Гуманизированные антитела и их использование

Гуманизированные антитела и их использование

Реферат

 

Изобретение относится к гуманизированным антителам и к их связывающим белкам, способным связываться с Т-клетками, имеющими определенные вариабельные бета-цепи. В частности, с субпопуляциями клеток, экспрессирующих V 5,2 и/или 5,3 и V 8,1 человека. Изобретение характеризует получение таких антител, фармацевтические композиции, содержащие эти антитела, и терапевтическое использование этих антител. Использование изобретения позволяет создать новые лекарства для лечения аутоиммунных заболеваний. 9 с. и 10 з.п.ф-лы, 4 ил.

Изобретение относится к "очеловеченным" антителам и их связывающим белкам, способным связываться с Т-клетками, имеющими определенные вариабельные бета-цепи, а в частности с субпопуляциями клеток, экспрессирующих V 5.2 и/или 5.3 и V 8.1 человека. Настоящее изобретение также относится к получению таких антител; к фармацевтическим композициям, содержащим эти антитела; и к терапевтическому использованию этих антител, например, для лечения аутоиммунных заболеваний.

Т-клетки играют главную роль в дифференцировке и регуляции эффекторных механизмов в иммунной системе (Paul et а1. (1987) Science 195:1293-1300). Распознавание антигена и молекул главного комплекса гистосовместимости Т-клетками должно быть специфическим и точно регулируемым, поскольку неправильная иммунная регуляция способствует развитию аутоиммунитета. В некоторых лабораториях проводились исследования заболеваний, которые, по-видимому, обусловлены неправильной иммунной регуляцией, например такие как аутоиммунные состояния и некоторые формы иммунодефицита; причем в патогенезе указанных заболеваний участвуют Т-клетки.

Существуют такие ситуации, в которых, как сообщалось, происходит клональная или олигоклональная экспансия отдельного комплекса Т-клеточного рецептора. Наиболее ярким примером является состояние малигнизации (злокачественного развития), которое приводит к Т-клеточному лейкозу или к образованию лимфомы. В условиях развития Т-клеточного лейкоза или лимфомы Т-клеточный рецептор действует как уникальный опухолевый маркер, поскольку в этих случаях происходит стабильная перестройка Т-клеточных рецепторов и их представление на поверхности клетки. Другая ситуация, где конкретный рецепторный комплекс Т-клеток играет активную роль, возникает у реципиента трансплантированного органа, Т-лимфоциты которого имеют Т-клеточные рецепторы, делающие их агрессивными против молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС) конкретного донора, например донора трансплантата костного мозга.

Что более важно, некоторые исследователи сообщали о селективном гене V-области т-клеточного рецептора антигена, экспрессируемом при некоторых аутоиммунных состояниях. Так, например, Grunwald и др. сообщают, что у пациентов, страдающих саркоидозом, экспрессия продукта V 2.3-гена в CD4⁺Т-клетках в бронхоальвеолярной промывной жидкости была преимущественной по сравнению с лимфоцитами периферической крови (Grunwald et а1., (1992) Eur.J.Immunol. 22: 129). При болезни Кавасаки преимущественная экспансия V2 и V8 в Т-клетках наблюдалась в начальной стадии болезни (Abe et а1., (1992) Proc. Natl, Acad. Sci. USA 89:4066).

C этой точки зрения было также проведено широкое изучение ревматоидного артрита. Некоторые исследователи отмечали предпочтительную экспансию субпопуляций Т-клеток; так, например, DerSimonian и др. ((1993) J.Exp.Med. 177-1623) наблюдали предпочтительную экспансию V 12.1-несущих Т-клеток в CD8⁺-лимфоцитах периферической крови; Stamenkovic и др. ((1988) Proc.Nati. Acad. Sci. USA 85:1179) сообщают, что, как показал Саузерн-блот-анализ, синовиальные мембрано-инфильтрующие Т-клетки, культивированные в 1L2, были олигоклональными; Paliard и др. ((1991) Science 253: 34) высказывают предположение, что суперантиген активирует V 14⁺-Т-клетки, включая аутореактивные Т-клетки, которые клонально размножаются и мигрируют в синовиальную жидкость пациентов, страдающих ревматоидным артритом; Howell и др. ((1991) Proc.Nati. Acad.Sci. USA 88:10921) областей Т-клеток: V 3, 14 и 17 в 2R⁺-клетках синовиальной жидкости пациентов, страдающих ревматоидным артритом; Uematsu и др. (Proc.Natl.Acad. Sci. USA 88:8534) показали использование гена V-области олигоклональных Т-клеток в Т-клетках синовиальной жидкости пациентов с ревматоидным моноартритом; а в заявке на Международный патент N W090/06758 указывается на причастность V 3, 9 и 10 к ревматоидному артриту.

