Авирулентный штамм vibrio cholerae не-01 серогруппы (варианты), способ получения штамма (варианты), вакцина

Авирулентный штамм vibrio cholerae не-01 серогруппы (варианты), способ получения штамма (варианты), вакцина

Реферат

 

Изобретение относится к авирулентным штаммам Vibrio cholerae (CVD 112 и CVD 112RM) не-01 серогруппы, у которых отсутствует RS1-последовательность и коровая (сердцевинная) последовательность холерного энтероксина. Штаммы содержат последовательности, кодирующие устойчивость к ртути, и последовательности, кодирующие В-субъединицу холерного энтеротоксина, повторно вставленную в хромосому. Изобретение также относится к способам получения авирулентных штаммов Vibrio cholerae (CVD 112 и CVD 112RM) не-01 серогруппы. Авирулентные штаммы Vibrio cholerae CVD 112 и CVD 112RM не-01 серогруппы применяются в производстве вакцины против холеры. 5 с. и 11 з.п. ф-лы, 40 ил.

Данная заявка является частичным продолжением патентных заявок США 08/133438 и 08/133439, зарегистрированных 8 октября 1993 года, обе из которых включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылочного материала. Обе указанные патентные заявки США 08/133438 и 08/133439 являются частичным продолжением патентной заявки США 07/931943, зарегистрированной 12 августа 1992 года, которая является продолжением заявки США 07/821872 настоящего заявителя, зарегистрированной 16 января 1992 года и являющейся продолжением патентной заявки США 07/533315 настоящего заявителя, зарегистрированной 5 июня 1990 года, каждая из которых включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылочного материала. Патентная заявка США 07/533315 является частичным продолжением патентной заявки США 06/581406, зарегистрированной 17 февраля 1984 года и являющейся частичным продолжением патентной заявки США 06/472276, зарегистрированной 4 марта 1983 года, каждая из которых включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылочного материала. Патентная заявка США 07/533315 также является частичным продолжением патентной заявки США 07/363383 настоящих заявителей, зарегистрированной 5 июня 1989 года, по которой принято решение о выдаче патента 12 декабря 1989 года, которая является продолжением патентной заявки США 06/867633, зарегистрированной 27 мая 1986 года, являющейся продолжением патентной заявки США 06/472276, зарегистрированной 4 марта 1983 года, каждая из которых включена в данное описание в качестве ссылочного материала. Научно-исследовательские работы, результаты которых подробно изложены в материалах настоящей заявки, проведены при содействии Национального Института Здоровья и частично Центра по Медицинской Биотехнологии Мерилендского Биотехнологического Института.

Холерный вибрион (Vibrio cholerae) является неинвазивным энтеропатогеном тонкой кишки, не способным проникать через слизистую оболочку. Локальный Siga-опосредованный иммунитет слизистой кишечника выступает, таким образом, в качестве защитного механизма. Патогенный холерный вибрион (V.cholerae) серотипа 01 выделяет белковый энтеротоксин (известный также под названием холерный энтеротоксин или холероген, или холерный экзотоксин), который ответственен за размножения и выделение кишечником холерного вибриона, что приводит к возникновению диареи - клиническому симптому холерной инфекции. Гены, ответственные за продукцию холерного энтеротоксина относятся к ctx-генам (известным специалистам также под названием tox-гены или гены токсинов). Холерная диарея может иметь чрезвычайно тяжелое течение, приводя к значительной потере воды и минеральных солей организмом человека, состоянию обезвоживания, ацидозу, шоку и смерти без оказания экстренного терапевтического лечения.

Известно, что в области хромосомы V.cholerae, содержащей ctx-гены, которые ответственны за размножение, можно обнаружить участок длиной 2700 пар оснований, названный RS1 (в виде повторяющейся последовательности). Mekalanos, Cell, v.35, pp. 253-263 (1983).

В ходе создания настоящего изобретения было также установлено, что V. cholerae продуцирует второй энтеротоксин, названный как токсин зоны плотных контактов (zonula occludents toxin), о чем ранее сообщали Fasano и др., в статье " Vibrio cholerae Produces a Second enterotoxin Which Affects Interstinal Tight Junction ", Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 88.5242-5246 (1991).

