Выделенная и очищенная молекула нуклеиновой кислоты, не встречающаяся в природе молекула нуклеиновой кислоты и способ придания растению устойчивости к вирусу табачной мозаики (варианты)

Выделенная и очищенная молекула нуклеиновой кислоты, не встречающаяся в природе молекула нуклеиновой кислоты и способ придания растению устойчивости к вирусу табачной мозаики (варианты)

Реферат

 

Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть использованы для получения растений, устойчивых к вирусу табачной мозаики. Устойчивость к вирусу достигается трансформацией растений нуклеотидными последовательностями, которые кодируют протеин N-гена. Протеин N-гена распознает патоген и инициирует сигнальный каскад трансдукции, приводящий к экспрессии устойчивости к ВТМ за счет взаимодействия с его компонентом. 4 с. и 12 з.п.ф-лы, 13 ил., 9 табл.

Настоящее изобретение относится к способам и материалам для усовершенствования борьбы с патогенами растения. Более конкретно, настоящее изобретение относится к последовательностям нуклеиновых кислот, которые кодируют протеин N-гена, к содержащим эти последовательности рекомбинантным полинуклеотидным молекулам и их использованию, в частности, к их использованию для трансформации растений семейства Solanaceae для придания им устойчивости к вирусу табачной мозаики.

Предпосылки изобретения Основные потери количества и качества урожаев определяются патогенами, вызывающими болезни растений, включая вирусы, бактерии и грибки. Вирус табачной мозаики (TMV) инфицирует растения, представляющие коммерческую ценность, включая табак и такие родственные растения, как томаты и перец. Хотя и не являясь гибельным, TMV влияет на рост и продуктивность этих растений. Вирусный патоген распространяется в растении в две стадии. Вначале вирусная инфекция наблюдается в том месте, где вирус проникает в клетки растения-хозяина. Затем происходит репликация вируса, во время которой вирус размножается в клетках растения.

У растений существует множество механизмов, которые обеспечивают природную устойчивость к патогенам. Они включают заранее сформированные структурные и химические барьеры и активные механизмы устойчивости. Устойчивость растений к заболеваниям контролируется отдельными комплементарными генами в растении и в патогене. Гены в растении называют генами устойчивости, а гены в патогене называют генами авирулентности. Растения, которые содержат ген устойчивости, эффективно защищены от заболевания, вызываемого патогеном, содержащим соответствующий ген авирулентности.

Доминантный N-локус табака придает устойчивость к TMV и является посредником локализованной гиперчувствительной реакции (HR) в сайте вирусной инфекции, и индуцирует реакцию системной приобретенной устойчивости (SAR) в клетках, соседних с инфицированным участком и во всем растении. Растения табака, гетерозиготные или гомозиготные для N-локуса устойчивы к заболеванию, вызываемому TMV. HR представляет собой комплексную активную реакцию устойчивости, которая вырабатывается в растении в ответ на атаку патогена после неудачи механизмов ранее сформированной устойчивости (Keen et.al Biotechnoloqy in Plant Disease Control, Wiley-Ziss, Inc., p.65-88 (1993)). HR характеризуется гибелью клеток (некрозы) в участке проникновения патогена. Хотя сам по себе некроз может и не быть ответственным за устойчивость к заражению патогеном, сопутствующий синтез противомикробных соединений, связанных с патогенезом протеинов, который характеризует SAR реакцию, и установление структурных барьеров, как считают, играет центральную роль в остановке распространения патогена. Взаимодействия патоген- растение, в которых вырабатывается устойчивость, называют несовместимостью, тогда как те, которые приводят к заболеванию, называются совместимостью.

Были проведены исследования механизмов, за счет которых растения, содержащие гены устойчивости, определяют наличие заражающего патогена и индуцируют HR и SAR. Во многих случаях HR управляется за счет ген-для-гена взаимодействиями между несовместимыми комбинациями растения и патогена. Модель гена, предложенная Flor (Journal of Aqricultural Research 74: 241-262 (1947)), предполагает, что устойчивость к заболеванию и патогенная авирулентность являются характерными особенностями. Поэтому устойчивость будет проявляться только в тех случаях, когда растения обладают специфическим геном устойчивости (R-ген), а патоген обладает соответствующим геном авирулентности (Avr-ген). Некоторые Avr-гены были клонированы из бактерий, грибков и вирусов (см. Gabriel and Rolfe Annual Rev.Phytopatholoqy 28:365-391 (1990) и Keen, Annual Rev. Genet 24:447-463 (1990)), и в некоторых случаях природа элизиторных молекул была определена (см.Keen, Plant Molecular Biology 19: 109- 122 (1992)). Сообщается о гене устойчивости к грибкам НМ1 кукурузы (Johal and Briqs, Science 258:985-987 (1922)) и гене устойчивости к бактериям Pto томатов (G.Martin etal. Science 262:1432-1436 (1993)). Однако до сих пор не было выделено или клонировано никаких природных генов устойчивости к растительным вирусам.

