Аналоги -аминомасляной кислоты, способ их получения, способ лечения и фармацевтическая композиция

Аналоги -аминомасляной кислоты, способ их получения, способ лечения и фармацевтическая композиция

Реферат

 

Изобретение относится к новым соединениям, являющимся аналогами -аминомасляной кислоты (GАВА), которые могут найти применение в качестве средств противоприпадочной терапии от расстройств центральной нервной системы. Описываются новые производные -аминомасляной кислоты общей формулы (I) Н₂N СН(R₃) - С(R₁)(R₂)-СН₂СООН, где R - прямая или разветвленная алкильная группа, имеющая 2-6 атомов углерода; R₂ и R₃ - водород, их индивидуальные энантиомеры и фармацевтически приемлемые соли. Описываются также способ получения указанных соединений, способ лечения и фармацевтическая композиция на основе указанных соединений. 4 с. и 11 з.п. ф-лы, 6 табл.

Изобретение относится к новым соединениям, являющимися аналогами - аминомасляной кислоты (GABA). Более конкретно указанные аналоги полезны в качестве средств противоприпадочной терапии от расстройств центральной нервной системы (ЦНС), таких как эпилепсия, хорея Хантингтона, церебральная ишемия, болезнь Паркинсона, поздняя дискинезия и мышечная спастичность. Возможно, что настоящее изобретение можно использовать в качестве антидепрессантных, успокаивающих и антипсихотических средств.

- Аминомасляная кислота (GABA) является основным нейротрансмиттером, участвующим в регулировании активности мозговых нервных клеток. GABA является основным ингибиторным нейротрансмиттером, a также является возбудительным трансмиттером (Roberts E. и др. GABA in Nervous System Funition, Raven Press: Нью-Йорк, 1976; Me Geer и др. Glutamine. Glutamate, and GABA in the Central Nervous System; Hertz L., Kvamme E, Me Geer E.G., Schousba A. eds. , Liss. Нью-Йорк, 1983, 3-17). Дисбаланс в концентрации этих нейротрансмиттеров может приводить к конвульсивным (судорожным) состояниям. Соответственно, клинически уместно контролировать конвульсивные состояния регулированием метаболизма этих нейротрансмиттеров. Когда концентрация GABA снижается ниже порогового уровня в мозге, наступает конвульсия (Karlsson A. и др. Biochem. Pharmacol, 1974, 23, 3053-3061). Когда уровень GABA в мозгу поднимается во время конвульсий, припадок заканчивается (Hagashi T.J. Physiol. (Лондон), 1959, 145, 570-578). Термин припадок, используемый здесь, обозначает избыточную несинхронизированную нейронную активность, которая прерывает нормальную нейронную функцию. При некоторых припадочных расстройствах пониженным уровням GABA сопутствует пониженный уровень активности декарбоксилазы - глутаминовой кислоты (GAD) (Me Geer PO, и др. GABA in Nervous System Function; Roberts E. Chase TN, Tower DB, eds., Raven Press: Нью-Йорк, 1976, 487-495, Butterworth J. и др. Neurochem. 1983, 41, 440-447, Spokes EG, Adv. Exp. Med. Biol. 1978, 123, 461-473, Wu JY и др., Neurochem. Res. 1979, 4, 575-586, и Iversen LL и др. Psychiat. Res. 1974, 11, 244-256). Часто концентрации GAD и GABA изменяются параллельно, потому что пониженная концентрация GAD приводит к более низкой выработке GABA.

Вследствие важности GABA в качестве ингибиторного нейротрансмиттера и ее влияния на конвульсивные состояния и другие моторные дисфункции были предложены разные подходы для увеличения концентрации GABA в мозге. Например, большинство очевидных подходов заключается в назначении для приема GABA. Когда GABA инъецируют в мозг конвульсирующего животного, конвульсия прекращается (Purpura DP и др., Neurochem., 1959, 3, 238-268). Однако если GABA вводят систематически, то антиконвульсантный эффект отсутствует, потому что GABA при нормальных обстоятельствах не может пересекать гематоэнцефалический барьер (Meldrum BS и др. Epilepsy: Harris P., Mawdsley C. eds., Churchill Livingston: Эдинбург 1974, 55. В свете этого ограничения существуют три альтернативных подхода для поднятия уровня GABA.

Наиболее часто встречающийся подход заключается в предложении соединения, которое пересекает гематоэнцефалический барьер и затем дезактивирует GABA-аминотрансферазу. Эффект заключается в блокировании разложения GABA и, таким образом, увеличении ее концентрации. Известны многочисленные, основанные на механизме инактиваторы GABA-аминотрансферазы (Silverman RB, Mechanism-Based Enzyme Inactivation: Chemistry and Enzymology, T.I и Il, CRC: Boca Raton 1988).

