Фрагмент днк, способ получения натрийправастатина, плазмида экспрессии (варианты), рекомбинантный штамм (варианты)

Фрагмент днк, способ получения натрийправастатина, плазмида экспрессии (варианты), рекомбинантный штамм (варианты)

Реферат

 

Фрагмент ДНК имеет размер не менее 74 п.о. последовательности N 1. Получают фрагмент частичным перевариванием в направлении 5' --> 3'. Фрагмент ДНК обладает активностью промотора транскрипции в Streptomyces. Соответствует части 5'-некодирующей области в 1 т.п.о., непосредственно примыкающей к открытой рамке считывания Streptomyces carbophilus, кодирующей цитохром Р-450_SCA-2. Для получения натрийправастатина культивируют штамм Streptomyces lividans ТК 21 или Streptomyces lividans SANK 62795, трансформированный экспрессирующим вектором ген Р-450_SCA-2 Streptomyces carbophilus, 5'-некодирующую область (1 т.п.о.) и фрагмент ДНК, обладающий активностью промотора. Культивирование ведут в среде, содержащей натрий-ML-236В и при условиях, обеспечивающих экспрессию цитохрома Р-450_SCA-2. Натрийправастатин извлекают из трансформантов и/или из культуральной среды. Плазмиды экспрессии конструируют на основе плазмиды pIJ702 с включением в нее фрагментов ДНК, обладающей активностью промотора. Рекомбинантный штамм Streptomyces lividans трансформирован плазмидой для продуцирования Р-450_SCA-2. Изобретение позволяет получить полезные белки в промышленном масштабе. 12 с. и 13 з.п. ф-лы, 5 ил. , 2 табл.

Настоящее изобретение относится к новой форме промотора транскрипции, ассоциированного с геном, кодирующим цитохром P-450, присутствующий в Streptomyces carbophilus, векторам, содержащим такой промотор, к применению таких векторов при экспрессии белков, особенно, P-450_sca-2 клеткам-хозяевам, содержащим такие векторы, экспрессионным системам, содержащим такие клетки, и к применению таких белков и экспрессионных систем. Настоящее изобретение также дает возможность получения полезных белков в промышленном масштабе с использованием упомянутого промотора.

В последние годы прогресс в области генетической инженерии создал хорошую возможность для введения и экспрессии чужеродных генов в различных микроорганизмах. Особый прогресс достигнут в отношении использования Eshcerichia coli (Е. coli) в качестве хозяина для получения рекомбинантных белков, и разработанные в результате способы лежат в основе коммерческого применения. Позднее существенный прогресс достигнут в исследованиях дрожжей как промышленной альтернативы E. coli.

Актиномицеты (и, в частности, род Streptomyces) представляют собой прокариотические микроорганизмы, обычно используемые при производстве антибиотиков. Гетерологичную ДНК обычно вводят в актиномицеты, используя систему вектор-хозяин, разработанную в 1980-е Hoopwood et al. [см. Hoopwood, D.A., et al. , (1987), "Methods in Enzymology", 153; 116-166, Academic Press, New York] . Этот метод дал возможность продолжать важные исследования и разработки систем экспрессионных векторов в актиномицетах. Примером промотора транскрипции, пригодного для экспрессионных векторов актиномицетов, является tipA - промотор, индуцируемый антибиотиком тиострептоном [см. Murakami, Т., et al., (1989), J. Bacteriol., 171, 1459].

Натрийправастатин, применяемый при лечении гиперлипемии, обладает полезным фармакологическим действием, поскольку способен понижать сывороточный холестерин [см. Arai, et al., (1988), Ann. Rep. Sankyo Res. Lab., 40, 1-38]. Натрийправастатин получают, главным образом, микробным гидроксилированием натрий-ML-236B - вещества, продуцируемого, нитчатым грибом Penicillium citrinum. Гидроксилирование обычно осуществляют в присутствии актиномицета Streptomyces carbophilus. Доказано, что агент, ответственный за активность гидроксилирования, представляет собой цитохром типа P-450_sca (далее сокращенно обозначаемый "P-450_sca") [см. Serizawa, et al., (1990), Biochimica et Biophysica Acta, 1084, 35-40].

