приблизительно 1000. Q и Q' независимо один от другого представляют собой ковалентную связь или спейсерное соединение, соединяющее У, Р и А ковалентными связями. Изобретения обеспечивают пероральную доставку пептидных и белковых лекарственных средств. 2с. и 36 з.п.ф-лы.

Данное изобретение касается пероральной доставки пептидных и белковых фармацевтических средств при помощи системы поглощения витамина B₁₂ (VB₁₂). Более конкретно, изобретение касается амплификации системы поглощения при помощи полимеров.

Пероральный путь введения пептидов, таких как LHRH и его аналоги, или белков, таких как колониестимулирующий фактор гранулоцитов (GCSF), эритропоэтин (EPO) и инсулин, в качестве фармацевтических средств в лечении системных (относящихся ко всему организму) состояний в прошлом был малоуспешным. В общих чертах, количество пептида, необходимое для успешного введения, в 100 - 1000 раз превышало дозу, необходимую для парентерального введения, что делало введение этих агентов пероральным способом непозволительно дорогим. Существуют две основные причины отсутствия успеха. Во-первых, кишечная среда обладает высокой степенью протеолитической активности, которая быстро разрушает большинство пептидов. Во-вторых, в то время как имеется хорошо установленные механизмы поглощения для отдельных аминокислот и дипептидов, нет общего механизма для полипептидов, которые должны транспортироваться через эпителий слизистой оболочки в кровообращение. Скорее эта мембрана предназначена служить общим барьером, препятствующим поглощению многочисленных чужеродных белков, встречающихся в этой среде. Поэтому, хотя пептид может быть модифицирован, чтобы противостоять ферментативной преграде, встречаемой им в кишечнике, такая модификация малополезна, если пептид не может впоследствии пересечь барьер слизистой оболочки и войти в кровообращение.

Однако недавняя работа автора данного изобретения, описанная в патентной заявке PCT/AU 86/00299 (WO 87/02251), обеспечила способ преодоления барьера слизистой оболочки. Этот способ использует преимущества опосредованного природным внутренним фактором (1F) механизма поглощения витамина B₁₂ (VB₁₂). B₁₂ является природно встречающейся пригодной для употребления в пищу молекулой, которая активно поглощается из кишечника. Во время этого процесса она сначала связывается с внутренним фактором (1F) в верхней части тонкой кишки. Комплекс [VB₁₂-1F] спускается в нижнюю часть тонкой кишки и связывается с рецептором 1F, расположенном на поверхности подвздошного эпителия. Затем весь комплекс [VB₁₂-1F-рецептор] интериализуется посредством опосредованного рецептором эндоцитоза и спустя некоторое время VB₁₂ появляется в сыворотке.

Заявка PCT/AU 86/00299 (WO 87/02251) описывает способы химической модификации VB₁₂ для обеспечения подходящих функциональных групп для конъюгирования VB₁₂ с различными лекарственными средствами и пептидными/белковыми фармацевтическими средствами. При пероральном введении комплекса [VB-фармацевтическое средство] можно использовать опосредованную природным 1F систему поглощения VB₁₂ для доставки фармацевтического средства в кровообращение.

Одним из основных ограничений этого общего механизма поглощения VB₁₂ является то, что доза фармацевтического препарата, которая может доставляться с пищей реципиенту, является низкой. Эта доза прямо пропорциональна количеству VB₁₂, которое может поглощаться при одном кормлении. Поэтому в случае мышей и крыс можно доставить только приблизительно 20 - 40 нМолей фармацевтического препарата на дозу, тогда как для человека количество фармацевтического препарата, которое может быть доставлено, составляет приблизительно 1 нМоль. Хотя этот уровень поглощения достаточен для доставки фармацевтически активных доз некоторых веществ, таких как антагонисты LHRH, кальцитонин и EPO, он недостаточен для доставки белков, таких как GCSF и инсулин, в количествах, достаточно больших для обеспечения фармакологического эффекта. Поэтому желательно усилить (амплифицировать) способность поглощения системы транспорта VB₁₂ по меньшей мере в 10 раз.

Для введения активных агентов были предложены полимеры. Известны полимеры с боковыми группами, соединенными со скелетом через спейсеры, содержащие ароматические диазосвязи. Многие из этих полимеров были получены специально для высвобождения боковых групп после расщепления диазосвязи азоредуктазами, выделяемыми бактериями в толстой кишке. Однако оказалось, что эти полимеры непригодны для доставки лекарственных средств всему организму после перорального введения, т.к. комплексы полимера с лекарственным средством не адсорбируются в интактном виде из кишечного тракта, а скорее доставляют их лекарственное средство к толстой кишке после расщепления диазо-связи ферментами толстой кишки. Небольшие количества высвобождающегося лекарственного средства могут в конечном счете достичь кровообращения, но это количество, достигающее кровотока, как было обнаружено, дает мало практической пользы.