Еще один подход заключается в увеличении концентраций GABA в мозге с помощью придания GABA липофильных свойств посредством превращения в гидрофобные амиды GABA (Kaplan JP и др., G.J.Med. Chem. 1980, 23, 702-704, Carvajal G. и др., Biochem. Pharmacol. 1964, 13, 1059-1069, имины: Kaplan JP, там же, или эфиры GABA, Shashoua VE и др. J.Med. Chem. 1984, 27, 659-664, и РСТ заявка на патент WO 85/00 520, опубликованная 14.02.85), с тем, чтобы GABA могла пересекать гематоэнцефалический барьер. Попав в мозг, эти соединения требуют амидазу и эстеразы для удаления гидролизом группы-носителя и высвобождения GABA.

Следующий подход заключается в увеличении уровня GABA в мозге путем создания активаторов GAD. В качестве активаторов GAD описано несколько соединений. Сообщалось, что антиконвульсантное средство, малеинимид, увеличивает активность GAD на 11% и приводит к увеличению концентрации GABA в субстанции нигра на величину до 38% (Janssens de Varebeke P. и др. Biochem. Pharmacol. 1983; 32: 2751-2755).

Сообщалось также, что антиконвульсантный препарат, вальпроат натрия (Loscher W, Biochem. Pharmacol, 1982, 31, 837-842, Phillips NI и др., Biochem Pharmacol. 1982, 31, 2257-2261), активирует GAD и повышает уровень GABA.

Найдено, что соединения настоящего изобретения активируют GAD ин витро и оказывают защитное действие, зависящее от дозы, на припадки ин виво.

Также найдено, что соединения настоящего изобретения связываются с новыми участками (сайтами) связывания, которые, как было определено, связывают тритиированный габапентин. Найдено, что габапентин является эффективным лекарственным средством для профилактики частичных припадков у пациентов, не поддающихся лечению другими антиконвульсионными средствами. Chadwick D, Gabapentin, стр. 211-222, B: Recent Advances in Epilepsy, т. 5, Pedley TA, Meldrum BS, (ред.) Churchill Livingstone, Нью-Йорк (1991)). Новый сайт связывания, меченый тритиированным габапентином, был описан в работах по мембранным фракциям ткани мозга крыс и по ауторадиографическим исследованиям средств мозга крыс, Hill D, там же. Данный сайт связывания использовался для оценки соединений настоящего изобретения.

Новые соединения настоящего изобретения представлены ниже формулой I. Следует заметить, что соединения формулы I, в которой R₁ - метил, R₂ и R₃ - водород, описаны в патенте Японии N 49-40460.

Краткое описание изобретения В соответствии с настоящим изобретением предложены соединения формулы I в которой R₁- нормальный или разветвленный C₁-C₆-алкил, фенил или C₃-C₆-циклоалкил, R₂ - водород или метил, и R₃ - водород, метил или карбоксигруппа, при условии, что, когда каждый из R₂ и R₃ представляют водород, R₁ отличен от метила. Фармацевтически приемлемые соли соединений формулы I также включены в объем настоящего изобретения. Объемом изобретения охватываются также энантиомерные изомеры соединений формулы I.

Настоящее изобретение представляет также фармацевтические композиции соединений формулы I.

Как часть настоящего изобретения предлагается также новый метод лечения связанных с припадками расстройств с помощью назначения пациентам для приема антиконвульсантно эффективного количества соединений формулы II в которой R₁₁ - нормальный или разветвленный C₁-C₆-алкил, фенил или C₃-C₆-циклоалкил, R₁₂ - водород или метил, и R₁₃ - водород, метил или карбоксигруппа, или их индивидуальных энантиомерных изомеров, или фармацевтических приемлемых солей.

Настоящее изобретение представляет также метод повышения нейронной GABA мозга и фармацевтические композиции с соединениями формулы II.

Настоящее изобретение предлагает новые способы синтеза хиральных соединений формулы I.

Подробное описание изобретения В соответствии с настоящим изобретением предложен ряд аналогов 3-алкил-4-аминомасляной кислоты или 3-алкилглутаминовой кислоты, полезных в качестве антиконвульсантов. Примерами алкилов, представленных символами R₁ и R₁₁ в формулах I и II, являются метил, этил, пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, изопентил и неопентил, а также другие алкильные группы. Циклоалкильными группами, представленными R₁ и R₁₁ в формулах I и II, являются циклопропил, циклобутил, циклопентил и циклогексил. Показано далее, что данные аналоги предотвращают припадки, не вызывая при этом побочных эффектов атаксии, таких как побочные эффекты, обнаруженные у некоторых противоприпадочных средств.

Более предпочтительными соединениями изобретения являются соединения формулы I, в которой R₃ - водород, R₂ - водород и R₁ - изобутил.