Matsuoka et al. очистили цитохром P-450 из Streptomyces carbophilus, который способен катализировать гидроксилирование натрий-ML-236B в положении 6. Этот P-450_sca отличался тем, что существовал в трех формах - P-450_sca-1, P-450_sca-2 и Р-450_sca-3 [см.Matsuoka, et al., (1989), Eur. J. Biochem., 184, 707-713, и EP-A-0 281245], хотя не установлено, представляют ли эти формы изотопы или продукты различных генов.

Serizawa et al. , клонировали и экспрессировали ДНК, кодирующую P-450_sca-2 из Streptomyces carbophilus [см. патент Японии Kokai No. Hei 6-70780, и Watanabe, I. , et al., (1995), Gene, 163, 81-85]. ДНК, вместе с частью в 1 кб 5'-некодирующей области гена P-450_sca-2, клонировали в мультиреплицированную плазмиду pIJ702, и использовали для трансформации Streptomyces lividans, ТК21. Трансформированный ТК21 Streptomyces lividans конвертировал ML-236B до натрийправастатина даже быстрее, чем S. carbophilus, тем самым демонстрируя, что фрагмент в 1 кб содержит сильную промоторную активность. 5'-Некодирующая область в 1 кб не секвенирована.

В то же время было также установлено, что экспрессия P-450_sca является объектом субстратной индукции транскрипции, т.е., обнаружено, что ML-236B и фенобарбитал усиливают экспрессию Р-450 в 30 раз. Это установлено нозерн-блоттингом, который не обнаружил транскрипции в отсутствие ML-236B, но обнаружил три транскрипта, когда натрий-ML-236В присутствовал. Уровни транскрипции возрастали в течение 6 часов до максимальной степени в присутствии субстрата.

ДНК, кодирующая Р-450_SCA-2, имеет длину 1233 п.о., в то время как промоторная область имеет длину, очень близкую к этой величине - 1013 п.о., что делает трансформацию значительно труднее, чем если для трансформации используют только открытую рамку считывания (ORF). Однако уменьшение длины такого комплекса индуцированного субстратом промотора, с большой вероятностью, сделало бы промотор бесполезным. Кроме того, трансформация хозяина вектором, содержащим как ORF, так и 1-кб область, уже успешно осуществлена, так что нет необходимости в осознании укорачивания ORF или 5'- некодирующей области.

Однако временной лаг в шесть часов до достижения максимального продуцирования P-450 остается проблемой, причем этот временной лаг является основной проблемой при применении в промышленности.

Заявители обнаружили, что уменьшение длины 5'-некодирующей области, ассоциированной с геном, кодирующим P-450_sca-2, к удивлению, не только устраняет усиливающее действие субстрата ML-236B, но также увеличивает эффективность промотора.

Таким образом, в своем первом аспекте настоящее изобретение относится к ДНК, имеющей активность промотора транскрипции, причем упомянутая ДНК соответствует части, но не всей, 5'-некодирующей области в 1 кб, непосредственно примыкающей к открытой рамке считывания Streptomyces carbophilus, причем упомянутая открытая рамка считывания кодирует цитохром Р-450.

Особенно предпочтительно, когда ДНК имеет активность промотора транскрипции по крайней мере в одном штамме Strep- tomyces carbophilus и/или по крайней мере в одном штамме Streptomyces lividans.

Преимущественно, настоящее изобретение относится к промотору транскрипции для белка, который экспрессируется в актиномицете, предпочтительно - в стрептомицете, который делает возможной существенную экспрессию белка в подходящей экспрессионной системе без транскрипции, которая должна быть индуцирована субстратом для белка. Такая экспрессия является выгодно конститутивной.

Настоящее изобретение также относится к ДНК-последовательности для всего такого промотора или для его части; к ДНК, обладающей всей или частью активности такого промотора; к векторам, содержащим такие промоторы; к клеткам-хозяевам, трансформированным такими векторами; и к способам получения рекомбинантного белка с использованием таких клеток.

Особым преимуществом настоящего изобретения является то, что оно относится к способу получения натрийправастатина посредством использования хозяина, экспрессирующего рекомбинатный белок Р-450, транскрипция которого регулируется таким промотором.

