Молекула днк, кодирующая липазу человека, стимулируемую солями желчи

Молекула днк, кодирующая липазу человека, стимулируемую солями желчи

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии. Определена нуклеотидная последовательность молекулы ДНК, полученной из молочной железы человека, кодирующая липазу человека, стимулируемую солями желчи. Определены также фрагменты этой молекулы ДНК, также кодирующие липазу человека. Изобретение обеспечивает получение продуктов, обладающих свойствами липазы, которые используются для дополнения или замены молока, а также для лечения недостаточности панкреатической липазы. 2 с. и 1 з.п. ф-лы, 7 ил., 2 табл.

Настоящее изобретение относится к новым ДНК последовательностям, к новым белкам, кодируемым такими ДНК последовательностями, и к использованию, как будет раскрыто далее, таких белков. Настоящее изобретение охватывает также такие векторы, как плазмидные конструкции, содержащие такие ДНК последовательности, способные к экспрессии целевого фермента. Настоящее изобретение включает также организмы хозяев, трансфецированные такими конструкциями, например, дрожжевые бактерии, клетки млекопитающих и трансгенные животные. Настоящее изобретение включает также способы получения новых продуктов настоящего изобретения. Новые белки настоящего изобретения относятся к ферменту, известному как липаза, стимулированная солями желчи человека.

Предпосылки изобретения Молочная железа человека синтезирует и выделяет с молоком стимулируемую солью желчи липазу /BSSL/ /1/, которая, после специфической активации первичными солями желчи /2, 57, 58/ обеспечивает эндогенную способность у вскармливаемых грудью младенцев усвоения жира в кишечнике /3 - 5/. Этот фермент, который составляет приблизительно 1% от полного количества молочного белка /6/, является неспецифической липазой; in vitro он гидролизует не только три-, ди- и моно-ацилглицерины, но также сложные эфиры холестерина и ретинила, а также липофосфатдиглицерины /7 - 10/. Более того, ее активность не ограничивается эмульгируемыми субстратами, но также мицеллярные и растворимые субстраты гидролизуются с такими же скоростями /11/.

BSSL не разлагаются при прохождении с молоком через желудок, а в двенадцатиперстной кишке она защищена солями желчи от инактивации такими протеазами поджелудочной железы, как трипсин и хинотрипсин /2, 11/. Однако, она инактивируется при пастеризации молока, например, при нагревании до 62,5^oC в течение 30 минут /12/. Модельные эксперименты in vitro дают возможность предположить, что конечные продукты переваривания триацилглицерина различны в присутствии BSSL /5, 7/. Из-за низких внутрипросветных концентраций соли желчи во время младенческого периода /13, 14/ это может помочь усвоению продукта /5, 15/.

Гидролаза сложных эфиров карбоновых кислот /CEH/ секрета поджелудочной железы человека /16/ функционирует, по-видимому, идентично или по крайней мере весьма похоже на функцию BSSL /8/. Они также имеют общие эпитопы /8, 17/, имеют идентичные N-терминальные аминокислотные последовательности /17/ и ингибируются ингибиторами серинэстераз, например, эсерином и диизопропилфторфосфатом /6, 8, 16/. Была выдвинута гипотеза, что эти два фермента являются продуктами одного и того же гена /18, 19/. Наблюдающуюся разность в размерах молекул /8, 19/ можно объяснить различным ходом гликозилирования, как было предложено недавно /17/.

Пищевые липиды являются важным источником энергии. Богатые энергией триацилглицерины составляют более чем 95 % этих липидов. Некоторые из этих липидов, например, некоторые жирные кислоты и растворимые в жирах витамины составляют существенную часть питания. Перед усвоением в желудочно-кишечном тракте триацилглицеринов, а также меньших компонентов, то есть этерифицированных растворимых в жирах витаминов и холестерина, а также диацилфосфатдиглицеринов, требуется гидролиз сложноэфирных связей до получения менее гидрофобных абсорбируемых продуктов. Эти реакции катализируются специфической группой ферментов, называемых липазами.

У взрослых людей наиболее важные липазы включают желудочную липазу, липазу, зависимую от солипаз поджелудочной железы /три- и диацилглицерин гидролиз/, панкреатиновую фосфолипазу A2 /диацилфосфатдиглицерины/ и карбоксиэфиргидролизу /холестерин- и жирорастворимых витаминов сложные эфиры/. У новорожденных, вскармливаемых грудью, стимулируемая желчными солями липаза играет существенную роль в гидролизе некоторых вышеуказанных липидов. Наряду с солями желчи, продукты расщепления липидов образуют смешанные мицеллы, из которых и происходит усвоение /3 - 5/.