Кроме того, было также проведено тщательное изучение кишечных воспалительных заболеваний. Некоторыми группами исследователей, например Posnett и др. ((1990) J. Clin. Invest 85:1770); Spencer и др. ((1991) J.CIin.Pathol, 44: 915); Trejjdosiewicz и др. ((1991) Clin. Exp. Immunol. 84:440); и Van Kerckhove и др. ((1992)J.Exp.Meo.175:57), было отмечено, что кишечные воспалительные заболевания ассоциируются с размножением Т-клеточных популяций или преимущественной экспрессии V-области Т-клеточного рецептора. Другие исследователи (van Shooten et а1., (1992) Proc. Natl.Acad.Sci. USA 89:112 44; Wang et al. , (1993) Proc. Natl.Acad.Sci. USA 90:188) сообщали о преимущественной экспрессии гена V-области Т-клеток в бактерии Mycobacterium leprae.

Было установлено, что у человека, экспансия Т-клеток, несущих V 8.1, в воспалительной ткани ассоциируется с некоторыми аутоиммунными заболеваниями, включая болезнь Крона (Posnett et al., (1990) J.Clin.Invest. 85:1770-1776), болезнь Кавасаки (Abe et al., (1992) Proc.Nail. Acad.Sci. USA 89: 4066-4070, Abe et al., (1993) J.Exp. Mad. 177:791-796) и ревматоидный артрит (Brennan et al., (1988) Clin.Exp.Immunol. 73: 417-423).

Другим аутоиммунным заболеванием, относящимся к объектам интенсивных исследований, является рассеянный склероз (MS). Рассеянный склероз представляет собой иммунопатологическое заболевание, характеризующееся инфильтрацией и демиелинизацией мононуклеарных клеток центральной нервной системы. Хотя патогенез рассеянного склероза неизвестен, однако, по-видимому, в развитии этого заболевания играют роль как генетический, так и экологический факторы. Главными элементами наследственной предрасположенности к данному заболеванию является связь этого заболевания с конкретными гаплотипами главного комплекса гистосовместимости класса II, а в частности HLA-DR21 DQWL (Terasaid et а1. (1976) Science 1933:1245-1247; Но et а1. (1982) Immunogenetics 15: 509-517; Spielman et а1. (1982) Epidemiol.Rev. 4:45-65; Francis et al. , (1986) Lancet 1:211; Elian et а1. (1987) Disease Markers 5:89-99; Urban et. al. (1988) Cell 54:577-592, Vandenbark et а1. (1989) Nature 341: 541-544; Howell et а1. (1989) Science 246:668-670).

Было показано, что Т-клетки, выделенные из спинномозговой жидкости пациентов, страдающих рассеянным склерозом, используют ограниченный набор генов V-области. Обнаружение in vivo-активированных Т-клеток, специфичных к основному белку миелина, у пациентов, страдающих рассеянным склерозом, свидетельствует о причастности MBP-реактивных Т-клеток к патогенезу этого заболевания (Wucherpfennig et а1. (1990) Science 248:1016-1019). При определении участия V Т-клеточного рецептора MBP-реактивных клеточных линий посредством полимеразной цепной реакции (PCR) для амплификации кДНК с использованием праймеров V T-клеточного (TCP) была выявлена преимущественная экспрессия лимитированного числа V-генов (Wucherpfennig et а1., (1990), см. выше) - V 17 и в меньшей степени V 12 часто используются в распознавании области антигенной детерминанты аутоантигена MBP человека (MBP - основной белок миелина)) (Oksen-berg et.al. Nature 362:68). Результаты некоторых исследований также позволяют предположить, что в пораженных тканях головного мозга пациентов, страдающих рассеянным склерозом, происходит экспрессия ограниченного числа генов V Т-клеточного рецептора (Oksenberg et al., (1990) Nature 345: 344:346). Анализ популяции Т-клеток с использованием количественной PCR и окрашивания моноклональным антителом (mAb) показал, что V 5.2 и/или 5.3 используются преимущественно MBP-специфическими Т-клетками, выделенными от пациента с рассеянным склерозом, по сравнению с контролем (Oksenberg и др. (1993), см. выше) (реарранжированные V 5.2 гены были обнаружены в головном мозге пациентов с определенным HLA-фенотипом) и Kotzin и др. (1991) Proc.NatI. Acad. Sci.Sci. USA 88:9196 (смешение в сторону экспрессии вериабельной области -цепи 5.2 и в меньшей степени V 6.1 наблюдалось для MBP-специфических клонов от пациентов с рассеянным склерозом).