Простая генетическая связь между R-генами и их соответствующими Avr-генами приводит к обсуждению типа действия продуктов R-гена. Одна модель предполагает, что R-гены находятся в схемах подачи сигналов, способных распознавать патогены и инициировать последующие каскады трансдукции сигналов, приводящие к устойчивости (Lamb., Cell 76:419-422(1994). Вторая модель предполагает, что R-генные продукты являются трансмембранными ионными каналами, за счет которых происходит гибель клеток, независимо от других событий в клетке. Недавнее клонирование Pto из томатов, придающих устойчивость к бактериальному патогену Pseudomonas syrihqae pathovar tomato (Martin et al. Science 262:1432-1436 (1993)) дает возможность предположить, что по крайней мере первая модель может работать в клетках растений. Анализ последовательностей Pto указывает, что она кодирует серин/треонин киназу. Теоретически возможно, что эта серин/треонин киназа взаимодействует прямо или косвенно с элиситорной молекулой, а затем фосфорилирует последующий модулятор реакции устойчивости, инициируя тем самым каскад трансдукции сигнала.

Было отмечено сходство между реакциями гиперчувствительной устойчивости растений и "врожденной" иммунной реакцией животных. Общим является быстрое продуцирование реакционноспособных типов кислорода (ROS), известных как оксидативный импульс. Примерами ROS являются супероксидный анион (O₂^-) и перекись водорода (H₂O₂). Эти молекулы могут обладать прямым антимикробным действием и такими другими защитными действиями, как сшивание структурных протеинов в стенках растительной клетки. Важно, что ROS может активировать экспрессию генов, связанных с защитой у животных и растений (Scheck and Bauerle, Trends in Cell Biology 1:39-42 (1991), Chen et el. Science 262:1883-1886 (1993). У млекопитающих ROS с большими основаниями рассматривают как вторичный мессенджер для цитокинов, таких, как фактор опухолевого некроза (TNF) и Интерлейкин-1 (I1-1) в схеме, где фактор транскрипции NF-кВ регулирует экспрессию иммуноглобулинов, интерлейкинов и других протеинов. Фактор транскрипции Дрозофилы (Dif), гомологичный NF-кВ, также активирует транскрипцию антибактериальных протеинов, включая секропины (cecropins), аттацины (attacins), дефенсины и лизоцимы (Levine and Hultmark. Trends in Genetics 9: 178-183(1993)). Параллельно в растениях является индуцирование протеинов, связанных с патогенезом, и синтез таких противомикробных соединений, как фитоалексины, которые можно индуцировать экзогенным нанесением H₂O₂.

Важной модельной системой для исследования реакций устойчивости растений была система устойчивости N-гена. N-локус состоит из отдельного доминантного гена, который является медиатором индуцирования реакции некротического типа и SAR в ответ на инфицирование за счет TMv (Holmes, Phytopatohology 28: 553-561 (1938). Он был исходно идентифицирован в Nicotiana qlutinosa и был введен в N.tabacum. N - ген является медиатором гиперчувствительной реакции, которая характеризует образование локальных поражений, в которых вирус табачной мозаики локализован. Это представлено на фиг.1A. Культивары табака без N-гена позволяют вирусу табачной мозаики систематически распространяться и развивать "мозаичные" симптомы, которые характеризуются чередующимися участками светло- и темно-зеленой ткани листьев (фиг.1B).

Технология рекомбинантных ДНК предлагает возможность получения растений, трансформированных за счет патогенного гена устойчивости для придания таким растениям устойчивости. Такой подход сдерживался из-за отсутствия клонированных природных генов устойчивости растений и отсутствия знаний о механизме устойчивости. Однако до настоящего времени клонированные гены устойчивости были недоступны из-за отсутствия способов выделения генов растений, для которых не было информации относительно природы генов или их продуктов. В последнее время были разработаны два способа для растений, и они независимо от знания гена или биохимической информации о протеине позволяют выделять гены. И этими способами являются позиционное клонирование и транспозонное мечение (Baker, Shеll, Fedoroff, Proceediqs of National Academy of Science, USA 83: 4944-4848 (1986)).

