Синтетический пептид, синтетический липопептид, иммуногенный конъюгат (варианты), способ получения олигомера, защищенный твердым монометиловым эфиром полиэтиленгликоля полисахарид

Синтетический пептид, синтетический липопептид, иммуногенный конъюгат (варианты), способ получения олигомера, защищенный твердым монометиловым эфиром полиэтиленгликоля полисахарид

Реферат

 

Синтетический пептид имеет аминокислотную последовательность, относящуюся по крайней мере к одной антигенной детерминанте по крайней мере одного белка, обычно структурного, в особенности, Р1, Р2 и Р6-белкам Halmophilus influenzae (Нi), в частности типа В. Его используют в виде химерной липофильной Т-В формы, привязанной к молекуле носителя, например синтетической РRР-молекуле и/или полимеризованного и образующего молекулярные агрегаты, как вакцина против Нi. 6 с. и 29 з.п.ф-лы, 12 табл., 17 ил.

Изобретение относится к синтетическим вакцинам против инфекции Haemophilus influenzae (Hi). В частности, изобретение относится к использованию потенциальных T-хелперных детерминант (THDs), и B-клеточных эпитопов (BE) белков внешней мембраны Hi (OMP) P1, P2 и P6, ковалентно связанных с синтетическим олигосахаридом, содержащим повторяющиеся фрагменты полирибозилрибитол-фосфата (sPRP), образуя таким образом иммуногенные синтетические PRP-пептидные конъюгатные вакцины, которые вызывают в млекопитающих образование анти-PRP и анти-OMP антител с высоким титром.

Haemoph ilus influenzae типа в (Hib)-основная причина бактериального менингита у детей в возрасте до пяти лет [1,2]. Ссылки указаны в конце описания. От фагоцитоза бактерии защищены полисахаридной капсулой, которая представляет собой полимер полирибозилрибитол-фосфата (PRP). Антитела, продуцируемые на капсульный полисахарид этого организма, обладают защитным свойством [3] . Были получены эффективные конъюгатные вакцины, в которых PRP связан с различными белками-носителями, такими как дифтерийный токсин (PRP-D), тетанусный токсин (PRP-T), CRM197 (HbOC) Neisseria meningidis и белок внешней мембраны Neisseria meningidis [4,5]. Однако эти конъюгатные вакцины не являются защитой от других распространенных инкапсулированных H.influenzae - типа a- и c-штаммов и, что более важно, от не имеющих капсулы неклассифицированных разновидностей H. influenzae, которые являются причиной воспаления среднего уха, против которого нет вакцины. Следовательно, необходимо включение отобранных неинкапсулированных H.influenzae-иммуногенов в существующие Hib - вакцины, чтобы разработать универсальную Hi вакцину.

Granoff и Munson [6] показали, что антитела против внешних мембранных белков (OMP) Hib PI, P2 и P6 обладают защитным свойством при модельном заражении новорожденных крыс бактериемией. Значит многообещающей стратегией для получения универсальной вакцины с усиленной защитной способностью против H. influenzae было бы использование в качестве дополнительных иммуногенов и носителей для PRP либо очищенных OMP, либо их защитных эпитопов. Кодирующий ген Р1 был клонирован из различных подтипов Hib [7,8]. Сравнительный анализ последовательностей Pi-белков из этих Hib показал существование трех гипервариабельных участков. В действительности Pi-специфичные MA, о которых сообщал Hansen, узнают только 50% тестированных Hib [7,9] изолятов. Что касается Р2-белка, хотя нуклеотидные последовательности P2 гена, выделенного из двух различных подтипов Hib (1Н и 3L), оказались идентичны [10,11], найдена некоторая вариабельность аминокислот в Р2-последовательностях двух других подтипов (2L и 6U) [II]. Напротив, анализ антигенных детерминант, генных последовательностей и длин рестрикционных фрагментов показал, что P6 белок высоко консервативен из штаммов Hib [12].

Недавние исследования показали, что мышиные Pl-специфичные моноклональные антитела (MAB 7C8) и кроличьи антитела на очищенный PI белок из определенной и из неопределенной разновидностей H.influenzae имели защитный эффект в животных моделях [9, 13, 14]. Murphy и Bartos [15] также показали, что моноклональные антитела, узнающие экспонированную на клеточной поверхности неопределенного H.influenzae, имеют бактерицидную активность in Vitro. Для анти-Р1 и анти P2 моноклональных антител было найдено, что они перекрестно реагируют с определяемыми и неопределяемыми H.influenzae [16-18]. В действительности все еще существуют серьезные сомнения относительно использования всех нативных ОМР Hib как эффективной универсальной вакцины против обеих ветвей H. influenzae. Во-первых, у детей, выздоравливающих от отита, вызванного неопределяемыми Hi, вырабатываются бактерицидные антитела к различным антигенам, таким как Р2 и липополисахариды. Во-вторых, Р1- и Р2-кросс-реагирующие эпитопы, описанные выше, еще не идентифицированы. В-третьих, сообщалось, что [12] эпитоп(ы), которые узнаются анти-Р6 бактерицидными антителами, экспрессируются в малых количествах на клеточной поверхности и возможно таким образом возобновление инфекции. В-четвертых, недостаточно известно пока о роли клеточного иммунного ответа на ОМР. Иммунодоминантные Т-хелперные клеточные эпитопы ОМР Hi пока не охарактеризованы. Значит необходима идентификация функциональных T-хелперных клеточных эпитопов и сохраняющихся экспонированных на поверхности и/или защитных B-клеточных эпитопов Р1, Р2 и Р6-белков, чтобы определить, могут ли они вызывать иммунный ответ против Hi инфекции.