Были также предложены полимеры, с которыми конъюгированы различные цитотоксические лекарственные средства. Эти полимеры направлялись к раковым клеткам при помощи специфических антител или сахарных частей молекул. При достижении комплексом лекарственное средство-полимер ткани-мишени комплекс подвергается эндоцитозу клеткой-мишенью и присоединенное лекарственное средство высвобождается под действием лизосомных ферментов или путем отщепления связанного дисульфидной связью лекарственного средства внутриклеточным глутатионом. Однако пероральная доставка таких комплексов не приводила к значительному поглощению комплекса лекарственного средства с полимером из просвета кишечника в кровообращение.

Краткое изложение сущности изобретения Целью данного изобретения является описание новой серии конъюгатов лекарственное средство/фармацевтический препарат-полимер, с которыми были конъюгированы молекула VB₁₂ или ее аналог или производное. Эти конъюгаты VB₁₂ - полимер-лекарственное средство пригодны для пероральной доставки, т.к. они могут использовать упомянутую выше систему транспорта VB₁₂ для поглощения и имеют дополнительное преимущество увеличения количества фармацевтического агента, которое может быть доставлено через механизм поглощения VB₁₂.

Комплекс имеет общую формулу (V - Q)_n - P - (Q' - A)_m в которой V представляет собой носитель, который будет связываться с природным внутренним фактором (1F), выбранный из витамина B или его аналога; n обозначает коэффициент молярного замещения V в комплексе и представляет собой число от 1,0 до приблизительно 10; P представляет собой фармацевтически приемлемый полимер; A представляет собой фармацевтически активное вещество; m обозначает коэффициент молярного замещения A в комплексе и представляет собой число от более 1,0 до приблизительно 1000.

Q и Q' независимо один от другого обозначают ковалентную связь или спейсерное соединение, связывающее V, P и A ковалентными связями.

Описание предпочтительных вариантов Полимер P данного изобретения может быть любым фармацевтически приемлемым полимером. Этот полимер способен присоединяться по меньшей мере к одной молекуле носителя и по меньшей мере к одной, но предпочтительно ко множеству молекул активных веществ.

Полимер P может быть биодеградируемым полимером, таким как биодеградируемый углеводный полимер или полимер аминокислот. Или он может быть не деградируемым биологически полимером и в этом случае он предпочтительно имеет присоединенные биодеградируемые боковые цепи, делающие возможной ковалентную связь с активным веществом.

Подходящими полимерами для замещения витамином VB₁₂ и модификации в соответствии с данным изобретением являются поли[N-(2-гидроксипропил)-метакриламид] , декстран, хондроитансульфат, водорастворимые полиуретаны, образованные ковалентным соединением PEG с лизином, поли(глутаминовая кислота), поли(гидроксипропил-глутамин) и полипептиды с разветвленной цепью, образованные двойной модификацией и -групп лизина во время синтеза пептида. Такие полимеры могут иметь множество аминоконцов, с которыми могут быть конъюгированы многочисленные фармацевтические препараты или лекарственные средства. Эти полимеры могут быть также образованы с множественными цистеинами для обеспечения свободных тиолов или множественными глутаматами, или аспартатами для обеспечения свободных карбоксилов для конъюгирования с применением подходящих карбодиимидов. Полимер может также содержать множественные гистидины или тирозины для конъюгирования. Если полимер является полипептидом с разветвленной цепью, он может быть модифицирован дополнительно для обеспечения множества функциональных групп для соединения с активным веществом.

Некоторыми примерами подходящих полимеров являются полисахариды, в том числе декстран, инулин, целлюлоза, крахмал и их производные; хондроитансульфат, поли[N-(2-гидроксипропил)-метакриламид] и их производные, сополимер стирола и малеинового ангидрида, сополимер дивинилового эфира и малеинового ангидрида, полилизин, поли(глутаминовая кислота), поли(гидроксипропилглутамин), поли(молочная кислота), водорастворимые полиуретаны, образованные ковалентным соединением PEG с лизином или другими аминокислотами и полипептидами с разветвленной цепью.