По существу, заявители установили, что уменьшение размера 5'-некодирующей области, ассоциированной с геном Р- 450 S. carbophilus, в частности, 5'-некодирующей области, ассоциированной с геном P-450_sca-2, оказывает небольшое действие, или вовсе его не оказывает, на максимальную скорость транскрипционного промотирования, и что уменьшение размера также выгодно устраняет требование субстратной индукции. Эффект субстратной индукции является положительным эффектом, так что можно было бы ожидать, что его устранение оставит промотор, который промотирует только транскрипцию, на основном уровне. Вместо этого, укороченные промоторные области действуют значительно лучше, чем основной уровень, ассоциированный с 1-кб промотором. Даже такая небольшая длина как 74 п.о. все еще обладает активностью, имеющей преимущества, по сравнению с промотором в 1 кб.

Кроме того, выясняется, что скорость транскрипции промоторов с уменьшенной длиной является конститутивной, так что высокие скорости транскрипции достигаются сразу, вместо необходимости ждать достижения максимальных скоростей экспрессии, что происходит в течение шести часов после воздействия ML-236B или другого подходящего субстрата. Это обстоятельство является особенно важным для промышленности.

5'-Некодирующая область в 1 кб, имеющая активность промотора транскрипции, и которая непосредственно примыкает к ORF Р-450, также упоминается здесь как 5'-промотор. В частности, предпочтительно, чтобы это был промотор, ассоциированный с геном Р-450 S. carbophilus.

Хотя 5'-промотор относится к промотору, имеющему длину 1 кб, эта величина является только приблизительной длиной области, растягивающей 5' от области начала транскрипции (tsr) ORF. Располагается tsr вблизи позиции 384 последовательности N 1, и инициирующий кодон ATG следует сразу за позицией 428. Конец области, содержащей 5'-промотор, представляет собой сайт SacI, расположенный на 1013 п.о. в обратном направлении ORF. Сайт SacI этой области описан Watanabe et al. (см. выше), которые не определили длину 5'-промотора. Для облегчения обращения, 5'-промотор упоминается здесь как имеющий длину 1 кб, а не 1013 п.о., так как это, по существу, правильно, и не составляет отличительной особенности настоящего изобретения, как станет ясно из дальнейшего. В любом случае, промоторы настоящего изобретения должны быть короче, чем 5'-промотор полной длины в 1013 п.о.

Для 5'-области в 1 кб, соседней с геном Р-450, не является необходимостью содержать полную промоторную область этого гена, хотя размер области приводит к мысли, что на самом деле так и происходит. В действительности, оказывается, что промотор не занимает строго определенную область, вследствие того факта, что, как установили заявители, область менее 74 п.о. длиной еще обладает сравнимой или лучшей" активностью, чем первоначальный 5'-промотор в 1 кб. Однако это также является случаем, когда промоторы по настоящему изобретению обладают значительно лучшей промоторной активностью, когда их длина превышает 160 п.о., предпочтительно - 300 п.о., или больше.

ДНК по настоящему изобретению, также отнесенные здесь к промоторам по настоящему изобретению, соответствуют 5'-промотору в 1 кб, при условии, что они короче в длину, чем 1 кб 5'-промотора. Уменьшение длины может быть осуществлено любым подходящим способом, таким как удаление частей с помощью рестрикционных эндонуклеаз, путем создания специфических, но более коротких, последовательностей, или путем переваривания либо из 3'-, либо из 5'-конца последовательности, причем упомянутые способы включают комбинации вышеперечисленных способов.

Следует хорошо представлять, что промоторы настоящего изобретения должны быть, как правило, двухцепочечными (дц), чтобы проявить промоторную активность, хотя следует хорошо представлять, что настоящее изобретение также предусматривает применение любых комплементарных цепей, составляющих промоторы изобретения. Настоящее изобретение также распространяется на части промоторов, которые, в конечном счете, могут использоваться для конструирования промотора по настоящему изобретению.

Заявители обнаружили, в частности, что 5'-переваривание дает отличные результаты, так что даже составляющая в 74 п.о., расположенная у 3'-конца промоторной последовательности, все еще имеет превосходную активность. Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления изобретения ДНК по настоящему изобретению соответствует 5'-промотору, частично переваренному в направлении 5'---> 3'. Минимальной длины промоторной ДНК не существует, при условии, что ДНК все еще обладает требуемой промоторной активностью.

Хотя хорошая промоторная активность видна при длине промотора менее 100 п. о. , особенно, у 3'-конца, оказывается, что значительное улучшение активности имеет место при длине от 158 до 320 п.о. Фрагмент в 320 п.о. обладает промоторной активностью почти в 5 раз большей, чем активность фрагмента в 158 п. о. Оба фрагмента являются 3'-концевыми фрагментами 5'-промотора в 1 кб. Это различие в промоторной активности не является критическим для настоящего изобретения, вследствие того факта, что длина в 152 п.о. (разница между двумя длинами) имеет минимальное влияние на трансформацию или экспрессию.

