Производные 3-(пиперидинил-1)-хроман-4,7-диола и 1-(4- гидроксифенил)-2-(пиперидинил-1)-алканола, фармацевтическая композиция и способ связывания nmda рецептора

Производные 3-(пиперидинил-1)-хроман-4,7-диола и 1-(4- гидроксифенил)-2-(пиперидинил-1)-алканола, фармацевтическая композиция и способ связывания nmda рецептора

Реферат

 

Изобретение относится к производным 3-(пиперидинил-1)-хромана-5,7-диола и 1-(4-гидроксифенил)-2-(пиперидинил-1)алканола общей формулы I или их фармацевтически приемлемым солям присоединения кислот, в которой (a) R² и R⁵ взяты в отдельности и R¹, R², R³ и R⁴ независимо представляют собой водород, (C₁-C₆)-алкил, галоген, ОН или OR⁷, а R⁵ представляет собой метил; или (b) R² и R⁵, взятые вместе, образуют кольцо хроман-4-ола, a R¹, R³ и R⁴ каждый независимо представляют собой водород, (C₁-C₆)-алкил, галоген, OН или OR⁷; R⁷ представляет собой метил; а R⁶ представляет собой замещенный пиперидинил или 8-азабицикло[3,2,1]октанильное производное; при условии, что (a) если R² и R⁵ взяты в отдельности, то по крайней мере один из R¹, R², R³ и R⁴ не является водородом; и (b) если R² и R⁵ взяты вместе, то по крайней мере один из R¹, R³ и R⁴ не является водородом, обладающие свойством NMDA антагониста. Предложены также фармацевтическая композиция на их основе и способ связывания NMDA рецептора. 8 с. и 16 з.п.ф-лы.

Изобретение относится к нейрозащитным (антиишемическим и блокирующим возбуждающий аминокислотный рецептор) производным фенола, отвечающим формуле I приведенной ниже; их фармацевтически приемлемым солям; их фармацевтическим композициям; способу применения таких соединений для лечения неврологических расстройств, включающих чувство беспричинной тревоги, церебральную ишемию, эпилепсию, мышечные спазмы и паралич; и к способу применения таких соединений для лечения дегенеративных заболеваний таких, как синдром Альцгеймера, синдром Хантингтона и болезнь Паркинсона. Кроме этого, настоящее изобретение относится к способу применения таких соединений для лечения привыкания к лекарственным средствам, мигрени и недержания мочи. Настоящее изобретение также относится к способу применения таких соединений для лечения травматических повреждений мозга.

Возбуждающие аминокислоты представляют собой важную группу нейромедиаторов, которые регулируют возбудительную нейропередачу в центральной нервной системе. Глутаминовая кислота и аспарагиновая кислоты представляют собой два эндогенных лиганда, активирующих рецепторы возбудительных аминокислот (EAA). Существует два типа EAA рецепторов, ионотропный и метаботропный, которые отличаются по типу сигнальной трансдукции. Имеется по крайней мере три индивидуальных ионотропных EAA рецепторов, характеризующихся селективным агонистом активирующим каждый тип: NMAA, (N-метил-Д- аспарагиновая кислота), AMPA (2-амино-3-(5-метил-3-гидроксиизоксазол -4-ил)пропановая кислота) и рецептор каиновой кислоты. Ионотропные EAA рецепторы связаны с ионными каналами проницаемыми натрием и, в случае NMDA рецепторов, кальцием. Метаботропные рецепторы, связанные с фосфоинозитидным гидролизом с помощью связанного с мембраной G-протеина активируются квискуаловой кислотой, иботеновой кислотой и (1S, 3R)-1-аминоциклопентан 1,3- дикарбоновой кислотой.

NMDA рецептор представляет собой макромолекулярный комплекс, состоящий из ряда индивидуальных связующих сайтов, закрывающих ионный канал проницаемый для ионов натрия и кальция. Hansen и Krogsgaard-Larson, Меd. Res., Rey., 10, 55-94 (1990). Существуют связующие сайты для глутаминовой кислоты, глицина и полиаминов, а также сайт внутри ионного канала, где такие соединения, как фенциклидин (РСР) проявляют свои антагонистические эффекты.

Конкурирующие NMDA антагонисты представляют собой соединения, которые блокируют NMDA рецептор в результате взаимодействия с глутаматсвязующим сайтом. Способность конкретного соединения конкурентно связываться с NMDA глутаматным рецептором может быть определена с использованием анализа на радиолигандное связывание. См. Murphy с сотр., British J. Pharmacol. 95, 932-938 (1988). Такие антагонисты могут быть различены от агонистов с использованием анализа коркового клина крыс. См. Harrison и Simmonds, British.J.Pharmacol., 84, 381-391 (1984).