То есть предпочтительным соединением является 4-амино-3-(2-метилпропил)бутановая кислота. Неожиданно было обнаружено, что данное соединение является более сильно действующим, чем другие, синтезированные, как описано здесь, и испытанные ин виво. Далее, что удивительно, как показывают последующие данные, это то, что данное предпочтительное соединение является наименее эффективным соединением из аналогов, испытанных в отношении активации GAD ин витро. Соответственно, очень неожиданно, что данное предпочтительное соединение обладает такой высокой активностью при испытании ин виво.

Наиболее предпочтительными соединениями настоящего изобретения являются (S)-(+)-(R)-(-)-4-амино-3-(2- метилпропил)бутановая кислота, причем (S)-(+)-энантиомер наиболее предпочтителен. Было найдено, что (S)-(+)-энантиомер является наиболее сильным соединением в рамках настоящего изобретения в отношении вытеснения тритиированного габапентина, и оба, (S)-(+)- и (R)-(-)-энантиомера, показывают ярко выраженную стереоселективность, как по вытеснению тритиированного габапентина, так и по антиконвульсантной активности ин виво.

Соединения, полученные в соответствии с настоящим изобретением, могут образовывать фармацевтически приемлемые соли с органическими и неорганическими кислотами или основаниями. Например, кислотно-иддитивные соли основных соединений получают растворением свободного основания в водном или водно-спиртовом растворе или других подходящих растворителях, содержащих соответствующую кислоту, и выделением соли путем упаривания раствора. Примерами фармацевтически приемлемых содей являются хлоргидраты, бромгидраты, гидросульфаты и т.д., а также натриевые, калиевые и магниевые соли и т.д.

Способ получения 3-алкил-4-аминобутановых кислот осуществляют, исходя из эфиров 2-алкеновых кислот, которые получают по реакции Кновенагеля из промышленно доступных альдегидов и монометилмалоната (Ким и др., J.Med.Chem. 1965, 8309), за исключением этил-4,4-диметил-2-пентеноата.

Более конкретно, для получения всех 3-алкилглутаминовых кислот можно обычно использовать следующую методику. 10 г 3-алкил-5,5- дикарбэтокси-2-пирролидинона нагревают с обратным холодильником в 150 мл 40% дымящей НВг в течение 4 часов. Затем содержимое помещают в испаритель и удаляют летучие компоненты в вакууме с помощью горячей водяной бани. Смолоподобный остаток растворяют в 25 мл дистиллированной воды и воду удаляют с помощью испарителя. Процесс повторяют еще раз. Остаток растворяют в 20 мл воды и pH раствора доводят до 3,2 концентрированным раствором аммиака. В данный момент растворимость отдельных 3-алкилглутаминовых кислот меняется в зависимости от длины цепи так, что те кислоты, боковые цепи которых крупнее, легко осаждаются из раствора. Осаждению алкилглутаминовых кислот с меньшими заместителями (метил, этил и пропил) может способствовать охлаждение на ледяной бане или разбавление водного раствора 100 мл абсолютного этанола. Осаждение из водно-спиртовой смеси завершается за 48 часов. Следует проявлять осторожность, чтобы добавлять этанол медленно, чтобы предотвратить осаждение аморфного твердого материала, который не является характерным показателем целевых 3-алкилглутаминовых кислот. Образцы аминокислот очищают для анализа с помощью перекристаллизации из смеси вода-этанол.

Все кислоты плавятся с разложением. Точки плавления разложившихся 3-алкилглутаминовых кислот соответствуют точкам плавления их пироглутаминовых кислот.

Этил-4,4-диметил-2-пентеноат получают из 2,2-диметил-пропанола и этиллитиацетата с последующей дегидратацией - гидроксиэфира фосфорилхлоридом и пиридином.

Присоединение по Михаэлю нитрометана к ,- ненасыщенным соединениям, протекающее при участии 1,1,3,3- тетраметилгуанидина или 1,8-диазабицикло[5,4.0]ундец-7-ена (ДВИ), дает 4-нитроэфиры с хорошим выходом. Более конкретно, смесь нитрометана (5 моль) ,- ненасыщенного эфира (1 моль) и тетраметилгуанидина (0,2 моль) перемешивают при комнатной температуре в течение 2-4 дней. В случае метилакрилата эфир следует добавлять при температуре ниже 30^oC. За ходом реакции следят с помощью ИК (исчезновение полосы С=С) и ГЖХ анализа. Реакционную смесь промывают разбавленной соляной кислотой и экстрагируют эфиром. Органический экстракт сушат, растворитель удаляют при пониженном давлении и остаток перегоняют при давлении 2 мм рт.ст. Хотя алифатические нитросоединения обычно восстанавливаются или с помощью каталитического гидрирования при высоком давлении с катализируемым металлом переносом водорода, или новых способов гидрогенолиза с использованием формиата аммония или боргидрида натрия и палладия в качестве катализаторов, заявители нашли, что эфиры 4-нитрокарбоновых кислот можно восстанавливать почти количественно в соответствующие эфиры 4-аминокарбоновых кислот гидрированием с использованием 10% палладия на угле в качестве катализатора в уксусной кислоте при комнатной температуре и атмосферном давлении. Полученные сложные аминоэфиры подвергают кислотному гидролизу с получением целевых соединений изобретения с хорошим выходом. Данный прием обеспечивает доступ к многочисленным 3-алкил-4-аминобутановым кислотам, перечисленным в таблицах 1 и 2 в качестве примеров, и, таким образом, имеет преимущество по сравнению с ранее используемыми способами.

