Очищенная и изолированная молекула нуклеиновой кислоты, рекомбинантная плазмида, рекомбинантный вектор, очищенный и изолированный белок, очищенный и изолированный белок d 15 наружной мембраны или его часть, синтетический пептид, химерная молекула, иммуногенная композиция и антисыворотка или антитело

Очищенная и изолированная молекула нуклеиновой кислоты, рекомбинантная плазмида, рекомбинантный вектор, очищенный и изолированный белок, очищенный и изолированный белок d 15 наружной мембраны или его часть, синтетический пептид, химерная молекула, иммуногенная композиция и антисыворотка или антитело

Реферат

 

Изобретение характеризует очищенную и изолированную молекулу нуклеиновой кислоты, способную кодировать белок D 15 наружной мембраны Haemophilus. Молекула может быть встроена в рекомбинантную плазмиду или рекомбинантный вектор. Охарактеризован также белок, кодируемый нуклеиновой кислотой. Использование изобретения позволяет получить вакцины для лечения и диагностики заболеваний, вызванных Haemophilus. 9 с. и 14 з.п.ф-лы, 17 ил., 10 табл.

Данное изобретение относится к области молекулярной генетики и, в частности, касается клонирования белка D15 наружной мембраны HAEMOPHILUS.

Haemophilus influenzae ТИПА b(Hib) является главной причиной бактериального менингита у детей в возрасте до пяти лет. Защитные антитела против заболевания индуцируются капсульным полисахаридом микроорганизма, и была разработана вакцина, в которой используется очищенный полирибозилрибитолфосфат (ПРФ) в качестве антигена. Эта вакцина обеспечивает 90% защиту у взрослых и у детей в возрасте старше 24 месяцев, но неэффективна у детей в возрасте до 24 месяцев, Zangwill at al. 1993 (Ссылки даны в списке ссылок в конце этого описания). Подобно другим полисахаридным антигенам, PRP не индуцирует пролиферации Т-хелперных клеток, и повторная иммунизация не способна вызвать ни вторичный иммунный ответ, ни увеличения клеток памяти. Соединение PRP полисахарида с белками-носителями придает вакцине свойства Т-клеточной зависимости и значительно усиливает имиунологический ответ на PRP антиген. В настоящее время существует четыре доступные вакцины на основе конъюгатов PRP-носитель. Существуют вакцины на основе капсульного полисахарида. Н. influenzae типа b, соединенного с дифтерийным токсоидом, столбнячным токсоидом или протеином наружной мембраны Neisseria meningitidis (обзор по ним представлен у Zangwill at al. 1993).

Однако, используемые в настоящее время конъюгатные вакцины против Haemophilus защищают только от менингита, вызываемого Haemophilus influenzsae типа b. Они не защищают от других инвазивных типируемых штаммов (типов a и c) и, что более важно, от нетипируемых штаммов (HTHi), которые являются обычными возбудителями при постнатальном и неонатальном сепсисе, пневмонии и воспалении среднего уха. Только в Соединенных Штатах стоимость лечения воспаления среднего уха составляет от 1 до 2 миллиардов долларов в год на антибиотики и хирургические вмешательства, такие как тонзилэктомии, аденоидэктомии и введение тимпаностомических трубок. Для достижения общей защиты от заболеваний, связанных с H.influenzsae, в возрастной группе от 2 до 6 месяцев и в некоторых группах риска желательно обеспечение сохранных, перекрестно-реактивных некапсульных иммуногенов H.influenzsae, методы индуцирования иммунитета против заболевания постоянно совершенствуются, и в настоящее время существует стремление использовать в качестве антигенов субъединицы и более четко определенные материалы. Это предпринимается с целью сведения к минимуму или устранения возможных побочных эффектов, вызываемых некоторыми природными иммуногенами, при сохранении их иммуногенности для обеспечения защиты от болезни. Поэтому было бы очень заманчиво разработать универсальную вакцину против Haemophilus, используя перекрестно-реактивные белки наружной мембраны, фрагмент, аналоги и/или соответствующие им пептиды в качестве защитных антигенов. Такие антигены могут включаться в обычные конъюгатные вакцины против H.influenzae типа b в качестве дополнительных иммуногенов или использоваться в качестве аутологичных носителей для капсульных полисахаридов H. influenzae. Белок наружной мембраны D15 с высоким молекулярным весом, обнаруженный у нетипируемых штаммов и штаммов типа b H.influenzae, был идентифицирован как перекрестно-реактивный антиген (Thomas et. al. 1990). В естественном состоянии D15 по-видимому расположен на поверхности и имеет молекулярную массу, равную примерно 80 кра, судя по анализу с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE). Было бы желательно получить последовательность в молекуле ДНК, которая кодирует этот белок наружной мембраны D15 и пептиды, соответствующие его частям, для диагностики, иммунизации и создания диагностических и иммунологических реагентов. Заболевания, вызываемые Haemophilus, являются тяжелыми, и необходимы усовершенствованные методы предупреждения, обнаружения и лечения заболеваний, таких как воспаление среднего уха, эпиглоттит, пневмония и трахеобронхит.