Методы индукции иммунности к болезням постоянно улучшаются и в настоящее время основное направление - использовать в качестве антигена меньший и хорошо очищенный материал. Цель - устранить возможные побочные эффекты определенных природных иммуногенов, сохраняя их иммунногенность и способность к защите от болезней. Последние исследования показали, что иммунизация экспериментальных животных синтетическими пептидами, представляющими собой определенные участки вирусных и бактериальных белков, могут вызывать иммунный ответ на родительские белки и нейтрализовать их функции [19-22]. Так что синтетические пептиды являются потенциальными антигенами для производства недорогих и надежных вакцин против инфекционных возбудителей. Недавний прогресс в фундаментальной иммунологии свидетельствует о том, что хорошие и эффективные иммуногены должны содержать две различные функциональные антигенные детерминанты (эпитопы). Один эпитоп (Т-клеточный) служит для того, чтобы представлять комплекс соответствующего МНС II класса антигена иммунной системе и вызывать активизацию Т-хелперных клеток. Другой эпитоп (В-клеточный) должен узнаваться В-клеточным антигенным рецептором, чтобы вызывать продукцию антител [23-26]. Таким образом, чтобы получить сильнодействующую и эффективную синтетическую вакцину, в синтетическую конструкцию должны включаться оба функциональных эпитопа: Т-хелперный и В-клеточный.

Синтетические PRP-димер, тример и тетрамер были синтезированы, очищены и конъюгированы с белками-носителями для изучения иммуногенности в животных. Эти исследования показали, что конъюгаты из -тримеров PRP-белка в присутствии сильных добавок таких, как полный адъювант Фрейнда (CFA), могут вызвать в экспериментальных животных отклик анти-PRP антител.

Вместо использования условных гетерологичных белковых носителей наша стратегия использует синтетические пептиды, которые содержат иммунодоминантные эпитопы из ОМР Hi как дополнительные антигены и в качестве носителей PRP, чтобы разработать первое поколение полностью синтетических PRP-пептидных конъюгатных вакцин с усиленной защитной способностью и аутологичным Т- клеточным примированием. Подобные вакцины имеют и другие возможные преимущества перед существующими вакцинами, в которых PRP связан с чужеродным белком (дифтерийным токсином (PRP-D), тетанусным токсином (PRP-T) или CRM₁₉₇ (Hb OC или OMP Neisseria meningidis). Во-первых, использование синтетических Hi должно сократить количество D или Т в любой будущей мультивалентной комбинированной вакцине, уменьшая таким образом риск гипериммунизации против этих белков-носителей. Во-вторых, PRP может быть привязан к сохранившемуся защитному эпитопу для получения вакцины против Hi-заболевания и отита.

Сокращения и определения: CRM₁₉₇ - нетоксичный белок антигенно кросс-реагирующий с дифтерийным токсином Hi - Н.influenzae Hib - Н.influenzae типа В MAP - множественный антигенный пептид MBS - малеимидобензоил-N-гидроксилсукцинимид OMP - белок внешней мембраны PEG - полиэтиленгликоль монометиловый эфир PRP - полирибозирибитол фосфат Один из аспектов настоящего изобретения направлен на обеспечение иммунногенных синтетических конъюгантных вакцин, включающих синтетические PRP-олигомеры и антигенные детерминанты белков внешней мембраны Hi.

Настоящее изобретение, с другой стороны, направлено на обеспечение вакцин на основе конъюгатов синтетических PRP с пептидами, включающих олигомеры синтетических PRP определенной длины.

Следующий аспект настоящего изобретения состоит в обеспечении химического процесса, в котором эффективно ведется производство синтетических PRP с химически реакционными функциональными группами, позволяющими сайт-направленно конъюгировать с антигенными детерминантами наружной мембраны Hi с использованием полиэтиленгликольмонометилового эфира (PEG) в качестве твердого носителя.

Следующий аспект настоящего изобретения состоит и в обеспечении метода, который может быть использован для улучшения иммуногенности конъюгатов синтетических PRP с пептидами путем выбора правильной ориентации сахарной части по отношению к Т-клеточному эпитопу.

Дополнительным аспектом настоящего изобретения является обеспечение такого химического процесса, который может усилить иммуногенность углеводов, используя множественные антигенные пептидные системы (MAP), содержащие антигенные детерминанты Hib как носители, чтобы увеличить плотность углеводной части в конъюгатах с синтетическими PRP.