Если полимер является полипептидом с разветвленной цепью, то он может в одной из предпочтительных форм иметь общую последовательность: (R⁵₁₆-Lys₈-R⁴₈-Lys₄-R³₄-Lys₂-R²₂-Lys)_n-R¹-COOH, где n обозначает 1 - 17, R¹ обозначает любую последовательность из 1 - 10 аминокислот, R², R³, R⁴ и R⁵, каждый независимо, представляет собой любую последовательность из 0 - 6 аминокислот, при условии, что не все R², R³, R⁴ и R⁵ представляют собой последовательность из 0 аминокислот, и где полимер может заканчиваться при любом положении внутри скобок. Некоторые примеры полимеров, имеющих эту общую формулу, представляют собой полипептиды с последовательностью (Gly₄-Lys₂-Ser₂-Lys)₅-Ala-COOH и (Gly₁₆-Lis₈-Lys₄-His₄-Glu₄- Lys₂-Lys)-Gly₅-Cys-COOH, например. Концевые аминогруппы на концевых аминокислотах могут быть дополнительно химически модифицированы, если желательно, для связывания с активными веществами.

Носитель V получают из витамина B₁₂ (VB₁₂) или аналога витамина B₁₂, который будет связываться с природным внутренним фактором (1F). Носитель может быть также химически модифицирован для связывания с полимером.

Подходящими аналогами VB₁₂ для дериватизации перед конъюгированием с полимером являются любой вариант или производное VB₁₂ (цианокобаламина), которые обладают связывающей активностью в отношении внутреннего фактора. Предпочтительными аналогами VB₁₂ являются также аквокобаламин, аденозилкобаламин, метилкобаламин, гидроксикобаламин, цианокобаламин, карбаналид и 5-метоксибензилцианокобаламин [(5-Meo)CN-Cbl] , а также дездиметил-, моноэтиламидные и метиламидные аналоги всех перечисленных выше соединений. Другие аналоги включают в себя все алкилкобаламины, в которых алкильная цепь соединена с ядром коррина прямой CoC ковалентной связью. Другие аналоги включают в себя хлоркобаламин, сульфитокобаламин, нитрокобаламин, тиоцианатокобаламин, производные бензимидазолцианокобаламина, такие как 5,6-дихлорбензимидазол, 5-гидркосибензимидазол, триметилбензимидазол, а также аденозилцианокобаламин [(Ade)CN-Cbl] , лактон кобаламина, лактам кобаламина и анилидные, этиламидные производные VB₁₂ и производные VB₁₂ с монокарбоновой и дикарбоновой кислотой или их аналоги.

Предпочтительные производные VB₁₂ также включают производные моно-, ди- и трикарбоновых кислот или пропионамидные производные VB₁₂. Носители могут также включать аналоги VB₁₂, в которых кобальт заменен цинком или никелем. Корриновое кольцо VB₁₂ или его аналогов может быть замещено любым заместителем, который не влияет на его связывание с 1F, и такие производные VB₁₂ или его аналоги являются частью этого изобретения. Другие производные VB₁₂ или его аналоги, имеющие функциональную группу, способную реагировать со спейсерным соединением, также являются частью этого изобретения. Другие производные и аналоги витамина B₁₂ обсуждаются в Schneider, Z, и Stroinski, A.: Comprehensive B₁₂; (Walter De Gruyter; NY; 1987), включенной здесь в виде ссылки.

Фармацевтически активное вещество A представляет собой любое подходящее фармацевтическое вещество, в частности биологически активный полипептид или часть этого пептида. Например, оно может быть гормоном, фактором роста, интерлейкином, цитокинами, лимфокинами или подобными веществами. Некоторые предпочтительные активные вещества представляют собой GCSF, EPO, LHRH, интерферон или биологически активные аналоги, части или производные этих веществ, кальцитонин, TRH, вазопрессин, окситоцин, инсулин, гормон роста, соматостатин, GM-CSF, SCGF (фактор роста стволовых клеток), CGRP или биологически активные аналоги, части или производные этих веществ.

Примеры типичных веществ для доставки согласно изобретению включают активные вещества, такие как гормоны и биоактивные пептиды (и их аналоги и производные), такие как LHRH, вазопрессин, окситоцин, инсулин, тестостерон, интерферон, соматостатин, эритропоэтин, колониестимулирующпе факторы (GCSF, GM-CSF, CSF), PMSG, HCG, ингибин, Pa1-2; терапевтические агенты, такие как неомицин, салбутамол, пириметамин, пенициллин G, метициллин, карбенициллин, петидин, ксилазин, кетамин HCl, мефенезин, GABA, железо-декстран, нуклеотидные аналоги или рибозим.