Краткое изложение изобретения Данное изобретение направлено на получение очищенных и изолированных молекул нуклеиновой кислоты, содержащих по крайней мере часть, кодирующую белок наружной мембраны D15 видов Haemophilus. Молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие по крайней мере часть, кодирующую белок наружной мембраны D15, пригодны для специфического определения штаммов Haemophilus и для диагностики инфекции, вызванной Haemophilus. Очищенные и изолированные молекулы нуклеиновой кислоты, такой как ДНК, содержащие по крайней мере часть, кодирующую белок наружной мембраны D15, также применимы для экспрессии гена D15 посредством рекомбинантной ДНК для получения экономным путем очищенного и изолированного белка наружной мембраны D15.

Белок наружной мембраны D15 или его фрагменты или аналоги пригодны в качестве иммуногенных композиций для получения вакцин против заболеваний, вызываемых Haemophilus для диагностики инфекции, вызванной Haemophilus и в качестве средств для получения иммунологических реагентов. Моно- или поликлональные антисыворотки (антитела), индуцированные белком наружной мембраны D15, полученные в соответствии с особенностями данного изобретения, применимы для диагностики инфекции, вызнанной Haemophilus, специфического определения Haemophilus (при, например, исследованиях in vitro и in vivo) для лечения заболеваний, вызываемых инфицированием.

Пептиды, соответствующие частям белка наружной мембраны D15, или их аналоги применимы в иммуногенных композициях для получения вакцин против заболеваний, вызванных Haemophilus, диагностики инфекции, вызванной Haemophilus, и в качестве средств для получения иммунологических реагентов. Моно- и поликлональные антисыворотки, выработанные к этим пептидам, полученные в соответствии с особенностями данного изобретения, применимы для диагностики инфекции, вызванной Haemophilus, специфического определения Haemophilus (при, например, исследованиях in vitro и in vivo) и для применения при пассивной иммунизации для лечения заболевания, вызванного инфицированием Haemophilus. В соответствии с одним из аспектов этого изобретения, таким образом, создана очищенная и изолированная молекула нуклеиновой кислоты, молекула, содержащая по крайней мере часть, кодирующую белок наружной мембраны D15. Молекула нуклеиновой кислоты имеет последовательность ДНК, выбираемую из: (а) последовательности ДНК, представленной на любой одной из фигур 1А-1Е (как описано ниже) или комплементарной ей нити, и (b) последовательностей ДНК, которые гибридизуются в строгих условиях с последовательностями ДНК, которым дано определение в (a). Последовательности ДНК, которым дано определение в (b), предпочтительно обладают по крайней мере 90% идентичностью последовательности с последовательностями, которым дано определение в (a). Последовательность ДНК, которой дано определение в (b), в частности, могут включать консенсусную последовательность, представленную на фигуре IF (как описано ниже).

В другом аспекте этого изобретения представлен очищенный и изолированный белок наружной мембраны D15 или его часть. Белок наружной мембраны D15 может быть белком наружной мембраны D15 Haemophilus и более конкретно, белком наружной мембраны D15 H.influenzae и штамм H.influenzae может быть штаммом H. influenzae типа b, таким как штаммы Ca или Eagan или Minn A, или нетипируемым штаммом H.influenzae, таким как PAK 12085 или SB33.