Настоящее изобретение в дополнительном аспекте состоит в обеспечении универсальной вакцины против Hi, которая включает иммуногенные конъюгаты PRP с пептидами и обладающие кроссзащитными свойствами Hi антигены.

Следующий аспект настоящего изобретения состоит в получении нового поколения поливалентных вакцин, в составе которых иммуногенные конъюгаты PRP с пептидами и Hi антигенами, комбинированными с другими вакцинами, такими, как DTP -polio, Neisseria meningidis типа A, B, C, abd W и S. pneumoniae серотипа 6B, 14, I9F и 23F.

Настоящее изобретение в следующем аспекте направлено на получение конъюгатов синтетического PRP с пептидами, которые могут быть использованы в диагностических иммунотестах для определения присутствия анти- Hib антител, например, анти-PRP и анти-ОМР антител.

И следующий аспект этого изобретения состоит в получении смеси PRP-специфичных и ОМР-специфичных антител как компонента в наборе для диагностического иммуноанализа для определения присутствия в биологических образцах определяемых и неопределяемых штаммов Hi.

Краткая сущность изобретения.

Настоящее изобретение относится к обеспечению иммуногенов и возможных вакцин на основе пептидов, содержащих аминокислотные последовательности разнообразных антигенных детерминант (Т-хелперных и В-клеточных эпитопов) белков внешней мембраны (Р1, Р2 и Р6)Hib. Открыты синтетические вакцины, включающие один или больше таких пептидов, которые могут быть введены как свободные пептиды или ковалентно связанные с синтетическими PRP-олигомерами в качестве синтетических гликоконъюгатных вакцин и/или привязанные к липидной части с целью увеличения их иммуногенности.

В одном из аспектов настоящего внедрения обеспечивается синтетический пептид с аминокислотной последовательностью, соответствующей по крайней мере одной антигенной детерминанте по крайней мере одного белка H.influenzae, предпочтительно белка внешней мембраны H.unfluenzae b.

С одной стороны, настоящее изобретение включает значительно очищенную форму пептида, содержащего по крайней мере одну аминокислотную последовательность, относящуюся к сохранившейся антигенной детерминанте PI белка Hi, пептид которого может вызывать образование поликлональных антител, которые узнают Hi in vitro в млекопитающих. Эти PI-специфичные поликлональные антитела могут быть использованы в качестве компонентов тест-наборов для определения Hi в биологических образцах. Пептиды могут содержать, например, аминокислотные последовательности из следующих аминокислот: с 1 по 29, 39-64, 103-137, 165-193, 189- 218, 226-253, 248-283, 307-331, 400-437 и 179-218 зрелого PI- белка Hib MinnA-штамма в соответствии, как показано в табл. 1 (SEQ ID NOS : 1, 12, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 13 или 14 и 15 соответственно) или же любая часть или комбинация из них сохраняющая иммуногенность.

С другой стороны, настоящее изобретение включает существенно очищенную форму пептида, содержащего по крайней мере одну аминокислотную последовательность, относящуюся к консервативной последовательности P2-белка, пептид которой способен вызывать у млекопитающих образование поликлональных антител, которые узнают Hi in vitro. Эти P2-специфичные поликлональные антитела могут быть использованы в качестве компонентов тест-наборов для определения Hi в биологических образцах. Пептиды могут содержать, например, аминокислотные последовательности из следующих аминокислот: с 1 по 14, 125-150, 241-265, 263-289, 285-306, 302-319, 314-341 зрелого P2-белка Hib MinnA-штамма, как показано соответственно в табл. 2 (SEQ ID NOS : 16, 23, 28, 29, 30, 31 и 32 соответственно) или же любая часть, или их вариация их, сохраняющая иммуногенность.

Другим воплощением настоящего изобретения является наличие существенно очищенной формы пептида, содержащего по крайней мере одну аминокислотную последовательность, относящуюся к консервативной последовательности P6-белка, пептид которой способен вызывать у млекопитающих образование поликлональных антител, которые узнают Hi vitro. Эти P6-специфичные поликлональные антитела могли бы быть использованы в качестве компонентов тест-наборов для определения H в любых биологических образцах. Пептиды могут содержать, например, аминокислотные последовательности из следующих аминокислот: с 1 по 22, 19-41, 35- 58, 54-77, 73-96, 90-114, и 109-134 зрелого P6-белка Hib MinnA штамма, как показано соответственно в табл. 3 (SEQ ID NOS : 35-41 соответственно) или же любая часть, или комбинация из этого, обладающая иммуногенностью.