Созданные в настоящее время холерные вакцины можно разделить на две широкие категории: вакцины, стимулирующие антитоксический иммунитет, и вакцины, предназначенные для индукции противобактериального иммунитета. Эксперименты на модельных животных подтверждают защитную роль антитоксического и/или противобактериального иммунитета. Было сделано предположение, что, если оба иммунитета действуют одновременно, возникает синергический эффект. [Holmgren, J. и др., J.Infect.Dis 136 Suppl., S105-S1122 (1977); Peterson, J. W. Infect. Immun. 25, 594 (1979); Resnick, I.G. и др., Infect. Immun. 13, 375 (1980); Svennerholm, А.-М. и др. Infect. Immun. 13, 735 (1976)]. Однако оказывается, что у людей защитный иммунитет проявляется без синергического эффекта, то есть, либо действует механизм защиты против токсинов, либо против бактериальной инфекции [Eubanks, E.R. и др., J.Infect. Immun. 15, 533 (1977); Fujita, K. и др., J. Infect. Dis. 125, 647 (1972); Holmgren, J., J. Infect. Dis., см. ранее; Lange, S. и др., Acta Path. Microbiol. Scand Sect. С 87,145 (1978); Peterson, J.W., см. ранее (1979); Pierce, N.F. и др. Infect. Immun. 37, 687 (1982); Pierce, N.F. и др., Infect. Immun. 21, 185 (1978); Pierce, N.F. и др, J. Infect. Dis. 135,888 (1977); Resnick, I.G. и др., см. ранее; Svennerholm, А.-М. и др., см. ранее].

Убитые цельноклеточные вакцины 1. Парентеральные цельноклеточные вакцины Уже почти столетие убитые цельные холерные вибрионы используют в качестве парентеральных вакцин; эти вакцины все еще имеются на рынке. Накопленный опыт в области использования вакцин, полученных из инактивированных цельных холерных вибрионов, проанализирован Joo, I. в работе "Cholera vaccines. " в книге Cholera. (Barua D. и Burrows W., eds.), Saunders, Phyladelphia, стр. 333-355 (1974) и Feeley, J.D. и др., в тезисах доклада Cholera and Related Diarrhears, 43rd Nobel Symp., Stockholm, 1978. (O.Oucherlong, J.Holmgren, eds) Karger, Basel, стр. 204-210 (1980). Такие вакцины стимулируют образование высоких титров сывороточных антител с вибриоцидными свойствами. Они также усиливают нарастание титра Siga антитела в кишечнике против соматического O-антигена V.cholerae в условиях вакцинации населения Пакистана, а не Швеции [Svennerholm, А.-М. и др. Infect. Immun. 30., 427 (1980); Svennerholm, А.-М. и др., Scan. J. Immun. 6, 1345 (1977)]. Было выдвинуто предположение, что такая иммунная реакция на вакцину происходит у реципиентов в Пакистане потому, что они уже иммунологически устойчивы в результате их предыдущего контакта с антигеном, в то время как такой иммунной реакции не происходит у лиц, проживающих в неэндемических регионах (например, Швеция). Парентеральные убитые цельноклеточные вакцины, как свидетельствуют результаты их апробации, обладают высоким иммунным потенциалом для защиты организма от V.cholerae гомологичного серотипа, но, как правило, на срок менее одного года [Joo, I. см. ранее; Feeley,J.C., см. ранее; Svennerholm, А.-М. и др. , см. ранее,(1980); Svennerholm, A.-M. и др., см. ранее, (1977); Mosley, W. H. и др., Bull. Wld. Hlth., Org. 49, 13 (1973); Philippines Cholera Committee, Bull. Wld. Hlth. Org., 49, 381 (1973)]. Имеются некоторые данные, подтверждающие предположение о том, что парентеральная цельноклеточная вакцина на основе холерного вибриона серотипа Инаба обеспечивает превосходный непродолжительный иммунитет как к холерному вибриону серотипа Огава, так и серотипу Инаба, тогда как вакцина серотипа Огава эффективна только против серотипа Огава. Использование адъювантов в составе парентеральной цельноклеточной вакцины, позволило обеспечить защитный иммунитет примерно на 70% в течение до полутора лет (см., например, Soroso, J.S. и др., Bull. Wld.Hlth. Org., 56, 619 (1978)). Однако в месте прививки вакцины с адъювантом довольно часто возникают сильно выраженные побочные явления (включая стерильные абсцессы), что ограничивает использование таких адъювантных вакцин общепринятым методом.

2. Пероральные цельноклеточные вакцины Убитые цельные вибрионы, вводимые перорально, усиливают выработку секреторного антитела против вибрионного антигена. [Freter, R. J., Infect. Dis., 111, 37 (1972); Freter R. и др., J, Immunol., 91 724 (1963); Ganguly, R. и др. , Bull. Wld. Hlth.Org., 52, 323 (1975)]. Результаты, полученные другими исследователями, свидетельствовали о высокой эффективности таких вакцин, однако в большинстве случаев они приводили к развитию холерной диареи после последующей провокационной пробы патогенными вибрионами [Cash, R.A. и др. J. Infect. Dis. 130, 325 (1974)].

Токсоиды К иммуногенам, предназначенным для противохолерной профилактики путем усиления антитоксического иммунитета, относятся следующие вещества: 1) Обработанный формальдегидом холерный токсоид; 2) Обработанный глютаральдегидом холерный токсоид; 3) Очищенная В-субъединица холерного энтеротоксина и 4) Термоинактивированный холерный энтеротоксин (обработанный или необработанный формальдегидом).