Дальнейшие примеры активных веществ включают полипептиды, такие как инсулин, саматостатин, производные соматостатина (U. S. Pat. NN 4 087 390, 4 093 575, 4 100 117 и 4 253 398), гормоны роста, пролактин, адренокортикотропный гормон (ACTH), меланоциты стимулирующий гормон (MSH), гормон высвобождения тиреоидного гормона (TRH), его соли и их производные (U.S. Pat. NN 3 957 247 и 4 100 152), тиреотропный гормон (TSH), лютеинизирующий гормон (LH), фолликулостимулирующий гормон (FSH), вазопрессин, производные вазопрессина [десмопрессин [Folia Endocrinologica Japonica 54, N 5, p. 676 - 691 (1978)] ], окситоцин, кальцитонин, паратиреоидный гормон, глюкагон, гастрин, секретин, панкреозимин, холецистокинин-ангиотензин, лактоген плаценты человека, хорионический гонадотропин человека (HCG), энкефалин, производные энкефалина [U. S. Pat. N 4 277 394, EP заявка Публикация N 31567], эндорфин, киоторфин, интерфероны (,,), интерлейкины (I, II и III), туфтсин, тимопоэтин, тимозин, тимостимулин, гуморальный фактор вилочковой железы (TFH), сывороточный фактор вилочковой железы (FTS) и его производные (U.S. Pat. N 4 229 438) и другие факторы вилочковой железы [Medicin in Progress 125, N 10, p. 835 - 843 (1983)], фактор некроза опухолей (TNF), колониестимулирующий фактор (CSF), мотилин, динорфин, бомбезин, нейротензин, церулеин, брадикинин, урокиназа, аспарагиназа, калликреин, аналог и антагонист вещества P, фактор роста нервов, факторы свертывания крови VIII и IX, хлорид лизозима, полимиксин B, колистин, грамицидин, бацитрацин, стимулирующие пептиды белкового синтеза (British patent N 8232082), желудочный ингибиторный полипептид (GIP), вазоактивный кишечный полипептид (VIP), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), фактор гормона роста (GRF, соматокринин), костный морфогенетический белок (BMP), эпидермальный фактор роста (EGF) и т.д.

Примеры противоопухолевых агентов включают гидрохлорид блеомицина, метотрексат, актиномицин D, митомицин C, сульфат винбластина, сульфат винкристина, гидрохлорид даунорубицина, адриамицин, неокарциностатин, цитозинарабинозид, фторурацил, тетрагидрофурил-5-фторурацил, крестин, пицибанил, лентинан, левамизол, бестатин, азимексон, глицирризин, поли 1:C, поли A:U и поли 1:CLC.

Примеры антибиотиков включают гентамицин, дибекацин, канендомицин, ливидомицин, тобрамицин, амикацин, фрадиомицин, сизомицин, гидрохлорид тетрациклина, гидрохлорид окситетрациклина, политетрациклин, гидрохлорид доксициклина, ампициллин, пиперациллин, тикарциллин, цефалотин, цефалоридин, цефотиам, цефсулодин, цефменоксим, цефметазол, цефазолин, цефотаксим, цефоперазон, цефтизоксим, моксолактам, латамоксеф, тиенамицин, сульфазецин и азтреонам.

Вышеупомянутые жаропонижающие, аналгезирующие и противовоспалительные лекарственные средства включают, например, салицилат натрия, сульпурин, флуфенамат натрия, диклофенак натрия, индаметацин натрия, гидрохлорид морфина, гидрохлорид петидина, тартрат леворфанола и оксиморфон. Примерами противокашлевых и отхаркивающих средств являются гидрохлорид эфедрина, гидрохлорид метилэфедрина, гидрохлорид носкапина, фосфат кодеина, фосфат дигидрокодеина, гидрохлорид аллокламида, гидрохлорид хлофедианола, гидрохлорид пикоперидамина, клоперастин, гидрохлорид протокилола, гидрохлорид изопротеренола, сульфат салбутамола и сульфат тербуталина. Примерами седативных средств являются гидрохлорид хлорпромазина, прохлорперазин, трифторперазин, сульфат атропина и метилбромид скополамина. Миорелаксанты включают в себя, среди прочих, метансульфонат придинола, хлорид тубокурарина и бромид панкурония. Средства против эпилепсии, например, включают фенитоин натрия, этосуксимид, ацетазоламид натрия и гидрохлорид хлордиазепоксида. Примеры противоязвенных лекарственных средств включают метоклопрамид и моногидрохлорид L-гистидина. Примерами антидепрессантов являются имипрамин, кломипрамин, ноксиптилин и сульфатфенелзина. Антиаллергические лекарственные средства включают, среди прочих, гидрохлорид дифенгидрамина, малеат хлорфенирамина, гидрохлорид трипеленамина, гидрохлорид метдилазина, гидрохлорид клемизола, гидрохлорид дифенилпиралина и гидрохлорид метоксифенамина. Кардиотонические средства включают, среди прочих, транс-п-оксокамфору, теофиллол, аминофиллин и гидрохлорид этилефрина. Средства против аритмии включают в себя, например, гидрохлорид пропанолола, гидрохлорид алпренолола, гидрохлорид буфетолола и гидрохлорид оксипренолола. Сосудорасширяющие средства, среди прочих, включают гидрохлорид оксифедрина, гидрохлорид дитиазема, гидрохлорид толазолина, гексобендин и сульфат баметана. Гопотензивные диуретические средства включают, среди прочих, бромид гексометония, пентолиниум, гидрохлорид мекамламина, гидрохлорид экаразина и гидрохлорид клонидина. Примеры антидиабетических средств включают глимидин натрия, гидрохлорид фенформина, гидрохлорид буформина и метформин. Противосвертывающие средства включают, среди прочих, гепарин натрия и цитрат натрия.