Краткое содержание изобретения Настоящее изобретение включает ДНК-последовательность в выделенной и очищенной форме, которые кодируют протеин N-гена, причем этот протеин осуществляет функцию передачи устойчивости к TMV в растениях, синтезирующих протеин N-гена. Геномные и кДНК последовательности, кодирующие конкретный протеин N-гена, здесь конкретно представлены. В объем изобретения включены ДНК последовательности, кодирующие протеин N-гена представленной аминокислотной последовательности. ДНК-последовательности, которые гибридизуются специфически с N-ген колирующей последовательностью или ее комплементом в стандартных условиях и которые кодируют протеины N-гена, которые функционируют как медиаторы устойчивости к TMV, также включены в объем настоящего изобретения.

Следующим аспектом изобретения является создание рекомбинантных молекул нуклеиновых кислот, содержащих последовательности, кодирующие протеин N-гена. Такие молекулы включают, например, рекомбинантные векторы, такие как векторы клонирования, экспрессии или трансформации, которые содержат ДНК- последовательность, кодирующую протеин N-гена.

В другом аспекте настоящего изобретения предложены клетки, которые трансформированы вышеуказанными векторами или ДНК-последовательностями.

Конкретным использованием настоящего изобретения является создание растений или растительных клеток, трансформированных N-геном, кодирующим последовательность для придания растениям устойчивости к TMV.

Следующим аспектом изобретения является создание олигонуклеотидных зондов, способных детектировать N-ген или их функциональных эквивалентов в растениях семейства Solenaceae и использование этих зондов для выделения ДНК-последовательностей, кодирующих N-ген или их функциональных эквивалентов. ДНК- последовательности, которые специфически гибридизуются с зондами и которые кодируют функциональный протеин N-гена, также входят в объем настоящего изобретения.

Использование последовательности N-гена облегчает выделение гомологичных генов из родственных и неродственных хозяев для получения генов, которые защищают растения-хозяева от родственных вирусных патогенов и неродственных патогенов.

В соответствии с настоящим открытием целью настоящего изобретения является создание генной конструкции, включающей ДНК последовательность, которая кодирует протеин N-гена, который функционирует как медиатор устойчивости к TMV в растениях, синтезирующих протеин N-гена.

Целью настоящего изобретения является также создание вектора трансформации, включающего конструкцию N-гена, причем этот вектор эффективен для стабильного введения конструкции N-гена в растение.

Другой целью изобретения является создание трансгенных растений, устойчивых к TMV, в которых устойчивость является результатом экспрессии конструкции N-гена.

Другие цели и преимущества настоящего изобретения станут очевидны из прилагаемого описания.

Краткое описание рисунков Фиг.1 представляет фенотипы листьев табака после инокуляции TMV. На фиг. 1A представлен лист растения, содержащего функциональный N-ген. На фиг.1B представлен лист растения, восприимчивого к TMV. На фиг. 1C представлен лист растения, демонстрирующий участки некрозов на TMV-восприимчивом фоне (сеторный фенотип). На фиг.1Д представлен лист растения TMV- восприимчивого, SR1 табака, трансформированного pTG38 Т-ДНК- конструкцией. Фиг.2A-2C иллюстрируют Саузерн-блоттинг гибридизационный анализ маркера зонда Nt1 RFLP и Ac для Д111 популяции. Фиг.2A демонстрирует результаты гибридизации Nt-1 зонда с геномной ДНК, выделенной из Nicotiana видов qlutinosa tomentosiformis и sylvostris и культиваторов табака Samsun NN и SR1. Фиг. 2B демонстрирует результаты Nt-1 гибридизации с потомством бэккроссов геномных ДНК, сегрегирующих Nt1 (G) N- связанный RFLP маркер. Фиг.2C демонстрирует гибридизацию 5' Ac зонда с той же ДНК, что представлена на фиг. 2B.

Фиг. 3A демонстрирует рестрикционную карту части дикого типа N-гена и Ac за счет вставки мутагенизированного N-гена. Фиг. 3B-3C демонстрируют Саузерн блоттинг ДНК, выведенных из родственных видов Nicotiana и Ac-мутагенизированных растений, секториальных растений и мутантов, содержащих Ac-вставки в дикого типа (WT) N- ген, и герминальные ревертанты. Фиг. 3B демонстрирует гибридизацию зонда N-5 N-гена с ДНК выбранного растения. Фиг.3C демонстрирует Ac-гибридизацию с ДНК выбранного растения.

