Молекула нуклеиновой кислоты (варианты), вектор экспрессии или клонирования, синтетический полипептид, способ получения синтетического полипептида, композиция вакцины для стимулирования иммунной реакции против гельминтных паразитов у человека или животных, способ стимуляции иммунной реакции против гельминтных паразитов у человека или животных, олигосахарид

Молекула нуклеиновой кислоты (варианты), вектор экспрессии или клонирования, синтетический полипептид, способ получения синтетического полипептида, композиция вакцины для стимулирования иммунной реакции против гельминтных паразитов у человека или животных, способ стимуляции иммунной реакции против гельминтных паразитов у человека или животных, олигосахарид

Реферат

 

Изобретение направлено на создание вакцины для стимулирования иммунной реакции против гельминтных паразитов у человека и животных. Вакцина содержит фармацевтически приемлемый носитель, а также носитель нуклеиновой молекулы, которая способна кодировать гельминтные энзимы аминопептидазы. Использование изобретения позволяет получить новые лекарства для борьбы с гельминтами человека и животных. 9 с. и 4 з.п. ф-лы, 21 ил., 4 табл.

Рекомбинантные молекулы ДНК, кодирующие энзимы - аминопептидазы, и их использование для получения вакцин против инфекций, вызываемых гельминтами.

Настоящее изобретение относится к получению защитных антигенов с помощью технологии рекомбинантных ДНК, для использования в качестве антигельминтных агентов и в качестве защитных иммуногенов для борьбы с заболеваниями, вызываемыми гельминтными паразитами.

Такие паразиты, как гельминты, ответственны за широкий круг заболеваний и заражений паразитами (инвазий) домашних животных, которые приводят к потере продуктивности и даже к гибели животных, что имеет существенное экономическое значение. Так, например, кровососущие нематоды Haemonchus инфицируют выстилку желудочно-кишечного тракта жвачных, что вызывает анемию и потери веса, а если не проводить лечения, это часто кончается гибелью животных. Аналогично, животные, инфицированные некровососущими нематодами Ostetagia не дают привеса и без лечения могут погибнуть. Другие рода гельминтов, представляющие экономическую важность, включают Trichostrongylus and Nematodirus, которые вызывают энтериты у различных животных, и трематоды.

Проблемы создают и такие нематоды, как анкилостомы (например, Necator, Ancylostoma, Uncinaria and Bunostomumbugu) и трематоды (например, Fasciola, Paramphistomum and Dicrocoelium) и их родственники, которые помимо жвачных и домашних животных инфицируют людей, и часто с фатальным исходом.

В настоящее время борьба с паразитами-гельминтами основывается, главным образом, на применении антигельминтных препаратов, наряду с обработкой пастбищ. Такие способы имеют ряд недостатков, частое введение лекарств и обработка пастбищ обычно непрактична и приводит к усиливающему распространению устойчивых штаммов гельминтов.

Поэтому существует необходимость в создании эффективных антигельминтных вакцин, и за последние годы в этой области были сконцентрированы усилия ученых. Однако до сих пор не существует коммерчески доступных молекулярных или субъединичных вакцин против основных видов гельминтов, особенно против желудочно-кишечных нематод жвачных, таких как Haemonchus и Ostertagia.

Наиболее обещающие на настоящее время результаты были получены с новыми протеинами, выделенными из Haemonchus, обладающими потенциалом в качестве защитных антигенов не только против Haemonchus, но и также против ряда других гельминтов. В частности, показано, что протеиновый дублет H110D, обнаруженный на люминальной поверхности кишечника H. contortus, обладает защитным иммунитетом против Haemonchus у овец.

H110D из H. contortus имеет приблизительный молекулярный вес 110 килодальтон (кд) в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях, что определено с помощью SDS-PAGE и описано в WO 88/00835 и WO 90/11086. Термин "H110D" в том смысле, как здесь использован, относится к протеиновому дублету Н110D, как определено в WO 88/00835 и WO 90/11086. Как недавно было показано, соответствующие протеины находятся и в других видах гельминтов, например, Nеcator americanus.

В WO 88/00835 был описан ряд способов выделения Н110D, что достаточно для характеристики протеина, и они могут быть масштабированы, чтобы обеспечить получение протеина в экспериментально и коммерчески подходящих количествах. Однако существует необходимость в улучшенных и более удобных источниках, из которых можно получать но только H110D, но также и родственные антигенные протеины, особенно для процессов, основанных на технологии рекомбинантных ДНК и экспрессии протеинов в соответствующим образом трансформированных прокариотических и эукариотических организмах.