В настоящее время не существует эффективных способов лечения рассеянного склероза (Harrison's Principles of Internal Medicine, 12-th ed. Wilson et al., McGraw Hill, Inc., 1991). Применяемое терапевтическое лечение направлено на улучшение состояния в периоды обострения, предупреждения рецидивов или прогрессирования заболевания и ослабления симптомов.

Однако было обнаружено, что экспрессия гена вариабельной области V 8.2 ассоциируется с экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом (ЕАЕ) в мышиной модели человеческого рассеянного склероза. Было продемонстрировано, что обработка V 8.2-специфическим моноклональным мышиным антителом (mAb) может предупреждать и ослаблять симптомы заболевания (Achaorbea et а1., (1988) Cell 54:263; и Urban et al. (1988) Cell 54:577). Таким образом, существует крайняя необходимость в разработке антитела или "антитело-подобной" молекулы, подходящей для лечения этого заболевания.

Антитела обычно состоят из двух тяжелых цепей, связанных друг с другом дисульфидными связями, и двух легких цепей, ассоциированных с N-концом каждой тяжелой цепи соответственно. Каждая тяжелая цепь имеет у своего N-конца вариабельный домен, а за ним, у своего С-конца, константный домен. Каждая легкая цепь также имеет у своего N-конца вариабельный домен, за которым следует константный домен. Вариабельные домены каждой пары легкой и тяжелой цепей образуют антигенсвязывающий центр. Вариабельные домены на легкой и тяжелой цепях имеют одинаковую общую структуру, и каждый домен содержит четыре каркасных участка, которые имеют относительно консервативные последовательности и которые перемежаются с тремя гипервариабельными (или определяющими комплементарность) участками (CDR). Указанные четыре каркасных участка имеют до некоторой степени -складчатую конформацию, а гипервариабельные участки образуют петли, соединяющие -складчатую структуру. Эти гипервариабельные участки находятся в непосредственной близости друг к другу, образуя антигенсвязывающий центр. Гипервариабельные и каркасные участки антител могут быть определены по системе нумерации Кэбета (Kabat и др. (1987) "Sequences of Proteins of Iimmunological Interest" US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office) в сочетании рентгеновской кристаллографией, как описано в WO91/09967.

Для продуцирования антитела, которое может быть направлено против конкретного антигена, обычно используют метод Kohler Milstein (Kohler et al., (1976) Nature 256:495-497). B общих чертах этот метод предусматривает иммунизацию мышей антигеном; слияние клеток селезенки, полученных от иммунизированных мышей, с мышиными миеломными клетками; и отбор из продуцированных таким образом гибридом одной или несколько гибридом, секретирующих моноклональное антитело, специфичное к данному антигену-мишени.

Указанные мышиные моноклональные антитела (mAb) можно с успехом использовать в терапии. Однако такие антитела имеют в основном мышиное происхождение, а поэтому сами по себе они являются антигенными для человека. Если это антитело вводить человеку несколько раз, то его иммунная система будет вырабатывать иммунный ответ против указанного mAb, что в результате приведет к неэффективности этого антитела.

Поэтому Winter и его сотрудниками (см., например, Reichmann et а1., (1988) Nature 332:323-327; и Verhoeyen et al. (1988) Science 239; 1534-1536) было высказано предположение о возможности "прививки" гипервариабельных областей мышиного моноклонального антитела к каркасным участкам антитела человека с получением антитела с CDR-вставками, обладающего связывающими свойствами донорного мышиного mAb и физиологической совместимостью с иммунной системой человека благодаря наличию акцепторного каркаса, происходящего от антитела человека.