Обычными случаями недостаточного поглощения липидов и, следовательно, недостаточного питания являются пониженные внутрипросветные уровни липаз, зависящие от панкреатических солипаз и/или солей желчи. Типичными примерами такого дефицита липаз являются пациенты, страдающие цистофиброзом, общегенетическими расстройствами, приводящими к сокращению жизни в 80% случаев, и хроническими панкреатитами, часто связанными с хроническим алкоголизмом.

Функции поджелудочной железы и печени не развиты полностью при рождении, и особенно у преждевременно родившихся младенцев. Недостаточное усвоение жиров по физиологическим причинам обычно является результатом низкого содержания липазы, зависимой от панкреатических солипаз и концентраций солей желчи /3, 4, 13 - 15/. Однако, благодаря BSSL, такое недостаточное усвоение гораздо менее часто встречается у младенцев, вскармливаемых грудью, нежели у младенцев, которым дают пастеризованное женское молоко состава для младенцев /3 - 5, 12, 59, 60, 61/. Вот почему всегда требовалось, чтобы новорожденных, которых нет возможности кормить молоком собственной матери, кормили непастеризованным молоком других кормящих матерей /12/.

В настоящее время лечение пациентов, страдающих недостатком панкреатической липазы, состоит в оральном приеме очень больших доз неочищенного препарата свиных панкреатических ферментов. Панкреатическая липаза, зависящая от солипаз, инактивируется низкими значениями pH. Именно такие условия превалируют в желудке, что приводит к тому, что проглоченная липаза практически полностью инактивируется при прохождении через желудок к кишечнику. Поэтому это не удавалось преодолеть полностью за счет приема больших доз фермента. Большие пронимаемые дозы неадекватны для большинства пациентов, а препараты неочищены и неприятны. Были приготовлены некоторые таблетки, которые проходят через кислотные области желудка и высвобождают фермент только в относительно щелочном окружении тощей кишки. Однако, многие пациенты, которые страдают расстройством поджелудочной железы, имеют ненормально кислотную среду в тощей кишке, и такие таблетки поэтому не смогут высвободить фермент, и следовательно, окажутся неэффективными. Более того, так как имеющиеся на рынке препараты имеют животное происхождение, возникает риск иммунореакции, которая может оказать вредное воздействие на пациента или привести к снижению эффективности лечения. Другим недостатком этих пациентов является то, что в них содержатся и другие неуказанные липолитически активные агенты, помимо липазы, зависящей от солипаз. В действительности, большинство из них содержит весьма низкие уровни CEH/BSSL - активностей. Это может быть одной из причин, по которым многие пациенты, страдающие цистофиброзом, невзирая на дополнительное лечение, страдают от недостатка растворимых в жирах витаминов и важных аминокислот.

Таким образом, существует большая необходимость в продуктах со свойствами и структурой, полученными из липаз человека, и с широкой специфичностью субстрата, причем эти продукты можно орально вводить пациентам, страдающим недостатком одного или нескольких панкреатических липолитических ферментов. Продукты настоящего изобретения удовлетворяют эту необходимость сами по себе или в сочетании с другими липазами или в сочетании с препаратами содержащими другие липазы. Более того, для некоторых младенцев существует существенная необходимость в улучшении усвоения жиров из обычных питательных смесей для младенцев или пастеризованного материнского молока из так называемых молочных банков.

BSSL обладает несколькими уникальными свойствами, которые делают его идеально подходящим для замещающей и дополнительной терапии: он был создан по природе для орального приема. Таким образом, он устойчив при прохождении желудка и активируется в среде тонкого кишечника. Его специфический механизм активации должен предотвратить вредный липолиз пищи или липидов тканей при хранении и прохождении к месту его действия. За счет широкой специфичности субстрата он потенциально способен сам по себе обеспечить полное расщепление большей части липидов пищи, включая сложные эфиры растворимых в жирах витаминов.

BSSL может лучше чем липаза, зависящая от панкреатической солипазы, гидролизовать сложноэфирные связи в длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислотах.

В присутствии липазы и при отсутствии или низком содержании липазы, зависящей от солипазы, BSSL может обеспечить полное расщепление триацилглицерина in vitro, даже если уровень солей желчи низок, как например, у новорожденных. При наличии BSSL конечные продукты расщепления триацилглицерина становятся свободными жирными кислотами и свободными глицеринами вместо свободных жирных кислот и моноацилглицеринов, которые образуются за счет двух других липаз /5/. Это может облегчать усвоение продуктов, особенно если низко содержание внутрипросветной соли желчи /13, 15/. С исторической точки зрения питательный состав для неворожденных разрабатывался и усовершенствовался исходя из концепции, что его составы должны быть как можно ближе по составу к материнскому молоку. Желательно дополнить эти составы.