Кровоостанавливающие агенты включают, среди прочих, тромбопластин, тромбин, менадион-бисульфит натрия, ацетоменафтон, -аминокапроновую кислоту, транэкзамовую кислоту, карбазохром-сульфонат натрия и адренохром-моноаминогуанидинметансульфонат. К противотуберкулезным средствам относятся изиниазид, этамбутол и п-аминосалицилат натрия. Примерами гормональных лекарственных средств являются сукцинат преднизолона, преднизолон-фосфат натрия, дексаметазон-сульфат натрия, бетаметазонфосфат натрия, фосфат гексестрола, ацетат гексестрола и метимазол. Антинаркотическими средствами являются, среди прочих, тартрат леваллорфана, гидрохлорид налорфина и гидрохлорид налоксона.

Если активное вещество представляет собой GCSF, оно может быть соединено с полимером при помощи спейсерного соединения, содержащего дисульфидную связь. В этом случае дисульфидная связь может быть образована со скрытой тиоловой группой цистеина при положении 17 в полипептидной цепи GCSF.

Если активное вещество представляет собой аналог LHRH, оно может быть ANTIDE или аналогом ANTIDE. ANTIDE представляет собой линейный декапептид, содержащий ряд неприродных и/или D-аминокислот в дополнение к трем L-аминокислотным остаткам. Его N-конец ацетилирован, а C-конец амидирован. ANTIDE имеет следующую последовательность: N-Ac-D-Nal(2), D-Phe(pCl), D-Pal(3), Ser, Lys(Nic), D-Lys(Nic), Leu, Lys(iPr), Pro, D-Ala-NH₂ [Nal(2) обозначает 3-(2-нафтил)аланин: Phe(p-Cl) обозначает 3-(4-хлорфенил)аланин; Pal(3) обозначает 3-(3-пиридил)аланин; Lys(Nic) обозначает N-никотиноиллизин; Lys-(iPr) обозначает N-изопропиллизин].

Для ANTIDE-1 остаток 6 является D-Lys, а не D-Lys(Nic); для ANTIDE-2 остаток 5 является Lys, а не Lys(Nic) и для ANTIDE-3 остаток 8 является Lys, а не Lys(iPr).

Если активное вещество представляет собой аналог LHRH, оно может быть гистреллином, D-Lis₆-LHRH, D-Lys₆-LHRH-этиламидом или аналогом этих веществ.

Спейсерные соединения Q и Q' являются необязательными. Когда они отсутствуют, носитель V и/или активное вещество A соединены с полимером P прямой ковалентной связью. Спейсерные соединения вводят для улучшения аффинности внутреннего фактора в отношении VB₁₂-комплекса или для преодоления проблем в связывании носителя, V и/или активного вещества A, возникающих вследствие неблагоприятных стерических взаимодействий между V и/или A. с полимером P или для увеличения биоактивности A в комплексе. Спейсерные соединения могут также действовать в качестве связывающих агентов, будучи бифункциональными соединениями с выбранными функциональными группами на каждом конце, пригодными для реакции с подходящими функциональными группами, расположенными на полимере, а также молекуле-носителе VB и/или на фармацевтически активных веществах.

Спейсерное соединение Q и/или Q' предпочтительно содержит иногда замещенные насыщенные или ненасыщенные, разветвленные или линейные C_1-50-алкилен, циклоалкилен или ароматическую группу, в которых один или несколько углеродов внутри цепи заменены N, O или S, и необязательные заместители выбраны, например, из карбонила, карбоксигруппы, аминогруппы и других групп.