1. Обработанный формальдегидом холерный токсоид Обработка очищенного холерного энтеротоксина формальдегидом in vitro устраняет полностью его вирулентность, в результате чего получают анатоксин, проявляющий биологическую активность с незначительным токсическиv эффектом, но стимулирующий образование антитоксиновых антител после парентеральной иммунизации животных. Однако при введении первичного анатоксина такого типа, как обезьянам, так и человеку, в качестве парентеральной вакцины он становился опять частично токсикогенным, вызывая нежелательные побочные явления в месте прививки [Northrup, R.S. и др., J. Infect. Dis., v. 125, 471 (1972)]. Формалинированный холерный токсоид с адъювантом на основе окиси алюминия вводили парентерально бангладешцам-добровольцам, в том числе кормящим матерям, но без массовой апробации этой вакцины [Merson, M.H. и др., The Lancet 1,931(1980)]. Кроме того, формалинированный холерный анатоксин, полученный в присутствии глицина, был апробирован путем перорального введения, однако не было получено никаких данных, свидетельствующих об иммунологической эффективности этой вакцины [Ohtomo, N. In Proceedings of the 12 th Joint Conference on Cholera, U. S. - Japan Cooperative Medical Science Program, Sapporo (Fukumi H., Zinnaka Y., eds), pp. 286- 296 (1976); Noriki.H, In Proceedings of the 12 th Joint Conference on Cholera, U.S. - Japan Cooperative Medical Science Program, Sapporo (Fukumi H., Zinnaka Y., eds), pp. 302-310 (1976)].

2. Обработанный глютаральдегидом холерный токсоид В настоящее время разработаны методы для крупномасштабного производства обработанного глютаральдегидом холерного анатоксина, который практически не содержит соматического антигена [Rappaport, E.S. и др. Infect, lmmun., v.l4, р. 687 (1976)] . Исследователи возлагали надежду на то, что этот антиген, полученный в чистом виде, можно будет использовать для оценки защитного механизма антитоксического иммунитета. Массовую апробацию этого анатоксина, вводимого в виде парентеральной вакцины, провели в Бангладеш в 1974 году [Curlin, G. In Proceeding of the 11 th Joint Conference on Cholera, US-Japan Cooperative Medical Science Program., pp.314-329, New Orleans, 1975)]. Этот анатоксин усиливал образование высоких титров циркулирующих антитоксиновых антител у бангладешских реципиентов. Две вспышки холеры, вызванные вибрионом Эль Тор Инаба, а затем Эль Тор Огава захватили и район, где проводились массовые испытания вакцины, что позволило сделать достаточно достоверную оценку ее эффективности. Однако защитный эффект вакцины смогли продемонстрировать только на одной возрастной группе населения, и при этом он был ограничен продолжительностью эпидемической холеры серотипа Инаба, в результате чего эффективность обработанного глютаральдегидом холерного токсоида, полученного в чистом виде в форме парентеральной вакцины, была невысокой и ниже результатов апробации парентеральных инактивированных цельноклеточных вакцин на той же самой категории населения.

Была исследована возможность использования обработанного глютаральдегидом холерного токсоида в качестве пероральной вакцины, базируясь на предположении, что указанный анатоксин, вводимый таким путем, должен быть более эффективен за счет усиления образования антител против холерного энтеротоксина [Levine, М.М. и другие, Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 73, 3, (1979)] . С этой целью две группы добровольцев иммунизировали путем введения трех доз по 2.0 мг или трех доз по 8.0 мг указанного анатоксина непосредственно в просвет тонкой кишки (через кишечный зонд), каждую через месяц. После чего получившие вакцину добровольцы и не иммунизированные лица, служившие в качестве контроля, приняли участие в экспериментах с контрольным инфицированием их холерным вибрионом. Ни в одном эксперименте с антигенным стимулом не отмечено достоверного ослабления симптоматики болезни и тяжести диареи у вакцинированных по сравнению с контролем. Отсутствие эффективности перорально вводимого, обезвреженного глютаральдегидом холерного энтеротоксина может быть обусловлено тем, что способность В-субъединиц связывать ганглиозид GM1 сильно снижается в результате его обезвреживания глютаральдегидом.

3. Очищенная субъединица B холерного энтеротоксина Холерный энтеротоксин состоит из двух субъединиц, A и B, кодируемых ctx AB-опероном. A-субъединица индуцирует ферментативные изменения, которые вызывают секрецию жидкости в просвет кишечника, в то время как нетоксичная B-субъединица представляет собой иммуногенную группу, которая связывает рецептор токсина (ганглиозид GM1) на клетках эпителия кишечника [Holmgren, J. Nature, 292, 413 (1981)]. Было продемонстрировано, что очищенная B-субъединица, вводимая как перорально, так и парентерально бангладешцам, усиливает образование Siga антитоксина в жидкости кишечника, то есть результат, полученный, возможно, за счет иммунологической устойчивости в эндемическом холерном очаге [Svennerholm, A. -M. и другие. The Lancet I, 305 (1982)].