Фиг. 4A и фиг. 4B суммируют организацию N-гена. Фиг.4A иллюстрирует организацию N-гена по отношению к относительным положениям интронов и экзонов, а фиг. 4B представляет рестрикционные карты трех геномных клонов, каждый из которых содержит полной длины N-ген. Эти карты были получены из анализа последовательностей кДНК клонов C7, C16 и C18, и G38 геномного клона и рестрикционного анализа трех геномных клонов. кДНК C7 (не представлена) оказывается идентичной C18, за исключением того, что C7 содержит интрон 11, и считают, что это частично процессированный месседж. У C18 отсутствуют 753 bp с 5'-конца. Взятые вместе C7 и C18 предсказывают открытую считывающую рамку из 3432 пар оснований, кодирующую полипептид из 1144 аминокислот. C16 кодирует протеин из 652 аминокислот за счет включения альтернативного экзона из 70 bp, который изменяет считывающую рамку. Все три кДНК клона идентичны по их 3'-концам, но лишь C7 и C16 идентичны по их 5'-концам. Фиг. 4B: геномные клоны переварены EcoR1 (Е), Bam H1 (В) и Xho 1(Х). X⁺ указывает, что этот Xho 1 сайт получен за счет полинкера Gem 11 клонирующего вектора.

Фиг. 5 представляет модель для N-протеина, который является медиатором сигнальной трансдукции в реакции на TMV-инфицирование.

Подробное описание изобретения Считают, что доминантные гены устойчивости растений кодируют протеины, которые могут распознавать конкретные патогены или расы патогенов, и инициируют сигнальный каскад трансдукции, что приводит к экспрессии устойчивости к заболеванию. TMV проникает в клетку в результате механического повреждения тканей растения. После проникновения в клетку его распространение и локализация внутри клетки непонятны. В N-содержащих растениях табака считают, что N-протеин взаимодействует прямо или косвенно с каким-то компонентом TMV. Этот компонент TMV до сих пор не определен, но считают, что в этом участвует репликаза (Padqett and Beachy, Plant Cell 5:577-586 (1993)). После распознавания TMV N инициирует реакцию устойчивости, что приводит к образованию локальных поражений и к индуцированию отдаленной системной приобретенной устойчивости.

Считают, что настоящее изобретение является первым сообщением о клонировании, секвенировании и передаче устойчивости к трансгенному вирусу табачной мозаики для N- гена Nicotiana.

В том смысле, как здесь использован, термин "протеин N-гена" относится к протеину, обладающему способностью придавать устойчивость к TMV в растении, синтезирующем протеин N-гена. N-ген включает геномные последовательности, которые кодируют протеин N-гена и которые управляют и регулируют транскрипционную и трансляционную экспрессию N-кодирующих последовательностей. Представленный N- генный продукт имеет предсказанный молекулярный вес около 131 кДа и предсказанную аминокислотную последовательность, которая представлена в последовательности ID N 4 и в таблице 7A. Представленная геномная ДНК-последовательность, которая охватывает кодирующую последовательность для этого N-генного продукта, представлена в последовательности ID N 1. Полной длины кДНК последовательность (из клонов C18) и усеченная кДНК последовательность (из клона C16) представлены как последовательность ID N 3 и последовательность ID N 5 соответственно.

Вырожденность генетического кода хорошо известна специалистам, поэтому синонимы кодирующих последовательностей с одним или более замещенными кодонами специалисты легко определят. Синонимные кодирующие последовательности отличаются от представленных кодирующих последовательностей, но кодируют протеины тех же самых аминокислотных последовательностей, что и те, которые здесь специфически представлены.

Специфические варианты нуклеотидных последовательностей, которые кодируют протеин N-гена, который имеет функцию передачи устойчивости к TMV, представлены в последовательностях ID N1, 3 и 5.

кДНК последовательность, содержащая полной длины N-ген, представлена как последовательность ID N 3. Эта кДНК последовательность состоит из 3760 bp в длину. Образующаяся открытая считывающая рамка (кодирующая часть), начинающаяся у основания 60 и заканчивающаяся у основания 3494, кодирует протеин длиной в 1144 аминокислоты. Кодируемый протеин представлен в таблице 7A и в примере 5.

кДНК последовательность, которая кодирует усеченный протеин N-гена, родственный приведенному в таблице 7A, представлена в последовательности ID N 5. Эта кДНК в длину имеет 3830 bp и кодирует протеин из 652 аминокислот (см. последовательность ID N 6).

Геномная ДНК последовательность, содержащая полной длины N-ген, представлена в последовательности ID N 1. Геномная ДНК имеет длину 7400 bp, и анализ нуклеотидной последовательности выявил пять экзонов, которые вместе соответствуют кодирующей последовательности в последовательности ID N 3. Последовательность кодируемого N-протеина представлена в последовательностях ID N 2 и ID N 4.