Если для специалиста в этой области техники желательно идентифицировать точную длину промотора, при которой происходит переход между большей и меньшей активностью, то необходимая для этого процедура должна быть совершенно ясна и незатруднительна для специалиста. Однако пользы в идентификации такой длины нет, так как нет ни практического различия, ни какого-либо преимущества, извлекаемого при применении в качестве промоторной последовательности 158 п.о. или 320 п.о.

Следует правильно представлять, что, вообще, предпочтительно использовать промотор скорее с достаточно более высокой активностью, чем с более низкой активностью, с тем, чтобы достичь максимальной транскрипции. Однако может случиться, что скорость транскрипции при использовании промотора с более высокой активностью станет нежелательно высокой, и что слишком много ресурсов хозяина исчерпывается при получении белка. В таком случае был бы желателен менее активный промотор.

Заявители также установили, что существует длина промотора где-то между 428 п. о. и 1 кб, при которой теряется зависимость от субстратной индукции. Хотя такая специфическая длина в 428 п.о. получена 5'-концевым перевариванием, вполне возможно, что любая последовательность в 428 п.о. или подобная, в пределах полной последовательности в 1 кб, может в равной степени служить в качестве промотора.

Как описано выше, потеря зависимости от субстратной индукции является весьма выгодной. Однако в то же время, точная длина, при которой это случается, не является важной. Заявители демонстрируют, что активность промотора, имеющего длину 428 п.о., равноценна или несколько выше, чем полная активность 5'-промотора в 1 кб, по крайней мере, после субстратной индукции в течение одного часа. Таким образом, промотор длиной менее половины длины исходного промотора работает по крайней мере так же хорошо, как первоисточник, но без потребности в субстратной индукции. Это означает, что любой процесс, при котором скорость экспрессии является составным элементом, становится выгодным. Длины, превышающие 428 п.о., становятся все в большей степени громоздкими, не принося пользователю выгоды. Кроме того, в некоторый момент более длинные промоторы снова становятся также объектом субстратной индукции, тем самым сводя на нет любое преимущество, приобретенное за счет более коротких промоторов по настоящему изобретению.

Соответственно, ДНК по настоящему изобретению имеет, преимущественно, такую длину, при которой она показывает промоторную активность, равноценную, по существу, или большую, чем активность 3'-фрагментов в 320 и/или 428 п.о. 5'- промотора. В частности, представляется, что длина промотора не должна быть настолько велика, чтобы он подвергался субстратной индукции.

Термин "субстратная индукция" хорошо известен в технике. По существу, в природе часто требуются только определенные продукты экспрессии, когда присутствует определенный субстрат, на котором они могут действовать. В отсутствие упомянутого субстрата микроорганизм будет растрачивать ресурсы путем экспрессии продукта. Соответственно, различные системы в природе развились таким образом, что экспрессия продукта происходит только в присутствии субстрата.

В случае Р-450_sca-2 это достигается с помощью такого субстрата, как ML-236B, действующего в промоторном сайте с индуцированием транскрипции мРНК. Это не означает, что не существует другого средства, кроме ML-236B, которое является природным субстратом для цитохромов P- 450_sca. Могут существовать другие субстраты, в том числе, любые, которые являются предполагаемыми субстратами, если они отличаются от ML-236B, которые могут индуцировать 5'-промотор. Другим примером подходящего субстрата для индуцирования 5'-промотора, как упоминалось выше, является фенобарбитал. Однако точная природа индуцирующего фактора для 5'-промотора не является важной для настоящего изобретения, и в дальнейшем не будет здесь обсуждаться.

Хотя настоящее изобретение не претендует на теоретические выкладки, кажется вероятным, что, к удивлению, индукция цитохромов Р-450_sca-2 с помощью субстрата каким-то образом преодолевает блокировку транскрипции. Затем, как представляется, уменьшение размера промоторной области в 1 кб, особенно, путем переваривания 5'-конца промотора, служит для удаления блокировки. По этой причине заявители полагают, что не существует определенной длины промотора, при которой возобновляется субстратная индукция, скорее, промоторная активность снижается с возрастанием длины, начиная с определенного момента, так как восстанавливается блокировка промотирования транскрипции. Может начаться субстратная индукция, которая по эффективности прямо пропорциональна регенерации блокировки промотирования транскрипции, или она может быть только вероятной сразу по достижении определенной длины. В любом случае, предпочтительны промоторы, активность которых не снизилась вследствие возрастания длины чуть за 500 п.о. Иными словами, промоторы, которые имеют длину, превышающую 500 п.о., точнее - превышающую 428 п.о., и которые показывают снижение активности, не являются предпочтительными.