К существенным преимуществам пероральной вакцины из B-субъединицы холерного энтеротоксина, предназначенной для усиления антитоксического иммунитета, относятся ее полная безопасность (исключается вероятность обратного превращения в токсин, как это имеет место с анатоксинами), и сохранение способности связывать рецепторы энтеротоксина на энтероцитах. Результаты исследований на животных свидетельствуют, однако, что очищенная В-субъединица имеет меньший потенциал по сравнению с нативным голотоксином в усилении выработки нейтрализующих токсин антител [Pierce, N.F., см. ранее, (1982].

Следует понимать, что очищенную B-субъединицу можно использовать, если вообще существует такая необходимость, совместно, например с пероральными инактивированными вибрионными вакцинами в качестве комбинированной пероральной вакцины, предназначенной для усиления выработки как антибактериальных, так и токсин нейтрализующих антител.

4. Термоинактивированный холерный энтеротоксин Термоинактивированный холерный энтеротоксин представляет собой анатоксин большой молекулярной массы (Мол.масса примерно 1000000), полученный в результате термообработки холерного энтеротоксина при температуре 65^oC в течение по меньшей мере пяти минут [Finkelstein, R.A. и другие, J. Immunol., 107, 1043 (1971)] . Этот анатоксин обладает иммуногенной способностью, хотя все еще сохраняет менее 5% токсикогенной активности нативного холерного энтеротоксина. При более продолжительной термообработке (например, в течение 25 минут) получают менее биологически токсичный анатоксин [Germanier, R. и другие, J. lmmun., 13, 1692 (1976)], и последующая его обработка формальдегидом полностью устраняет в нем остаточную биологическую токсичность. Полученный формалинированный термоинактивированный холерный энтеротоксин обладает по меньшей мере таким же потенциалом, как и нативный энтеротоксин в усилении образования сывороточного антитоксинового антитела после иммунизации кроликов. У швейцарцев-добровольцев развивался мощный гуморальный иммунный ответ после парентеральной иммунизации их формалинированным термоинактивированным холерным энтеротоксином, получаемым в дозах по 10, 30 или 100 мкг [Germanier, R., и другие, J. Inf. Dis., 135, 512 (1977)]. Никаких выраженных побочных реакций при этом не отмечалось.

В качестве перорального антигена, термоинактивированный холерный энтеротоксин обладает большей иммуногенностью при приеме его в форме без обработки формальдегидом. У собак переносимость к необработанному формальдегидом термоинактивированному холерному энтеротоксину такая же хорошая, как и в случае пероральной вакцины; перорально вводимые дозы его (с использованием NaHCO₃ в качестве носителя) до 500 мкг не вызывают диареи. Пероральный прием пяти доз его по 500 мкг в течение примерно 42 дней обеспечивает достоверное усиление защитного иммунитета у собак против пероральной пробы с патогенным V. cholerae. В группах из шести и четырех взрослых добровольцев, получавших его в дозах по 50 мкг и 200 мкг, соответственно, с использованием NaHCO₃ в качестве носителя, не отмечено побочных эффектов.

Следует понимать, что термоинактивированный холерный энтеротоксин можно использовать в комбинации, например, с живыми вакцинами, убитыми вибрионами или другими родственными антигенами, которые обладают способностью стимулировать антибактериальный иммунитет, в результате чего усиливается антитоксический иммунитет, индуцируемый термоинактивированным холерным энтеротоксином.

Комбинированные вакцины Главным преимуществом пероральной вакцины из убитых возбудителей холеры является ее безопасность. Пероральная вакцина, состоящая из смеси антигенов, предназначенная для стимуляции как антибактериального, так и антитоксического иммунитета вероятнее всего имела успех по следующим причинам: вакцины из анатоксинов, стимулирующие только антитоксический иммунитет, неэффективны, как свидетельствуют результаты исследований, для защиты от заболевания холерой у человека, хотя их можно использовать для иммунизации модельных животных. Кроме того, пероральные и парентеральные убитые цельноклеточные вакцины, не стимулирующие никакой иммунной реакции на энтеротоксин, обеспечивают существенный защитный иммунитет против холеры у человека, хотя и на короткий промежуток времени. Более того, смеси антигенов (например, неочищенный холерный энтеротоксин, или токсин вместе с липосахаридом), стимулирующие как антитоксический, так и антибактериальный иммунитет, вызывают синергический защитный эффект.