Анализ последовательности N-протеина и сравнение с последовательностями других протеинов выявил значительное сходство последовательностей с некоторыми протеинами, вовлеченными в сигнальную трансдукцию (см. также таблицу 7A и пример 5). Протеин N-гена содержит три функциональных домена: сигнальный домен, ATP/GTP связующий сайт (Р-петля), и богатый лейцином участок. Такие домены присутствуют в протеинах, которые играют роль в сигнальной трансдукции.

Богатый лейцином участок (LRR) N состоит из 13 повторов и в большинстве повторов содержится последовательность LXXLXXLXL (или аналогичная последовательность). В дополнение к лейциновым остаткам доминирующей отличительной особенностью LRR является наличие пролина. Определено, что в среднем длина LRR составляет приблизительно 25 аминокислот. Предположительно первой аминокислотой в каждом повторе является пролин. Таблица 7C демонстрирует первичную структуру богатых лейцином повторов N-гена (аминокислоты/аа/590-928) и сравнение их консенсусной последовательности с консенсусными последовательностями LRR аденилатциклазы дрожжей, Drosophila Toll, Iba-цепью мембранного гликопротеина тромбоцита человека, Htrk, Drosophila Chaoptin, Arabidopsis рецептороподобной трансмембранной киназой (ТМК1) и TMKLI.

Предполагают, что LRR являются посредниками протеин-протеин взаимодействий для широкого круга протеинов. Важность LRR в функциях некоторых протеинов была определена за счет мутагенеза или выделения мутаций за счет мутантного фенотипа. В дрожжевой аденилатциклазе такие мутации, как делеции двух аминокислот в 1 или 26 LRR, исключают способность быть активированными за счет Ras (Suzuki et al., (1990) Proceedings of the National Academy of Science USA 87:8711-87-15). Аминокислотное замещение А156-У в одном из LRR альфа субъединицы 1b гликопротеина тромбоцита человека приводит к кровотечению (Ware et al., (1993) J.Clin. Invest 92:1213-1220).

Считают, что LRR играет очень важную роль в управлении специфическими протеин-протеин взаимодействиями. Без желания связываться с какой-либо конкретной теорией можно считать, что LRR из N может взаимодействовать с компонентом TMV. Так как небольшие изменения в структуре LRR приводят к разительным изменениям функции протеина, можно предположить, что LRR является медиатором специфического взаимодействия между TMV и N-протеином. Кроме того, небольшие изменения в аминокислотных последовательностях могут также привести к новым особенностям, которые, с эволюционной точки зрения, были бы благоприятны для растений, так как развивали бы новую устойчивость к каждому из изменений популяций патогенов. Другой возможной ролью LRR является взаимодействие со специфической эффекторной молекулой, такой как киназа или фосфатаза, после распознавания TMV.

Предсказанная аминокислотная последовательность N содержит фрагмент Р-петли (таблица 7A). Последовательность GMGGVG КТ (аа 216-223 последовательности ID N 4) удовлетворяет консенсусной последовательности Р-петли (A/G)XXXXGK(S/T), найденной в различных АТР- или GTP-связывающих протеинах (таблица 7A). Семейства протеинов, содержащие Р-петлю, включают аденилаткиназы, ras семейство протеинов, факторы удлинения, b-субъединицу АТР синтазы, тимидинкиназы и фосфоглицераткиназы (Saraste, (1990) Trends in Biochemical Sciences 15:430-434). Р-петля N, по- видимому, не участвует в GTP связывании, так как отсутствуют консенсусные последовательности DXXG и NXKD, необходимые для GTP связывания помимо Р-петли (Dever et.al. (1987) Proceedinq of the National Academy of Science USA 84:1814-1818).

Помимо P-петли два других "сегмента", по- видимому, должны быть включены в АТР связывание в аденилаткиназе и F1-ATP-азе (Fry et al (1986) Proceedinq of the National Academy of Sciences USA 83:907-911). Исследование N-последовательности предполагает, что эти сегменты присутствуют, причем в нужном расположении (подчеркнутые аминокислотные остатки в таблице 7A). Сегмент 2 содержит дипептид (I, A, L, V) (V, I) и N содержит последовательность A1 в положении 228 и 229 соответственно. У 80 - 100 аминокислот из P-петли сегмент 3 определен как глицин (G), за которым следует участок из 5 гидрофобных аминокислот и аспартат (D). N содержит последовательность VLIVLDD у аминокислот 296-302. Исходя из последовательности аминокислот, можно предсказать, в каких условиях АТР связан или гидролизован.