Примеры более конкретных способов получения соединений в соответствии с настоящим изобретением приведены далее, которые необязательно используют методики, описанные выше. Когда исходный материал не является промышленно доступным, последовательность синтеза может начинаться с соответствующего спирта, который окисляют в альдегид по методу Corey EJ и др., Tetrahedron Lett 1975, 2647- 2650.

Хиральные соединения формул I и II получают, как указано на Схеме 1. Хотя схема 1 показывает хиральный синтез определенного соединения, (S)-(+)-4-амино-3-(2-метилпропил)бутановой кислоты, специалист легко увидит, что метод синтеза пригоден для любого диастереомерного соединения формулы I и II.

На схеме 1 Ph означает фенил, Bn - бензил, THF тетрагидрофуран, LDA - диизопропиламид лития, BH₃-SMe₂ - комплекс борина с диметилсульфидом, Tsll - тозилхлорид, и DMSO - диметилсульфоксид.

Подробная методика синтеза представлена ниже в примере 1. Ключевая вводная литература по этой методике обсуждается в статье Эванса, J.Am. Chem. Soc. , 1982, 104, 1737-9. Еноляты металлов могут образовываться с амидом лития или натрия и алкилироваться впоследствии с образованием производных замещенных карбоновых кислот. Данная методика полезна для энантиоселективного синтеза указанных производных - замещенных карбоновых кислот. В данной статье Эванс описал получение производных пропионовой кислоты с рядом простых алкилирующих агентов. Изменяя стереохимию хирального синтона (оксазолидинона), он смог получить высокую стереоселективность.

Эванс использовал этот хиральный вспомогательный реагент и в других синтетических исследованиях, но ни одно не связано с 4-амино-3-(2-метилпропил)бутановой кислотой, которая содержит - замещенную - аминокислоту. Методика Эванса раскрывает - замещение и далека от - замещения и не использовалась для получения данного типа необычных аминокислот. N-Ацилоксазолидиноны использовались для получения энолятов хлортитана, которые подвергались реакции с аддкутами Михаэля, такими как акрилонитрил, J.Org. Chem., 1991, 56, 5750-2. Они использовались в синтезе антибиотиков семейства рутамицина, J. Org. Chem. , 1990, 55, 6260-8 и в реакциях стереоселективной альдольной конденсации, Org. Synth., 1990, 68, 83-91. Хиральные - аминокислоты получали с использованием оксазолидинов. В данной последовательности энолят дибутилбора бромировался и замещался азидом Tetrahedron Lett., 1987, 28, 1123-6. Сообщалось также о других синтезах - гидрокси -- аминокислот с помощью данного хирального вспомогательного реагента через альдольную конденсацию Tetrahedron Lett. , 1987, 28, 39-42, J.Am. Chem. Soc., 1987, 109, 7151-7. , -ненасыщенные N-ацилоксазолидиноны также использовали для индуцирования хиральности в реакции Дильса- Альдера (J.Am. Chem. Soc., 1988, 110, 1238-56). Ни в одном из этих примеров или других примеров, найденных в литературе, данная методика не использовалась для получения - замещенных карбоновых кислот или 3 - замещенных аналогов GABA.

Согласно еще одному воплощению хиральные соединения формул I и II можно получать способом, похожим на синтез, показанный на схеме 1. В этом варианте, однако, стадию 8 на схеме 1, заменяют двухстадийной процедурой, представленной ниже в примере 2. Вместо восстановления азида (8) в аминокислоту (9) по схеме 1 согласно альтернативной процедуре азид (8) гидролизуется в промежуточный азид (8a), который затем восстанавливается (см. схему 1a).

Гидролиз азида (8) в промежуточный азид (8a) перед восстановлением имеет два основных преимущества. Первое преимущество заключается в том, что промежуточный азид (8a) может очищаться экстракцией водным основанием. После подкисления водного экстракта промежуточный азид (8a) можно экстрагировать в органическую фазу и выделить. Это дает возможность очистки промежуточного азида (8a) без использования хроматографии. Для очистки азида (8) требуется хроматография, которая очень дорога и часто непрактична в крупном масштабе.