Настоящее изобретение посвящено поискам такого усовершенствованного способа. Определение последовательности кДНК для H110D из Haemonchus contortus было осуществлено, и было обнаружено, что предсказанная аминокислотная последовательность демонстрирует гомологию с семейством интегральных мембранных аминопептидаз (систематическое название: -аминоацил-пептид- гидролаза/микросомная).

У млекопитающих интегральные мембранные аминопептидазы расположены в нескольких тканях, например, на краях щетки микроворсинок кишечника и в почках. Их роль в почках неясна, но в кишечнике их функцией является расщепление мелких пептидов, которые представляют собой конечный продукт переваривания (см. Kenny и Maroux, 1982; Kenny и Turner, 1987; Noren et al, 1986; Semenza, 1986).

В одном аспекте настоящего изобретения, таким образом, предложены молекулы нуклеиновых кислот, содержащие одну или более из нуклеотидных последовательностей, которые кодируют гельминтные энзимы-аминопептидазы или их антигенные участки, практически соответствующие всей или части нуклеотидных последовательностей, представленных на фиг. 2, 3, 4 или 5 (последовательности ID N 1-15) или последовательностей, кодирующих гельминтные энзимы-аминопептидазы, которые практически гомологичны любой из указанных последовательностей, или гибридизуются с ними.

Таким образом, нуклеиновая кислота в соответствии с настоящим изобретением может быть однонитевой или двунитевой ДНК, кДНК или РНК.

Вариации нуклеотидных последовательностей, кодирующих аминопептидазы, могут наблюдаться между различными штаммами гельминтов внутри вида, между различными стадиями жизненного цикла гельминтов (например, между личинками и взрослыми особями), между аналогичными штаммами различного географического происхождения, а также внутри одного и того же гельминта. Такие вариации также включены в объем настоящего изобретения.

Термин "практически гомологичны" здесь используют в смысле, который включает последовательности, в которых идентичность последовательностей составляет приблизительно 50% или более, например 60% или более, а также функционально-эквивалентные аллельные варианты и родственные последовательности, модифицированные замещением одного или нескольких оснований, их добавлением и/или делецией. Под "функционально эквивалентными" подразумевают последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды, имеющие аминопептидазные активности, которые аналогично иммунореактивны, т.е. те, которые вызывают выработку защитных антител хозяина против гельминтов.

Молекулы нуклеиновых кислот, которые гибридизуются с последовательностями, представленными на фиг. 2, 3, 4 или 5 (последовательности ID N 1-15), или любые существенно гомологичные или функционально-эквивалентные последовательности, как указано ранее, также включены в объем изобретения. Термин "гибридизация" в том смысле, как здесь использован, определяет связывание последовательностей в нежестких условиях (6 х SSC/50% формамида при комнатной температуре) (SSC - раствор хлорида и цитрата натрия) и промывку в мягких условиях (2 х SSC, комнатная температура, более предпочтительно - 2 х SSC, 42^oC), или в более жестких условиях, например 2 х SSC, 65^oC), где SSC - 0,15 М NaCl, 0,015 М цитрата натрия, pH 7,2).

Способы получения таких производных родственных последовательностей, например, сайт-направленным мутагенезом, статистическим мутагенезом или в результате энзиматического расщепления, и/или лигирования нуклеиновых кислот, хорошо известны специалистам, как и способы определения наличия значительной гомологии между модифицированной таким образом нуклеиновой кислотой и подлинной последовательностью, например, с помощью гибридизации.

Таким образом, получение молекулы нуклеиновой кислоты по способу настоящего изобретения позволяет получать рекомбинантные аминопептидазы, или их иммуногенные фрагменты, в количествах, до сих пор недоступных, и, следовательно, позволяет разрабатывать антигельминтные вакцины.

В другом аспекте настоящего изобретения предложены молекулы нуклеиновых кислот, содержащие одну или более из нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более из полипептидов, способных вызывать выработку защитных антител против гельминтных паразитов, причем эти последовательности включают один или более из участков, кодирующих антигенную детерминанту, как показано на фиг. 2, 3, 4 или 5 (последовательности ID N 1-15).

Настоящее изобретение относится также к синтетическим полипептидам, содержащим одну или более из аминокислотных последовательностей, составляющих энзим-аминопептидазу или его антигенную часть, практически соответствующую всей или части нуклеотидных последовательностей, представленных на фиг.2, 3, 4 или 5 (последовательности ID N 1-15), или их функционально-эквивалентных вариантов, отличных от синтетического полипептида, соответствующего протеиновому дублету Н110D, или синтетического полипептида, соответствующего любой из отдельных полипептидных последовательностей, раскрытых в WO 90/11086.