Подходящие удлиненные спейсеры для конъюгирования фармацевтического препарата (A) или носителя (V) с полимерным матриксом (P) включают: дисукцинимидилсуберат (DSS), бис(сульфосукцинимидил)суберат (BSS), этиленгликоль-бис(сукцинимидилкцинат (EGS), этиленгликоль-бис(сульфосукцинимидилсукцинат) (sulfo-EBS), п-аминофенилуксусную кислоту, дитио-бис-(сукцинимидилпропионат) (DSP), 3,3'-дитио-бис-(сульфосукцинимидилпропионат) (DTSSP), дисукцинимидилтартрат (DST), дисульфосукцинимидилтартрат (sulfo-DST), бис-[-2(сукцинимидооксикарбонилокси)-этилен]сульфон (BSOCOES), бис[2-(сульфосукцинимидооксикарбонилокси)-этилен]сульфон (sulfo-ESOCOES), диметиладипимидат2HCl (DMA), диметилпимелимидат2HCl (DMP), диметилсуберимидат2HCl (DMS).

Подходящими сшивающими агентами для использования в получении тиолрасщепляемых биодеградируемых спейсеров или линкеров включают в себя N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), иминотиолан, сульфосукцинимидил-6-[3-(2-пиридилдитио)-пропионамид] -гексаноат (sulfo-LC-SPDP), сукцинимидил-6-[3-(2-пиридилдитио)-пропионамидо] -гексаноат (LC-SPDP), сульфосукцинимидил-6-[ -метил-(2-пиридилдитио)-толуамидо] - гексаноат (sulfo-LC-SMPT), 1,4-ди[3'-(2'-пиридилдитио)пропионамидо] - бутан (DPDPB), 4-сукцинимидилоксикарбонил- -метил- -(2- пиридилдитио)-толуол (SMPT), диметил-3,3'-дитиобиспропионимидат2HCl (DTBP).

В формуле n средний коэффициент молярного замещения V в комплексе является числом от 1,0 до приблизительно 10. Предпочтительно n находится между 1,0 и 1,2. Идеально полимер соединен с одной молекулой-носителем V, но поскольку полимер имеет неопределенный размер и/или неопределенную структуру, число n обозначает статистическую среднюю величину. Также в формуле m средний коэффициент молярного замещения A в комплексе, обозначает число от не менее 1 до приблизительно 1000. Для усиления поглощения активного ингредиента m должно быть как можно большим, идеально между 10 и 100, m представляет собой также статистическую среднюю величину, и различные количества активных молекул (A) будут связываться с полимером вследствие варьирования в структуре полимера P.

Данное изобретение имеет дело с комплексом, содержащим более одного активного вещества, соединенного с полимером, который связан по меньшей мере с одной молекулой-носителем, такой как VB₁₂ или его аналогом. При этом способность подвергаться реакциям связывания, необходимым для поглощения и транспорта VB₁₂ в позвоночном хозяине, и активность активного вещества в основном сохраняется после конъюгирования или после биологического высвобождения активного вещества из полимера. Комплекс, имеющий общую формулу (V - Q)_n - P - (Q' - A)_m, где V, Q, P, Q', A, n и m имеют указанные ранее значения, получают одним из следующих способов: a) реакция A с P с образованием промежуточного комплекса с последующей реакцией промежуточного комплекса с V; b) реакция V с P с образованием промежуточного комплекса с последующей реакцией промежуточного комплекса с A; c) способ стадий a) или b), в котором один или несколько V, P или A модифицированы для обеспечения по меньшей мере одной функциональной группы, способной образовать химическую связь, перед соединением с другими реагентами; или d) реакция одного или двух из V, P или A с Q и/или Q' перед соединением с другими реагентами.

В общих чертах, способ может предусматривать одну из следующих стадий: a) реакция активного вещества с полимером с образованием комплекса; b) химическая модификация активного вещества для обеспечения по меньшей мере одной функциональной группы, способной образовать химическую связь, и реакция активного вещества и полимера с образованием комплекса; c) химическая модификация носителя для обеспечения по меньшей мере одной функциональной группы, способной образовать химическую связь, и реакция активного вещества и полимера с образованием комплекса; d) химическая модификация активного вещества и полимера для обеспечения функциональных групп, способных образовать химическую связь, и реакция активного вещества и полимера с образованием комплекса; e) реакция активного вещества по меньшей мере с одним сшивающим агентом и реакция активного вещества с полимером с образованием комплекса; f) реакция носителя по меньшей мере с одним сшивающим агентом и реакция активного вещества с полимером с образованием комплекса; g) реакция активного вещества и полимера по меньшей мере с одним сшивающим агентом и реакция активного вещества с полимером с образованием комплекса; h) реакция активного вещества непосредственно с полимерным носителем с образованием промежуточного соединения, содержащего множество молекул активного вещества, соединенных с полимером, и последующее соединение с промежуточным комплексом полимер-активное вещество молекул одного или нескольких носителей; i) соединение по меньшей мере одного носителя непосредственно с полимерным носителем с образованием промежуточного продукта, содержащего по меньшей мере одну молекулу носителя, соединенную с полимером, с последующей реакцией промежуточного продукта полимер-носитель со множеством молекул активного вещества.