Второе преимущество заключается в том, что промежуточный азид (8a) можно восстановить в аминокислоту (9) без добавления кислоты. Восстановление азида (8) требует добавления кислоты, например соляной кислоты, для того чтобы получить аминокислоту (9). К сожалению, лактамизация аминокислоты (9) промотируется присутствием кислоты. Промежуточный азид (8а) можно восстановить в аминокислоту (9) в условиях, близких к нейтральным, таким образом сводя до минимума проблему лактамообразования.

Согласно еще одному предпочтительному варианту хиральные соединения формул I и II можно получать как показано на схеме 2. Хотя в схеме 2 показан хиральный синтез конкретного соединения, (S)-(+)-4-амино-3-(2-метилпропил)бутановой кислоты, специалист легко увидит, что данный способ синтеза может применяться для получения любого диастереомерного соединения формул I и II. На схеме 2 Ph означает фенил и Ts - тозил.

Подробная методика синтеза описана ниже в примере 3. Данная процедура сходна со способом синтеза по схеме 1, однако бензиловый эфир схемы 1 заменяется трет-бутиловым эфиром на схеме 2. Целевая аминокислота (9) и (109) соответственно является одной и той же на обеих схемах 1 и 2.

Существует несколько преимуществ использования трет- бутилового эфира, а не бензилового эфира в синтезе аминокислоты (9) или (109). Первое преимущество относится к гидролизу вспомогательного хирального реагента на стадии 4 схемы 1. В ходе гидролиза хирального вспомогательного реагента в данной реакции часто происходит некоторый гидролиз бензилового эфира. Гидролиз трет-бутилового эфира по схеме и не обнаружен.

Другое преимущество относится к использованию спирта (106) схемы 2 по сравнению со спиртом (6) схемы 1. Бензиловый эфир-спирт имеет склонность к лактонизации, как показано ниже. Хотя лактонизации бензилового эфира-спирта можно избежать в некоторых условиях, но трет-бутиловый эфир-спирт гораздо менее склонен подвергаться лактонизации Еще одним преимуществом, которое ранее уже обсуждалось в связи со способом по схеме 1a, является то, что трет-бутиловый эфир уменьшает до предела проблему образования лактана конечной аминокислотой (109). Вместо восстановления азида (108) в аминокислоту (109), которое требует добавления кислоты, вызывающей лактамизацию аминокислоты (109), азид (108) сначала гидролизуют в промежуточный азид (108a). Промежуточный азид (108a) может восстанавливаться в нейтральных условиях, давая аминокислоту (109), практически устраняя, таким образом, проблему образования лактама.

Следует упомянуть также, что с помощью описанных здесь способов получаются несколько новых промежуточных продуктов. Некоторые из них, которые показаны на схемах 1, 1a и 2, включают рацемат или R- или S-энантиомеры: 4-метил-5-фенил-2- оксазолидинон, фенилметиловый эфир 4-метил-(2-метилпропил)-2- диоксо-5-фенил-3-оксазолидинбутановой кислоты, 4-метилпентаноилхлорид, 4-метил-3-(4-метил-1-оксопентил)-5-фенил-2- оксазолидинон, 4-(фенилметиловый) эфир 2-(2- метилпропил)бутандиовой кислоты, бензиловый эфир 3-(азидометил)-5- метилгексановой кислоты, бензиловый эфир 3-(гидроксиметил)-5- метилгексановой кислоты, бензиловый эфир 5-мeтил-3-[[[(4- мeтилфeнил)сульфонил] окси] метил] гексановой кислоты, 3- (азидометил)-5-метилгексановая кислота, 4-трет-бутиловый эфир 2- (2-метилпропил)-1,4-бутандиовой кислоты, трет-бутиловый эфир 3- (азидометил)-3-метилгексановой кислоты, трет-бутиловый эфир 3- (гидроксиметил)-5-метилгексановой кислоты, трет-бутиловый эфир 5- метил-3-[[[(4-мeтил(фенил) сульфонил] окси]метил] гексановой кислоты или трет-бутиловый эфир 4-метил-(2-метилпропил)-2-диоксо-5-фенил-3-оксазолидинбутановой кислоты.

Соединения, полученные вышеприведенными способами, можно использовать в лекарственных препаратах в качестве антидепрессантных, успокаивающих, антипсихотических, противоприпадочных, антидискинезийных или антисимптоматических средств при болезни Хантингтона или Паркинсона, если использовать эффективное количество соединения приведенной выше формулы I вместе с фармацевтически приемлемым носителем. То есть настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию для подавления припадков, возникающих в результате эпилепсии, лечения церебральной ишемии, болезни Хантингтона, болезни Паркинсона и мышечной спастичности, а также возможно для создания антидепрессантного, успокаивающего и антипсихотического эффектов. Ожидается, что последние эффекты обусловлены функциональным сходством с другими известными соединениями, обладающими данными видами фармакологической активности. Лекарственные средства можно применять для лечения таких заболеваний у страдающих от них млекопитающих, включая человека, причем назначения таким млекопитающим эффективного количества соединений формул I и II в форме единичной дозы.