К настоящему времени проведено пока еще два широкомасштабных испытания комбинированных вакцин в условиях практической работы. В первом испытании девять добровольцев, получавших обработанный глютаральдегидом холерный энтеротоксин (в дозе по 2 мг еженедельно в течение четырех недель) вместе с убитыми холерными вибрионами Эль Тор Инаба (10¹⁰ вибрионов два раза в неделю в течение четырех недель) через месяц после иммунизации были инфицированы, наряду с шестью не иммунизированными добровольцами, служившими в качестве контроля, патогенными холерными вибрионами Эль Тор Инаба в дозе 10⁶ вибрионов. Диарея имела место только у двух из девяти вакцинированных, против четырех из шести в контроле (эффективность вакцины составляла 67%), при этом болезнь протекала в более легкой форме у двух заболевших, принимавших вакцину. Более важным в этом эксперименте, возможно, является факт, что V.cholerae можно непосредственно культивировать из выделенных испражнений только у двух из девяти вакцинированных, против шести из шести в контроле. Это свидетельствует о том, что иммунологические механизмы ингибируют пролиферацию вибрионов. В другом исследовании, три дозы комбинированной вакцины, состоящей из B-субъединицы холерного энтеротоксина и убитого цельного вибриона холеры давали взрослым добровольцам, которые затем участвовали в эксперименте с контрольным инфицированием для оценки эффективности вакцины. Комбинированную вакцину принимали на 0, 14, и 28 день. Каждая из трех доз вакцины содержала по 0.5 мг очищенной B-субъединицы холерного энтеротоксина и 210¹¹ убитого V. cholerae (510¹⁰ классического вибриона серотипа Инаба, 510¹⁰ классического вибриона серотипа Огава, и 110¹¹ вибриона Эль Тор Инаба).

Группе из одиннадцати добровольцев, иммунизированных этой комбинированной вакциной вводили через месяц после приема последней дозы вакцины патогенный V. cholerae Эль Тор Инаба, наряду с семью добровольцами, служившими в качестве контроля. Диарея имела место у семи из семи добровольцев в контроле, и только у четырех из одиннадцати вакцинированных (p=0.01). Симптоматика болезни у четырех из получавших вакцину имела менее выраженный характер.

Таким образом, результаты оценочных исследований пероральных комбинированных вакцин на основе указанного анатоксина и убитых цельных клеток демонстрируют соизмеримую степень их эффективности. Эффективность таких вакцин для стимуляции защитного иммунитета, однако, относительно невысока (55-65%), и для индуцирования механизма противоинфекционной защиты необходимо проведение нескольких ревакцинаций.

Вакцины из ослабленного V. cholerae Исследования, проведенные с участием североамериканских добровольцев, свидетельствуют о том, что как так называемые классические холерные инфекции, так и вызванные клиническим штаммом вибриона Эль Тор, стимулируют высокую степень защитного иммунитета в течение по меньшей мере трех лет [Cash, R.A. и другие, см. ранее (1974): Levine, М.М. и другие, см. ранее (1979; Levine, М.М. и другие, " Volunteers studies in development of vaccines against Cholera and enterotoxigenic Escherichia coli: обзорная статья в книге " Acute Enteric Infections in Children: New Prospects for Treatment and Prevention. (T. Holm, J. Holmgren, M.Merson, и R. Mollby, eds.) Elsevier, Amsterdam, pp.443-459 (1981); и Levine, М.М. и другие, J. Infect. Dis.,143, 818 (1981)] . На основе результатов наблюдений за состоянием этих добровольцев, можно предположить, что наиболее многообещающий подход к решению проблемы иммунологической защиты от холеры возможно будет связан с ослабленными невирулентными штаммами V. cholerae, используемыми в качестве пероральных вакцин.

1. Природные штаммы серогруппы 01 V. cholerae.

Невирулентные штаммы серогруппы 01 V. cholerae, выделенные из источников окружающей среды в Индии и Бразилии, были апробированы на добровольцах в качестве потенциальных кандидатов для получения вакцин, и полученные результаты были неутешительны. Эти штаммы не колонизовали кишечник у человека, или колонизовали в минимальной степени; реакции вибриоцидных антител на антиген были слабые, и кроме того они не вызвали защитного иммунитета в экспериментальных исследованиях с контрольной прививкой [Cash, R.A. и другие,. Infect. Immun. 10, 762 (1974); Levine М.М. и другие, J. Infect. Dis. 145, 296 (1982)] . У этих штаммов, как показали результаты измерения методом гибридизации с использованием радиоактивно-меченого ДНК-зонда, утрачен токсиновый ген [Kaper, J.B. и другие. Infect. Immun. 32, 661 (1981)].

2. Мутагенные ослабленные штаммы.

Классический Инаба 569B был подвергнут мутации с использованием нитрозогуанидина (NTG) и был выделен гипотоксикогенный мутант. [Finkelstien, R.A. и другие, J. Infect. Dis. 129, 117 (1974); Holmes, R.K. и другие, J. Clin. Invest. 55, 551 (1975). Этот мутантный штамм, M13, вводили добровольцам. Диарея не возникала, однако штамм имел слабую колониеобразующую способность. Исследования с контрольным инфицированием продемонстрировали, что некоторый защитный эффект обеспечивался за счет иммунизации многократными дозами [Woodward, E. и другие, Develop. Biol. Stand. 33,108,(1976)].