Примерами конкретных NMDA антагонистов могут служить Д-2- амино-5-фосфонопентановая кислота (Д-AP5) и Д-2-амино-7- фосфоногептановая кислота, см. Schoepp. с сотр., J.Neur. Trangm., 85, 131-143 (1991).

Антагонисты нейропередачи на NMDA рецепторах представляют собой полезные терапевтические агенты для лечения неврологических нарушений. Патент США N 4902695 относится к ряду конкурентных NMDA антагонистов, используемых для лечения таких неврологических нарушений, как эпилепсия, паралич, беспокойство, серебральная ишемия, мышечные спазмы и такие нейродегенеративные нарушения, как синдром Альцгеймера и синдром Хантингтона. Патент США N 4968878 относится к другому ряду конкурентных NMDA рецепторных антагонистов, используемых для лечения аналогичных неврологических нарушений и нейродегенеративных расстройств. В патенте США N 5192751 раскрывается способ лечения недержания мочи у млекопитающих, который заключается в применении эффективного количества конкурентного NMDA антагониста.

NMDA антагонисты также представляют собой терапевтические агенты, обладающие антиконвульсивной, анхиолитической, мышечнорелаксирующей и антипсихотической активностями См. J.Lehman NMDA рецептор. Лекарства будущего, 14, N 11, стр. 1059 (1989). Сообщалось также о том, что NМDА антагонисты проявляют эффективность в лечении мигрени Canadian Journal of Neurological Science, 19(4), стр. 487 (1992)); привыкания к лекарственным средствам Science, 251, стр. 85 (1992)); и нейропсихических заболеваний связанных с AIDS (PIPS, 11, стр. 1 (1990).

Ифенпродил представляет собой рацемическое, так называемое dl-эритро соединение отвечающее следующей стереохимической формуле: выпускаемое на рынок в качестве гипотензивного агента, применимость которого аналогична применимости ряда близких аналогов; Carron с сотр., патент США 3509164; Carron с сотр. Drug Bes., т. 21, стр. 1992-1993 (1971). Недавно было показано, что ифенпродил обладает антиишемической активностью и способностью блокировать возбуждающий аминокислотный рецептор; Gotti с сотр. , J.Pharm. Ехр. Therap. т. 247, стр. 1211-21(1988); Carter с сотр., там же, стр. 1222-32 (1988). См. также патент Франции 2546166. Настоящее изобретение предусматривает соединения, обладающие таким нейрозащитным эффектом в значительной мере и в то же время пониженным или незначительным гипотензивным действием. Кроме этого, настоящее изобретение предусматривает соединения обладающие повышенной метаболической стабильностью, в результате чего нейрозащитные эффекты указанных соединений могут в течение длительного времени не доставлять неприятных ощущений пациентам.

Сообщалось, что некоторые структурно родственные 1-фенил-3- (4-арил-4-ацилоксипиперидино)-1-пропанолы также являются ценными анальгетиками, например, в патенте США 3924804; а в Japanese Kokai 53-02,474 (CA 89:43498y; Derwent Abs. 14858A) и 53-59,675 (CA 89:146938w; Derwent Abs. 48671A) сообщается, что 1-(4-амино- и гидрокси-алкил)фенил)-2-(4-гидрокси-4-толилпиперазино)-1-алканолы и алканоны обладают анальгетической, антигипертонической, психотропной и противовоспалительной активностями.

Chenard (патенты США 5185343 и 5272160) описывает соединения общей формулы: в которой Q представляет собой S или CH=CH; X представляет собой H, OH или другой ароматический заместитель; R -водород, алкил, алкенил или алкинил; Y и Y¹, совместно, представляют собой арилметилен или аралкилметилен (или соответствующее эпокси производное), либо Y и Y¹, по отдельности, имеют следующие значения - Y представляет собой водород или OH, а Y¹ - представляет собой арил, аралкил, арилтио или арилокси; а также описывает структурно родственные 2-(пиперидино)алканолы и 2- (пирролидино)алканолы являющиеся полезными агентами для лечения расстройств центральной нервной системы (CNS).

Butler в EPO 441.506 раскрывает 3-пиперидино-1-хрома-нольные производные отвечающие формуле; в которой A и B, совместно, представляют собой -CH₂CH₂-, или по отдельности каждый из радикалов A и B может представлять собой H; X представляет собой CH₂ или O; X¹- представляет собой H или OH; Z представляет собой H, OH или галоген; Z¹ представляет собой H, галоген или алкил; n равно О или 1; а m представляет собой О или целое число в интервале 1-6 и указывается, что такие соединения обладают ценными свойствами в лечении расстройств CNS.