Фармацевтические соединения, полученные в соответствии с настоящим изобретением, можно приготавливать и назначать в разнообразных дозировочных формах. Например, эти фармацевтические композиции могут приготавливаться в инертных фармацевтически приемлемых носителях, твердых или жидких. Препараты твердых форм включают порошки, таблетки, диспергируемые гранулы, капсулы, облатки и суппозитории. По известным способам можно приготавливать другие препараты в твердой и жидкой форме. Количество активного соединения в единичной дозе препарата может изменяться или регулироваться от 1 до 300 мг/кг ежедневно, в расчете на средний вес пациента 70 кг, предпочтительная ежедневная доза составляет примерно 1-50 мг/кг. Дозировка, однако, может изменяться в зависимости от потребности больного, серьезности его состояния и применяемого соединения. Определение соответствующей дозы для каждой отдельно взятой ситуации находится в компетенции специалиста.

Примеры соединений, полученных в соответствии с настоящим изобретением, испытывались для демонстрации способности соединений активировать ин витро и для предотвращения припадков ин виво без побочного эффекта атаксии.

Активация GAD ин витро Опыты проводили в 10 мл пробирках, закрытых резиновыми крышками, через которые вставляли центральные ячейки (каталог N 882320-000), в центральную ячейку помещали 200 мкл свежеприготовленного 8% раствора КОН. L-Глутаминовую кислоту в различной концентрации (0,5, 0,25, 0,166, 0,125, 0,10 мм), содержащую [¹⁴C] L-глутамат (10 мккю/ммоль)в 50 мМ калийфосфатном буфере (pH 7,2), встряхивали при 37^oC в отдельных пробирках с очищенной декарбоксилазой L-глутаминовой кислоты (GAD) (18,75 мкг, удельная активность 10,85 мкмоль/мин. мг) при общем объеме 2,00 мл после встряхивания в течение 60 мин реакцию фермента подавляли добавлением 200 мкл и 6 М серной кислоты к содержимому каждой пробирки. Пробирки встряхивали дополнительно 60 мин при 37^oC. Центральные ячейки удаляли и помещали в сцинтилляционные пробирки с 10 мл сцинтилляционной жидкости для определения радиоактивности. Те же опыты были повторены при различной концентрации активаторов (2,5, 1,0, 0,5, 0,25, 0,1, 0,05 мМ). Величины V_макс определяли из графика 1 (циклов в мин относительно 1) (глутамат) при различных концентрациях активаторов. Данные выражены как отношение V_макс в присутствии активаторов к V_макс в отсутствие активаторов, умноженное на 100%.

Результаты опытов показаны в таблице 1. Испытания показали, что имеется значительная активация разными испытанными соединениями в разной степени. Испытаны также известные активаторы, вальпроат натрия и габапентин.

Чтобы показать способность новых соединений предотвращать припадки, были выполнены испытания ин виво. Моделью испытаний на животных распространенных припадков является электрошок порогового максимума, аналогичный описанному Piredda SG и др., Pharmacol and Exptl. Therap., 1985, 232(3), 741-45. Методика этого теста описана ниже.

Самцы мышей CF-1 (22-30 г) имели свободный доступ к пище и воде перед испытанием. Для скрининга группам из 5 мышей вводили соединение внутривенно в дозах 30, 100 и 300 мг/кг и тестировали через 0,5, 2,0 и 4,0 часа после введения дозы. Лекарства либо растворяли в 0,9% солевом (физиологическом) растворе или суспендировали в 0,2% метилцеллюлозе. Животных подвергали шоку через роговичные электроды (см. ниже) и наблюдали тонический приступ на разгибателях задних конечностей. Отсутствие распрямления задних конечностей считалось указанием на наличие антиконвульсантного эффекта.

Электрошоковый аппарат давал 60 Гц синусоидальную волну с постоянной амплитудой тока 14 мА (от максимума до максимума) в течение 0,2 сек. Сила тока 14 мА, используемая в этой методике, вызывала тонический приступ приблизительно у 95% необработанных мышей, но лишь слабо превышает порог тонического распрямления.

Суммарное число животных, защищенных от приступов (припадков) при испытании через 120 мин после введения каждого соединения, приведенного в левой колонке, дано в таблице 2 для разных уровней доз, указанных во второй колонке таблицы.

Вследствие интересных явлений, связанных с (R,S)-изобутил GABA (данное соединение обладает значительно более высокой эффективностью, не вызывая атаксию) испытание электрошоком порогового максимума проводили, изменяя время испытания от 1 до 8 часов, при дозе 10 мг/кг на мышах, вводимой внутривенно. Результаты таблицы 3 показывают, что максимальная защита наступает спустя 2 часа после тестирования.