В другом варианте в настоящем изобретении предложен синтетический полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, составляющую энзим-аминопептидазу или его антигенную часть, практически соответствующую всей или части нуклеотидных последовательностей, представленных на фиг.2, 3, 4 или 5 (последовательности ID N 1-15) или их функционально-эквивалентных вариантов, практически не содержащих других Haemonchus contortus компонентов.

Далее настоящее изобретение относится к композициям вакцин для стимуляции иммунных реакций против гельминтных паразитов у людей или животных, содержащим, по крайней мере, один синтетический полипептид, определенный ранее, наряду с фармацевтически приемлемым носителем.

В WO 90/11086 раскрыт ряд полипептидных или частично полипептидных последовательностей, полученных в результате протеолитического расщепления или химического расщепления протеинового дублета Н110D: (в конце описания).

Неопределенности обозначены либо такой формой, как Phe/Gly, где первый трехбуквенный кодон представляет, по всей вероятности, правильную аминокислоту на основании силы сигнала, или знаком вопроса; знак "-" обозначает неизвестный остаток.

Специфические индивидуальные полипептиды последовательности, которые раскрыты в WO 09/11086, но включены в формулу.

Термин "полипептид", в том смысле, как использован здесь, включает как протеин полной длины, так и более короткие пептидные последовательности.

Термин "функциональный эквивалент" используют в отношении полипептидной аминокислотной последовательности, которая определяет полипептиды, родственные с или полученные из вышеуказанных полипептидных последовательностей, в которых аминокислотная последовательность модифицирована одиночным или множественным замещением, добавлением или делецией аминокислоты, а также последовательностей, в которых аминокислоты модифицированы химически, включая способы гликозилирования или дегликозилирования, но которые, тем не менее, сохраняют защитную (иммуногенную) активность. Такие функционально-эквивалентные варианты могут встречаться как природные биологические вариации, или их можно получить, используя известные методики, например, функционально-эквивалентные рекомбинантные полипептиды можно получить, используя известные методики сайт-направленного мутагенеза, статистического мутагенеза или энзиматическое расщепление и/или лигирование аминокислот.

Обычно синтетический полипептид настоящего изобретения представляет защитные антигенные последовательности.

Термин "защитный антиген" используют для обозначения антигенов, способных вызывать защищающую хозяина (иммуногенную) иммунную реакцию, т.е. реакцию хозяина, которая приводит к выработке иммунных эффекторных молекул, антител или клеток, которые стерилизуют оплодотворяющую способность источника поражения, ингибируют или убивают паразита и тем самым "защищают" хозяина от клинического или субклинического заболевания и снижения продуктивности. Такая защитная иммунная реакция обычно может проявляться в виде выработки антител, которые способны ингибировать метаболические функции паразита, приводя к задержке развития, отсутствию продуцирования яиц и/или к гибели.

Синтетические полипептиды в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения можно получить за счет экспрессии в хозяйской клетке, содержащей рекомбинантную ДНК молекулу, которая содержит нуклеотидную последовательность, подробно описанную ранее, оперативно связанную с последовательностью, контролирующей экспрессию, или вектор клонирования рекомбинантной ДНК, или вектор, содержащий такую рекомбинантную ДНК молекулу. В другом варианте такие полипептиды можно экспрессировать непосредственной инъекцией выделенной молекулы ДНК настоящего изобретения в клетки хозяина.

Экспрессированный таким образом полипептид может быть полипептидом слияния, содержащим участок, представляющий иммуногенность всего или части энзима аминопептидазы, и дополнительный полипептид, кодируемый слитой ДНК. Так, например, может оказаться желательным получить протеин слияния, содержащий синтетическую аминопептидазу или другой полипептид настоящего изобретения, соединенный с таким протеином, как - галактозидаза, фосфатаза, глютатион-S-трансфераза, уреаза, коровий антиген вируса гепатита B (Francis et al. , 1989) и т.п. Большинство протеинов слияния получают за счет экспрессии рекомбинантного гена, в котором две кодирующие последовательности соединены вместо в рамке считывания. В другом варианте полипептиды можно слить in vitro с помощью химических способов. Все такие слияния или производные гибридов аминопептидазу-кодирующих молекул нуклеиновых кислот и их соответствующих аминокислотных последовательностей входят в объем настоящего изобретения. Такие подходящие методики экспрессии рекомбинантных ДНК и полипептидов раскрыты, например, у Sambrook et al., 1989. В другом варианте, синтетические полипептидазы можно получить химическими способами, например, хорошо известным способом твердофазного синтеза Меррифильда.