Другим воплощением настоящего изобретения является наличие по крайней мере одного PI-пептида, который содержит по крайней мере одну аминокислотную последовательность, относящуюся к иммунодоминантному линейному В-клеточному эпитопу PI-белка. Эти эпитопы можно использовать в качестве антигенов-мишеней в диагностических наборах для определения анти-Hi антител, к примеру, защитных антител. Пептиды могут содержать, например, аминокислотные последовательности из следующих аминокислот: с 39 по 64, 103-137, 165-193, 248-283, 307-331, 400- 437 и 179-218 зрелого PI-белка Hib MinnA- штамма, как показано в табл. 1 (SEQ ID NOS : 12, 3, 4, 7, 9, 13 или 14 и 15, соответственно) или же любая часть, или комбинация их, обладающая иммуногенностью.

Другое воплощение настоящего изобретения включает наличие по крайней мере одного P2-пептида, который содержит по крайней мере одну аминокислотную последовательность, относящуюся к иммунодоминантному линейному B-клеточному эпитопу Р2-белка. Эти эпитопы можно использовать в качестве антигенов-мишеней в диагностических наборах для определения анти-Hi антител, к примеру, защитных антител. Пептиды могут содержать, например, аминокислотные последовательности из следующих аминокислот: с 53 по 81, 148-174, 241-265 и 314-342 зрелого P2-белка Hib MinnA-штамма, как показано в табл. 2 (SEQ ID NOS) : 20, 24, 28 и 32 соответственно) или же любая часть, или комбинация их, обладающая иммуногенностью.

Другим аспектом настоящего изобретения является наличие по крайней мере одного P6-пептида, который содержит по крайней мере одну аминокислотную последовательность, относящуюся к иммунодоминантному линейному B-клеточному эпитопу P6-белка. Эти эпитопы можно использовать в качестве исследуемых антигенов в диагностических наборах для определения анти-Hi антител, к примеру, защитных антител. Пептиды могут содержать, например, аминокислотные последовательности из следующих аминокислот: с 73 по 96, 90-114 и 109-134 зрелого P6-белка Hib MinnA-штамма, как показано в табл. 3 (SEQ ID NOS: 39, 40 и 41 соответственно) или же любая их часть, или комбинация, обладающая иммуногенностью.

Другим аспектом настоящего изобретения является наличие пептидов, которые можно определить как иммунодоминантные Т- клеточные эпитопы PI. Эти пептиды могут быть использованы в качестве аутологичных носителей для PRP, или как носители для аутологичных и гетерологичных B-клеточных эпитопов. Пептиды могут содержать, например, аминокислотные последовательности из следующих аминокислот: с 39 по 64, 226-253, 339-370 и 400-437 и 179-218 зрелого PI-белка Hib MinnA-штамма в соответствии, как показано в табл. 1 (SEQ ID NOS : 12, 6, 10 и 13 или 14 соответственно) или же любая часть, или комбинация их, обладающая иммуногенностью.

Другим свойством настоящего изобретения является наличие пептидов, которые можно определить как иммунодоминантные Т-клеточные эпитопы Р2. Эти пептиды могут быть использованы в качестве аутологичных носителей для PRP, или как носители для аутологичных и гетерологичных В-клеточных эпитопов. Пептиды могут содержать, например, аминокислотные последовательности из следующих аминокислот: с 125 по 150, 193-219, 219-244 и 241-265, зрелого Р2-белка Hib MinnA-штамма, как показано в табл. 2 (SEQ ID NOS : 26, 27 и 28 соответственно) или же любая часть, или их комбинация, обладающая иммуногенностью.

Другим свойством настоящего изобретения является наличие пептидов, которые можно определить как иммунодоминантные Т-клеточные эпитопы Р6. Эти пептиды могут быть использованы в качестве аутологичных носителей для PRP, или как носители для аутологичных и гетерологичных B-клеточных эпитопов. Пептиды могут содержать, например, аминокислотные последовательности из следующих аминокислот: с 19 по 41, 35-58, 73-96 и 109-134, зрелого P6-белка Hib MinnA-штамма в соответствии, как показано в табл. 2 (SEQ ID NOS: 36, 37, 39 и 41, соответственно) или же любая часть, или их комбинация, сохраняющая иммуногенность.

Следующий аспект, следовательно, это то, что настоящее изобретение предлагает иммуногенный конъюгат, включающий синтетический пептид, который имеет аминокислотную последовательность, относящуюся по крайней мере к одному T-клеточному эпитопу по крайней мере одного белка Haemophilus influenzae, привязанного по крайней мере к одному B-клеточному эпитопу.

Другой чертой изобретения является то, что здесь обеспечивается высокоэффективный химический синтетический способ получения синтетических PRP-олигомеров. Этот процесс является комбинацией твердофазного синтеза с использованием полиэтиленгликольмонометилового эфира (PEG) в качестве твердой подложки. Твердофазная подложка содержит большое количество химически активных функциональных групп, в диапазоне от приблизительно 200 до 500 мкмоль/г носителя в сравнении с от 30 до 35 мкмоль реакционных групп на 1 г традиционных подложек, таких как стекло с контролируемым размером пор. Только стехиометрические количества синтетического PRP повторяющегося звена в каждом цикле связывания в сравнении с 5-10-кратным молярным избытком в обычном твердофазном синтезе. Кроме того, настоящий новый способ является быстрым и эффективным в коммерческих целях, в противоположность твердофазному синтезу, который представляет собой трудоемкий, дорогостоящий и занимающий время процесс.