В дополнительном осуществлении данное изобретение также включает рекомбинантную плазмиду, приспособленную для трансформации клетки-хозяина, рекомбинантной плазмиды, содержащей плазмидный вектор, в который встроен сегмент ДНК, содержащий очищенную и выделенную молекулу ДНК, представленную здесь. Такая рекомбинантная плазмида содержит плазмидный вектор, в который встроен сегмент ДНК, который по крайней мере включает фрагмент из 18 bp, выбираемый из молекул ДНК, перечисленных выше. Рекомбинантная плазмида может быть плазмидой DS-712-2-1, имеющей номер поступления АТСС 75604, помещенной на хранение 4 ноября 1993 г, и плазмидой JB-1042-5-1, имеющей номер поступления 65006 ATCC, помещенной на хранение 4 ноября 1993 г.

Плазмиды могут быть приспособлены для экспрессии кодируемого белка наружной мембраны D15 в клетке-хозяине, которая может быть гетерологичным или гомологичным хозяином, путем включения в рекомбинантный вектор, представляемый в соответствии с дополнительным аспектом этого изобретения. Рекомбинантный вектор может включать по крайней мере сегмент ДНК, содержащий по крайней мере фрагмент из 18 bp, выбираемый из молекул ДНК, которые перечислены выше, и средства экспрессии, действенно соединенные с сегментом ДНК для экспрессии продукта гена, кодируемого тем самым в клетке-хозяине. Плазмида для экспрессии кодируемого белка наружной мембраны 15 может быть плазмидой DS-880-1,-2, имеющей номер поступления ATCC 75605, помещенной на хранение 4 ноября 1993 г, адаптированной для экспрессии белка наружной мембраны D15 в E.coli. Выбранный сегмент ДНК может кодировать полипептид из по крайней мере 6 остатков и, в частности, может выбираться из этих сегментов, кодирующих полипептид из таблицы 2 (ниже). Сегмент ДНК может, кроме того, включать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую лидерную последовательность для выделения продукта гена из клетки- хозяина. Клетка-хозяин для экспрессии может выбираться из, например, грибов, дрожжей или может использоваться бакуловирусная система экспрессии.

Дополнительные аспекты этого изобретения включают белок, кодируемый молекулой ДНК, содержащей по крайней мере часть, кодирующую белок наружной мембраны D15, фрагмент или функциональный аналог такого белка, использование этого белка или аналога для вакцинации и диагностики и создания иммуногологических реагентов. Изобретение также включает антисыворотки (антитела), вырабатываемые к белку наружной мембраны D15, кодируемому молекулой ДНК, содержащей по крайней мере часть, кодирующую белок наружной мембраны, и очищенным пептидам, соответствующим частям белка наружной мембраны D15, и которые применяются при пассивной иммунизации и лечении заболеваний, вызываемых Haemophilus.

В соответствии с другим аспектом изобретения очищенный и изолированный пептид содержит аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности по крайней мере части белка наружной мембраны D15 или варианта или мутанта, который сохраняет иммуногенность. Пептид может быть получен с помощью рекомбинантных методов или с помощью пептидного синтеза, посредством чего очищенный пептид освобождается от примесей, связанных с бактериями, в норме содержащими белок наружной мембраны D15. Такие синтетические пептиды предпочтительно имеют аминокислотную последовательность, выбираемую из последовательностей, представленных в таблице 2.

В соответствии с дополнительным аспектом этого изобретения представлена имумногенная композиция, которая включает белок наружной мембраны D15, его фрагменты, его функциональные аналоги или пептиды, которые перечислены выше, и физиологически приемлемый носитель для этого. Такая иммуногенная композиция, в частности, оформляется в виде вакцины для применения in vivo с целью защиты от заболеваний, вызываемых Haemophilus.

Для подобной цели иммуногенная композиция может быть оформлена в виде препарата микрочастиц, капсульного препарата или липосомного препарата. Кроме того, такая иммуногенная композиция может быть представлена в комбинации с конъюгированной нацеливающей молекулой для доставки к специфическим клеткам иммунной системы или поверхностям слизистых оболочек.

В соответствии с дополнительным аспектом этого изобретения представлен способ индуцирования защиты от заболевания, вызываемого Haemophilus, включающего стадию введения субъекту, включая млекопитающего, такого как человек, эффективного количества иммуногенной композиции или молекул нуклеиновой кислоты, которые перечислены выше, для обеспечения защитного иммунитета против инфекции, вызываемой Haemophilus.