Другие аспекты изобретения включают использование молекулы нуклеиновой кислоты, или синтетического пептида, или полипептида, как определено ранее, для получения композиции вакцин для стимуляции иммунных реакций у людей или животных, предпочтительно, млекопитающих, против заболеваний, вызываемых гельминтными паразитами.

В другом варианте в настоящем изобретении предложен способ стимуляции иммунной реакции у людей или животных, предпочтительно млекопитающих, против инфекций, вызываемых гельминтными паразитами, включающий введение указанному животному композиции вакцины, включающей одну или более из пептидаз, кодируемых указанной ранее нуклеотидной последовательностью.

Композиции вакцин можно получить по способу настоящего изобретения способами, известными специалистам в изготовлении вакцин. Традиционные вакцинные композиции могут содержать один или более из синтетических полипептидов по способу настоящего изобретения вместе с подходящим одним или более из соответствующих адъювантов, например, гидроксида алюминия, сапонина, Quil A или более очищенных их форм, дипептида мурамила, минеральных масел или Novasomes, в присутствии одного или более из фармацевтически приемлемых носителей или разбавителей. Подходящие носители включают такие жидкие среды, как физиологический раствор, подходящие для использования в качестве носителей для введения пептидов или полипептидов в пациента. Могут быть включены такие дополнительные компоненты, как консерванты.

Альтернативные композиции вакцин могут содержать вирусы или клетки хозяина, например, микроорганизма (например, вирус осповакцины, аденовирус, Salmonella) со встроенной в них молекулой нуклеиновой кислоты (например, молекулой ДНК) по способу настоящего изобретения для стимуляции иммунной реакции, направленной против полипептидов, кодируемых встроенной молекулой нуклеиновой кислоты.

Введение композиции вакцины можно осуществить любым удобным способом, например, орально или парентерально, например, внутривенной инъекцией, необязательно с интервалами, например, в виде двух инъекций с интервалом 7-28 дней.

Как было указано ранее, трансляция аминокислотных последовательностей, изображенных на фиг. 2, 3, 4 или 5, демонстрирует гомологию последовательностей с семейством интегральных мембранных аминопептидазных энзимов. Это было определено при поиске различных баз данных, доступных в пакете анализа последовательностей компьютерной группы генетиков, версия 7.01, ноябрь 1991 (Devereux et al., 1984), используя трансляции последовательностей, представленных на фиг. 2, 3, 4 или 5. Два из таких сопоставлений представлены на фиг.6.

Экспрессию последовательностей, кодирующих аминопептидазу настоящего изобретения, можно, как это было указано ранее, осуществить, используя различные известные методики и системы экспрессии, включая экспрессию в таких прокариотических клетках, как E. coli, и в таких эукариотических клетках, как дрожжи или бакуловирусные системы клеток насекомых, или в трансформированных клетках млекопитающих и в трансгенных животных и растениях. Наиболее выгодно экспрессировать нуклеотидные последовательности, используя трансгенные системы нематод, такие как систему для нематод Caenorhabditis, описанную, например, у Fire (1986); Fire et al. (1989); Spieth et al. (1988); Han et al. (1990).

В следующем аспекте изобретение предлагает способ получения синтетического пептида, описанного ранее, который включает культивирование эукариотических или прокариотических клеток, содержащих молекулу нуклеиновой кислоты, как указано ранее, в условиях, в которых осуществляется экспрессия указанного полипептида, и выделение полученного таким образом указанного полипептида.

В дальнейшем аспекте изобретение включает клонирование векторов экспрессии, содержащих нуклеотидные последовательности изобретения. Такие векторы экспрессии включают такие соответствующие контрольные последовательности, как например, элементы, контролирующие трансляцию (например, кодоны старта и остановки) и транскрипцию (например, промотор-операторные участки, рибосомные связывающие сайты, терминальные стоп-последовательности), связанные в считывающей рамке с молекулами нуклеиновых кислот настоящего изобретения.

Векторы настоящего изобретения могут включать плазмиды и вирусы (включая как бактериофаги, так и вирусы эукариотов), согласно хорошо известным и опубликованным способам, и могут быть экспрессированы в различных экспрессирующих системах, также хорошо известных специалистам. Подходящие вирусные векторы включают, как было указано ранее, бакуловирусы, а также аденовирусы и вирус осповакцины. Специалистам известно множество других вирусных векторов.