Однако функция молекулы антитела зависит от ее трехмерной структуры, которая, в свою очередь, зависит от ее первичной аминокислотной последовательности. Изменение аминокислотной последовательности антитела может неблагоприятным образом повлиять на его активность. Аналогичным образом, фрагменты антитела могут не сохранять соответствующую трехмерную структуру, которая благоприятствует связывающей активности. Кроме того, изменение ДНК-последовательности, кодирующей антитело, может повлиять на способность клетки, содержащей эту ДНК-последовательность, осуществлять экспрессию, секрецию или сборку молекулы антитела. Точно определить конкретные остатки, составляющие гипервариабельные участки (CDR), довольно трудно, и, кроме того, эти остатки не обязательно будут соответствовать всем остаткам гипервариабельных участков, определенных по системе нумерации Кэбета. Имеются также критические каркасные остатки, которые играют важную роль в расположении гипервариабельных участков, взаимодействующих с антигеном, либо которые участвуют во взаимодействиях между тяжелыми и легкими цепями. В некоторых случаях может оказаться необходимым изменить определенные каркасные остатки таким образом, чтобы они соответствовали донорным остаткам в определенных положениях, сообщая тем самым антителу с чужеродными CDR менее "человеческий" характер.

Были опубликованы различные предложения по поводу идентификации остатков гипервариабельных участков и каркаса, которые необходимо заменить на донорные остатки для продуцирования нужного антитела с чужеродными CDR (см., например, Queen et al., W090/07861; Kurrle et al, EP-A-O 403156; Adair et al., W091/09967; Queen et al., W092/11018; Bendig et al., WO92/01568). Как видно из этих документов, продуцирование нужного антитела с чужеродными CDR в каждом конкретном случае не является точно предсказуемым процессом.

Несмотря на проблемы, возникающие при попытке продуцировать специфическое антитело с чужеродными CDR, авторам настоящего изобретения в предпочтительном его варианте удалось получить антитело с чужеродными гипервариабельными участками (CDR), сконструированное на основе человеческих каркасных участков и имеющее антигенсвязывающий центр, специфичный к вариабельным участкам бета-цепи, которые являются характерными для определенных субпопуляций, Т-клеток. Неожиданно было обнаружено, что "очеловеченные" антитела настоящего изобретения обнаруживают такую же хорошую, если не лучше, аффинность связывания с Т-клетками-мишенями, как и их мышиные прототипы. Антитела настоящего изобретения или их части имеют те преимущества, что по сравнению со своими мышиными прототипами они являются менее иммуногенными, что способствует снижению неблагоприятных реакций организма пациента при лечении с использованием указанных антител.

Настоящее изобретение относится к "очеловеченным" антителам, обладающим специфичностью в отношении селективного связывания с определенными субпопуляциями Т-клеток; причем указанные антитела являются в высокой степени чувствительными к связыванию с этими субпопуляциями и обнаруживают такую же, если не лучше, специфичность и аффинность связывания, как и их мышиные прототипы (mAb), от которых происходят гипервариабельные участки рассматриваемых антител.

Настоящее изобретение также относится к способам получения таких "очеловеченных" антител, предусматривающим использование новых кДНК, кодирующих определенные остатки гипервариабельных и каркасных участков, и встраивание этих остатков в каркасные области тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина человека. В других своих вариантах настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям и терапевтическим методам с использованием указанных антител.

В одном из особо предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения мышиные моноклональные антитела (mAb) 16G8, которые распознают V 8.1 человека, были "очеловечены" путем встраивания некоторых CDR и выбранных каркасных остатков, происходящих от мышиного mAb, в каркасные области тяжелой цепи KOl и легкой цепи REl. Для этого кДНК, кодирующие "очеловеченные" тяжелые (IgG1) и легкие (К) цепи в экспрессирующих векторах клеток млекопитающего, вместе с селективными маркерами Neo и DHFR соответственно трансфецируют в клеточную линию DHFR-фибробластов китайского хомячка (CHO) с последующей селекцией и амплификацией. Секретированные "очеловеченные" mAb (обозначенные "TM29") сохраняют специфичность в отношении V 8.1 Т-клеточного рецептора TCR с аффинностью, сравнимой с аффинностью прототипов мышиного mAb (16G8). Таким образом, настоящее изобретение продемонстрировало, что "очеловечение" антител против TCR может быть осуществлено при сохранении нужной специфичности и аффинности в отношении данной субпопуляции клеток.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к использованию этих "очеловеченных" антител в качестве терапевтического средства для лечения аутоиммунных заболеваний, а в частности болезни Крона.