Краткое изложение сущности изобретения.

Настоящее изобретение относится к соединениям общей формулы: или их фармацевтически приемлемым солям присоединения кислот, в которой: (a) R² и R⁵, в отдельности и R¹, R², R³ и R⁴-, независимо друг от друга, представляют собой водород, (C_1-6) алкил, галоген, CF₃, OH или OR⁷, a R⁵ представляет собой метил или этил; либо (b) R² и R⁵ совместно образуют группу: с образованием кольца хроман-4-ола; а каждый из R¹, R³ и R⁴, независимо друг от друга, представляют собой водород, (C_1-6) алкил, галоген, CF₃, OH или OR⁷; R⁶ представляет собой группы: R⁷ представляет собой метил, этил, изопропил или н- пропил; R⁸ представляет собой фенил необязательно замещенный заместителями в числе до трех, независимо друг от друга выбранных из группы, состоящей из (C_1-6) алкила, галогена или CF³; X представляет собой О, S и (CH₂)_n; а n равно 0,1,2 или 3; при условии, что (а) если R² и R⁵ рассматриваются в отдельности, то по крайней мере один из заместителей R¹, R², R³ и R⁴ не является водородом; и (b) если R² и R⁵ рассматриваются совместно, то по крайней мере один из радикалов R¹, R³ и R⁴ не является водородом.

Настоящее изобретение, в особенности, относится к соединениям, отвечающим формуле I, в которой R² и R⁵ представляют собой отдельные заместители; R² и R³ представляют собой водород; R⁶ представляет собой группу: a R⁸ представляет собой фенил, 4-гелофенил или 4-трифторметилфенил. В рамках такой группы, изобретение в особенности относится к соединениям, в которых R⁵ - представляет собой метил с 1R^*, 2R^* относительной стереохимией: Еще больший интерес в указанной выше группе представляют собой те соединения, в которых R¹ и R², независимо друг от друга, представляют собой водород, фтор или метил, a R⁸ представляет собой 4-фторфенил, 4-хлорфенил или 4-трифторметилфенил и особенно (1R^*,2R^*)-1-(4-гидрокси-3-метилфенил) -2- (4- (4-фторфенил) -4- гидрокси) -пиперидин-1-ил-пропан-1-ол; (1R^*, 2R^*)-1-(3,5-диметил-4- гидроксифенил) -2- (4- (4-фторфенил) -4-гидрокси) -пиперидин-1-ил-пропан-1-ол; (1R^*, 2R^*)-1-(3, 5-дифтор-4-гидроксифенил) -2- (4- (4-хлор- фенил) -4-гидрокси) -пиперидин-1-ил-пропан-1-ол; (1R^*, 2R^*)-1- (3, 5-дифтор-4-гидроксифенил) -2- (4- (4-фторфенил) -4- гидрокси) -пиперидин-1-ил-пропан-1-ол; и (1R^*, 2R^*)-1-(3, 5-дифтор-4- гидроксифенил) -2- (4- (4-трифторметилфенил) -4-гидрокси) - пиперидин-1-ил-пропан-1-ол. Главным образом, настоящее изобретение относится к мезилатным солям соединений, которые перечислены выше.

Кроме этого, настоящее изобретение также относится к соединениям, отвечающим формуле I, в которой R² и R⁵, представляют собой отдельные заместители, a R⁶ представляет собой: В рамках такой группы, настоящее изобретение главным образом относится к соединениям, отвечающим формуле I, в которой R⁵ представляет собой метил, имеющий 1R^*, 2R^* относительную стереохимическую конфигурацию: Настоящее изобретение также относится к соединениям,отвечающим формуле I, в которой R² и R⁵ представляют собой обобщенный заместитель и являются группой: с образованием кольца хроман-4-ола. В рамках такой группы, изобретение в особенности относится к соединениям, в которых C-3 и C-4 положения кольца хроман-4-ола имеют 3R^*, 4S^* относительную стереохимическую конфигурацию: В рамках такой группы, настоящее изобретение еще более конкретно относится к соединениям, в которых R⁶ представляет собой: a R⁸ представляет собой фенил и 4-галофенил.