При рассмотрении результатов, изложенных выше, была построена кривая отклика на дозу через 2 часа после тестирования, причем лекарство вводили внутривенно в количестве 10 мг/кг. Результаты этого испытания показаны в таблице 4, а вычисленная эффективная доза (ЭД₅₀) равна 2,07 мг/кг.

Третье фармакологическое испытание выполняли, как описано в работе Krall R. L. и др., Epilepsia, 178, 19, 409. По этой методике лекарства испытывали на ослабление порогового клонического приступа у мышей вызываемого подкожным введением пентилентетразола (85 мг/кг), который является общепринятой моделью для приступов типа абсанс. Результаты третьего испытания для соединений, вводимых либо внутривенно, либо перорально, показаны в таблице 5. Испытания, проводимые для трех разных доз, показали эффективную защиту при дозах 30 и 100 мг/кг при отсутствии атаксии.

Указанное выше является значительной находкой, потому что соединение, имеющее наименьшую способность активировать GAD ин витро, показало на удивление приблизительно 10-кратное увеличение эффективности по сравнению с другими испытанными соединениями. Еще более неожиданным является отсутствие атаксического побочного эффекта в сочетании с данным увеличением эффективности.

Роговичный высокий интенсивности электрошок, состоящий из 50 мА, от основания до максимума синусоидального тока в течение 0,2 сек. Все другие данные получены из электрошока низкой интенсивности, 17 мА от основания до максимума синусоидального тока в течение 0,2 сек.

Как отмечено выше, (S)-(+)-энантиомер 4-амино-3-(2- метилпропил) бутановой кислоты (3-изобутил-GABA или IBG), структурно близкий известному антиконвульсанту габапентину, активно вытесняет тритиированный габапентин с новых сайтов высокого сродства во фракциях мембран мозга крыс. (S)-(+)- Энантиомер 3-изобутил-GABA также ответственен за фактически всю блокаду приступа от максимального электрошока у мышей и крыс. (R)- (-)-энантиомер 3-изобутил-GABA гораздо менее эффективен в блокаде приступов от максимального электрошока и в вытеснении тритиированного габапентина с новых связывающих сайтов высокого сродства. В таблице 6 ниже представлены данные по сравнению габапентина, рацемической 3-изобутил-GABA (()-IBG-), (S)-(+)- 3-изобутил-GABA ((S)-IBG), и (R)-(-)-3-изобутил-GABA ((R)-lBG) в этих анализах.

Противосудорожная активность (всех соединений) достигает пика через 2 часа после введения дозы и проходит в основном через 8 часов после введения дозы.

Данные, приведенные в таблице 6, получены следующим образом. Для антиконвульсантных (противосудорожных) испытаний самцов мышей штамма CF-1 (20-25 г) и самцов крыс Sprague-Dawley (75-115 г) получали из Чарлз Ривер Лабораториз и содержали со свободным доступом к пище и воде перед испытанием. Максимальный электрошок создавали с помощью роговичных электродов обычными методами (Krall, см. выше, 1975), за исключением того, что электрошок низкой интенсивности у мышей состоял из тока 17 мА, а не с обычным током 50 мА (от нуля до максимума). Мышам давали испытываемое вещество и проверяли на предотвращение приступа при действии электрического тока, подводимого через роговицу двумя металлическими электродами, покрытыми марлей, и насыщенной 0,9% хлоридом натрия. Электрошоковую стимуляцию создают прибором постоянного тока, который производит 60 Гц синусоидальный электрический ток в течение 0,2 сек. Для крыс максимальная электрошоковая стимуляция создается током 120 мА. Атаксию у мышей оценивают по методу переворачивающейся сетки, по которому мышей индивидуально помещают на 4,0-дюймовую квадратную проволочную сетку, которую впоследствии переворачивают (Coughenour, см. выше, 1978). Любая мышь, которая падала с проволочной сетки в течение 60 сек испытания, оценивалась как атаксичная. Величину ЕД₅₀ определяли по методу пробит-анализа результатов с по меньшей мере 5 дозированными группами 10 мышей или 8 крыс каждая.

Все лекарства были свободно растворимы в водной среде. Для исследований ин виво готовили растворы лекарств в 0,9% хлориде натрия и вводили в объеме 1 мл/100 г массы тела. Внутривенное введение осуществляли инъекцией шарика в ретро-орбитальную полость мышей. Пероральное введение осуществляли через внутрижелудочный зонд.