Известны и могут быть использованы различные методики введения таких векторов в прокариотические и эукариотические клетки для экспрессии, или в зародышевые или соматические клетки для создания трансгенных животных. Подходящие способы трансформации или трансфекции подробно описаны в литературе.

Следующий аспект настоящего изобретения составляют трансформированные или трансфектированные клетки эукариотических или прокариотических хозяев или трансгенные организмы, содержащие молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретения.

Вообще эукариотические экспрессионные системы, и нематодная система экспрессии в частности, обладают тем преимуществом, что посттрансляционный процессинг и, в частности, гликозилирование, могут осуществляться (в случае трансгенных нематодных систем можно ожидать гликолизирование, соответствующее тому, которое происходит в нативном протеине). Это составляет важный аспект изобретения, так как во многих случаях посттрансляционный процессинг необходим для того, чтобы рекомбинантный протеин экспрессировал оптимум биологической активности.

Системы экспрессии клеток млекопитающих также имеют ряд преимуществ. Клетки млекопитающих обеспечивают хорошее воспроизведение нативной формы и защитных эпитопов антигена, так как эукариотическая экспрессионная система приводит к более подобному гликозилированию образцов, дисульфидным связям и другим посттрансляционным модификациям, нежели E. coli, которая может продуцировать нерастворимый протеин, требующий восстановления трехмерной организации и обладающий плохой репродукцией нативной формы. Кроме того, гликозилирование у млекопитающих, по-видимому, не индуцирует иммунной реакции, которая отличается от защитной антипротеиновой реакции. Для защиты людей и домашних животных, таким образом, предпочтительно использовать фибробласты или миеломные клеточные линии человека или животных, такие, как HeLa - клеточная линия человека; BHK - клетки почек детеныша хомяка; FR 3T3 - крысиные фибробласты Фишера; VERO - клеточная линия почек обезьяны; NIH3T3 - клеточная линия фибробластов мышей; клеточная линия опухоли молочной железы мышей - C127I; CV-I - фибробласты почек африканской зеленой обезьяны; 3T6 - фибробласты эмбриона мыши; L клетки - мышиная клеточная линия; CHO - клеточная линия яичников китайского хомяка; NSO NS1, SP2 и другие мышиные миеломные клеточные линии, и клеточные линии миелом у крыс, такие как YB2/0 и Y3.

Специалистам хорошо известны векторы, соответствующие различным классам клеточных линий млекопитающих. Обычно они содержат промотор и/или энхансер, операбельно связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей антиген или его фрагмент. Подходящие промоторы включают ранний или поздний промоторы SV40, например, PSVL вектор, промотор цитомегаловируса (CMV), промотор металлотионеина I мыши и длинный терминальный повтор вируса опухоли молочной железы мыши. Этот вектор, предпочтительно, включает подходящий маркер, такой как ген дигидрофолатредуктазы или глутамин-синтетазы. Векторы этих типов описаны в WO 86/05807, WO 87/04462, WO 89/01036 и WO 89/10404.

Трансфекцию клеток хозяев можно осуществить, используя стандартные методики, например, используя фосфат кальция, ДЕАЕ декстран, полибрен, протопластное слияние, липосомы, прямую микроинъекцию, генную бомбардировку или электропорацию. Последняя методика предпочтительна и способы трансфекции клеточных линий млекопитающих с использованием электропорации раскрыты Andreason et al., 1980. Вообще, линейную ДНК вводить легче, нежели циркулярную ДНК.

В случае протеина H110D, было обнаружено, что он имеет уникальную и необычную схему гликозилирования, которая, по-видимому, вносит вклад в иммуноактивность, так как многие моноклональные антитела до сих пор полученные против Н110D из Haemonchus распознают углеводные эпитопы, которые могут оказаться важными при разработке нужных вакцин.

В частности, был продемонстрирован следующий набор гликозилирования для Н110D из Haemonchus: i) около 65% олигосахаридов N-связаны, остальные O-связаны; ii) основная часть (около 48%) N-связанных олигосахаридов принадлежит к сложному классу; iii) практически все (более 95%) олигосахариды не имеют заряда; iv) относительное молярное содержание составляющих моносахаридов таково: N-ацетилгалактозамин 1,0, фукоза 3,6, галактоза 4,1, глюкоза 4,4, манноза 6,2 и N-ацетилглюкозамин 5,2; v) олигосахариды, отличающиеся от основного олигосахарида (обозначаемого олигосахарид D), практически устойчивы к деградации в широком интервале экзо-гликозидаз (например, - D-маннозидазы, - D-маннозидазы, - D-глюкозидазы, - D-галактозидазы, - D-галактозидазы, - L-фукозидазы, - D-ксилозидазы, - D-N-ацетилглюкозаминидазы).