Данное изобретение обеспечивает также способ модификации полимерного носителя для введения функциональных групп, способных реагировать либо непосредственно с активным веществом, либо с химически модифицированной формой активного вещества. Полученное промежуточное соединение полимер-активное вещество содержит одну или более молекул активного вещества, причем этот промежуточный комплекс пригоден для соединения с носителем с образованием комплекса, способного усиливать доставку активного вещества.

В одном варианте изобретения связь, соединяющая фармацевтическое средство или носитель с полимером, представляет собой дисульфидную связь. В другом варианте изобретения связь, соединяющая фармацевтическое средство или носитель с полимером, представляет собой эфирную связь. Еще в одном варианте изобретения связь, соединяющая фармацевтическое средство или носитель с полимером, представляет собой связь -глутамил- -лизин. В следующем варианте изобретения связь, соединяющая фармацевтическое средство или носитель с полимером, представляет собой диазосвязь. В предпочтительном варианте изобретения описан комплекс, содержащий множество молекул GCSF, соединенных через дисульфидную связь посредством реакции с (дитио-пиридил-пропионамидо)додециламин - производным полимера. В другом предпочтительном варианте описан комплекс, содержащий множество молекул GCSF, присоединенных через дисульфидную связь к (дитиопиридил-пропионамидо)додецилсуберилгексилпроизводному полимера.

Было обнаружено, что можно синтезировать три аналога ANTIDE (антагониста LHRH), пригодных для конъюгирования с полимерным матриксом, а именно: N-Ac-D-Nal(2), D-Phe(pC1), D-Pal(3), Ser, Lys(Nic), D-Lys, Leu, Lys(iPr), Pro, D-Ala-NH₂ (D-Lys₆ ANTIDE или ANTIDE-1; N-Ac-D-Nal(2), D-Phe(pC1), D-Pal(3), Ser, Lys, D-Lys(Nic), Leu, Lys(iPr), Pro, D-Ala-NH₂ (Lys₅-ANTIDE или ANTIDE-2); и N-Ac-D-Nal(2), D-Phe(pC1), D-Pal(3), Ser, Lys(Nic), Leu, Lys, Pro, D-Ala-NH₂ (Lys₈ ANTIDE или ANTIDE-3.

Данное изобретение касается также фармацевтической композиции, содержащий описанный выше комплекс вместе с фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем, хорошо известными в данной области и описанными, например, в Remigton's Pharmaceutical Sciences (Mark Publishing Company, 10th Edition, включенной здесь в виде ссылки). Эта композици моет быть в форме капсул, таблетки, лекарственной формы с медленным высвобождением активного ингредиента, эликсира, геля, пасты или лекарственной формы с энтеросолюбильным покрытием или любой другой пригодной лекарственной формы, хорошо известной в данной области.

Комплексы и композиции данного изобретения могут вводиться человеку или животному в комбинации с одним или несколькими носителями и/или наполнителями. Способы введения не являются критическими для этого изобретения и включают парентеральное (внутривенное, внутримышечное или внутриорганное введение инъекций), пероральное, трансдермальное, вагинальное, анальное введение или другие пути введения, хорошо известные в этой области. В контексте лечения заболевания терапевтически эффективным количеством комплекса или соединения данного изобретения является такое количество, которое обеспечивает лечение конкретного состояния заболевания. Что входит в состав эффективного количества, будет зависеть от природы заболевания, которое должно быть подвергнуто лечению, от оценки состояния консультирующим врачом или ветеринарным хирургом и от других факторов, таких как возраст, вес и/или пол субъекта. Только в виде примера, эффективное количество содержащей комплекс композиции согласно данному изобретению может составлять от 1 нанограмма до 10 нанограммов комплекса в соответствии с изобретением. Данное изобретение применимо в лечении любого болезненного состояния, отвечающего на введение пептидных фармацевтических препаратов.

Частью данного изобретения является способ лечения заболевания, предусматривающий введение субъекту терапевтически эффективного количества комплекса, описанного выше, предпочтительно в форме фармацевтической композиции.

В следующем аспекте данное изобретение касается использования описанных здесь комплексов для изготовления лекарственных средств для введения их человеку и животным.

Пример 1: Синтез мультилизинового полимера 1 (MLP1) Мультилизиновый полимер (MLP1) формулы (Gly₄-Lys₂-Ser₂-Lys)₅-Ala COOH синтезировали на пептидном синтезаторе Applied Biosystems. Более точно он может быть изображен как (Gly₄-Lys₂-Ser₂-Lys)₄- (Gly₄-Lys₂-Ser₂-Lys)-Ala-COOH.