Настоящее изобретение также относится к соединениям, отвечающим формуле I, в которой R² и R⁵ образуют совместно группу: с образованием кольца хроман-4-ола, причем C-3 и C-4 положения указанного кольца хроман-4-ола имеют 3R^*, 4S^* относительную стереохимическую конфигурацию: а R⁶ представляет собой: Кроме этого, настоящее изобретение относится к способам лечения паралича, травм спинного и головного мозга, апоплексической или постинсультной деменции, таких дегенеративных заболеваний ЦНС, как болезнь Альцгеймера, старческое слабоумие типа Альцгеймера, синдром Хантингтона, болезнь Паркинсона, эпилепсия, амиотрофный латеральный склероз, боли, слабоумие связанное со СПИДом, психотические состояния, привыкание к лекарствам, мигрень, гипогликемия, тревожные состояния, недержание мочи и ишемические ситуации возникающие при хирургических вмешательствах в ЦНС, хирургических операциях на открытом сердце или к любому другому методу, в ходе которого подвергается риску функция сердечно-сосудистой системы, причем такие способы включают применение на указанном млекопитающем эффективного количества соединения формулы I, приведенной выше, или его фармацевтически приемлемой соли присоединения кислоты.

Настоящее изобретение главным образом относится к описанному выше способу, с помощью которого проводят лечение млекопитающего, страдающего старческим слабоумием типа синдрома Альцгеймера, заболеванием Хантингтона, болезнью Паркинсона, амиотрофным латеральным склерозом, эпилепсией, параличом, мигренью и травматическими нарушениями головного мозга.

Еще в большей степени, настоящее изобретение относится к способу лечения мигрени, синдрома Альцгеймера, травм головного мозга, травм спинного мозга и паралича.

В наибольшей степени, настоящее изобретение относится к способу лечения болезни Паркинсона, травм головного мозга и мигрени.

Кроме всего перечисленного выше, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение по пункту 1 и фармацевтически приемлемый носитель.

Описание изобретения Фармакологически активные соединения настоящего изобретения, отвечающие приведенной выше формуле I, могут быть легко получены.

Как правило, соединения формулы I получают путем снятия защитной группы с фенольного спиртового промежуточного соединения. Такую феноло-защитную группу удаляют традиционными методами. Фенольную группу предпочтительно защищают с помощью реакций, приводящих к образованию общепринятых силильных эфиров, таких как триизопропил, трет.-бутил-диметилсилил, трифенилсилил и т. п. или бензиловых или замещенных бензиловых эфиров. Предпочтительный способ удаления указанных силильных групп включает использование 1-1,1 молярных эквивалентов фтористого тетрабутиламмония или другого традиционного источника фторида в среде такого инертного реакционного растворителя, как тетрагидрофуран. Реакцию обычно проводят при 0-50^oC и лучше всего при комнатной температуре с целью избежания затрат на обогрев или охлаждение реакционной смеси и минимизации разложения продукта в случае нагревания. Один из способов удаления бензильных или замещенных бензильных эфирных групп заключается в осуществлении традиционного гидрогенолиза с использованием такого катализатора на основе благородного металла, как палладий или никель, в среде инертного растворителя, например, с использованием 10% палладия на угле в качестве катализатора, предпочтительно при низком давлении (например, 1-10 атмосфер) при температурах (например, 20-75^oC) и, как правило, в среде такого инертного растворителя, как метанол или этанол. В другом способе гидрогенолиза используют формиат аммония в качестве источника водорода в среде инертного растворителя при низкой температуре (например, от 20^oC до температуры дефлегмации). Подходящие инертные растворители для такой реакции гидрогенолиза включают такие простые эфиры, как диэтиловый эфир, тетрагидрофуран или диоксан; такие низшие спирты, как метанол или этанол; или комбинации указанных веществ. Особенно предпочтительной комбинацией растворителей для такой реакции гидрогенолиза является смесь тетрагидрофурана и метанола.

Встречающееся в предыдущем параграфе и в других местах текста выражение "инертный в отношении реакции растворитель" относится к любому растворителю, который не взаимодействует с исходными веществами, реагентами, интермедиатами или продуктами реакции таким образом, что реализуется нежелательное воздействие на выход целевого продукта.

Соединения формулы I, в которой фенольная гидроксигруппа является защищенной группой могут быть также получены традиционным гидридным восстановлением альфа-пиперидино хроман-4-она, альфа- пирролидино-хроман-4-она или альфа-8-аза-бицикло(3.2.1) октанил хроманона, например, которые, как правило, образуют смесь цис- и транс- изомеров, соответственно, например, Конечно, в конкретных случаях, в смесях могут доминировать тот или иной из указанных цис- или транс-изомеров.