Данное изобретение, кроме того, включает химерную молекулу, содержащую белок D15 или пептид, ему соответствующий, который, как здесь представлено, связан с другим полипептидом или белком, или полисахаридом.

Связанный полипептид или белок может включать поверхностный белок или пептид, соответствующий этой цели из патогенных бактерий, который может быть белком наружной мембраны H.influenzae P1, P2 или P6. Связанный полисахарид предпочтительно состоит из молекулы PRP из H.influenzae.

Данное изобретение будет, к тому же, понятно из следующего описания со ссылками на чертежи, в которых: Фигура 1A представляет нуклеотидную последовательность гена D15 из штамма Ca H.influenzae типа b (ПОСЛ ИД N:1) и его производную аминокислотную последовательность (ПОСЛ ИД N:2).

Фигура 1b представляет нуклеотидную последовательность гена D15 из штамма Eagan H.influenzae типа b (ПОСЛ ИД N:3) и его производную аминокислотную последовательность (ПОСЛ ИД N:4).

Фигура 1C представляет нуклеотидную последовательность гена D15 из штамма Minn A H. influenzae типа b (ПОСЛ ИД N:5) и его производную аминокислотную последовательность (ПОСЛ ИД N:6).

Фигура 1D представляет нуклеотидную последовательность гена D15 из нетипируемого штамма SB 33 H.influenzae (ПОСЛ ИД N:7) и его производную аминокислотную последовательность (ПОСЛ ИД N:8).

Фигура 1E представляет нуклеотидную последовательность гена D15 из нетипируемой H.influenzae.

РАК 12085 (ПОСЛ ИД N: 9) и его производную аминокислотную последовательность (ПОСЛ ИД N:10).

Фигура IF представляет сравнительный анализ первичной структуры нуклеотидных последовательностей из генов D15 (ПОСЛ ИД N:1, 3, 5, 7 и 9), полученных из различных штаммов (типируемых Ca, Eagan и Minn A, нетипируемых SB 33 и PAK 12085).

Фигура 2 представляет карты рестрикции клонов pU C19/D15 (Ca), DS-712-2-1 (Eagan, DS-691-1-5 (Minn A), JB-1042-5-1 (SB 33) и JB-1042-9-4 (PAK 12085).H = Hind III, R = EcoRI S = A San 3A 1, и Xb = Xbal.

Фигура 3 представляет сравнительный анализ первичной структуры аминокислотных последовательностей белков наружной мембраны D15 (ПОСЛ ИД NN::2, 4, 6, 8 и 10), полученных из различных штаммов H.influenzae (типируемых, Ca, Eagan и Minn A, нетипируемых SB 33 и PAK 12085). Аминокислоты представлены общепринятым однобуквенным кодом. Последовательность D15 Ca используется в качестве эталонной, и точки указывают аминокислотные остатки, которые идентичны остаткам белка наружной мембраны D15 Ca.

Фигура 4 представляет построение плазмиды (DS-880-1-2), экспрессирующей D15 SB 33 (rDI5) полной длины с использованием сильного индуцибельного промотора Т7.

Фигура 5 представляет результаты анализа с помощью SDS-PAGE природного D15, очищенного с помощью афинной хроматографии, из H.influenzae штамм 30.

Фигура 6 представляет результаты анализа с помощью SDS-PAGE последовательных фракций, полученных во время очистки D15 полной длины экспрессированного в E.coli, содержащей плазмиду DS-880-1-2.

Фигура 7 показывает Ig G - антительные ответы у морской свинки на rD15 полной длины. Стрелки показывают режим иммунизации. Отбор крови производился через 0, 1, 4, 5 и 7 недель. Ограниченные отрезки представляют стандартное отклонение.

Фигура 8 представляет антительные Ig G ответы у мышей на rD15 полной длины. Стрелки показывают схему иммунизации. Пробы крови брали через 0, 1, 4, 5 и 7 недель.

Ограниченные отрезки представляют стандартное отклонение.