Аминотерминальные аминокислоты (8-150) N-протеина аналогичны цитоплазмическим (сигнальным) доменам протеина Drosophila Toll и рецептору интерлейкина-1 человека (IL-1R). Это соответствие представлено в таблице 7B. Окантованные аминокислоты указывают участки, где последовательности идентичны или где наблюдаются консервативные замещения. N последовательность содержит некоторые консервативные аминокислоты, которые необходимы для трансмиссии сигнала с цитоплазмы на ядре в Toll и IL 1-R регуляторных схемах (Schneider et al (1991) Genes and Development 5:797-807; Hequy et al (1992) J. of Bioloqical Chemistry 267:2605-2609).

Сходство последовательностей между аминотерминальным участком N-протеина и цитоплазмическим доменом Drosophila Toll и IL-1R человека ведет к предположению, что после TMV инфицирования N может возбуждать аналогичного типа каскад внутриклеточной трансдукции сигнала (фиг.5). Взаимодействие различных агентов подобных вирусам, цитокинам (IL-1, TNF) и митогенам (пробол-12-миристат-13-ацетат, РМА), лектинам и ионофорам кальция, с рецептором интерлейкина-1 (IL-1R) или восприятие неизвестного сигнала внеклеточным доменом Toll приводит к активации и транслокации Rel-связанных транскрипционных факторов NFкВ и dorsal, соответственно, из цитоплазмы в ядро. У млекопитающих иммунные, воспалительные и острофазные реакции, комплекс NF-кВ фактора активной транскрипции индуцирует или подавляет синтез различных защитных и сигнальных протеинов после связывания с декамерным фрагментом последовательности, который называют кВ-связывающим фрагментом (обзор в Baeuerle, (1991) Biochimica et Biophysica Acta 1072:63- 80). Эти индуцированные протеины инициируют общий клеточный защитный механизм за счет подачи сигнала о наличии патогенов другим клеткам (Baeuerle and Baltimore, (1988) Science 242:540-546 and Baeuerle, 1991 (ранее). Тогда как у зародыша Drosophila более высокая концентрация дорсального протеина в ядрах регулирует транскрипцию зиготных генов, вовлеченных в детерминацию дорсовентральной полярности эмбриона (обзор в Johnston and Nusslein-Vohard Cell, 68:201-219 (1992)). Точечные мутации в сигнальном (цитоплазмическом) домене природных рецессивных аллелей Toll (Schneiden et al. (1991) см. ранее) и сайт- направленные точечные мутации в сигнальном домене IL 1-R (Hequy (1992) ранее приводят к нарушению транслокации, либо dorsal, либо Nf-кВ, соответственно к ядрам.

Недавно было сообщение о другом rel-содержащем гене, названном Dif (иммунитет, связанный с dorsal), вовлеченном в Drosophila иммунную реакцию (Ip et al. Cell 75:753-763 (1993)). Аналогично NFKB и dorsal, Dif-протеин обычно присутствует в цитоплазме жирного тела личинок; после поражения или инфицирования он транслоцируется в ядра и специфически связывается с кВ-подобными фрагментами в промоторном участке различных антимикробных генов (Sun et al. , European Journal of Biochemistry 196:247-254 (1991); Enqstomet at al. Journal of Molecular Biology 232:327-333 (1993); и Kappler et al., EMBO J. 12:1561-1568 (1993)). Аналогично вышеуказанным иммунным реакциям и реакциям развития, и без желания связываться с какой-либо конкретной теорией, можно предположить, что продукт TMV (элиситор) связывается с LRR или другим участком N-протеина (рецептор) в цитоплазме или через другой неизвестный протеин в конечном счете активирующем rel/кВ транскрипционный факторный комплекс, необходимый для индуцирования связанных с патогеном (PR) генов.

Одно из основных преимуществ настоящего изобретения состоит в том, что оно предлагает способ индуцирования устойчивости к TMV в табаке и родственных растениях, таких как томаты и перец. Это очень важно, так как передаваемая за счет N устойчивость к TMV высоко эффективна и до сих пор не была преодолена обычными штаммами TMV.

Клонированный природный ген устойчивости N предлагает преимущества по сравнению с доступными в настоящее время способами защиты растений от TMV. Два гена, которые широко используются для получения устойчивости к TMV, получены из TMV оболочкового протеина (CP) или полимеразного гена. Недостатками существующей технологии защиты от TMV являются то, что CP-опосредствованная устойчивость может проходить со временем или при более высоких уровнях инокулюма вируса, а полимеразой- опосредствованная устойчивость очень специфична к штамму вируса, из которого получен ген полимеразы. Другим высоким риском, связанным с устойчивостью за счет вирусного гена, является риск или возможность эволюции гиперштаммов вирусов за счет рекомбинации между природными штаммами и трансгенами. Встраивание клонированного гена устойчивости к вирусам растений в коммерческие культиваторы за счет трансформации позволяет избежать вышеуказанных недостатков. N-ген табака придает устойчивость ко всем известным штаммам TMV за исключением одного. Клонированный природный ген устойчивости к растительному вирусу позволяет также проводить фундаментальные исследования механизма распознавания патогена геном устойчивости и передачи сигнала индуцирования защитных реакций так, чтобы идентифицировать критические функциональные домены гена, и облегчить конструирование генов устойчивости с более широким спектром устойчивости. Это первое описание гена устойчивости растений, последовательность протеинов которого предсказывает предполагаемый ATP/GTP фрагмента сайта связывания (P-петля), обогащенный лейцином участок и сигнальный домен.