Такие олигосахариды и гликопротеины, содержащие их, составляют следующий аспект настоящего изобретения.

Олигосахарид D из Haemonchus H110D гликопротеина относится к N-связанному типу и имеет новую структуру, состоящую из двух фукозных остатков, соединенных через - 1,3 связь и - 1,2 связь с ядром маннозы (N-ацетилглюкозамин).

Таким образом, в другом аспекте настоящего изобретения предложен олигосахарид формулы и более конкретно формулу особенно, если связан с протеином, например, таким рекомбинантным протеином, как протеин гельминтной аминопептидазы или ее антигенный фрагмент, или если используют для создания антиидиопатических антигенов для иммунизации, особенно очень молодых животных.

Гликопротеины животных обычно содержат - 1,6-фукозную связь, и поэтому - 1,3-фукозная связь олигосахарида настоящего изобретения представляется необычной характеристикой.

Далее настоящее изобретение будет более подробно описано для Н110D из Haemonchus contortus. Однако, в результате использования таких методик, как гистохимия и ДНК гибридизация, Н110D эквиваленты наблюдались и в других видах паразитов. Считают, что Н110D протеин представляет собой мультигенный комплекс, и, кроме того, нуклеотидная кодирующая его последовательность может демонстрировать вариации между различными штаммами и различными жизненными циклами развития гельминтов. Более того, существует множество энзимных форм (изоэнзимы), которые могут по-разному экспрессироваться на различных стадиях или в различных штаммах.

В настоящем исследовании ДНК последовательности и, следовательно, предсказанные аминокислотные последовательности были определены из кДНК клонов и PCR продуктов, полученных из мРНК, соответствующих H110D гену, за счет технологии рекомбинантных ДНК из различных источников, и для различных стадий развития паразитов H. contortus жизненного цикла.

Секвенирование кДНК и PCR продуктов позволило нам идентифицировать три близко родственные H110D последовательности, которые обозначены H11-1 (последовательность ID N 19), H11-2 (последовательность ID N 20) и H11-3 (последовательность ID N 21). H11-1 содержит три непрерывные и перекрывающиеся последовательности, кДНК клон Aust B1 (последовательность ID N 6), PCR продукт А-648 (последовательность ID N 9) и с 3' конца PCR продукт 014-178 (последовательность ID N 12); H11-2 содержит PCR продукты А-650 и 2,5 кb (последовательность ID N 10 и 7 соответственно); H11-3 содержит PCR продукты 3,5 кb и А-649 (последовательности ID N 8 и 11 соответственно). Специфическое взаимоотношение между клонами индивидуальной секвенированной кДНК и PCR продуктов и H11-1, H11-2 и H11-3 суммированы на фиг.1 и детально изображены на фиг.3, 4 и 5.

Наблюдаемые различия и вариации в последовательностях, полученных из кДНК клонов и PCR продуктов, которые видны, в частности, на фиг. 2, 3, 4 и 5 (состоящих из последовательностей ID NN 1-15 и 19-21) представлены в таблице 1.

Наблюдаемые различия можно приписать различным мДНК (мультигенного семейства). Кроме того, вариации могут быть связаны, по крайней мере, частично, с различными вариантами H110D-кодирующей последовательности или мРНК, присутствующей на различных стадиях жизненного цикла или в штаммах различного географического происхождения.

В таблице 2 дополнительно представлены уровни идентичности и сходства для соответствующих предсказанных аминокислотных последовательностей и двух опубликованных последовательностей аминопептидаз млекопитающих.

Фиг.1 демонстрирует карту секвенированных клонов кДНК и PCR продуктов H. contortus H110D и их соотношения и относительные положения с Н110D мРНК.

Фиг. 2 представляет H110D нуклеотидные последовательности, обозначенные H11-3 (последовательность ID N 21, полученная из клонированных PCR продуктов последовательностей ID N 8 и 11 и кДНК клона M1AUS, последовательности ID N 5), H11-2 (последовательность ID N 20, полученная из клонированных PCR продуктов последовательностей ID N 7 и 10) и H11-1 (последовательность ID N 19, полученная из клонированных PCR продуктов последовательностей ID N 9 и 12 и кДНК клона Aust B1, последовательности ID N 6).