Такие реакции гидридного восстановления проводят с использованием традиционных гидридных восстанавливающих агентов, например, NaBH₄ или LiAIH₄. Последний гидридный реагент обычно используют в избытке (например, моль на моль) в среде инертного в отношении реакции растворителя, такого, как тетрагидрофуран, при пониженной температуре (например, -15^oC - 75^oC. Любые защитные группы, которые все еще остаются после восстановления кетона далее удаляют с использованием описанных выше способов. Промежуточные соединения типа (В), указанные выше, в которых R² и R⁵ представляют объединенный заместитель и промежуточные соединения типа (Д), указанные выше, в которых R² и R⁵ являются отдельными заместителями, обычно получают по реакции соответствующего производного монобром хроманона с подходящим замещенным пиперидином, пирролидином или 8-азабицикло (3.2.1) октаном, например: соответственно. Специалисту в данной области химии должно быть понятно, что в такой реакции альфа-бром группа может быть заменена другой нуклеофильно-замещаемой группой, такой как хлор, алкансульфонилокси или арилсульфонилокси. Такую реакцию проводят в условиях, которые типичны для осуществления реакций нуклеофильного замещения. В том случае, когда два таких реагента примерно эквивалентны по доступности могут применяться примерно их молярные эквиваленты; однако в том случае, когда один из указанных реагентов более доступен или более пригоден для такой реакции, обычно предпочитают использовать избыток такого более доступного реагента с целью более быстрого завершения реакции бимолекулярного нуклеофильного замещения. Указанную реакцию обычно проводят в присутствии по крайней мере 1 молярного эквивалента основания, например аминного производного как такового, если это вещество легко доступно, но, как правило, применяют третичный амин, который по крайней мере сравним по основности с нуклеофильным амином; и реакцию проводят в среде такого инертного растворителя, как ацетонитрил, этанол, метанол и т.п. Если желательно, то реакцию проводят в присутствии катализатора путем добавления в реакционную смесь до одного молярного эквивалента или более иодида (например, NaI, KI). Температура реакции не имеет решающего значения, но обычно используют несколько повышенные температуры с тем, чтобы форсировать завершение реакции за более короткое время, однако температура не должна быть слишком высокой с тем, чтобы не происходило нежелательного разложения. Обычно, удовлетворительным температурным интервалом является интервал 20-120^oC. Специалист в данной области должен принимать во внимание тот факт, что при использовании повышенных температур необходимо тщательно контролировать ход реакции с тем, чтобы использовать по возможности наиболее короткие времена реакции с целью минимизации разложения. Как правило реакцию проводят при температуре дефлегмации реакционной смеси.

Промежуточные соединения типа (С), указанные выше, в которых R² и R⁵ представляют собой объединенный заместитель, обычно получают по реакции соответствующего производного альфа, альфа-дибром хроманона с подходящим замещенным пиперидином, пирролидином или 8-аза-бицикло(3.2.1)октаном, например, За исключением того, что в такой реакции используют по крайней мере один дополнительный молярный эквивалент основания (для нейтрализации НВг образовавшегося в ходе конкурентного дегидрогалогенирования), условия проведения реакции аналогичны тем, что описаны выше для получения соединений типов (В) и (Д) по реакции нуклеофильного замещения.

Соединения формулы I содержат два ассиметричных атома углерода, что соответствует двум рацематам и четырем оптически активным соединениям. Один из таких рацементов представляет собой упомянутый выше цис-изомер, а другой - транс-изомер. Каждый из таких рацематов способен расщепляться на пару энантиомеров через диасереомерные соли присоединения кислот в присутствии оптически активной кислоты. С другой стороны, рацемический спирт превращают в соответствующие диастереомерные сложные эфиры или уретаны с помощью оптически активной кислоты или изоцианата. Такие ковалентно связанные производные могут быть подвергнуты разнообразным методам разделения (например, хроматографическому разделению). Такие диастереомерные сложные эфиры образуются из спирта и оптически активной кислоты или изоцианата стандартными методами, которые, как правило предусматривают активизацию кислоты, например, ее использование в виде хрорангидрида кислоты, смеси ангидрида кислоты и алкил формиата или такого дегидратирующего агента сочетания, как дициклогексилкарбодиимид. После разделения полученных в результате диасереомерных сложных эфиров, например, методами хроматографии, их подвергают гидролизу осуществляемому общепринятыми способами, например, с использованием водного раствора кислоты или основания, с получением энантиомерных, оптически активных спиртовых соединений формулы I. В соответствии с намерениями заявителя, настоящее изобретение не ограничивается рацемическими цис- и транс- соединениями специально проиллюстрированными ниже, а охватывает все оптически активные энантиомеры соединений формулы I настоящего изобретения.