ДНК по настоящему изобретению соответствует части, или частям 5'-промотора. Под термином "соответствует" подразумевается, что ДНК по изобретению имеет тип промоторной активности, подобный типу активности 5 - промотора в том смысле, что она может служить для активирования транскрипции ORF цитохрома P-450_sca. Уровень, при котором происходит такое активирование, не является существенным признаком настоящего изобретения, и здесь не описываются уровни промоторной активности промоторов по настоящему изобретению. Единственным требованием является требование, чтобы промоторы по настоящему изобретению имели активность, которая, в определенном случае по крайней мере, лучше, как описано выше, чем активность 5'- промотора.

Промоторы настоящего изобретения могут непосредственно соответствовать части или частям 5'-промотора. В рядовом варианте осуществления изобретения 5'-промотор может быть переварен с 5'-конца, так что получающийся в результате промотор изобретения имеет ту же последовательность, что и остающаяся 3'-часть 5'-промотора. Если 5'-промотор переваривается из 5'-конца, а часть также удаляется посредством эндонуклеазного переваривания и лигирования, тогда получающийся в результате промотор изобретения будет соответствовать непосредственно двум важным частям 5'-промотора. В обоих этих примерах получающийся в результате промотор имеет последовательности, идентичные одной или нескольким частям 5'-промотора.

Промотор по настоящему изобретению будет, вообще, содержать одну или несколько последовательностей, подобных или идентичных последовательности или последовательностям 5'-промотора. Однако нуклеотидная последовательность промоторов по изобретению не нуждается в прямом соответствии последовательностям 5'-промотора. Хотя, вообще, предпочтительно, чтобы промоторы по изобретению участвовали в весьма существенной гомологии последовательностей с важными частями 5'-промотора, которым они соответствуют, это обстоятельство не является существенным. Единственным требованием является наличие требуемой промоторной активности.

Промоторы по настоящему изобретению могут отличаться от исходного 5'-промотора настолько, насколько это желательно, при условии, что получающийся в результате промотор все еще показывает требуемую промоторную активность. Вообще, путем изменения последовательности приобретается незначительное преимущество, и нет гарантии, что изменением последовательности оснований будет достигаться что-либо иное, кроме разрушения или падения промоторной активности. Однако не являются невозможными некоторые изменения последовательности оснований, чтобы получить какой-либо заметный эффект, особенно, если они не требуются для последовательности оснований, которая кодирует белок.

Изменения последовательности оснований, как правило, будут происходить через процедуру трансформации, или могут осуществляться, для удобства, таким образом, чтобы ввести, например сайт рестрикции. Таким образом, настоящее изобретение предусматривает промоторы, которые отличаются от части, или от частей, 5'-промоторной последовательности, которой они соответствуют, путем, например делеций, инверсий, инсерций и замещений. В природе также могут происходить изменения встречающейся в природе 5'-промоторной последовательности, и промоторы изобретения на основе таких вариантов, также предусмотрены.

Другие различия и изменения последовательности и способы их осуществления будут достаточно ясны для специалистов в этой области техники, и настоящее изобретение их все предусматривает. Промоторы по настоящему изобретению, которые изменяются путем иным, чем природное изменение, также относятся к настоящему как мутанты, так что как мутанты, так и варианты охватываются настоящим изобретением. Однако следует отчетливо представлять, что экспрессия, "соответствующая части, но не всей 5'-некодирующей области в 1 кб, непосредственно примыкающей к открытой рамке считывания Streptomyces carbophilus, причем упомянутая открытая рамка считывания кодирует цитохром P-450_sca", включает в себя все такие мутанты и варианты.

В основном, подходящие мутанты и варианты могут гибридизоваться при 60^oC в 6 х SSC с ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность 1-428 последовательности N 1 из списка последовательностей. ДНК, с которой гибридизуются мутанты и варианты, может или не может образовывать часть более длинной последовательности.