Использование для дополнения, замены или лечения липаз, стимулируемых солями желчи /BSSL/ или белков с основными функциями BSSL требует, однако, крупномасштабных количеств продукта. В промышленных масштабах не представляется, однако, возможным полагаться на природные источники /такие как молоко/ в качестве исходных материалов. Кроме указанных ранее проблем инактивации BSSL во время пастеризации, существует дополнительный риск загрязнения материала из природных источников такими инфекционными агентами, как вирусы HIV и CMV. Следовательно, для крупномасштабного производства необходимы продукты, обладающие свойствами BSSL. Настоящее изобретение обеспечивает получение таких продуктов и способы их получения.

Список известных ранее ссылок приведен после описания.

Содержание изобретения Настоящее изобретение основано на клонировании кДНК кодирующей BSSL полученный из молочной железы женщины. Выделена также из поджелудочной железы человека частичная кДНК, кодирующая CEH. Выделенные из кДНК человека аминокислотные последовательности и их сравнение с CEH из других источников подтверждают предположение об идентичности BSSL и CEH.

Как будет подробно раскрыто далее, мы с удивлением обнаружили, что строение белка, выделенного из кДНК последовательности, совершенно отлично от строения других липаз. Было показано, неожиданно, что его строение ближе к типичным эстеразам, таким как холинэстераза.

С привлечением фиг. 2 и фиг. 7, продукты настоящего изобретения можно охарактеризовать как: a/ белок, определяемый аминокислотной последовательностью 1-722 на фиг. 7, b/ белок, определяемый аминокислотной последовательностью 1-535 на фиг. 7, c/ белок, определяемый аминокислотной последовательностью 1-278 на фиг. 7, d/ белок, определяемый аминокислотной последовательностью 1-341 на фиг. 7, e/ белок, определяемый аминокислотной последовательностью 1-409 на фиг. 7, f/ белок, определяемый аминокислотной последовательностью 1-474 на фиг. 7, g/ комбинацию белков, определенную пунктами b /-f/, например, как определено аминокислотными последовательностями в положениях 1-278, 279-341, 279-409, 279-474, 342-409, 342-474 и 536-722, h/ комбинацию белков, определенных в пунктах b /-g/ в сочетании с одним или более из повторов в соответствии с фиг. 5, i/ белок, определенный в пунктах a /-h/, содержащий, кроме того, N-терминальную аминокислоту, а именно метионин, и функционально эквивалентные варианты и мутанты белков определенных ранее в пунктах a /-i/; Следует отметить, что белки по пунктам a, b, c, d, e, f, h /и i/ не будут идентичны во всех отношениях природному BSSL, но они будут демонстрировать одну или более из критических функций, встречающихся в природе BSSL.

Критические функции приведены далее.

j/ ДНК последовательность, кодирующая белки, определенные в a, b, c, d, e, f, h и i указанных ранее, k/ ДНК последовательность в соответствии с фиг. 2, определяемая нуклеотидными номерами на фиг. 2: a/ ДНК последовательность 151 - 2316 по фиг. 2, кодирующая белок, определяемый аминокислотной последовательностью 1 - 722 на фиг. 7, b/ ДНК последовательность, по фиг. 2, кодирующая белок, определяемый аминокислотной последовательностью 1 - 535 на фиг. 7, c/ ДНК последовательность 151 - 985, по фиг. 2, кодирующая белок, определяемый аминокислотной последовательностью 1 - 278 на фиг. 7, d/ ДНК последовательность 151 - 1172 по фиг. 2, кодирующая белок, определяемый аминокислотной последовательностью 1 - 341 на фиг. 7, e/ ДНК последовательность 151 - 1376 по фиг. 2, кодирующая белок, определяемый аминокислотной последовательностью 1 - 409 на фиг. 7, f/ ДНК последовательность 151 - 1574 по фиг. 2, кодирующая белок, определяемый аминокислотной последовательностью 1 - 474 на фиг. 7, g/ сочетания белков, определенных по пунктам b /-f/, например, определенных аминокислотными последовательностями в положениях 1-278, 279-341, 279-409, 279-474, 342-409, 342-474 и 536-722, h/ сочетания белков, определенных по пунктам b /-g/, в сочетании с одним или более из повторов в соответствии с фиг. 5, i/ белок, определенный по пунктам a /-h/, содержащий дополнительно N-терминальную аминокислоту, а именно метионин, и функционально эквивалентные варианты и мутанты белков, определенных в пунктах a /-i/ ранее, Следует отметить, что белки по пунктам a, b, c, d, e, f, h и i не будут полностью идентичны природному BSSL, но в них будет содержаться одна или более из критических функций природного BSSL. Критические функции приводятся далее.