В другом из особо предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения мышиное моноклональное антитело ТМ23, которое распознает V 5.2 и 5.3 человека, "очеловечивают" путем встраивания CDR в каркасы тяжелой цепи NEWM и легкой цепи REl. Для этого кДНК, кодирующие "очеловеченные" тяжелые (IgG1) и легкие (К) цепи в экспрессирующих векторах клеток млекопитающего вместе с селективными маркерами Neo и DHFR соответственно трансфецируют в клеточную линию NHFR-фибробластов китайского хомячка (CHO) с последующей селекцией и амплификацией. Продуцированные таким образом "очеловеченные" mAb, обозначенные "ТМ27", сохраняют специфичность в отношении V 5.2 и 5.3 TCR с аффинностью, сравнимой с аффинностью прототипов мышиного mAb (ТМ23). В других своих вариантах настоящее изобретение относится к использованию ТМ27 в качестве терапевтического средства для лечения рассеянного склероза (MS) у человека.

На фиг. 1 представлены различные вариабельные последовательности легкой цепи и тяжелой цепи для ТМ27; на фиг. 2 представлены различные вариабельные последовательности легкой цепи и тяжелой цепи для ТМ29; на фиг. 3 представлены результаты конкурентного анализа, проводимого для сравнения ТМ27L/NSO и ТМ27L/CHO с 4H11; и на фиг. 4 представлены графики Скэтчарда, описывающие эксперимент, проиллюстрированный на фиг. 3.

Ниже приводится объяснение некоторых терминов, используемых в описании настоящего изобретения.

Используемый в настоящей заявке термин "антитело" относится к Ig или к любому его фрагменту, к мономерам или димерам легкой или тяжелой цепи и к одноцепочечным антителам, таким как одноцепочечные FV-фрагменты, в которых вариабельные домены тяжелой и легкой цепи соединены пептидным линкером; причем все перечисленные антитела могут быть натуральными или продуцированными с использованием техники рекомбинантных ДНК или какого-либо другого метода при условии, что полученное в результате антитело имеет по крайней мере один антигенсвязывающий центр. При этом остальная часть антитела не обязательно должна содержать лишь последовательности, происходящие от Ig. Так, например, может быть сконструирован ген, в котором ДНК-последовательность, кодирующая часть цепи Ig человека, соединена с ДНК-последовательностью, кодирующей аминокислотную последовательность полипептидной эффекторной или репортерной молекулы. Таким образом, термин "антитело" включает в себя понятие "гибридное антитело" (см. ниже).

Используемый в настоящей заявке термин "связывающий белок" относится к конструкции, имеющей конкретную аминокислотную последовательность, происходящую от антитела или комбинации антител, причем указанная последовательность имеет такую стерическую конфигурацию, что она образует по крайней мере один антигенсвязывающий центр.

Используемое в настоящей заявке сокращение "mAb" означает моноклональное антитело, продуцированное гибридомой или производной клеточной линией.

Используемый в настоящей заявке термин "рекомбинантное антитело" относится к антителу, продуцированному способом, предусматривающим использование техники рекомбинантных ДНК.

Термин "CDR" или "участок, определяющий комплементарность" или "гипервариабельный участок", относится к тем частям вариабельных участков тяжелой или легкой цепи антитела, которые, будучи расположены в непосредственной близости друг от друга в трехмерном пространстве, образует антигенсвязывающую поверхность.

Термин "химерное антитело", используемый в настоящем описании, означает антитело, в котором вариабельные домены, в целом происходящие из антитела от первого вида млекопитающих, соединены по крайней мере с одним константным доменом, происходящим из антитела от другого вида млекопитающего.

Используемый в настоящем описании термин "антитело с чужеродными CDR" относится к антителу или его фрагменту, в котором CDR, происходящие из антитела от первого вида млекопитающего, встроены в вариабельные каркасные участки, в основном происходящие от второго вида млекопитающего. Некоторые выбранные аминокислоты в указанных участках могут также происходить от указанного первого вида млекопитающего.

Используемый в настоящем описании термин "гибридное антитело" относится к белку, содержащему по крайней мере связывающую часть Ig, соединенную пептидной связью по крайней мере с частью другого белка. При этом следует отметить, что для описания таких конструкций некоторые специалисты могут также использовать термин "химерное антитело", однако в настоящем описании эти конструкции называются гибридными антителами, а термин "химерные антитела" имеет смысл, определенный выше.