Штамм холерного вибриона Эль Тор Огава 3083 также подвергали мутации [Honda, Т. и др., Proc. Nat. Acad. Sci., вып. 76, 2052 (1979]. В результате интенсивного скрининга и анализа тысяч колоний получили один изолят, который продолжал продуцировать иммуногенную B-субъединицу, однако без обнаруживаемой продукции A-субъединицы или голотоксина. Этот единственный изолят, Texas Star-SR, отвечал указанным критериям. Штамм Texas Star-SR продуцирует нормальную или повышенную продукцию B-субъединицы, но обнаруживает отрицательную реакцию в тест-пробах на активность голотоксина или активность A- субъединицы.

Широкомасштабные испытания вакцинного штамма Texas Star-SR проводили с участием добровольцев (см., например, Levine М.М. и др. Acute Enteric,ранее (1981). Группы из пяти добровольцев получали по две дозы 10⁹ микроорганизмов, каждую с интервалом в неделю, и еще одна из восемнадцати добровольцев получала по две дозы 210¹⁰ микрорганизмов, каждую через неделю. Некоторая диарея была отмечена у 16 из 68 человек, получивших вакцину (24%). И только лишь у одного из вакцинированных общий объем стула превысил 1.0 литр (1464 мл). В типичных случаях, вызванная введением вакцины диарея сопровождалась двумя или тремя скудными жидкими стулами, не превышающими 400 мл в суммарном объеме.

Вакцинные микроорганизмы выделяли из совместных прокультур, примерно из половины реципиентов, получавших вакцину. В случае, когда культивировали содержимое тощей кишки (реципиентов, получавших вакцину в дозе 10⁸ и более микроорганизмов), культуры обнаруживали положительную реакцию у 35 из 46 вакцинированных(76%). Сотни мутантных клонов Texas Star, выделенных из совместных прокультур и культур содержимого тощей кишки было проверено на активность субъединичного домена холерного энтеротоксина серологической тест-пробой с использованием адреноцитов и Y-1; ни в одном случае не отмечено сероположительной реакции.

Существенное нарастание в сыворотке крови нейтрализующих токсин антител обнаружено только лишь у 29% из получавших вакцину; у 93% вакцинированных отмечено значительное нарастание в сыворотке вибриоцидного антитела и титры их почти приближались к титрам, как и в случае после инфицирования патогенным V.cholerae.

В экспериментальных исследованиях с антигенным стимулом, проведенных на добровольцах, мутантный штамм Texas Star-SR, как было установлено, достоверно вызывает иммунную реакцию на антигены вибрионов как Эль-Тор Огава, так и Эль-Тор Инаба. Введение одной или двух доз пероральной вакцины из ослабленного штамма Texas Star-SR обеспечивает хороший защитный иммунитет против холеры, вызываемой вибрионом Эль-Тор.

Ясно, что использование ослабленных штаммов имеет только присущие им преимущества, поскольку такие штаммы обеспечивают имитацию иммунитета после перенесенной инфекции (поствакцинальный иммунитет). Однако, штаммы Texas Star-SR не лишены некоторых недостатков. Во-первых, мутагенез (например, с использованием нитрозогуанидина) вызывает многочисленные мутации, не все из которых обязательно распознаются. Кроме того, точный механизм генетического повреждения, который, как полагают, может быть ответственен за ослабление вирулентности Texas Star-SR, не известен. Кроме того, как и в случае с любым патогеном, претерпевшим мутацию под действием нитрозогуанидина, Texas Star-SR может восстанавливать свою вирулентность. 3. Природные 01-серологически нетипируемые штаммы V. cholerae.

Холерный вибрион серотипа 01 обычно ответственен за возникновение эпидемической холеры. Холерный вибрион, не принадлежащий к классу серотипа 01 ответственен, главным образом, за спорадические случаи гастроэнтерита и внекишечные инфекционные заболевания. Совсем недавно, однако, в печати появилось сообщение о том, что получено несколько штаммов V. cholerae, выделенных из больных во время вспышки холероподобной инфекции[Ramamurthy и другие. The Lancet, vol. 341, 703-704 (1993), содержание которого целиком приводится в данном описании в качестве ссылки]. Серологические характеристики большого количества клинических штаммов, полученных во время этой недавней эпидемии свидетельствовали о том, что эти штаммы не вызывали ни реакции агглютинации с антисывороткой 01, ни с любым из тестированных моноклональных антител, нарастаемых против фактора A, B или C V. cholerae серогруппы 01. В результате, эти вибрионы были идентифицированы как 01-серологически атипичные.