j/ ДНК последовательность, кодирующая белки по пунктам a, b, c, d, e, f, h и i; k/ ДНК последовательность по фиг. 2, определенная следующими нуклеотидными последовательностями под номерами на фиг. 2: a/ ДНК последовательность 151-2316 по фиг. 2, кодирующая белок, определяемый аминокислотной последовательностью 1-722 на фиг. 7, b/ ДНК последовательность 151-1755 по фиг. 2, кодирующая белок, определяемый аминокислотной последовательностью 1-535 на фиг. 7, c/ ДНК последовательность 151-985 по фиг. 2, кодирующая белок, определяемый аминокислотной последовательностью 1-278 на фиг. 7, d/ ДНК последовательность 151-1172 по фиг. 2, кодирующая белок, определяемый аминокислотной последовательностью 1-341 на фиг. 7, e/ ДНК последовательность 151-1376 по фиг. 2, кодирующая белок, определяемый аминокислотной последовательностью 1-409 на фиг. 7, f/ ДНК последовательность 151-1574 по фиг. 2, кодирующая белок, определяемый аминокислотной последовательностью 1-474 на фиг. 7, g/ ДНК последовательность 986-1172 по фиг. 2, кодирующая белок, определяемый аминокислотными последовательностями 279-341 на фиг. 7, h/ ДНК последовательность 986-1376 по фиг. 2, кодирующая белок, определяемый аминокислотными последовательностями 279-409 на фиг. 7, i/ ДНК последовательность 986-1574 по фиг. 2, кодирующая белок, определяемый аминокислотными последовательностями 279-474 на фиг. 7, j/ ДНК последовательность 1173-1376 по фиг. 2, кодирующая белок, определяемый аминокислотными последовательностями 342-409 на фиг. 7, k/ ДНК последовательность 1173-1574 по фиг. 2, кодирующая белок, определяемый аминокислотными последовательностями 342-474 на фиг. 7.

Существенные черты белков настоящего изобретения: a/ пригодны для орального введения, b/ активируются специфическими солями желчи, c/ действуют как неспецифическая липаза в содержании тонких кишок, то есть способны гидролизовать липиды относительно независимо от их химического строения и физического состояния /эмульсии, мицелий, раствор/, d/ способны гидролизовать триацилглицерины с жирными кислотами различных длин цепей и с различной степенью ненасыщенности, e/ способны гидролизовать также диацилглицерины, моноацилглицерины, сложные эфиры холестерина, лизофосфатдиацилглицерин, ретинил и другие сложные эфиры витаминов, растворимые в жирах.

f/ способны гидролизовать не только sn-1/3/ сложноэфирные связи в триацилглицерине, но также sn-2 сложноэфирные связи.

g/ способны взаимодействовать не только с первичными, но и с вторичными солями желчи, h/ их оптимальная активность зависит от солей желчи, i/ они настолько стабильны, что желудочный сок существенно не влияет на их каталитическую эффективность, j/ их стабильность не нарушается под действием протеаз поджелудочной железы, например трипсина, при условии присутствия солей желчи, k/ способны связываться с гепарином и производными гепарина, например сульфатом гепарина, l/ способны связываться с межфазой липец-вода, m/ стабильны при лиофилизации, n/ стабильны при смешивании с такими составляющими пищи, как материнское молоко или молочные структуры.

Критическими функциями для дополнения, замены или терапии являются функции по пунктам a, c, d, e, f, i, j и l. Для других целей могут понадобиться не все критические функции.

Для экспрессии указанных ранее белков соответственные указанные ранее ДНК последовательности нужно встроить в подходящий вектор, который затем вводят в подходящий организм-хозяин. Указанный вектор должен также содержать соответствующий сигнал и другие последовательности, обеспечивающие экспрессию целевого белка этим организмом.

Организмы, подходящие для экспрессии: С помощью методик рекомбинантных ДНК возможно клонировать и осуществлять экспрессию целевого белка в различные прокариотные и эукариотные организмы-хозяева. Возможными для экспрессии организмами являются бактерии, простые эукариоты /дрожжи/, клеточные культуры животных, клеточные культуры насекомых, клеточные культуры растений, растения и трансгенетические животные. Каждая отдельная система имеет свои собственные конкретные преимущества и недостатки. Короче говоря, каждый подлежащий экспрессии ген представляет отдельную проблему, и не существует стандартных решений. Обычно используют такие системы бактерий, как: b. coli, Bacillus Subtilis, Streptomyces. Обычно используют такие дрожжи как Saccharomyces и Pichia Pastoris. Обычно используют такие клетки животных, как CHO и COS. В качестве клеточных культур насекомых используют клетки, полученные от мухи дрозофилы. Из растений обычно используют растение табака. Возможными трансгенными животными являются козы и коровы.