Фигура 9 представляет результаты анализа с помощью SDS-PAGE концевого фрагмента rD15, очищенного из GST - (фрагмент D15) слитого белка. Дорожки: 1, предварительно окрашенные маркеры низкого молекулярного веса (14 кDa, 21 кDa, 31 кDa, 45 кDa, 68 кDa, 97 кDa), 2 стандарт GST, 3 GST- (фрагмент D15) белок слияния, 4, белок слияния, расщепленный тромбином, 5 N-концевой фрагмент rD15, 6 GST, 7, маркеры низкого молекулярного веса.

Фигура 10 (a,b) представляет антительный Ig G ответ у морских свинок на N-концевой фрагмент rD15. Стрелки показывают режим иммунизации. Отбор образцов крови производили через 2, 4, 6 и 8 недель. Ограниченные отрезки представляют стандартное отклонение, и Фигура N представляет график гидрофильности D15, построенный с использованием окна в среднем через 7 остатков по Hope, 1986.

Основное описание изобретения Любые штаммы Haemophilus, которые имеют гены D15, могут соответственно использоваться для получения очищенных и изолированных молекул нуклеиновой кислоты (которые могут быть в форме молекул ДНК), содержащих по крайней мере часть, кодирующую белок наружной мембраны D15, примерами чего служат осуществления данного изобретения. Такие штаммы обычно доступны из клинических источников и из коллекций бактериальных культур, таких как Американская коллекция типичных культур (American Type Culture Collection). Штаммы H. influenzae могут включать типы a, b и c, нетипируемые штаммы и другие бактерии, которые продуцируют белок D15, его фрагмент или аналог. Соответствующие штаммы Haemophilus включают: H.influenzae типа b, штамм Ca, H.influenzae типа b, штамм Minn A; H.influenzae типа b, штамм Eagan; H.influenzae нетипируемый b штамм SB 33 или, H.influenzae нетипируемый b штамм PAK 12085.

В этой заявке термин белок наружной мембраны D15 используется для определения семейства белков D15, которое включает белки, имеющие природно встречающиеся вариации в их аминокислотных последовательностях, которые обнаружены у разных штаммов, например Haemophilus. Очищенные и изолированные молекулы ДНК, содержание по крайней мере часть, кодирующую белок наружной мембраны D15 из данного изобретения, также включают молекулы, имеющие естественно присутствующие вариации в их последовательностях нуклеиновых кислот, что обнаружено у разных штаммов, например Haemophilus, и те молекулы ДНК, которые кодируют функциональные аналоги белка наружной мембраны D15. В этой заявке первый белок является функциональным аналогом второго белка, если первый белок иммунологически родственен и/или имеет одинаковые функции со вторым белком. Функциональным аналогом может быть, например, фрагмент белка или его мутант с заменой, добавлением или делецией.

В разделах данного изобретения ген D15 выделяли из штамма Ga H.influenzae типа b, как показано на фигуре 1A, H.influenzae типа B Eagan фигура 1B, H.influenzae типа b Minn A, фигура 1C, нетипируемой H.influenzae SB 33, фигура 1D, нитипируемой H.influenzae PAK 12085, фигура 16. Сравнение последовательностей нуклеиновой кислоты генов D15 и производных аминокислотных последовательностей белков наружной мембраны D15 из этих штаммов H.influenzae показало, что гены и белки высоко консервативны (фигуры 1F и 3). Консенсусная последовательность (ПОСЛ ИД N:55) для гена 15 показана на фигуре 1F.

Очищенные и изолированные молекулы ДНК, содержащие по крайней мере часть, кодирующую белок наружной мембраны D15 видов Haemophilus, примерами чего служат осуществления, описанные здесь, применимы в качестве: - проб нуклеиновой кислоты для специфической идентификации штаммов Haemophilus in vitro и in vivo; - продукты, кодируемые молекулами ДНК, применимы в качестве диагностических реагентов, антигенов для продукции специфичных для Haemophilus анисывороток, для вакцинаций от заболеваний, вызываемых видами Haemophilus и обнаружения инфицирования Haemophilus и - пептиды, соответствующие частям белка наружной мембраны D15, что подтверждено примерами осуществлений, описанных здесь, применимы в качестве диагностических реагентов, антигенов для получения специфических для Haemophilus антисывороток, для вакцинации от заболеваний, вызываемых видами Haemophilus и для определения инфекций, вызванных Haemophilus.