Для изучения связывания приготавливали частично очищенные мембраны синаптической плазмы из неокортекса крыс с использованием градиентов плотности сахарозы. Кору головного мозга 10 крыс иссекали из остального мозга и гомогенизировали в 10 объемах (масса/объем) ледяной 0,32 М сахарозы в 5 мМ трис-ацетата (pH 7,4) с использованием стеклянного гомогенизатора, снабженного тефлоновым пестиком (10-15 ударов при 200 об/мин). Гомогенат центрифугировали при 100 g в течение 10 мин и надосадочный раствор собирали и держали на льду. Осадок (P1) повторно гомогенизировали в 20 мл трис-сахарозы, повторно центрифугировали при 21500 g в течение 20 мин. Осадок (P2) повторно суспендировали в 1,2 М трис-сахарозы и 15 мл данной смеси добавляли в пробирки для ультрацентрифугирования. На этот слой помещали слой 10 мл 0,9 М сахарозы с последующим конечным слоем 5 мМ трис-ацетата с pH 8,0. Пробирки центрифугировали при 100000 g в течение 90 мин. Синаптические мембраны плазмы, расположенные на границе раздела 0,9/1,2 М сахароз, собирали, повторно суспендировали в 50 мл 5 мМ трис-ацетата с pH 7,4 и центрифугировали при 48000 g. Конечный осадок повторно суспендировали в 50 мл трис-ацетата с pH 7,4, разделяли на отдельные количества (аликвоты) и замораживали до использования.

Анализируемую ткань (0,1-0,3 мг белка) инкубировали 20 мМ [³H]-габапентина в 10 мМ HEPES буфера (pH 7,4 при 20^oC, без натрия) в присутствии переменных концентраций испытываемого соединения в течение 30 мин при комнатной температуре до фильтрования под вакуумом через фильтры GFB. Фильтры промывали 3х5 мл ледяным раствором 100 М NaCl и определяли dpm, связанный с фильтром, используя жидкостной сцинтилляционный счетчик. Неспецифическое связывание определяли по связыванию, наблюдаемому в присутствии 100 мМ габапентина.

В результате показанной выше активности соединений настоящего изобретения, и особенно 4-амино-3-(2-метилпропил)-бутановой кислоты (изобутил-GABA), ясно, что соединения, полученные в соответствии с настоящим изобретением, являются ценными фармакологическими средствами, особенно для лечения припадков у млекопитающих, включая человека.

Пример 1.

(S)-(+)-4-Амино-3-(2-метилпропил) бутановая кислота Последовательность стадий см. на схеме 1 Стадия 1 К раствору 4-метилвалериановой кислоты (50,0 г, 0,43 моль) в 100 мл безводного хлороформа добавлялся тионилхлорид (60 мл, 0,82 моль). Реакционная смесь нагревалась с обратным холодильником в течение 2 часов, а затем охлаждалась до комнатной температуры. Избыток хлороформа и тионилхлорида удаляли с помощью перегонки. Остаточное масло подвергалось фракционной перегонке, давая 45,3 г (78%) ацилхлорида (2), т.пл. 143-144^oC.

Ацилхлорид (2) также получался с помощью альтернативного способа, который устранял использование хлороформа, при использовании которого имеются трудности, связанные с устранением отходов и воздействием на оператора. Альтернативный способ также уменьшал до предела образование 4- метилвалерианового ангидрида.

К раствору тионилхлорида (98,3 кг, 828 моль) и N, N-диметилформамида (2 кг, 27 моль) добавляли 4-метилвалериановую кислоту (74 кг, 37 моль) при поддержании температуры 25-30^oC. Добавляли гексан (30 л) и раствор выдерживали при 30-35^oC в течение 1 часа 15 мин. Затем раствор нагревали до 70-75^oC в течение 1 часа 10 мин и подвергали перегонке при атмосферном давлении до тех пор, пока раствор не достигал температуры 95^oC. После охлаждения добавляли гексан (30 л) и раствор подвергали перегонке при атмосферном давлении до тех пор, пока достигалась температура 97^oC. Перегонка остаточного масла давала 79 мг (92%) ацилхлорида (2), т.кип. 77^oC, 60-65 мм рт.ст.

Стадия 2 К раствору (4R,5S)-(+)-4-метил-5-фенил-2-оксазолидинона (5,27 г, 29,74 ммоль) в 70 мл безводного тетрагидрофурана при -78^oC в атмосфере аргона добавляли медленно 1,6 М раствор н- бутиллития (19 мл, 30,40 ммоль) в гексане. Смесь оставлялась перемешиваться при -78^oC в течение 15 мин, затем добавлялся ацилхлорид (4,5 г, 33,43 ммоль) для гашения реакции. Реакционную смесь перемешивали при -78^oC в течение 10 мин, затем при 0^oC в течение 30 мин. Добавляли насыщенный раствор бикарбоната натрия (50 мл), и смесь перемешивали при 0^oC в течение 30 мин. Органический слой собирали, а водный слой экстрагировали этилацетатом (3х). Органические экстракты объединяли и сушили безводным MgSO₄. Смесь фильтровали и концентрировали, получая бесцветное масло. Масло хроматографировалось на силикагеле (элюент - 8% этилацетат в гексане), давая 7,56 г (82%) ацилоксазолидинона (3) в