Кроме того, за исключением только лишь одного 01-серологически нетипируемого штамма в вышеуказанной тест-пробе, все остальные штаммы не серогруппы 01, испытанные во время новой вспышки в эпидемическом очаге нельзя было идентифицировать при типировании на панели из 138 антигенов, созданную для V. cholerae не 01- серогруппы в Японском Национальном Институте Здоровья, что свидетельствует о том, что штамм, ассоциируемый с этой новой вспышкой эпидемии, принадлежит к ранее нераспознаваемому типу, или появившегося недавно, не-01 серогруппы, способному вызывать эпидемическую холеру.

При анализе методом ДНК-гибридизации, все штаммы, выделенные во время этой эпидемии, скрещивались как с ctx-, так и zot- генноспецифическими зондами, но не отмечено ни одного случая гибридизации с ДНК-зондами, специфичными термоустойчивому энтеротоксину V. cholerae не серогруппы 01 (NAG-ST). Кроме того, продукция холерного энтеротоксина достоверно выявлялась методом твердофазного иммуноферментного анализа. Сообщалось, что количество энтеротоксина, продуцируемого этими новыми штаммами- изолятами, аналогично продукции энтеротоксина в клинических штаммах V.cholerae серогруппы 01. Большинство из этих штаммов, как сообщалось, были резистентны к, например, стрептомицину и фуразолидону, но чувствительны к другим традиционно используемым антибиотикам, в том числе к тетрациклину. Не сообщалось об устойчивости их к ампициллину, или его производным.

В другой недавней эпидемии, хотя общее количество случаев заболевания холеры не возросло, широкое разнообразие изолятов V. cholerae, полученных от выявленных больных с холероподобной диареей не относились к 01-серогруппе, и так же как и вышеуказанные штаммы нельзя было идентифицировать тест-пробами и с использованием стандартной панели для типирования.

Сообщалось еще об одной случае заболевания, вызванного холерным вибрионом не 01-серогруппы, мощной вспышке эпидемической холеры, которая поражала взрослое население [Albert и другие. The Lancet, vol. 341, 704 (1993), содержание которой целиком включено в данное описание в качестве ссылки]. Из мазков, взятых из прямой кишки, как сообщалось в этой публикации, приблизительно 67 процентов изолятов V. cholerae не относилось к 01-серогруппе после стандартной тест-пробы, и не один из них не типирован как V. cholerae серогруппы 01.

Сообщалось также, что V.cholerae, ответственный за эту вспышку инфекции, напоминает V. cholerae 01 серогруппы, как биохимически, так и по морфологии колоний, но в то же время, как отмечалось, он не вызывает реакции агглютинации на антисыворотку V.cholerae. Штаммы V.cholerae в тест-пробе не обнаруживали реактивности с моноклональными антителами, специфичными к фактору A V.cholerae серогруппы 01.

В этой второй эпидемии, о которой сообщалось недавно, все испытанные 01- нетипированные штаммы реагируют положительно на продукции холерного энтеротоксина в реакции агглютинации с Y-1 адреноцитами, и, как отмечено, нейтрализуются кроличьей поликлональной антисывороткой против холерного энтеротоксина.

Блот-гибридизационный тест с полимеразным усилением с использованием токсин-специфических праймеров холеры не 01-серогруппы, как также описано, вызывал амплификацию последовательности холерного энтеротоксина.

Отобранные изоляты были также проанализированы методом перевязки кроличьей подвздошной кишки и, как описано, они вызывали водянистый понос при перепетливании, аналогично, как и в случае, ассоциированном с V. cholerae 01.

Штамм V. cholerae, выделенный во время этой второй вспышки, как сообщалось, был чувствителен к определенным антибиотикам, включая тетрациклин, но был резистентен к другим вибриостатикам. Такой результат находится в противоречии с предположением о том, что преобладающие в настоящее время штаммы в данной области, большинство из которых являются изолятами, резистенты к тетрациклину.

Вследствие этих вспышек, вызвавших вспышки инфекции V. cholerae не 01-серогруппы в эпидемических очагах, имеется настоятельная потребность в получении вакцин, специфичных для этих микроорганизмов. Кроме того, было бы также желательно получить ассоциированные вакцины, которые эффективны как для 01, так и не -01 серогрупп, особенно для использования в таких регионах, где можно встретить вирулентные штаммы обеих серогрупп V. cholerae.

Краткое изложение сущности изобретения На основе предлагаемых новых методов заявители получили и выделили мутанты вирулентного штамма Vibrio cholerae не -01 серогрупп, которые пригодны для использования в качестве вакцины для профилактики от заболевания холерой после введения вирулентного штамма V. cholerae.