Теперь будет дана детальная справка по предпочтительным в настоящее время осуществлениям изобретения, которая вместе с примерами служит для объяснения этого изобретения. Для ясности раскрытия, но не путем ограничения, детальное описание изобретения делится на следующие разделы: (I) Последовательности ДНК, кодирующие белок наружной мембраны D15 из H. influenzae типа b, штамм Ca.

Клон, продуцирующий белок наружной мембраны, обозначенный D15 H.influenzae типа b (Hib), был выделен путем просмотра геномной библиотеки с помощью поликлональных антител, специфичных для белка наружной мембраны (OMP-специфичных), как ранее описано Berns и Thomas 1965, Thomas и Rossi 1986. Фрагмент ДНК, кодирующий белок D15, был выделен, субклонирован в pUC19 с получением pUC19/D15 (фигура 2) и использовался, для трансформации E.coli HB101, как описано в примере 1. Плазмидную ДНК получали из двух отдельных колоний Е. coli HB101, содержащих pUC19/D15 плазмиду. Секвенирование выполнялось на секвенаторе ДНК ABI модель 370А с использованием химической реакции с красящим терминатором и олигонуклеотидными праймерами, которые были синтезированы на синтезаторе ДНК ABI модель 380B, и очищали с помощью хроматографии. Анализ нуклеотидной последовательности гена D15 выявил, что он содержит предполагаемый промотор и открытую рамку считывания, кодирующую 789 аминокислот (фигура 1A).

Первые 19 аминокислотных остатков транслируемой открытой рамки считывания образуют типичную лидерную последовательность, которая обнаружена для других белков наружной мембраны H.influenzae типа b, таких как PI и P2 N-концевая последовательность нативного антигена D15, очищенного с помощью иммуно-аффинитета, была определена с помощью автоматической деградации по Эдману с использованием секвенатора белков ABI 477А, и было обнаружено, что она представляет собой Ala-Pro-Phe, что идентично-N-концевой аминокислотной последовательности Ala-Pro-Phe-Val-Ala-Iys - (ПОСЛ ИД N:11), предсказанной по анализу последовательности гена D15, представленного на фигуре 1A.

(II) Последовательность генов D15 из других штаммов H.influenzae. Гены D15 были выделены из других штаммов H.influenzae путем просмотра хромосомных библиотек H.influenzae типа b, штаммов Eagan, Minn A и нетипируемых штаммов H. influenzae (HTTi) SB 33, и РАК 12085, как описано в примерах 2, 3 и 4. Клоны, положительные по гибридизации, высевали на чашки и подвергали второму кругу - отбора. Рестрикционные карты полученных клонов представлены на фигуре 2. Нуклеотидные последовательности генов D15 определены для всех этих клонов (фигуры 1B - 1E) и проверено сравнение их производных аминокислотных последовательностей (фигура 3). Аминокислотные последовательности 15 из трех штаммов H. influenzae типа b были идентичны, и наблюдалось только несколько различий аминокислот в аминокислотной последовательности белка D15 из нетипируемых штаммов (фигура 3).

(III) Экспрессия D5 и его фрагментов в E.coli Так как D15 экспрессируется в небольших количествах штаммами H.influenzae, выгодно экспрессировать этот антиген как рекомбинантный белок в гетерологичной системе, такой как E.coli, или модифицировать микроорганизм H.influenzae для усиления природной экспрессии D15. Фрагмент Hind III/EcoRI из штамма Ca H.influenzae типа b, кодирующий белок D15 полной длины, экспрессировался в pUC19, а не в pUC18, что наводит на мысль о том, что Iac промотор помогает в экспрессии гена D15 в E.coli, даже если присутствует природный промотор гена D15. Система экспрессии Т7 - строго контролируемая, индуцибельная система, которая дает большую выгоду при экспрессии гетерологичных белков в E.coli. Система экспрессии Т7 описана в патенте США 4952496. Поэтому сконструированы клоны, которые используют систему Т7 для экспрессии зрелого белка D15, который содержит дополнительный метиониновый остаток на амино-конце. Сигнальная последовательность D15 удалялась во время этого процесса конструирования. Рекомбинант D15 (названный rD15) полной длины экспрессировался при включении частей, которые позволяют легко очищать белок D15. Гены D15 из штамма Ca H.influenzae типа b и нетипируемого штамма SB 33 H. influenzae экспрессировались на высоком уровне в E.coli с использованием системы Т7, чтобы дать возможность продукции больших количеств белка rD15. Здесь описано конструирование клона DS-880-1-2, который экспрессирует ген D15 SB 33 (смотрите фигуру 4 и пример 5).