Термин "очеловеченное антитело", используемый в настоящем описании, относится к антителу, содержащему в одном или двух своих вариабельных доменах по крайней мере один, а предпочтительно два или три гипервариабельных участка (CDR), происходящих из антитела от первого вида млекопитающего; при этом следует отметить, что такие антитела могут также содержать в сочетании с некоторыми гипервариабельными аминокислотными последовательностями определенные выбранные аминокислоты каркасной области, происходящие от указанного первого вида млекопитающего. Остальные Ig-части антитела происходят от одного или нескольких антител другого вида. Вариабельные домены могут быть получены с помощью техники рекомбинантных ДНК или с помощью пептидного синтеза.

Термин "экспрессирующие векторы" относится к векторам, способным экспрессировать содержащиеся в нем ДНК-последовательности, т.е. к векторам, в которых кодирующие последовательности соответствующим образом присоединены к другим последовательностям, обеспечивающим их эффективную экспрессию. Полезным, но не всегда необходимым (т.е. клетки насекомых) элементом эффективного экспрессирующего вектора является последовательность, кодирующая маркер, т.е. последовательность, кодирующая векторную последовательность, сообщающую клетке, содержащей данный белок, фенотипические свойства (например, резистентность к неомицину, резистентность к метионинсульфоксимину или триптофен-прототрофию), которые позволяют затем легко идентифицировать эти клетки. В целом термин "экспрессирующий вектор" является функциональным определением, а поэтому под этим термином подразумевается любая ДНК-последовательность, способная к эффективной экспрессии конкретной кодирующей ДНК-последовательности. В настоящее время в качестве таких векторов часто используются плазмиды. Таким образом, термины "плазмида" и "экспрессирующий вектор" часто являются взаимозаменяемыми. Однако настоящее изобретение включает в себя и другие формы экспрессирующих векторов, которые обладают эквивалентными функциями и которые со временем становятся все более известными, например ретровирусы, аденовирусы, in-vitro-системы (Baranov et а1., (1989) Gene 84:2:463) и т.п.

Как уже было установлено ранее, ДНК-последовательности после их правильного присоединения (т.е. такого присоединения, которое обеспечивало бы их экспрессию) к регулирующей экспрессию последовательности могут быть экспрессированы в клетках-хозяевах. Указанные экспрессирующие векторы обычно способны реплицироваться в организмах-хозяевах либо в виде эписом, либо в виде интегральной хозяйской хромосомной ДНК.

Термин "рекомбинантные клетки-хозяева" относится к клеткам, котоые были трансформированы векторами, сконструированными с использованием техники рекомбинантных ДНК. Благодаря такой трансформации, хозяйская клетка способна продуцировать нужный продукт в достаточных количествах, а не в тех небольших количествах (чаще всего в количествах, меньших, чем детектируемые количества), которые обычно продуцируются нетрансформированным хозяином. Антитела и связывающие белки настоящего изобретения могут продуцироваться рекомбинантными клетками-хозяевами в количествах, достаточных для проведения дополнительных экспериментов, или в коммерчески приемлемых количествах, например около 100 граммов или более.

В описании способов выделения антител или связывающих белков из рекомбинантных хозяев термины "клетка" и "клеточная культура", используемые для обозначения источника антитела, являются (если это не указано особо) взаимозаменяемыми. Другими словами, выделение из "клеток" может означать либо центрифугирование целых клеток с последующим выделением белка, либо выделение из клеточной культуры, содержащей среду и суспендированные клетки, либо, как это возможно в случае клеточных линий миеломы, выделение из асцитной культуры.

"Очеловеченные" антитела или их связывающие белки настоящего изобретения имеют аминокислотные последовательности, которые содержат все или часть гипервариабельных участков (CDR), происходящих в основном от моноклонального антитела, обладающего специфичностью к выбранным субпопуляциям Т-клеток, а в частности к субпопуляции V 8.1 или субпопуляции V 5.2/5.3. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения предпочтительным моноклональным антителом является мышиное антитело. Поскольку антитела настоящего изобретения называются "очеловеченными" антителами, то в предпочтительных вариантах осуществления изобретения каркасная аминокислотная последовательность вариабельных доменов антител или их частей происходит в основном от человека. Очевидно, что такое "очеловечение" антител осуществляют для снижения их иммуногенности при терапевтическом введении человеку. Для использования в настоящем изобретении предпочтительными являются каркасные области NEWM или KOL, происходящие от тяжелой цепи иммуноглобулина человека, и каркасные области REl, происходящие от легкой цепи иммуноглобулина человека. При этом некоторые выбранные каркасные остатки могут иметь также мышиное, а не человеческое происхождение. Это необходимо, как очевидно, для получения соответствующей трехмерной структуры молекулы антитела в целях повышения специфичности и аффинности связывания с конкретной Т-клеточной субпопуляцией.