Как обсуждалось, промоторы по настоящему изобретению обнаруживают превосходную активность к 5'-промотору в 1 кб. Это вовсе не означает, что уровень транскрипции ORF-объекта для активирования промотором по изобретению является более высоким, чем уровень, активированный 5'-промотором в 1 кб при индуцировании субстратом. Вместо этого, часто случается, что конститутивное активирование промотором по изобретению служит для обеспечения таких уровней белковой активности, которые являются еще более высокими после одночасового периода, например, по сравнению с уровнями, получаемыми с 5'-промотором после одночасовой субстратной индукции. Такое конститутивное продуцирование может быть далеким от предпочтительного для ослабления наращивания, которое впоследствии достигает уровней, которые, например превышают либо требуемые, либо полезные.

Хотя ДНК по настоящему изобретению пригодны, преимущественно, в случае цитохромов Р-450_sca, следует отчетливо представлять, что они могут попользоваться в сочетании с любой подходящей последовательностью для экспрессии в любом подходящем прокариотическом хозяине. В частности, промоторы по настоящему изобретению могут применяться в подходящих хозяевах-актиномицетах, особенно, в стрептомицетах. Промоторы изобретения соответствуют части или частям промотора, происходящего из S. carbophilus, и требуемая промоторная активность демонстрируется, если промотор изобретения способен активировать транскрипцию ORF цитохрома P-450_sca.

На основании вышесказанного, следует правильно представлять, что при оперативном связывании с подходящей ORF образуются другие промоторы изобретения. Также образуются векторы, такие как плазмиды, содержащие промоторы изобретения, особенно, когда промотор оперативно ассоциируется с ORF, и хозяева, содержащие такие векторы.

Нужные векторы необязательно являются экспрессирующими векторами. Такие другие векторы могут использоваться для мультиплицирования промоторов изобретения, или для обеспечения легко доступной библиотеки. Однако экспрессирующие векторы являются предпочтительными, и экспрессирующие системы, содержащие хозяина и экспрессирующий вектор изобретения, являются особенно предпочтительными.

В настоящее время особенно предпочтительно использовать S. lividans, когда в качестве клетки-хозяина для экспрессии продуктов из гетерологичной ДНК используют актиномицет. В случае цитохромов P-450_sca, особенно, P-450_sca-2, S. lividans также экспрессирует необходимую систему переноса электронов для возможности для цитохрома принимать участие в гидроксилировании ML-236B. Однако любой другой подходящий белок или продукт экспрессии также может быть экспрессирован через экспрессирующую систему, содержащую промотор настоящего изобретения.

Как правило, не является предпочтительной экспрессия эукариотической ДНК в прокариотах, таких как S. lividans, так как определенные посттрансляционные события, такие как гликозилирование, не имеют места в прокариотах, которые встречаются в природе в эукариотах. Однако это не предотвращает экспрессии эукариотических продуктов в системах настоящего изобретения, при условии, что существует понимание того, что любые требуемые посттрансляционные модификации, не происходящие в природе в экспрессирующей системе, не будут происходить без специальной пищи дли них.

Экспрессирующие системы настоящего изобретения особенно пригодны для экспрессии прокариотических продуктов экспрессии в большом количестве. Продукты экспрессии могут быть получены даже в еще больших количествах, если в экспрессирующей системе используются мультикопийные плазмиды, такие как pIJ702.

Экспрессирующие системы настоящего изобретения более пригодны для экспрессии продуктов, которые обычно экспрессируются только после субстратной индукции. Такие системы могут использоваться в процессах для получения некоторых веществ, таких как антибиотики. Такие процессы возможны, например, когда продукт экспрессии обладает активностью для превращения субстрата в конечный продукт, или в более поздний промежуточный продукт, или даже для разрушения субстрата. Такой процесс может вовлекать сокультуру экспрессирующей системы, если это уместно, с системой, продуцирующей субстрат, на который будет оказываться действие.

При условиях, при которых продукт экспрессирующей системы изобретения является нормально индуцируемым субстратом, сокультивация с субстратом, продуцирующим экспрессионную систему, обычно будет испытывать временный лаг, и появляется необходимость ожидания для экспрессирующей системы, чтобы продуцировать продукт экспрессии в достаточной степени. Используя экспрессирующие системы по настоящему изобретению, эту проблему устраняют, так как продукт синтезируется системой автоматически, исключая необходимость субстратной индукции, за счет чего устраняется фактор временного лага.