Клонирование N-гена осуществляют за счет транспозонного мечения кукурузным транспозоном Ac в N.tabacum. Позитивный отбор разрабатывают для выделения Ac индуцированных мутантов, неспособных реагировать на TMV с HR (HR мутанты). Один из 36 HR- мутантов, содержащих Ac, имеет нестабильную мутацию, что коррелирует с присутствием отдельного Ac-транспозона, обозначенного Ac10. Геномные ДНК-последовательности, фланкирующие Ac10, используют для скринирования кДНК и геномных ДНК-библиотек для клонов, содержащих полной длины кДНК и геномные ДНК N-гена. Геномный клон, содержащий N ген, выделяют из геномной библиотеки N.qlutinosa для использования, для трансформации растений, для придания им устойчивости к TMV N-ген клонируют в вектор и используют для трансформации растений, восприимчивых к TMV. Трансформированные растения демонстрируют устойчивость к TMV.

В том смысле, как здесь использовано, молекула нуклеиновой кислоты может быть молекулой ДНК, молекулой РНК или гибридной ДНК-РНК-молекулой. Не встречающаяся в природе молекула нуклеиновой кислоты является молекулой, которая не встречается в природе. Не встречающаяся в природе молекула нуклеиновой кислоты включает, например, ДНК-последовательности в выделенной и очищенной форме; рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую гетерологичный участок, то есть идентифицируемый сегмент ДНК, который ковалентно не связан с N-ген-кодирующей последовательностью в природе; или такая не встречающаяся в природе молекула может быть сконструирована из частей, которые были синтезированы химически; конструкция, в которой сама кодирующая последовательность не встречается в природе, например кДНК, в которой геномная кодирующая последовательность содержит интроны; или синтетическая последовательность содержит интроны; или синтетическая последовательность, содержащая кодоны, отличные от кодонов нативного гена. Части из гетерологичных источников могут быть соединены способами, известными специалистам, например, за счет лигирования ин витро. В другом варианте части могут быть соединены за счет in vivo процесса, например за счет рекомбинации, но такая рекомбинация будет управляться вручную, и желательный результат будет определяться человеком.

Примерами молекул ДНК являются кДНК N-гена Nicotiana qlutinosa, определяемые нуклеотидной последовательностью, представленной в последовательности ID N 3, и нуклеотидной последовательностью, представленной в последовательности ID N 5. Геномная нуклеотидная последовательность, содержащая полной длины N. qlutinosa N-ген, представлена в последовательности ID N 1.

В объем настоящего изобретения включены также молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие N-ген, который содержит нуклеотидную последовательность, которая по крайней мере на 70% гомологична с последовательностью ID N 1 примерно с нуклеотида 1 до нуклеотида 7400, и где протеин N-гена, кодируемый молекулой, обладает функцией медиатора устойчивости к TMV в растении, которое синтезирует этот протеин N-гена. Настоящее изобретение включает также молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие протеин N-гена- кодирующую последовательность, где кодирующая последовательность по крайней мере на 70% гомологична нуклеотидной последовательности ID N 3 от нуклеотида 60 до нуклеотида 3494, где кодируемый N-протеин обладает функцией медиатора TMV устойчивости в растении, которое экспрессирует этот протеин. Гомологичные последовательности, входящие в объем изобретения, можно идентифицировать в экспериментах по Саузернблоттингу, используя условия, в которых гибридизация соответствует по крайней мере 70% гомологичности, в противоположность неспецифическому связыванию (см. пример 2 для обсуждения жестких и мягких условий). Гомологичность определяют как то, что нуклеотиды соответствуют по определенной длине выбранного участка. Условия гибридизации описаны у Sambrook et al. Molecular Cloninq: A Laboratory Manual Cold Sprinq Harbor Laboratory (1989) Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Bioloqy, Current Protocols (1989), которые включены сюда по ссылке.