Фиг.3 представляет последовательность H11-3 (последовательность ID N 21) (представлена на фиг. 2) с параллельно расположенными кДНК клонами M1 и M1AUS (последовательности ID N 1 и 5).

На фиг. 4 представлена последовательность H11-2 (последовательность ID N 20, представлена на фиг.2) и выравненный кДНК клон B2 (последовательность ID N 4).

На фиг.5 представлена последовательность, обозначенная H11-1 (последовательность ID N 19) и выравненный кДНК B1A и Aust B1 (последовательности ID N 2 и 6 соответственно).

На фиг. 6 представлены: а) предсказанные аминокислотные последовательности (последовательности ID N 22, 23 и 24), полученные из ДНК последовательностей H11-1, H11-2 и H11-3, представленных на фиг.2; bi) и ii) представляют предсказанную аминокислотную последовательность H11-3 в сравнении с опубликованной аминокислотной последовательностью микросомной аминопептидазы крыс М (Watt et al., 1989) и микросомной аминопептидазы мышей A (Wu et al., 1990) соответственно; идентичные части заключены в прямоугольники, пунктиром обозначены участки, введенные для максимизации уровня гомологичности сравниваемых последовательностей. Использован обычный однобуквенный код для аминокислот. Горизонтальная линия над последовательностью указывает положение трансмембранного участка, а звездочки указывают положение цинк-связывающего фрагмента. Уровни сходства указаны в таблицах 1 и 2.

На фиг. 7 представлены выравнивание аминокислотных последовательностей (обозначенных Pep A, Pep В, Pep C, Pep D и Pep Е), полученных из C NBr и Lys-C фрагментов H110D, как было ранее описано (международная патентная заявка WO 90/11086 и как перечислено ранее, полипептидных последовательностей (a), (b), (e) (k) и (aa) соответственно) и трех новых последовательностей (последовательности ID N 16, 17 и 18), полученных из H110D после переваривания эластазой или термолизином с трансляциями a) H11-1, b) H11-2 и с) H11-3.

В следующем аспекте изобретения предложены молекулы нуклеиновых кислот, содержащие одну или более из нуклеотидных последовательностей, которые практически соответствуют или которые практически комплементарны одной или более из последовательностей, выбранных из клонов M1, B1A, B1A-3', B2, M1AUS, Aust B1, 014-015 (2,5PCR), 014-872 (3,5PCR клон 2), A-648 (5' конец B1), A-650 (5'конец 2,5PCR), A-649 (5' конец 3,5PCR), 014-178 (3' конец Aust B1 клона 2), 014-178 (3' конец Aust B1 клонов 3 и 6), 014-872 (3,5PCR клона 10) и 014-872 (3,5PCR клона 19), H11-1, H11-2 и H11-3, последовательности ID N 1-15 и 19-21 соответственно, как представлено на фиг.2, 3, 4 и 5 или последовательности, которые практически гомологичны с любой из этих последовательностей или гибридизуются с ними.

Как указано ранее было, сравнение последовательностей различных указанных ранее клонов с компьютерными базами данных известных последовательностей выявляет существенную гомологию с семейством микросомных аминопептидазных энзимов (EC.3.4.11. -). Исследования энзиматической активности и ингибирующей способности, осуществленные для Н110D протеина и его субфракций, подтверждают, что протеин на самом дело является микросомной аминопептидазой ( -аминоацил-пептид-гидролазой (микросомной)). Эти исследования показали далее, что проявляются как аминопептидаза A-подобные, так и аминопептидаза N-подобные активности, и что каждый из компонентов Н110D дублета отдельно демонстрирует энзиматическую активность.

Исследования протеолитического расщепления Н110D также проводились. Используя энзим-эластазу, удалось обнаружить, что Н110D может быть расщеплен частично, образуя при этом две фракции, детергент-растворимую фракцию (которая остается с мембраной) и водорастворимую фракцию (которая обозначается Н11S). Н11S существует в виде протеинового димера, который можно разделить на два компонента. Интересно, что было обнаружено, что только подобная аминопептидазе М активность связана с водорастворимой Н11S фракцией, тогда как аминопептидаза A-подобная активность связана только с детергент-растворимой фракцией.

В следующих далее примерах приводится описание исследований, которые привели к определению последовательностей, представленных на фиг.1-7, со ссылкой на следующие дополнительные фигуры.