Возможные бактериальные векторы представлены pVC и белком A.

Возможный дрожжевой вектор представлен pMA 91. Возможные векторы насекомых получены из Baculo - вирусов. Возможные векторы клеток животных получены из SV/40. Возможные векторы растений получены из Ti - плазмид. В каждой системе можно использовать как природные, так и синтетические промоторы и терминаторы.

Следует учитывать, что в зависимости от выбора системы экспрессии, экспрессируемый протеин может содержать дополнительную N-терминальную аминокислоту /метионин/, содержать несколько дополнительных аминокислот или может быть сплавлен с гетерологичным белком /например, белком A/ или отличаться от нативного белка при гликозилировании. Более того, векторы могут также содержать сигнальные последовательности, определяющие экспорт белка в периплазму или в культуральную среду.

Таким образом, следующими аспектами изобретения будут: a/ вектор, содержащий ДНК последовательность, кодирующую белок, как указано ранее, b/ организм-хозяин, содержащий ДНК последовательность, как указано ранее, c/ способ получения белка, как указано ранее, за счет выращивания организма-хозяина, содержащего вектор, как указано ранее в пункте a/, и выделения белка.

Способы очистки зависят от используемых систем экспрессии /например, белок A/IgG/ и/или используют способы очистки природных ферментов, как указано в ссылке 6.

Дополнительные аспекты настоящего изобретения: - фармацевтическая композиция, содержащая белок, как указано ранее, - использование белка, определенного ранее для изготовления медикаментов для лечения патологических состояний, связанных с экзокринной недостаточностью панкреатина, - использование определенного ранее белка для изготовления медикаментов для лечения цистофиброзов, - использование определенного ранее белка в качестве добавки к питательным смесям для младенцев, - использование определенного ранее белка для изготовления медикаментов для лечения хроматических панкреатитов, - использование определенного ранее белка для изготовления медикаментов для лечения недостаточного усвоения жиров любой экологии, - использование определенного ранее белка для изготовления медикаментов для лечения недостаточного усвоения растворимых в жирах витаминов, - использование определенного ранее белка для изготовления медикаментов для лечения недостаточного усвоения жиров по физиологическим причинам, например, у новорожденных.

ДНК последовательность на фиг. 2, начиная с положения 151 и до /и включая/ положения 2316, представляет собой последовательность, кодирующую полный белок. Последовательность с положения 2317 до /и включая/ показания 2415 не транслируется в белок, но она включена в эксон d, идентифицированный далее в таблице 2.

В одном из вариантов изобретения белок, определенный ранее в пунктах a/ - i /, получают в выделенном виде и/или в практически чистом виде.

ДНК последовательности, определенные в пунктах a/ -k/ ранее, представляют собой один из вариантов изобретения и получаются в выделенном виде и/или практически чистом виде.

Экспериментальная часть Сокращения в тексте: aa - аминокислота, bp - пары оснований, BSSL - липаза, стимулированная солями желчи, c-AMP циклический аденозинмонофосфат, CEH-гидролиза сложного эфира карбоновой кислоты, Да-дальтон, c ⁷GTP - 7-деаза-2-деоксигуанозин-5'-трифосфат, EDTA - этилендиаминтетраацетат, kb - килопары оснований, MOPS - 3 - N-морфолинопропансульфокислота, nt - нуклеотид, PAGE - электрофорез на полиакриламидном геле, SDS - натрийдодецилсульфат, SSC - цитрат NaCl, xGal - 5-бром-4-хлор-3-индолил- -D-галактопиранозид.

Ферменты: Липаза, стимулированная солями желчи - EC 3.1.1.3.

Гидролаза сложного эфира карбоновой кислоты EC 3.1.1.3.

Материалы и способы A. Ферменты и получение антител BSSL очищают из материнского молока как описано ранее /6/. Если его используют для получения антител, фермент очищают дополнительно с помощью SDS - PAGE. Полосу белка, соответствующую липазе, после подкрашивания Coomassil Brilliant blue электроэлюируют из геля. 25 мг очищенного фермента вместе с эквивалентным объемом полного адъюванта Freund используют для первой подкожной инъекции, и такое же количество фермента с неполным адъювантом для последующих ежемесячных бустерных инъекций. У кроликов брали кровь спустя две недели после каждого бустера, приготавливали сыворотку и хранили ее при -20^oC.