Термин "фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли" включает, но не ограничивается ими, такие соли, как гидрохлорид, гидробромид, гироиодид, нитрат, кислый сульфат, первичный кислый фосфат, мезилат, малеат и сукцинат. Такие соли обычно получают по реакции свободно-основной формы соединения формулы I с соответствующей кислотой, обычно в количестве одного молярного эквивалента, в среде растворителя. Те соли, которые непосредственно не осаждаются обычно выделяют концентрированием растворителя и/или присоединением нерастворяющего агента.

Альфа-гало кетонные исходные материалы, требуемые для синтеза соединений настоящего изобретения, обычно получают по реакции соответствующего галоидангидрида с ароматическим галогенидом в условиях реакции ацилирования по Фриделю-Крафтсу или в других условиях ацилирования ароматики хорошо известных специалистам в данной области. В том случае, когда галоидный ацил не имеет гало-заместителя в альфа положении к карбонильной группе, осуществляют реакцию продукта реакции указанного ароматического ацилирования в стандартных условиях бромирования хорошо известных специалистам в данной области. Другие исходные материалы и реагенты, требуемые для синтеза соединений настоящего изобретения, являются легко доступными веществами, либо выпускаются промышленностью в соответствии с данными по методам получения, приведенными в литературе или с помощью методов описанных в разделе Препаратные примеры, приведенном ниже.

Соединения настоящего изобретения отвечающие формуле I обладают нейрозащитной активностью и активностью в лечении паралича, травм спинного мозга, травматических повреждений головного мозга, мультиинфарктного слабоумия, таких дегенеративных заболевания ЦНС, как болезнь Альцгеймера, старческое слабоумие типа Альгеймера, синдром Хантингтона, болезнь Паркинсона, эпилепсия, амиотрофный латеральный склероз, болевой синдром, слабоумие связанное со СПИДом, психотические состояния, привыкание к лекарствам, мигрень, гипогликимия, состояния тревоги, недержание мочи и ишемические состояния, возникающие при хирургии ЦНС, хирургических операциях на открытом сердце или любом другом вмешательстве, в ходе которого функция сердечно-сосудистой системы подвергается опасности, основанной на ее способности блокировать возбуждающие аминокислотные рецепторы, причем при этом наблюдается пониженная или отсутствие значимой гипотензивной активности. Соединения настоящего изобретения, отвечающие формуле I также обладают пролонгированной метаболической стабильностью. Антиишемическую активность соединений формулы I определяют с помощью одного или более описанных ниже методов.

Описанное ниже исследование основанное на анализе связывания демонстрирует степень связывания испытуемого соединения с N-метил- Д-аспартатным (NMDA)рецептором. Мембраны, предназначенные для использования в анализе на связывание, готовили следующим образом. Десять самцов крыс обезглавливали и передние мозговые доли гомогенизировали в растворе сахарозы (0.32м). Объем системы увеличивали до 100 мл путем добавления дополнительного количества сахарозного раствора. Гомогенат центрифугировали со скоростью 3000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант (SI) сохраняли, а осадок после центрифугирования ресуспендировали и гомогенизировали. Объем системы увеличивали до 75 мл с помощью раствора сахарозы (0.32М). Гомогенат центрифугировали со скоростью 3000 об/мин в течение десяти минут, после чего полученный супернатант (S2) сохраняли, а осадок после центрифугирования (Р1) отбрасывали. Супернатанты (SI) и (S2) объединяли и центрифугировали со скоростью 12000 об/мин в течение 25 минут. Полученный в результате осадок после центрифугирования (Р2) повторно суспендировали в 100 мл Трис ацетата (5мМ, pH 7.4) и затем оставляли на льду в течение, как минимум, десяти минут с целью лизиса клеток. Осадок после центрифугирования трижды промывали 1.0 мл Трис ацетата (5 мМ, pH 7.4) и ресуспендировали в минимальном объеме Трис ацетата) около 2 мл в расчете на передний мозг, концентрация протеина около 10 мг/мл). Полученные таким образом мембраны замораживали и хранили при -20^oC. Анализ на связывание per se проводили следующим образом. Мембраны оттаивали и быстро гомогенизировали. Осадок после центрифугирования (Р2) разбавляли до концентрации протеина примерно 0.5 мг/мл в Трис НСl (50 мМ, pH 7.4). Добавляли испытуемое соединение, соединение формулы I, после чего добавляли меченный тритием лиганд. В этом случае меченный тритием лиганд (5 нМ), по которому тестировали связывание представлял собой соединение формулы: в которой Т представляет собой атом трития (³Н). Heспецифическое связывание определяли с помощью 100 мкМ холодного лиганда. Все испытуемые образцы анализировали трижды. Пробирки инкубировали в течение 20 минут при 30^oC на встряхиваемой водяной бане. Содержимое каждой пробирки фильтровали в присутствии коллектора клеток Брандела (Брандел, 8561 Атлас Драйв, Гайтерсбург, Мэрилэнд, 20877, США) с использованием GF/B фильтра. Осадок на указанном фильтре промывали в течение 10 секунд охлажденным на льду Трис HCl (5 мМ, pH 7.4). Фильтры помещали в ампулы, добавляли сцинтилляционную жидкость и подсчитывали радиоактивность на счетчике бета частиц. Число подсчетов в минуту (CPM) для неспецифического связывания вычитали из значений CPM в пробирках только с лигандами, в результате чего оценивали специфическое связывание. Значения CPM для неспецифического связывания вычитали из значений полученных в пробирках, содержащих испытуемое соединение и полученные значения выражали в процентах от специфического связывания.