Следует правильно представлять, что экспрессирующие системы по настоящему изобретению являются особенно применимыми для экспрессии цитохромов Р-450, особенно, цитохромов P-450_sca, и наиболее специфически - цитохрома P-450_sca-2. Р-450_sca-2 экспрессируется S. carbophilus, как описано выше, и при получении натрийправастатина S. carbophilus сокультивируют, преимущественно, с Penicillium citrinum. В этой системе Р-450_sca-2 служит для гидроксилирования субстрата ML-236B, экспрессированного Penicillium citrinum, но только после задержки, хотя ML-236B индуцирует транскрипцию Р-450_sca-2. При использовании экспрессирующей системы настоящего изобретения более нет необходимости иметь лаговый период при производстве натрийправастатина, и это обстоятельство ведет к большим выгодам при промышленном производстве натрийправастатина.

Ниже описываются некоторые предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения.

Предпочтительные промоторы настоящего изобретения гибридизуются с ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность 1-428 или 1-320 последовательности N 1.

Промоторы, имеющие нуклеотидную последовательность 1-428 последов. N 1 являются предпочтительными. Промоторы, имеющие нуклеотидную последовательность 1-320 последов. N 1, также являются предпочтительными. Настоящее изобретение также относится к мутантам и вариантам таких промоторов.

Рассматриваются также векторы рекомбинантных ДНК, содержащие промоторы по настоящему изобретению, в частности, когда такие векторы содержат ДНК, кодирующие нужный полипептид под контролем промотора, и при этом вектор способен экспрессировать полипептид в подходящей клетке-хозяине. Предпочтительно, когда полипептид представляет собой цитохром P-450_sca-2.

Настоящее изобретение также относится к клеткам-хозяевам, трансформированным такими векторами. Предпочтительными клетками-хозяевами являются актиномицеты, в частности, Streptomyces lividans. Особенно предпочтительным является Streptomyces lividans SANK 62795 (FERM BP-5299).

Настоящее изобретение также относится к способу получения нужного полипептида, такого, как определяется выше, причем упомянутый способ включает культивирование трансформированной клетки-хозяина, определение которой дается выше, при условиях, допускающих продуцирование полипептида, чтобы продуцировать полипептид, и извлечение полипептида.

Настоящее изобретение также относится к способу получения натрийправастатина, который включает культивирование штамма TK21 Streptomyces lividans, трансформированного экспрессирующим вектором изобретения, кодирующим Р-450_sca-2, в среде, содержащей натрий-ML-236B, и при условиях, допускающих продуцирование цитохрома Р-450_sca-2, и позволяющих превращать натрий-ML-236B в натрийправастатин в трансформированных клетках путем каталитического действия продуцированного в них цитохрома Р-450_sca-2, с последующим извлечением натрийправастатина из упомянутых трансформантов и/или упомянутой среды. Трансформированный штамм, предпочтительно, представляет собой Streptomyces lividans SANK 62795 (FERM ВР-5299). Также предпочтительно, чтобы ML-236B продуцировался Penicillium citrinum, который сокультивируют с упомянутым штаммом.

Промотор 5' не гомологичен какому-либо известному промотору, имеет ли он источником актиномицет или имеет какой-либо другой источник. Подобно другим промоторам, промоторы по настоящему изобретению вызывают инициацию транскрипции ДНК, кодирующей белок или полипептид в мРНК. Этот этап является первой частью внутриклеточного биосинтеза белков или полипептидов (термины, которые здесь являются взаимозаменимыми). Таким образом, промоторы изобретения являются промоторами транскрипции, причем эта функция обозначается как активность промоторов транскрипции. Промотор 5', как и промоторы, содержащие последовательности в 428, 320, 158, 101 и 74 п.о. последов. N 1, все обладают такой активностью.

Следует представлять, что промоторы по настоящему изобретению могут иметь одну или несколько дополнительных пар оснований, связанных в тандем, в обратном и/или прямом направлении. Такие дополнительные последовательности ограничены только в том, что не должна реинтродуцироваться субстратная индукция в заметной степени, и также в том, что должна сохраняться промоторная активность в полезной степени.