Продукт этого аспекта изобретения включает химически реактивный синтетический PRP олигосахарид, представленный следующей формулой: где n - целое число, предпочтительно от 3 до 20, и R - связующий фрагмент, определяемый -CH₂-((CH₂)-m -X, где m - целое число, предпочтительно от 3 до 5, а X - химически реактивная функциональная группа, такая как -CH₂NH₂, -CH₂ SH₂ или аминоактивная группа, такая как галоген, метаносульфонил, трифторметаносульфонил, или толуол-сульфонил и т.п. или фотоактивируемая группировка, такая как фенилазид, нитрофенил, бензилфенил и т.п. Реактивная функциональная группа позволяет синтетическому PRP связываться с другими молекулами.

Следующей чертой изобретения является то, что предложен иммуногенный конъюгат, куда входит синтетический углеводный антиген, связанный с по крайней мере одним синтетическим Т-клеточным эпитопом. Углеводный антиген может быть получен из бактериального материала, в частности синтетический рибозорибитолфосфат (PRP) олигомер.

Следующим воплощением настоящее изобретение обеспечивает иммуногенный конъюгат синтетического PRP и пептида, который способен вызывать образование анти-PRP антител с высоким титром у млекопитающих. Вакцина на основе конъюгата синтетического PRP с носителем имеет в составе вещество следующей формулы где n и m определены выше и R' - синтетический пептид, который содержит по крайней мере один Т-хелперный эпитоп, включающий последовательность GPKEPFRDYVDRFYK (SEQ ID NO 50) из HIV-I gag-белка P2 или Т-клеточный эпитоп из Hi OMP. Носитель может быть пептидом, который содержит Т-хелперный и В-клеточный эпитопы.

Следующим аспектом является то, что настоящее изобретение включает иммуногеный синтетический гликоконъюгат синтетического PRP-олигомера определенной длины и Hib PI-пептида, содержащего Т- и/или Т-В эпитопы. Размер синтетического PRP-олигомера составляет по крайней мере три повторяющихся звена PRP, но предпочтительным является повтор из шести звеньев. Пептиды могут содержать, например, аминокислотные последовательности из следующих аминокислот: с 39 по 64, 165-193, 189-218, 226-253, 339-370, 4OO-437, PI-белка Hib MinnA-штамма, как показано в табл. 1 (SEQ ID NOS : 12, 4, 5, 6, 10, 13 или 14 соответственно) или же любая часть, или их вариант, сохраняющий иммуногенность.

Один из аспектов настоящего изобретения состоит в том, что оно включает в себя иммуногенный синтетический гликоконъюгат синтетического PRP-олигомера определенной длины и P2-пептида, содержащего T- и/или T-B эпитопы. Размер синтетического PRP- олигомера составляет по крайней мере три повторяющихся звена PRP, но предпочтительным является повтор из шести звеньев. Пептиды могут содержать, например, аминокислотные последовательности из следующих аминокислот: с 125 по 150, 193-219, 219-244 и 241-265 зрелого P2-белка Hib MinnA-штамма, как показано в табл. 2 (SEQ ID NOS : 23, 26, 27 и 28 соответственно) или же любая часть, или вариант из них, проявляющий иммуногенность.

Один из аспектов настоящего изобретения состоит в том, что оно включает в себя иммуногенный синтетический гликоконъюгат синтетического PRP-олигомера определенной длины и P6-пептида, несущего T- и/или T-B-эпитопы. Размер синтетического PRP-олигомера составляет по крайней мере три повторяющихся звена PRP, но предпочтительным является повтор из шести звеньев. Пептиды могут содержать, например, аминокислотные последовательности из следующих аминокислот: с 19 по 41, 35-58, 73-96 и 109-134 зрелого P6-белка Hib MinnA-штамма в соответствии, как показано в табл. 3 (SEQ ID NOS : 36, 37, 39 и 41 соответственно) или же любая часть, или вариант из них, проявляющий иммуногенность.

Другое воплощение настоящего изобретения состоит в том, что предлагает концепцию того, что иммуногенность углеводного антигена, например, синтетического PRP может усиливаться при использовании множественной антигенной пептидной системы (MAP), в составе которой содержатся функциональные T-хелперные эпитопы как носитель для увеличения углеводной плотности внутри синтетического гликопептидного конъюгата. MAP могут содержать, например, (фиг. 1) последовательность DIVAKIAYGRTNYKYNESDEHKQQLNG (SEQ ID NO : 26), которая относится к аминокислотам 193-219 P2-белка Hib MinnA-штамма или их любой фрагмент.