Для идентификации N-гена из других видов Solanaceous выделяют, как указано, геномную ДНК из растения семейства Solanaceous. Выделенную ДНК разрезают одним или более из рестрикционных энзимов клонированных в или другой подходящий вектор; обрабатывают электрофоретически и получают блоты на такой найлоновой мембране, как Nytran. Эти блоты зондируют описанным здесь зондом. Из этих ДНК получают геномную библиотеку и скринируют ее, используя вышеуказанные зонды для идентификации N-гена. Оценивают активность гена, определяемую за счет экспрессии гена в растения Solanaceous и определяют устойчивость трансформированных растений к TMV, как будет подробно описано далее.

Олигонуклеотиды, полученные из последовательности N-гена, можно использовать в качестве праймеров в полимеразной цепной реакции (PCR). Табак содержит один геномный участок, кодирующий N- протеины. Консервативные участки N-гена можно использовать при конструировании праймеров для опосредствованного выделения функциональных N-гомологичных генов в растениях Solanaceous. Далее, антитела, выработанные против доменов N-протеина, можно использовать для скринирования экспрессионных библиотек других Solanaceous растений.

ДНК кодирующую последовательность протеина N-гена можно также получить синтетически из вырожденных олигонуклеотидов, последовательности которых содержат кодоны для аминокислотной последовательности протеина N-гена. Такие олигонуклеотиды получают стандартными способами и собирают, и используют для выделения целевого N-гена.

Доступность молекул нуклеиновой кислоты табака, кодирующих протеин N-гена, делает доступными последовательности N-гена, кодирующие протеин N-гена, или функциональные гомологи из других Solanaceous растений. Геномные или кДНК-последовательности табака или их части используют в качестве олигонуклеотидных зондов для гибридизации с дополнительными геномными или кДНК последовательностями за счет гибридизации в стандартных условиях. Последовательности, которые специфически гибридизуются с N-ген-кодирующими последовательностями или их комплементами, как указано ранее, и которые кодируют протеин N функционального гомологичного гена, который является медиатором устойчивости к TMV в растении семейства solanaceae, входят в объем изобретения. Такие зонды включают те, которые содержат полный N-ген, и те, которые содержат один или более из следующих доменов: 5'- и 3'-нетранслируемые участки; сигнальный домен (aa 8 до 150); богатый лейцином повторяющийся участок (aa 591-929). Такие олигонуклеотиды получают стандартными способами и собирают известными специалистам способами. Длина используемого зонда должна быть достаточной для гибридизации с гомологичными участками ДНК, в которых гибридизация связана с по крайней мере около 70% гомологичности, в противоположность неспецифическому связыванию. Примеры ДНК-последовательностей, пригодных в качестве олигонуклеотидных зондов, представлены в примере 5 далее.

Специфически представленный протеин N-гена Nicotiana qlutinosa характеризуется с точки зрения его аминокислотной последовательности в последовательности ID N 4, а соответствующая специфически представленная кодирующая последовательность представлена в последовательности ID N 3, с нуклеотида 60 до нуклеотида 3494.

Биологам хорошо известно, что некоторые аминокислотные замещения можно осуществить в последовательностях протеинов, не влияя на функции протеинов. Обычно консервативные аминокислотные замещения или замещения аналогичных аминокислот осуществляются, не затрагивая при этом функций протеина. Аналогичными аминокислотами могут быть те, которые аналогичны по размеру и/или заряду, например аспартат, и глутамат, и изолейцин, и валин являются парами аналогичных аминокислот. Сходство между парами аминокислот было оценено специалистами рядом способов. Так например, Dayhoff et al., (1978) в Atlas of Protein Sequence and Structure Y.5, Supplement 3, Chapter 22, paqe 345-352, что включено сюда по ссылке, предлагает таблицу частот для аминокислотных замещений, которые можно использовать как меру сходства аминокислот. Эта частотная таблица основана на сравнениях аминокислотных последовательностей для протеинов с одинаковыми функциями из многообразия эволюционно различных источников.

Аминокислотная последовательность протеина может быть, а может и не быть идентична аминокислотной последовательности, которая встречается в природе в Solanaceous растениях. Идентичность протеина N-гена может быть подтверждена по его способности придавать устойчивость к TMV в растениях или клетках растений, которые синтезируют протеин N-гена. Такой анализ описывается в примере 1 далее. Короче, последовательность, кодирующую протеин N-гена, трансформируют в растение или в клетку растения, обладающие способностью синтезировать протеин N-гена, из указанной последовательности, например, растение семейства Solanaceae. Трансформированное растение или клетку растения инфицируют TMV. Растение наблюдают на предмет наличия гиперчувствительной реакции. Если наблюдается устойчивость, тогда протеин обладает способностью придавать устойчивость к TMV. Кроме того, искусственно индуцированные мутации можно включать до тех пор, пока они не нарушают активн