Полипептиды под контролем промоторов настоящего изобретения могут быть такими, как описано выше. Следует представлять, что они могут иметь любую аминокислотную последовательность, такую как, например, последовательность природной, вариантной или полимерной формы нового или известного белка; слитой формы двух или нескольких различных белков; или заново созданного полипептида. Как описано выше, предпочтительным полипептидом является цитохром Р-450_sca-2.

Что касается векторов, следует отчетливо представлять, что вектор, который трансформируется, должен представлять собой вектор, который способен к саморепликации в подходящей клетке-хозяине. Таким образом, вектор должен содержать самореплицирующуюся последовательность или репликон. В случае актиномицетов, таким предпочтительным вектором является pIJ702.

Что касается хозяина, то особых ограничений нет, кроме того, что он должен быть подходящим для выбранного вектора. Вообще, могут использоваться любые клетки-хозяева, такие как клетки, собранные у дикого типа, или клетки могут быть приобретены путем закупки или передачи. Предпочтительными клетками-хозяевами являются актиномицеты, предпочтительно - Streptomyces carbophilus или Streptomyces lividans, и наиболее предпочтителен штамм TK21 Streptomyces lividans.

При таком способе получения натрийправастатина, какой описан выше, включающем культивирование трансформированного штамма Streptomyces lividans в присутствии натрий-ML-236B, получающийся в результате натрийправастатин может быть извлечен известными способами.

В простом варианте осуществления изобретения промоторы настоящего изобретения могут быть получены путем клонирования ДНК из Streptomyces carbophilus с использованием методологии Watanabe et al. [Gene, (1955), 163, 81-85]. Предпочтительным штаммом Streptomyces carbophilus, из которого могут быть клонированы промоторы настоящего изобретения, является Streptomyces carbophilus SANK 62585 (FERM ВР-1145).

В представленном варианте осуществления изобретения геномная библиотека может быть получена из полной геномной ДНК Streptomyces carbophilus с использованием в качестве клонирующего вектора, например, pUC18 (который можно получить от Takara Shuzo Ltd., Япония). Следует иметь в виду, что такие библиотеки и векторы образуют часть настоящего изобретения. Затем можно синтезировать олигонуклеотидный зонд на основе, например, предсказанной N-концевой аминокислотной последовательности P-450_sca-2. Этот олигонуклеотидный зонд затем может быть использован для идентификации клона из библиотеки, кодирующей по крайней мере часть P-450_sca-2. Так как N-конец белка кодируется 5'-концом ORF, тогда возможно, что любой клон, идентифицированный таким способом, также будет иметь достаточное количество 5'-нетранслированной и некодируюшей области, которая существует там, где располагается 5'-промотор. Подходящим способом скрининга с использованием библиотеки и олигонуклеотидного зонда является метод гибридизации колоний [см. Mania-tie, Т. , et al., (1982), "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Нью-Йорк. Любые методы, упоминаемые здесь, которые не сопровождаются какой-либо конкретной ссылкой, будут, как правило, описаны в "Molecular Cloning - A Laboratory Manual"].

Даже если клон, идентифицированный таким или каким-либо иным способом, содержит только часть промотора настоящего изобретения, еще можно получить полный клон. Из клона, содержащего только часть нужной ДНК, можно получить меченный зонд. Этот меченный зонд затем может быть использован в качестве матрицы для последующего скрининга геномной библиотеки, для того, чтобы идентифицировать и выделить клон, содержащий по крайней мере столько 5'-промотора, сколько требуется.

Следует ясно представлять, что настоящее изобретение предусматривает выделение клона, содержащего либо весь 5'- промотор, либо только часть 5'-промотора. Если получена полная последовательность, тогда, чтобы получить промотор по настоящему изобретению, обработку можно продолжить, например, таким способом, как субклонирование. Если получена неполная последовательность, тогда обработку также можно продолжить, как и в случае полной последовательности, или последовательность может быть достаточной как промотор изобретения без какого-либо существенного изменения в последовательности.

Следует также представлять, что предложенный выше способ клонирования и получения промотора по настоящему изобретению не является единственным способом, который можно использовать, и специалисту в этой области техники легко представить другие подходящие для этого способы. Можно изменить любую из стадий или даже общую методологию. Например, можно использовать зонд, полученный из 3'-конца 5'-промотора, а не зонд, соответствующий N-концевой последовательности Р-450_sca-2. Векторы не имеют особых ограничений, и можно использовать любой подходящий клонирующий вектор, такой как различные коммерчески доступные векторы, включая pBR322.

В соответствии с настоящим изобре