Следует отметить, что в объем настоящего изобретения входит любая часть "очеловеченных" антител (исходя из широкого определения термина "антитело"), которая обладает специфичностью и аффинностью связывания в отношении выбранных субпопуляций Т-клеток. Таким образом, в объем настоящего изобретения входят связывающие белки, происходящие от указанных антител, а также фрагменты, сохраняющие связывающую способность на уровне, по крайней мере подходящем для терапевтического использования, как описано ниже.

Каждый специалист может оценить параметры связывания различных конструкций настоящего изобретения с помощью стандартных анализов на связывание, проводимых с использованием специфических Т-клеток или Т-клеточных рецепторных белков, имеющих выбранную вариабельную область, являющуюся мишенью. Так, например, может быть осуществлен анализ на связывание с mAb-прототипом, на связывание с различными клеточными линиями, анализ Скэтчарда, и т.п., и полученные результаты можно сравнить с результатами, полученными для mAb-прототипа. Альтернативно для этих целей могут быть привлечены различные системы in vivo-моделей, например таких, как описаны ниже, либо для оценки терапевтической эффективности конструкций настоящего изобретения могут быть приведены клинические испытания; причем в этой связи следует отметить, что какая-либо конкретная конструкция может оказаться весьма подходящим терапевтическим средством, даже если ее характер связывания с антигеном-мишенью отличается от характера связывания с mAb-прототипом.

В особо предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения аминокислотная последовательность "очеловеченного" антитела или его связывающего белка содержит всю вариабельную легкую цепь или ее часть, выбранную из группы, включающей в себя: Легкая цепь ТМ 29: 1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSS VNYIYWYQQTPGKAPLLIYYT 50 51 SNLAPGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSL QPEDIATYYCQQFTSSPFTFGQG 100 101 TKLQIT Легкая цепь TM 27: 1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITKSASQG INYLNWYQQTPGKAPKLLIYY 50 51 TSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISS LQPEDIATYYCQQYSKLPRTFGQ 100 101 GTKLQIT отдельно или в комбинации со всей вариабельной тяжелой цепью или ее частью, выбранной из группы, включающей в себя: Тяжелую цепь TM 29: 1 EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSSSGFT FSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAY 50 51 ISSGSSTIYYADTLKGRFTISRDNSKN TLFLQMDSLRPEDTGVYFCARRG 100 101 EGAMDYWGQGTPVTVSS 117 Тяжелую цепь TM 27: 1 QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFS LTAYGVNWVRQPPGRGLEWLGM 50 51 IWGDGNTDYNSALKSRVTMLKDTSKNQ FSLRLSSVTAADTAVYYCARDRV 100 101 TATLYAMDYWGQGSLVTVSS 120 Для сохранения трехмерной конформации CDR очень важно выбрать каркасные остатки, находящиеся в непосредственной близости от отдельных CDR (Foote & Winter (1992) j.Mol., Biol.224:487-499). Так, например, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения были сконструированы модифицированные тяжелые цепи. В одних вариантах вместо человеческих остатков 66-69 включительно и 73 была введена мышиная последовательность Leu-Ser-Ile-Ser (66-69) и Asp (73).

В других предпочтительных вариантах в положения 78 и 79 вводили мышиные остатки валин и фенилалин соответственно либо в положение 92 вводили мышиный аргинин.

Эти замещения проиллюстрированы на фиг. 1, где гипервариабельные участки показаны жирным шрифтом и подчеркнуты. Такие предпочтительные конструкции антитела (включая их связывающие белки) связываются с V 5.2/5.3.

Другие предпочтительные антитела и связывающие белки настоящего изобретения могут быть получены путем модификации тяжелых цепей в остатках 23 и 24. В эти положения были введены соответствующие мышиные Ala-, в других проиллюстрированных конструкциях остаток 75 заменяли на мышиный пролин, а остатки 88, 89 и 91 заменяли на мышиный аланин, метионин или тирозин соответственно. Эти конструкции антител или их связывающих белков, которые более полно показаны на фиг. 2, связываются с V 8.1-Т-клетками.