B. Получение триптик-фрагментов и анализ аминокислотной последовательности 3 мг очищенного BSSL растворяют в 1 мл 0,1 M Трис-Cl буфере, pH 8,5, содержащем 6М гуанидингидрохлорида и 2 мМ EDTA. Добавляют дитиоэритритом до 5 мМ. После инкубирования при 37^oC в течение 2 часов добавляют 300 мкл 50 мМ иодацетата. После 90 минут инкубирования при 25^oC в темноте восстановленный и карбоксиметиллированный фермент обессоливают на колонке с Sephades G - 25, уравновешенной 0,5 М бикарбонатом аммония. 30 мкг тозил-L-фенилаланинхлорметаном обработанного бычьего трипсина /Worthington diagnostis Syctem Inc., Freehold, NJ, USA/ добавляют перед лиофилизацией. Лиофилизированный белок растворяют в 4 мл 0,1 М бикарбоната аммония, и добавляют дополнительно 90 мкг трипсина. После 5 часов инкубирования при 37^oC белок снова лиофилизируют. Трипсиновый перевар растворяют в 0,1% трифторуксусной кислоте /2 мг/мл/. Триста мкг обработанного трипсином BSSL хроматографируют на высокоэффективном жидкостном хроматографе, используя колонку с C - 18 обращенной фазой и элюируя с градиентом 0 - 50% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте. Сбор белка непрерывно контролируют, записывая поглощение на 214 нм. Белки, подлежащие секвенированию, очищают далее повторным хроматографированием на той же колонке с установленными градиентами.

Образцы белковых фрагментов, подлежащих секвенированию, сушат в атмосфере азота для удаления ацетонитрила и вводят в секвенсор. Для анализа N-терминальной последовательности нативный BSSL растворяют в 0,1% уксусной кислоте. Анализ последовательности осуществляют на жидкофазном импульсном секвенаторе Arrlied Biosystem Inc., 477A и на встроенном PTH 120A анализаторе с регулярной циклической программой и препаратами от изготовителя. Начальный и повторные выходы, рассчитанные из секвенированного стандартного протеина, -лактоглобулина, составляют 47 и 97% соответственно.

C. Выделение РНК Образцы жировой ткани поджелудочной железы и молочной железы человека были получены во время операций и немедленно помещены в гуанидинтиоцианат /1 - 5 г в 50 мл/. Полную РНК экстрагировали по способу Shirgwin /20/. Поли/A/-РНК получают хроматографически на колонке с олигодеокситимидилат/олиго/ДТ//-целлюлозой /21/.

D. Конструирование и скринирование кДНК библиотек Приблизительно 15 мкг полиаденилированной РНК из поджелудочной железы человека денатурируют гидроксидом метилртути /22/ и примируют олиго /дТ/_12-18 праймерами /Рharmacia, Uppsala, Sweden/, и подвергают обратной транскрипции по способу /23/. Синтез второй нити ведут по способу Gubler and Hoffman /24/, но только опускают ДНК лигазу и -NAD, и температуру реакции устанавливают при 15^oC. Избыток РНК переваривают РНКазой A /50 мкг/мл/, а двунитевую кДНК обрабатывают EcoRI метилазой /25/. Концы ослепляют ферментом Кленова. После лигирования с EcoRI линкерами и расщепления EcoRI кДНК фракционируют на колонке с Sеpharose 4B-Cl. Фракции вредного объема осаждают этанолом, и кДНК лигируют в EcoRI сайт dt II вектора, обработанного фосфатазой /26/. Упаковка in vitro дает более 7 10⁵ рекомбинант.

Библиотека кДНК молочной железы женщины, полученная от женщины на восьмом месяце беременности, была получена /Clontech Laboratories, Ins., Palo Alto, CA; USA/.

Фаги из кДНК библиотек помещали на 120-мм пластины в количестве 5 10⁴ед. Антисыворотку разбавляли до отношения 1:3200, и скринирование вели по способу Янга и Дэвиса /27/. Щелочно-фосфатазный конъюгат козел-анти-кролик антител использовали в качестве вторых антител /Bio-Rad, Richmоnd, CA USA/. C выделенными клонами, соответствующими 5'-концу иРНК, гибридизацию нуклеиновой кислоты проводили в стандартных условиях /23/, используя субклонированный фрагмент из одного из иммунопозитивных клонов в качестве зонда.

E. РНК анализ Электрофорез проводят на 1% агарозном геле в 40 мМ MOPS буфера, pH 7,0 после денатурации глиоксалем и диметилсульфоксидом /28/. Затем гликосилированную полную РНК переносят на нитроцеллюлозные фильтры /29/. Блоты зондируют субклонами BSSL и CEH рекомбинант, которые были мечены способом олигометок /30/. Прегибридизацию и гибридизацию проводят 50% формамидом при 46^oC /23/. Постгибридизационные промывки осуществляли при высоких эффективностях /0,1 % SDS и 0,1 х SSC при 60^oC/. /1 х SSC, 0,15 М NaCl, 0,0015M Na₃ цитрат, pH 7,6/.