В другом аспекте настоящее внедрение включает конъюгат синтетического PRP-и липопептида (или смесь синтетических PRP и липопептидов), который способен вызывать клеточный и гуморальный иммуногенный отклик против Hi у млекопитающих. Липопептиды могут иметь, например, последовательность Трипальметил CSSYAKAQVERNAGLIADSVKDNQITSALSTQC (SEQ ID NO: 43), которая относится к аминокислотам 165-193 PI-белка Hib MinnA-штамма или его любого фрагмента.

Следующая черта изобретения состоит в том, что оно включает иммуногенные химерные пептидные вакцины, которые состоят из идентифицированных T-B-эпитопов Р1, Р2 или Р6 Hib, и могут быть использованы для иммунизации против Hi-инфекции. Пептиды содержат, например, последовательности I (см в конце текста) или любую часть, или вариант, являющийся иммуногенным. Пептиды изобретения могут также иметь последовательность, соответствующую фрагментам, аналогичным изомерам штаммов Hi, отличных от MinnA.

Предложенные здесь новые синтетические пептиды и конъюгаты могут сформировать вакцину против заболевания, индуцированного патогеном, в частности, Н. influenzae, включающую по крайней мере один синтетический пептид и/или по меньшей мере один синтетический конъюгат, как описывается здесь, и физиологический носитель. Вакцину можно использовать для иммунизации хозяйского организма против патогенного заболевания путем введения ему эффективного количества вакцины. Далее вакцина может включать по крайней мере еще одну иммуногенную и/или иммуностимулирующую молекулу. B изобретении также предлагается метод иммунизации хозяйского организма против Hi-инфекции путем введения эффективного количества вакцины.

Пептиды, описанные в изобретении, могут быть далее модифицированы липидами подобно липопептидам или пришиты к синтетическим PRP (и/или полимеризованы) как синтетические липогликопептидные конъюгаты для производства модифицированных вакцин. Вакцины могут использоваться для иммунизации против инфекции путем введения млекопитающим, например, внутримышечно или перорально, или когда доставляются на слизистую с использованием микрочастиц, капсул, липосом и молекул, имеющих мишень, таких, как токсины и антитела.

Настоящее изобретение включает далее жизнеспособный вектор для доставки антигена, содержащий ген, кодирующий аминокислотную последовательность любого из синтетических пептидов, представленных здесь. Природный вектор может быть вирусного происхождения, например, поксовирусным, аденовирусным, полиовирусным или ретровирусным вектором. Также может быть бактериальным вектором, допустим, из сальмонеллы и микобактерий. Природный вектор может быть включен в вакцину, куда входит также и физиологически приемлемый носитель.

Как отмечено ранее, синтетические пептиды, предлагаемые здесь, могут быть использованы как диагностические реагенты в методах, определения заражения Haemophilus influenzae.

Антитела, которые вырабатываются против любого синтетического пептида и конъюгатов, описываемых здесь, включены в изобретение.

На фиг. 1 показаны аминокислотные последовательности пептидных носителей, использованных в исследовании конъюгатов синтетических PRP и пептидов, о которых здесь говорится. Как следует из фиг. 1, синтетические пептиды, обозначенные там, имеют следующие SED ID NOS : Пептид - SEQ ID NOS: HIBP-4 - 51 CHIBPI-4 - 52 COMP2-8 - 53 MAP (COMP2-8) - 54 CPC-6 - 55 PZ4EC - 56 На фиг. 2 представлена предсказанная по общепринятому алгоритму структурного анализа структура OMP P1.

Профиль гидрофобности предсказан Hopp [30]. Значения получены из средних для гептапептидных фрагментов и обозначены в центре каждого сегмента.

На фиг. 3 и 4 показаны соответственно предсказанные структуры Р2 и Р6 OMP, полученные по традиционному алгоритму структурного анализа. Верхняя часть, структурный анализ вторичной структуры по локальным средним потенциалам альфа-спирали и бета-слоев по Chou и Fasman [29]. Нижняя часть - профили гидрофобности, предсказанные Hopp и Woods (30). Значения получены из средних для гептапептидных фрагментов и обозначены в центре каждого сегмента.

На фиг. 5 представлено диаграммное воспроизведение иммунодоминантных B- и T-клеточных эпитопов Hib OMP P1; на фиг. 6 - диаграммное воспроизведение иммунодоминантных B- и T-клеточных эпитопов Hib OMP P2; на фиг. 7 - диаграммное воспроизведение иммунодоминантных B- и T-клеточных эпитопов Hi OMP Р6; на фиг. 8 показана активность P6-пептидов в отношении анти-P6 антител морской свинки, крысы и кролика в ELISA; на фиг. 9 показана активность P1-пептидов в отношении сывороток от трех выздоравливающих человек в ELISA; на фиг. 10 - активность Р2-пептидов в отношении сывороток от трех выздоравливающих человек в ELISA; на фиг. 11 представлен пролиферативный ответ у Р1-специфичной мышиной T-клеточной линии на P1-пептиды с иммунодоминантными T-клеточными эпитопами, выделенными звездочкой; на фиг. 12 представлен пролиферативный ответ в Р2-спе- нифичной мышиной T-клеточной линии на Р2-пептиды с иммунодоминантными T-клеточными эпитопами, выделенными звездочкой; на фиг. 13 представлена последовательная схема синтеза PRP с использованием PEG как твердой фазы; на фиг. 14 представлена последовательная схема синтеза PRP-интермедиатов (Br, бензил; Ac, ацетил; ETS, этилтио; AIIye, аллил; Me, метил; DMT, 4,4'-деметоксилтритил; NCE, цианоэтил; MMT, 4-метокситритил; на фиг. 15 показан иммунный ответ кролика на конъюгат синтетических PRP-димера и тримера с тетанусным токсином; на фиг. 16 - иммунный ответ кролика на различные типы конъюгатов PRP с носителями; на фиг. 17 - иммунный ответ кролика на различные типы конъюгатов синтетических пентамеров и гексамеров с HibP1-4 и MAP OMP.