Лиганд, который использовали в анализе на связывание получали в соответствии с описанным ниже в Препаративном примере 49.

В качестве предпочтительной методики оценки нейрозащитной активности использовали методику предложенную Ismail A.Shalaby с сотр. J.Pharm. and Experimental Therapeutics, 260,925(1992), на которую ссылаются в тексте и которая описана ниже.

Клеточная культура. (Hippocampal) Гиппокампальные клетки крысиных зародышей в возрасте 17 дней (CD, Charles River Breeding Laboratories, Inc., Wilmington, MA) культивировали на PRIMARIA культуральном планшете (Falcon Co., Lincoln Park, NJ) в течение 2-3 недель в сыворотке, содержащей культурную среду (минимальная поддерживающая среда с несущественными аминокислотами, содержащая 2 мМ глютамина, 21 мМ глюкозы, пенициллин/стрептомицин (до 5000 ед. , каждый), 10% сыворотки коровьего плода (возраст 1-7 дней) и 10% лошадиной сыворотки (дни 1-21)) (Choi с сотр., 1987). Клетки высеевали на 96-луночном титрометрическом микропланшете с плотностью 80.000 клеток на лунку, или на 24-луночных культуральных планшетах с плотностью 250.000 клеток на лунку. Культуры выращивали при 37^oC в увлажненном CO₂-инкубаторе с тканевой культурой, содержащем смесь CO₂-воздух в соотношении 5:95%. Пролиферацию ненейронных клеток контролировали добавлением 20 мкМ уридина и 20 мкМ 5-фтор-2-деоксиуридина (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) в период с 6-го по 8-й день культивации (Martin с сотр., 1990). Культурную среду каждые 2-3 дня заменяли на свежую партию.

Глютаматная токсичность. Культуры оценивали на глютаматную токсичность в течение 2-3 недель после посева. Культурную среду удаляли и культуры промывали дважды CSS (Chai с сотр., 1987): NaCl, 12:KCl, 5.4; MgCl₂, 0.8; CaCl₂ 1.8; глюкоза, 15; и 4-(2- гидроксиэтил)-1- пиперазинэтансульфокислота, 25 мМ (pH 7.4). Затем на такие культуры в течение 15 мин. (37^oC воздействовали различными концентрациями глютамата. После инкубации культуры трижды промывали не содержащей глютамата CSS и дважды - свежей культурной средой без сыворотки. Затем такие культуры инкубировали в течение 20-24 часов в не содержащей сыворотки культурной среде. За 2 минуты до этого и в ходе 15-минутного воздействия глютамата добавляли испытуемое соединение, соединение формулы I. В некоторых экспериментах указанное соединение формулы I добавляли через различные промежутки времени после воздействия глютамата и в последующие 20-24 часа.

Жизнеспособность клеток оценивали обычным способом через 20- 24 часа после воздействия экситотоксина путем измерения активности цитозольного энзима LDH (Кох и Choi, 1987; Wroblewski и LaDue, 1955). LDН активность определяли в культурной среде в каждой из 96 лунок титрометрических микропланшетов, 50 мкл-образец среды добавляли к равному объему натрий-фосфатного буффера (0.1М, pH 7.4), содержащего 1.32 мМ пуривата натрия и 2.9 мМ NADH. Поглощение при длине волны 340 нм общей реакционной среды из каждой из 96 лунок регистрировали каждые 5 секунд в течение 2 минут с помощью автоматизированного спектрофотометрического титрометрического микропланшета-ридера (Molecular Devices; Menio Park, CA). Скорость оптического поглощения автоматически рассчитывали с использованием программы IBM SOFTMax и использовали в качестве индекса LDH-активности.