Формула (Gly₄-Lys₂-Ser₂-Lys)₅-Ala- COOH может быть представлена следующим образом: Эта формула изображает структуру более точно. Если требуется, концевые аминогруппы на глицине могут быть дополнительно химически модифицированы.

Пример 2: Синтез мультилизинового полимера 2 (MLP2) Мультилизиновый полимер (MLP2) формулы (Gly₁₆-Lys₈-Lys₄-His₄-Glu₄- Lys₂-Lys))-Gly₅-Cys-COOH синтезировали на пептидном синтезаторе Applied Biosystems. Более точно эта структура может быть представлена следующим образом: Пример 3: Получение адипилгидразидпроизводного eVB₁₂-карбоксилата.

Адипилгидразидпроизводное eVB₁₂-карбоксилата получали конъюгированием концевых карбоксигрупп полимера посредством реакции с EDAC. Примененные адипилгидразидпроизводные могут быть представлены следующей (стенографически короткой) химической структурой: адипилгидразидо-eVB₁₂(=eVB₁₂-CONHNHCO(CH₂)₄ CJNHNH₂) Этот реагент легко получали в одной стадии из eVB₁₂-карбоксилата путем добавления EDAC к смеси кислоты и 20-кратного избытка адипиогидразида; т.е.: Пример 4: Образование конъюгатов полимер-ANTIDE с применением нерасщепляемых гомобифункциональных сшивающих агентов.

Предварительные эксперименты показали, что прямое конъюгирование между ANTIDE-1 и ANTIDE-3 и VB₁₂ давало конъюгаты со значительно пониженной биоактивностью по сравнению с ANTIDE. Тесная близость VB₁₂ к ANTIDE при использовании этой стратегии конъюгирования, вероятно, стерически мешает связыванию ANTIDE с рецептором LHRH. Для уменьшения этого стерического эффекта, возможно, наблюдаемого при прямом конъюгировании, для образования ковалентных комплексов между двумя полимерами и ANTIDE-1 и 3 следует использовать не деградируемые биологические линкеры. В качестве примера ANTIDE-1 или ANTIDE-3 реагировали с 1,5 молярным избытком дисукцинимидилсубератом (DSS) в течение 10 минут при комнатной температуре (RT). Затем добавляли MLP1 или MLP2 и реакция протекала в течение ночи. Конъюгированный материал очищали хроматографией на Сефадексе G-25 в 10% уксусной кислоте с последующей HPLC с обращенной фазой (RP-HPLC) (ЖХВР с обращенной фазой). Конъюгаты полимер-анилидо- ANTIDE-1 и полимер-анилидо-ANTIDE-3 получали реакцией MLP1 или MLP21 с п-аминофенилуксусной кислотой с применением EDAC/NHS. Комплекс полимер-анилид в свою очередь конъюгировали с ANTIDE-1 и ANTIDE-3 с применением DSS. Конъюгированный материал очищали хроматографией на Сефадексе G-25 в 10% уксусной кислоте с последующей RP-HPLC.

eVB₁₂ соединяли с комплексами полимер-ANTIDE при помощи реакции адипилгидразидил-"e"VB₁₂ с этим комплексом с применением EDAC. Полученный продукт очищали при помощи RP-HPLC.

Пример 5: Получение конъюгатов MLP-ANTIDE с применением тиолрасщепляемых сшивающих агентов.

Получали также конъюгаты, в которых ковалентный линкер содержал биодеградируемую дисульфидную связь, которая могла бы восстанавливаться in vivo, предположительно глутатином в сыворотке. Вкратце, MLP1 или MLP2 реагировали с N-сукцинимидил-3- (2-пиридилдитио)пропионатом (SPDP). Продукт дитиопиридил-MLP (DTP-MLP) очищали RP-HPLC. Свободный тиол вводили на ANTIDE-1 реакцией с SPDP. Затем дитиопиридил восстанавливали меркаптоэтанолом и продукт очищали при помощи RP-HPLC. Подобным образом свободный тиол вводили в ANTIDE-3 реакцией с иминотиоланом. Тиолированный продукт (SH-NH⁺AMT1DE-3) очищали при помощи RP-HPLC. Образование связанных дисульфидной связью конъюгатов MLP-ANTIDE-1 и MLP-ANTIDE-2 достигалось реакцией тиолированного производного ANTIDE с DTP-MLP в 2,5% уксусной кислоте в течение 24 часов. Конъюгированный материал очищали при помощи хроматографии на Сефадексе G-25 с последующей RP-HPLC.

VB₁₂ соединяли с комплек