Особенно предпочтительными для использования в настоящем изобретении являются антитела со встроенными чужеродными CDR, состоящие в основном из легкой цепи TM27 и тяжелой цепи TM27, где остаток 48 является мышиным лейцином или изолейцином. Предпочтительными также являются антитела со встроенными чужеродными CDR, состоящие в основном из легкой цепи TM29 в комбинации с тяжелой цепью TM29.

"Очеловеченные" антитела или связывающие белки настоящего изобретения могут быть продуцированы различными способами, предусматривающими экспрессию в трансфецированных клетках, предпочтительно таких как дрожжевые клетки, CHO, клетки насекомых или миеломные клетки. Наиболее предпочтительными клетками-хозяевами являются клетки яичника китайского хомячка (CHO).

Для конструирования антитела со встроенными чужеродными CDR или связывающего белка настоящего изобретения, сначала необходимо определить последовательность вариабельного домена антитела, имеющего нужные связывающие свойства. Подходящими клетками-источниками для таких ДНК-последовательностей являются клетки птиц, млекопитающих или других позвоночных, таких как куры, мыши, крысы и кролики, а предпочтительно мыши. Последовательности вариабального домена (V_H и V_L) могут быть определены, исходя из кДНК тяжелой и легкой цепи, синтезированной из соответствующей мРНК с использованием стандартной техники, в основном известной специалистам. Гипервариабельные участки могут быть затем определены по методу Кэбета (см. выше). CDR могут быть определены с помощью структурного анализа с использованием рентгеновской кристаллографии или техники молекулярного моделирования. Затем могут быть сконструированы составные CDR, содержащие все остатки, соответствующие гипервариабельным участкам, вместе с некоторыми выбранными остатками из каркасных участков. Полученные составные CDR могут быть затем перенесены в качестве "антигенсвязывающего центра", а оставшаяся часть антитела, если необходимо сконструировать полный иммуноглобулин (Ig), будет включать в себя константные домены тяжелой и легкой цепей и остальные каркасные остатки. Последние части могут происходить от антител человека различных классов.

Константные домены могут быть выбраны так, чтобы они обладали нужными эффекторными функциями, подходящими для использования сконструированного таким образом антитела. Так, например, иммуноглобулины человека изотипов IgG, IgG₁ и IgG₃ являются эффективными для фиксации комплемента и клеточноопосредованного лизиса. Для других целей могут быть более подходящими другие изотипы, такие как IgG₂ и IgG₄ или иммуноглобулины других классов, таких как IgM и IgE.

Для лечения человека в целях минимизации антиглобулинового ответа во время терапии, особенно предпочтительно использовать изотипы человека. ДНК-последовательности константного домена человека; предпочтительно в сочетании с их каркасными участками, могут быть получены в соответствии с хорошо известными процедурами. В качестве примера может служить САМРАТН 1Б от Burrougs Wellcome Ltd.

В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения некоторые антитела с чужеродными CDR имеют определенные модификации в человекоподобном каркасном участке (другими словами, за пределами CDR вариабельных доменов), в результате чего эти антитела обладают удовлетворительной аффинностью связывания. Такая аффинность связывания составляет предпочтительно от около 10^-5 М до около 10^-12 M, а более предпочтительно по крайне мере около 10^-8 М. Наиболее предпочтительно, чтобы афинность связывания была приблизительно равна или превышала аффинность связывания антитела-прототипа (в предпочтительных вариантах таким прототипом-антителом является антитело мыши).

При конструировании антител с чужеродными CDR в соответствии с настоящим изобретением V_H- и/или V_L-генные сегменты могут быть модифицированы путем мутагенеза. Любому специалисту ясно, что аналогичным способом могут быть также модифицированы (см., например, PCT/US 89/00297) другие нуклеотиды, кодирующие аминокислотные остатки или последовательности, содержащиеся в Fc-фрагменте или в других областях антитела. В этих целях могут быть использованы, например такие методы, как добавление, делеция, или неконсервативные замещения ограниченного числа различных нуклеотидов, или консервативного замещения многих нуклеотидов при условии, что будет сохранена правильная рамка считывания.

Для получения конечной конструкции могут быть использованы замещения, делении, инсерции или