Детальное описание изобретения.

Настоящее изобретение относится к идентификации иммуногенных эпитопов OMP Hib, новых конъюгатов синтетических PRP с пептидами и приготовленных таким образом вакцин. Эти новые иммуногенные агенты подготавливаются путем химического синтеза пептидов, имеющих общие антигенные детерминанты с OMP Hib P1, P2 и P6. Пептиды или липопептиды используются либо независимо, либо привязанными к синтетическим PRP-олигомерам в качестве вакцин. Также они могут быть полимеризованы для производства других вакцин. Такие вакцины могут использоваться для иммунизации против в Hi -инфекции, если их вводить млекопитающим, например, внутримышечно или парентерально или доставлять к слизистой оболочке, используя микрочастицы, капсулы, липосомы и молекулы имеющие мишень, такие как токсины и антитела.

Первоочередные черты изобретения, которые наряду с последующими примерами служат для объяснения принципов внедрения. Для ясности изложения, но не для ограничения изобретение разделено на следующие пункты: (i) предсказание эпитопов и пептидный синтез; (ii) идентификация и характеристика иммунодоминантных B-клеточных эпитопов OMP Hib P1, P2 и P6 с использованием синтетических пептидов; (iii) идентификация и характеристика иммунодоминантных T-клеточных эпитопов OMP Hib Р1, Р2 и Р6 с использованием синтетических пептидов; (iv) иммуногенность OMP пептидов Hib; (v) твердофазный углеводный синтез PRP-олигомеров с использованием PEG как подложки; (vi) конъюгация синтетических PRP-олигомеров с пептидами и иммунохимическая характеристика гликоконъюгатов; (vii) использование Hi конъюгатных PRP-пептидных вакцин.

Предсказание эпитопов и пептидный синтез.

Чтобы картировать иммунодоминантные T-клеточные или B-клеточные эпитопы Hi OMP, 13, 17 и 7, перекрывающиеся пептиды, охватывающие большую часть последовательностей Р1, Р2 и Р6-белков (табл. 1, 263), соответственно были синтезированы с использованием t-Вос твердофазного пептидного синтеза, как подробно описано в примере 12. Длина пептидов была выбрана на основании высокого показателя гидрофильных бета-слоев, оцененного из предсказательного анализа вторичной структуры согласно принятым алгоритмам (29-31) (фиг. 2, 3 и 4). Вероятно эти пептиды Van экспонированы на поверхности и являются антигенными. Пептиды длиной более 25 остатков были выбраны, чтобы маскировать нативные эпитопы как предлагалось в работе Regenmortel [32]. Иногда в целях сайт-специфической конъюгации к цепи добавлялся дополнительный цистеиновый остаток либо к N-концу, либо к C-концу пептида.

Идентификация и характеризация иммунодоминантных эпитопов OMP Hi Р1, Р2 и Р6 с использованием синтетических пептидов.

Чтобы идентифицировать иммунодоминантные B-клеточные эпитопы OMP Hib кроликов, морских свинок и мышей различных гаплотипов (H-2, H-2, H-2, H-2, H-2, H-2), иммунизировали очищенным Р1, Р2 или P6-белком в присутствии адъюванта Фрейнда. После первичной и вторичной иммунизации у всех животных развивался сильный и специфичный ответ анти-OMP антителами как было проверено в Р1-, Р2- и Р6-спепифичном ELISA (табл. 4, 5, 6) и иммуноблотном анализе. Как ранее показано Granoff Munson [6] , кроличьи Анти- PI, анти-Р2 и анти-P6 антитела постоянно защищают новорожденных крыс от заражения неубитыми Hib. Анти-Р2 антитела морской свинки также обладали защитными свойствами в этой модели.