На фиг. 8 представлены результаты Вестернблоттинга интегральных мембранных протеинов, присутствующих в детергентном экстракте Haemonchus contortus взрослых особeй, зондированных аффинно-очищенными антителами, элюированными из потенциальных H110D клонов; а) антигены в детергентном экстракте Haemonchus, распознаваемые антисывороткой к экстракту; b) антитела, элюированные из полоски так, как показано в a), тестированные снова против блота детергентного экстракта, подтверждают успех стадии элюирования; с) антитела, что и в b), которые связываются с клоном M1 экспрессированного протеина, четко распознают участок 110 кb (и относительно узкую полосу около 205 кb; d) связывания антител не происходит, если для абсорбции сыворотки используют не рекомбинанты; На фиг. 9 представлен Нозернблоттинг мРНК выделенных из 11-, 15- и 23-дневных Haemonchus contortus зондированных a) кДНК клоном M1 (последовательность ID N 1); b) кДНК клоном M1 AUS (последовательность ID N 5); c) кДНК клоном B1A (последовательность ID N 2 и 3); d) кДНК клоном Aust B1 (последовательность ID N 6); е) клонированным PCR продуктом 014-872 (3,5-2, последовательность ID N 8); и f) клонированным PCR продуктом 014-015 (последовательность ID N 7). Номера 11, 15 и 23 указывают возраст Haemonchus из которых были получены мРНК.

На фиг.10 представлен Саузернблоттинг Haemonchus contortus геномной ДНК, зондированной кДНК клонами M1AUS (последовательность ID N 5), В1А (последовательность ID N 2 и 3) и Aust B1 (последовательность ID N 6) и PCR продуктами 014-872 (3,5-2, последовательность ID N 8) и 014-015 (последовательность ID N 7); а) блоты промывают в условиях умеренной жесткости, b) блоты промывают в существенно жестких условиях; для каждого зонда дорожка 1 содержала Hind III -гидролизат ДНК в качество маркера, или оставлена без маркера, дорожки 2 и 3 содержали EcoR1 и Hind III гидролизаты, соответственно, геномной ДНК Haemonochus.

На фиг. 11 представлены Вестернблотты рекомбинантных GST-М1 и GST-B1A протеинов слияния, зондированных аффинно-очищенными антителами к электрофоретически очищенным Н110D (Н110DЕ).

На фиг.12 представлен Вестернблоттинг Con A Н110D антигена, зондированного антисывороткой к Con A H110D и к рекомбинантным GST-M1 и GST-B1A протеинам слияния.

На фиг. 13 представлены а) результаты анализа Н110D протеина и аминопептидазных активностей во фракциях, полученных с помощью ионообменной хроматографии Con A Н110D на Mono Q колонке; b) SDS-PAGE фракций, представлен на фиг.13a).

На фиг. 14 представлены а) pH значения, при которых были получены фракции в эксперименте с изоэлектрическим фокусированием в свободном потоке; b) SDS-PAGE в восстанавливающих условиях фракций из 14a), где нижняя полоса H110D дублета обнаружена во фракции 6, а верхняя полоса во фракции 16, с варьируемыми количествами каждой из них в перекрывающихся фракциях; c) Вестернблоттинг фракций представлен в 14b) зондированных i) моноклональными антителами, обозначенными TS 3/19.7, и ii) аффинно-очищенными поликлональными анти-MI антителами; контрольные антитела но дают детектируемой реакции.

На фиг. 15 представлены а) pH значения, при которых получают фракции в другом эксперименте изоэлектрического фокусировавания в свободном потоке; b) SDS-PAGE в восстанавливающих условиях для фракций от 15a), использованного в энзиматическом анализе, где нижняя полоса H110D дублета найдена во фракциях 4-6, а верхняя полоса - во фракциях 16-18, с варьируемыми количествами каждой полосы в перекрывающихся фракциях; с) микросомные аминопептидазные специфические активности фракций, представленных в 15 b).

На фиг. 16 представлена защита овец с помощью вакцинации отдельно верхней (U), нижней (L), рекомбинантной (U + L) и промежуточной дублетной (D) полосами из H110D; а) количество откладываемых паразитами яиц, выраженное как количество яиц на г фекалий, b) погибших червей относительно контроля.

На фиг. 17 представлена защита овец в результате вакцинации водорастворимым фрагментом (H11S), полученным из H110D в результате переваривания эластазой и H11А, остаточным детергент- растворимым H110D; а) количество яиц паразитов, выраженное в единицах яиц на г фекалий, b) погибших червой по отношению к контрольным значениям (C).

На фиг. 18 представлены примеры соотношения между ингибированием Ai), Bi) аминопептидаза M-подобной и Aii), Bii) аминопептидаз