кДНК вставки из BSSL и CEH рекомбинант были либо непосредственно клонированы в М3мр18 и мр19 после обработки ультразвуком и фракционирования по размерам или некоторые из них были далее субклонированы в pTLI9R после переваривания Ps т1, Bs тXI, NaгI и AhaII. Нуклеотидную последовательность определяли с помощью дидеоксицепитерминантного способа /31/. Богатые GC повторы /см. далее/ также были секвенированы TagI полимеразой и dc ⁷GTP. Были секвенированы обе нити. Информацию по секвенированию получили из авторадиограмм с применением программ MS-Edseg описанных Sjoberg et.al. /55/.

G. Предсказания и гомологи аминокислотной последовательности.

Для предсказания соответствующей аминокислотной последовательности кДНК вставок сравнивали с помощью кодона различные считывающие рамки по Стенду, и получили одну открытую считывающую рамку /32/. По программам UW GCG /33/ провели поиск гомологов.

Результаты и обсуждения A. Последовательность триптик-фрагментов и N-конца BSSL Трипсиновый перевар очищенных BSSL приводит к получению приблизительно 50 фрагментов, о чем можно судить по количеству пиков, полученных с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии /фиг. 1/. Пики собирают, и показательные пики, которые могут быть выделены с высокой степенью чистоты и в разумных количествах, секвенируют. Полученные последовательности представлены в таблице 1. Кроме того, 30 наиболее N-терминальных остатков также секвенируют /фиг. 2/, и они подтверждают описанную ранее последовательность Abonakil et.al /30 остатков/ /17/.

22 остаток длинной N-терминальной последовательности по данным Wang and Johnson /34/ является в нашем сообщении глицином, и у Wang and Johnson он описан как лизин.

B. Нуклеотидная последовательность BSSL Для конструирования Xgt II кДНК библиотеки были использованы полиаденилированные РНК из поджелудочной железы человека. Вначале выделили 4 иммунопозитивных клона, а затем библиотеку кДНК экспрессии поджелудочной железы скринировали с антисывороткой против BSSL. Анализ нуклеотидных последовательностей четырех клонов показал, что они находятся в прекрасном соответствии и соответствуют 3' концу иРНК. Все они начинаются с поли A хвоста и отличаются только по длине, причем наиболее длинная вставка, обозначенная ACEH, содержит 996 пар оснований.

кДНК библиотек из молочной железы женщины скринируют с антисывороткой и панкреатическим клоном ACEH в качестве зонда. В обоих скринированиях выделяют положительные клоны которые все начинаются с 3' конца. Самый длинный клон молочной железы, обозначенный ABSSL, достигает 2100 пар оснований в обратном направлении. Он содержит четыре из секвенированных триптик-фрагметов /фиг. 2/, но не включает N-терминальную аминокислотную последовательность. Для распространения последовательности за трансляционный старт библиотеку кДНК молочной железы повторно скринировали с зондом длиной 118 пар оснований, полученным из большей части 5' проксимальной ABSSL. Выделяют один клон, который продолжает дальнейшие 328 нуклеотидов в обратном направлении. Он совмещает N-терминальную аминокислотную последовательность и содержит остальной триптик-фрагмент. Как показано на фиг. 2, кДНК имеет длину 2428 нуклеотидов и содержит 81 пару оснований в обратном направлении от первого ATG кодона. Сигнал полиаденилирования, AATAAA расположен на 13 нуклеотидов в обратном направлении от поли A хвоста, а терминальный кодон TAG, как было обнаружено, содержится у 2317 нуклеотида, и после него следует 3' нетранслируемый участок 112 bp. Богатый GO участок, содержащий 16 повторов 33 оснований, был обнаружен в 3'-конце последовательности между основаниями 1756 и 2283. Нуклеотидная последовательность повтора, представленная на фиг. 3, состоит из 6 идентичных повторов, окруженных 10 повторами с различными количествами заместителей, которые возможно возникают после нескольких дупликаций. Небольшое количество замещений предполагает, что эти повторы возникли позднее во время эволюции.

C. Тканевое распределение экспрессии РНК из молочной женской железы, поджелудочной железы, жировой ткани и клеточной линии гепатомы /Hep G2/ анализируют Нозерн-блоттингом. Размер мессенджера оказался приблизительно 2,5 kb как для молочной железы, так и для поджелудочной железы. В линиях с РНК, экстрагированными из HepG2 или жировой ткани /фиг.4/, сигнал не обнаружен.