Чтобы картировать линейные B-клеточные эпитопы OMP Hib, перекрывающиеся пептиды, охватывающие большую часть последовательностей Р1, Р2 и Р6, были нанесены на планку ELISA и протестированы с различными анти-P1, анти-Р2 и анти-Р6 антисыворотками, как описано в примере 17. На фиг. 5, 6, 7 суммированы результаты. Было найдено, что иммунодоминантные линейные B-клеточные эпитопы Р1 локализованы среди пептидных последовательностей, относящихся к аминокислотным остаткам 39-64, 103-137, 165-193, 248-283, 307-331, 400-437 и 179-218 зрелого P1-белка Hib MA-штамма (см. табл. 1). Иммунодоминантные линейные B-клеточные эпитопы Р2 локализованы среди пептидных последовательностей, относящихся к аминокислотным остаткам 53-81, 148-174, 241-265 и 314-342 зрелого Р2-белка Hib MA штамма (см. табл. 2). Аналогично, P6-пептиды, содержащие иммунодоминантные линейные B-клеточные эпитопы есть аминокислотные остатки 73-96, 90-114 и 109-134 зрелого Р6-белка Hib MA-штамма (см. табл. 3). Интересно, что сыворотки трех выздоравливающих человек стабильно реагировали с Р1 и Р2 иммунодоминантными эпитопами, описанными выше (фиг. 9 и 10). Кроме того, штамм-специфичные протективные в отношении Р1 B-клеточные эпитопы были картированы в районе, относящемся к 165-193 остаткам P1-белка. Эти результаты свидетельствуют, что B-клеточные эпитопы, описываемые выше, могут использоваться как антигены-мишени в диагностических наборах для определения анти-Hi антител в биологических жидкостях.

Идентификация и характеристика иммунодоминантных T-клеточных эпитопов OMP Hib Р1, Р2 и Р6 с использованием синтетических пептидов.

Специфичные к OMP Hib T-клеточные эпитопы были определены с использованием Р1, Р2 и Р6 пептидов и T-клеточных линий из панели с различных мышей, иммунизированных нативными OMP. Лимфоцитные пролиферативные ответы OMP-специфичных Т-клеточных линий на перекрывающиеся Р1-пептиды (13 пептидов), Р2-пептиды (17 пептидов), и Р6- пептиды (7 пептидов) были определены в обычном анализе пролиферации, как описывается в примере 19. Результаты (фиг. 11 и 12 и табл. 7) показали, что определенные синтетические пептиды только вызывают пролиферативный ответ и узнавание E-клеточных эпитопов, рестриктированных MHC. Синтетические пептиды, которые относятся к остаткам 33-64, 226-253, 339-370 и 400-437 Р1; остаткам 125-150, 193-219, 219-244 и 241-264 Р2; остаткам 19-41, 35-58, 73-96 и 109-134 Р6, при представлении в составе соответствующего мышиного MHC, являются, как показано, высокостимуляторными для всех соответствующих OMP-специфичных мышиных T-клеточных линий. Следовательно, эти иммунодоминантные T-клеточные эпитопы могут быть использованы как аутологичные носители для PRP и/или OMP B- клеточных и T-клеточных эпитопов для увеличения их иммуногенности.

Иммуногенность OMP пептидов Hib.

Чтобы определить, могут ли синтетические OMP-пептиды служить возможными вакцинами, на иммуногенность оценивались раздельно свободные пептиды и KLH-конъюгаты. Кроличьи антипептидные сыворотки были тестированы на реактивность в отношении иммунизирующих пептидов и их родительских белков в ELISA и иммуноблотном анализе. Как показано в табл. 8, все анти-PI пептид-сыворотки, кроме тех, которые получены в ответ на HIBPI-8 или конъюгат HIBPI-8-KIH, специфичны по отношению к соответствующим иммунизирующим пептидам в ELISA. Индукция высокого титра пептидспецифичных lgG-антител свободными пентидами свидетельствует в пользу того, что пептид включает и функциональную T-хелперную детерминанту и B-клеточный эпитоп(в). В дополнение, анти-HIBPI-4, анти-HIBPI-5, анти-HIBPI-7, анти-HIBPI-9, анти-HIBPI-10, анти-NIBPI-11, анти-HIBPI-14-антитела узнавали Р1, во всех использованных методах, которые указывают на антигенность этих районов, и свободны при взаимодействии с антителами. Поскольку для этих пептидов показано, что они содержат потенциальные T-хелперные детерминанты и пептид-KLH-конъюгаты индуцируют сильный lgG ответ у кроликов, очевидно, что они могут действовать как антигены в приготовлении вакцин.

Представляло интерес определить, будут ли P1 Hib -специфичные антитела кроссреагировать с нативным Р1 из неопределяемого штамма Н.influenzae. Кроличьи антитела, образующиеся на синтетические пептиды HIBPI-1, HIBPI-3, HIBPI-5, HIBPI-6, HIBPI-7, HIBPI-9, HIBPI-12, HIBPI-13, узнают Р1-белок из дефинированных и недефинированных культур Н. influenzae. Эти результаты предполагают, что пептиды, относящиеся к аминокислотным остаткам 39-64, 103-137, 165-193, 248-283, 307-331, 400-437 и 179-218 зрелого Pi-белка, содержат высококонсервативные среди дефенированных и недефинированных культур Н. influenzae эпитопы.

Антитела кролика, выр