Согласно изобретению заявляется авирулентный штамм Vibrio cholerae CVD112 не-01 серогруппы, используемый для вакцинации против холеры. Указанный штамм является штаммом из серогруппы 0139 и имеет генотип, включающий ctxA^-, zot ace^-, mer, ctxB. Указанный штамм характеризуется тем, что ДНК, кодирующую устойчивость к ртути, и ДНК, кодирующую B-субъединицу холерного энтеротоксина вставляют в сайт гемолизинового гена в хромосоме.

Указанный штамм депонирован как штамм ATCC 55752 или его производное. Согласно изобретению заявляется также авирулентный штамм Vibrio cholerae CVD112 RM не-01 серогруппы, используемый для вакцинации против холеры. Указанный штамм является штаммом из серогруппы 0139 и имеет генотип, включающий ctxA^-, zot^- асе^-, recA-, mer, ctxB. Указанный штамм характеризуется тем, что ДНК, кодирующую устойчивость к ртути и ДНК, кодирующую B-субъединицу холерного энтеротоксина, вставляют в сайт гемолизинового гена в хромосоме.

В качестве исходного штамма для получения одного мутанта предлагаемого изобретения используют штамм V. cholerae 1837, который относится к 01-серологически атипичному штамму 0139. Заявляемые мутанты содержат делеции в области сердцевины ("ядра", кор-области) энтеротоксина V.cholerae. Эти делеции были получены с использованием эндонуклеаз рестрикции из заново идентифицированной, охарактеризованной и клонированной кор-области в ctx-локусе исходного штамма, хотя можно также использовать другие подходящие методы делеции, известные в данной области.

Для индуцирования иммуногенности, последовательности, кодирующие B субъединицу холерного энтеротоксина вновь встраивали в вакцинный штамм. Кроме того, в мутантные штаммы были встроены последовательности, кодирующие устойчивость к тяжелым металлам, например ртути, и которые обеспечивают выявление вакцинного штамма без использования потенциально терапевтически антибиотикоустойчивых маркеров.

01 серологически нетипированные вакцинные штаммы V. cholerae настоящего изобретения, таким образом, были целенаправленно трансформированы с помощью методов рекомбинантных ДНК для устранения их вирулентности, не оказывая воздействия на другие компоненты, необходимые для выработки иммунитета.

Один авирулентный штамм V.cholerae не 01-серогруппы предлагаемого изобретения является штаммом V. cholerae CVD112 (сер^-, zot^-, асе^-, orfU^-, ctxA^-, ctxB, mer, HylA^-, attRS1^-, RS1^-). Другой авирулентный штамм V. cholerae не-01 серогруппы является штаммом CVD112RM (сер^-, zot^-, асе^-, orfU^-, ctxA^-, ctxB, mer, HylA^-, recA^-, attRS1^-, RS1^-).

Проведены исследования по характеристике ctx-локус вирулентного штамма V. cholerae не 01-серогруппы, в результате которых получены новые данные о том, что выделенный штамм содержит две области сердцевины (кор-области) и четыре повторяющихся последовательности (RSl-последовательности). Конструируют плазмиду, в которой есть делеция во всей, или практически во всей кор-области холерного энтеротоксина, но при этом остаются длинные фланкирующие (ограничивающие) повторяющиеся ДНК-последовательности хромосомы V. cholerae в ctx-локусе (то есть сегменте ctx-гена). В результате конъюгативного переноса гена указанной плазмиды в вирулентный V. cholerae не 01-серогруппы с последующей гомологичной рекомбинацией и второго рекомбинационного события получили V. cholerae не 01-серогруппы ДНК-последовательность только лишь с одной кор-областью и один SR1-элемент. Оставшуюся последовательность в кор-области и RSl-элемент затем удаляли с использованием вновь клонированной, а затем делированной 0139 хромосомальной ДНК.

Последовательности, кодирующие B субъединицу холерного энтеротоксина и последовательности, кодирующие устойчивость к тяжелым металлам, были затем вновь встроены в хромосому мутанта V. cholerae методом гомологичной рекомбинации.

01-Нетипированные, нетоксикогенные делеционные мутанты предлагаемого изобретения способны к колонизации тонкой кишки и стимулированию локального защитного иммунитета против внедрения бактериальной клетки. После транзиторного эпизода колонизации, вакцина вызывает защитный иммунитет против последующего заражения вирулентными токсикогенными штаммами V. cholerae не-01 серогруппы.

Изобретение также предлагает способы получения авирулентных штаммов V. cholerae не-01 серогруппы, и вакцину, полученную из этих штаммов.

В одном аспекте, данное изобретение предлагает способ получения первого авирулентного штамма V. cholerae не 01- серогруппы, содержащего делецию области сердцевины (кор-область - основная часть нуклеосомы) холерного энтеротоксина и RS1- последовательностей, но экспрессирующий B субъединицу холерного энтеротоксина и последовательности, кодирующие продукт, вызывающий устойчивость к тяжелым металлам, который включает стадии: (а) конструирова