Так как иРНК, использованную для библиотеки молочной железы, получали от женщин на 8 месяцев беременности, очевидно, что транскрипция и возможно трансляция гена BSSL начинается до родов, в соответствии с ранее обнаруженной секрецией BSSL до родов /35/. См. фиг.4.

D. Аминокислотная последовательность BSSL По данным SDS - PAGE молекулярная масса составляет 107 - 125 кДа /8,36/, а по данным аналитического ультрацентрифугирования составляет 105 кДа /37/. Фермент, что следует из кДНК, состоит из 722 аминокислотных остатков /фиг. 2/, что дает молекулярную массу 76,271 Да, что указывает на то, что фермент содержит, по крайней мере, 15 - 20% углеводородов. Лидерная последовательность содержит 23 остатка. Предполагаемый активный сайт серинового остатка локализован по серину 217 /фиг. 5/. Последовательность вокруг этого серина соответствует активному сайту последовательности серин-гидролаза /33/. Недавно было высказано предположение, что основные остатки, находящиеся вблизи активного сайта серина, могут быть вовлечены в отщепление ацилглицериновых сложноэфирных связей липазами /39/. Интересно отметить, что таких остатков нет в BSSL. Единственный предполагаемый сайт N-гликозилирования расположен только в семи остатках от серина. Степень гликозилирования /6, 16/ предполагает, что фермент содержит O-связанный углеводород. Существует множество сайтов, по которым может происходить такое гликозилирование. Композиция аминокислот в расчете на очищенный фермент демонстрирует высокое содержание пролиновых остатков /6/. Аминокислотная последовательность, полученная из кДНК, подтверждает это. Более того, большая часть пролиновых остатков локализована в 16 повторах по 11 остатков каждый, составляющих основную часть C-терминальной половины фермента.

E. Сравнение ферментов молочной железы /BSSL/ и поджелудочной железы /CEH/ BSSL женского молока и CEH поджелудочной железы человека, как было ранее показано, аналогичны, если не сказать идентичны. Имеющиеся данные дают существенное подтверждение тому, что эти два фермента являются продуктами одного и того же гена. Нуклеотидная последовательность кДНК клонов показывает, что панкреатический клон ACEH идентичен клону молочной железы ABSSL из поли A хвоста и 996 оснований по направлению к 5' концу, включая последовательность, кодирующую богатые пролином повторы. Нозерн-блоттинг дает одну полосу 2,5 kb в РНК для панкреатитной и молочной желез /фиг. 4/. Геномный Саузерн-блоттинг далее подтверждает идею, что только один ген кодирует BSSL и CEH. Разницу в подвижностях BSSL и CEH при SDS - PAGE можно объяснить как следствие различного гликозилирования или различного сплайсинга. Близость BSSL к ферментам крыс и коров /см. далее/ и к результатам геномных блоттов подтверждает возможность того, что различный сплайсинг не может отвечать за различия в подвижности. Так как C-терминальная последовательность не была подтверждена на белковом уровне, маловероятно, что CEH может быть включена протеолитическим расщеплением в C-терминальном конце.

Насколько нам известно, панкреатичные ферменты, которые очевидно соответствуют CEH, часто называли по видам и конкретным субстратам, которые использовали для определения их соответствующих активностей, лизофосфолипазой, холестеринэстеразой, стиролэстергидролазой, неспецифической липазой, липазой сложного эфира карбоновой кислоты и гидролазой сложного эфира холестерина. Доступные данные совместимы с представлением о том, что все эти активности заключены в одной функции /42, 43/. Это иллюстрирует широкую специфичность субстрата и дает возможность охарактеризовать их как неспецифические липазы. При сравнении последовательности BSSL /CEH человека и последовательности лизофосфолипазы из жира поджелудочной железы /40/ и холестеринэстеразы из поджелудочной железы быка /41/, обнаруживается значительное сходство на протяжении около 530 остатков от N-конца /фиг. 5/; но они различаются в той части молекулы, где наблюдаются повторы. У фермента крыс только четыре повтора, а у фермента быка - три. Следовательно, фермент человека представляет собой значительно более длинный белок.

Более того, удивительное сходство было обнаружено между BSSL и множеством типичных эстераз, например, ацетилхолинэстеразами из различных видов, включая человека и Дрозофилу, а также карбоксилэстеразами /фиг. 6/. Эти участки сходства ограничиваются N-терминальными 300 остатками BSSL, которые включают предположительный сайт остатка серина. Сходство с ацетилхолинэстеразой было предсказано из того факта, что BSSL ингибируется типичными ингибиторами холинэстеразы /6, 8, 16/. За возможным исключением карбоксилэстеразы печени крыс /45/, ни один из этих похожих ферментов, как было показано, не имеет такой же зависимости от солей желчи, как у BSSL; это дает возможность предположить, что структурная основа для