Морфологическую оценку нейронной жизнеспособности проводили с использованием фаза-контрастной микроскопии. 96-луночные культуральные планшеты не позволяют получать хорошее фаза- контрастное изображение, поэтому для такой цели применяли 24- луночные планшеты. В количественном отношении, оба культурных посева в равной мере чувствительны к глютаматной токсичности и демонстрируют 2-3- кратное повышение LDH-активности через 24 часа после воздействия 0.1-1.0 мМ глютамата.

Реагенты. Лошадиную и фетальную коровью сыворотку приобретали у фирмы Hyclone (Logan, UT), а культуральную среду, глютамин и пенициллин со стрептомицином - у фирмы Gibco Со. (Grand Island, NY).

Данные анализа. Количественное определение нейротоксичности осуществляли измерением активности LDH присутствующей в культурной среде через 20-24 часа после воздействия глютамата. Первоначальные эксперименты подтвердили опубликованные сообщения о том, что повышения LDH-активности в культурной среде коррелирует с деструкцией и дегенерацией нейронов (Koh и Choi, 1987). Поскольку действительные уровни LDH изменяются в зависимости от типа культур, данные обычно выражают относительно обработанных буффером парных лунок на одном и том же культуральном планшете. Для получения значения индекса LDH-активности культур обработанных глютаматом и лекарственным средством, значения LDH для контрольных культур вычитали из соответствующих значений для обработанных групп. Данные, полученные для лекарственных обработок, выражали в процентах увеличения LDH, вызванного 1 мМ глютамата (или NMDA) в каждом эксперименте. Концентрации NMDA антагонистов, требуемые для достижения 50% повышения LDH, вызванного экситотоксинами (IC₅₀) расчитывали с использованием логарифмически-зондирующего анализа из объединенных результатов трех независимых экспериментов. Различные группы, прошедшие обработку, сравнивали с использованием двухкратно-убывающего t-теста.

Метаболическая стабильность. Для определения in vitro метаболической стабильности соединений формулы I осуществляли следующее испытание микросомы человеческой печени. Микросомальные инкубационные смеси содержали 1 мкМ микросомального Р450, NADPH- генерирующую систему (0.5 мМ NADP⁺, 4 мМ глюкоза-6-фосфат и 10 ед./мл глюкоза-6-фосфат дегидрогеназа), 0.1 М фосфатного буффера (pH 7.4), 10 мМ MgCl₂ и 2 мкМ испытуемого соединения в качестве субстрата в общем объеме 1.4 мл. Реакционные смеси проинкубировали при 37^oC в течение двух минут перед инициированием реакции в результате добавления печеночных микросом. Инкубации проводили при 37^oC на водяной бане при осторожном встряхивании. Аликвоты инкубационных смесей отбирали в точках, соответствующих 0,20,40 и 60 минут, и затем переносили в полипропиленовые пробирки для микроанализа, содержащие равный объем охлажденного на льду метанола с целью остановки реакции. Денатурированный протеин отделяли центрифугированием и полученный в результате супернатант переносили и хранили при -20^oC для последующего анализа. Субстрат подвергали количественному анализу методом HPLC с УФ-детекцией. После прямого ввода аликвоты (75 мкл) супернатанта в HPLC, высоту полученного пика субстрата использовали для количественного расчета скорости расходования субстрата в ходе инкубации, полагая что количество субстрата в начальный момент времени составляет 100%. Время полураспада (T_0.5) определяли делением 0,693 на К, где К определяли логарифмически-линейной регрессией всего инкубационного периода в ходе которого скорость расходования субстрата подчинялась кинетическому уравнению первого порядка.

Такие селективные нейрозащитные антиишимические и возбуждающие аминокислотные блокирующие активности в совокупности с повышенной метаболической стабильностью отражают ценную применимость соединений настоящего изобретения в лечении таких дегенеративных нарушений CNS (центральной нервной системы), как паралич и травматическое поражение головного мозга; синдром Альцгеймера, болезнь Паркинсона и синдром Хантингтона; причем не наблюдается существенного потенциала для конкурентного нежелательного падения кровяного давления. При систематическом лечении таких заболеваний нейрозащитным количеством соединений формулы I, дозировки обычно составляют 0.02-50 мг/кг/день (0.001-2.5 г/день на типичном человеческом представителе весом 50 кг) при применении в виде единичной или раздельных дозировок независимо от маршрута применения. Более предпочтительный интервал дозировок составляет 0.15-50 мг/кг/день. Естественно, что в зависимости от типа используемого соединения и конкретной природы заболевания лечащим терапе