Белок D15 был иммунологически сходным с его природным аналогом, выделенным из штаммов H.influenzae типируемых и нетипируемых (см. ниже). Таким образом, rD15 может использоваться как перекрестно-реактивный антиген в диагностическом наборе для определения многих, если не всех, штаммов H.influenzae и других бактерий, которые продуцируют белок наружной мембраны D15 или его аналог. Альтернативно D15 может использоваться в качестве антигена для специфического определения присутствия H.influenzae в образце.

Фрагмент усеченного D15 экспрессировался в Е.coli как белок слияния с глютатион-S-трансферазой (GST), как описано в примере 6. Конструкция была предназначена для экспрессии N-концевого фрагмента белка D15. Белок слияния экспрессировался на высоком уровне из конструкции pGEX-2T, и N-концевой фрагмент отщеплялся от белка-носителя GST путем обработки тромбином. Эта процедура давала молекулу, названную N-концевым фрагментом rD15, который заключает в себе аминокислоты 63-223 из белка D15. Этот N-концевой фрагмент rD15 был высокоиммуногенным и вызывал образование защитных антител от заражения живыми.

(IV) Очистка природного D15 из клеточной массы H.influenzae. Данное изобретение также представляет способ получения очищенного природного белка D15 из H.influenzae. Белок экстрагируется и очищается с использованием фаффинитета из клеточной массы или типируемых или нетипируемых штаммов с помощью процесса, включающего растворение белка в водном растворе детергента (смотрите пример 13). Природный белок D15 из штамма 30 нетипируемой H.influenzae солюбилизировали с помощью 50 мм Транс-HCl /0,5%, Тритона X-100/ 10 мМ ЭДТУ буфером pH 8,0 и далее очищали на колонке для аффинной хроматографии с D15 - специфичными моноклональными антителами (фигура 5А). Белок в 80 кDa элюировали с колонки 50 мМ диэтиламином, pH 12,0, и, как показано, он реагирует с D15 - специфическими моноклональными антителами при иммуноблоттинговом анализе (фиг. 5В). Природный D15 также высокоиммуногенен у экспериментальных животных. Кроличьи анти- D15 антисыворотки реагировали со всеми штаммами H.influenzae, что определялось с помощью иммуноблоттинга.

(V). Очистка рекомбинантного белка D 15 полной длины, экспрессированного в E.Coli.

Рекомбинантный белок D15 полной длины экспрессировался в тельцах включения в E.coli. Как показано на фигуре 6, очистка телец включения rD15 достигалась с помощью последовательной экстракции лизата клеток E.coli 50 мМ Трис-HCl, pH 6,0, затем 50 мМ Трис, содержащим 0,5% Тритон X-100 и 10 мМ ЭДТА, pH 8,0. После центрифугирования более 95% белков в подученном в результате осадке было белком в 80 кDa по анализу SDS-PAGE, который реагировал с D15 - специфическими моноклональными антителами на иммуноблоте. Как было обнаружено, N-концевая последовательность rD15 представляет собой Met-Ala-Pro-Phe-Val-Iys-Asp- (ПОСЛ ИД N:54), которая идентична предсказанной аминокислотной последовательности.

Тельца включения rD15 делали растворимыми с помощью смеси фосфатно-буферного раствора (ФБР), 0,5% Тритона X-100, 10 мМ ЭДТУ и 8М мочевины (смотрите пример 8). После диализа против ФБР для удаления мочевины более 80% белка D15 оставалось растворенным. Этот растворимый антиген rD15 использовался для исследований по иммуногенности описанных ниже. По экспериментам с выращиванием в колбах при встряхивании было установлено, что из 1 л бактериальной культуры E.coli получалось 10 мг растворимого белка rD15. Ясно, что выращивание рекомбинантных штаммов E.coli при оптимизированных условиях ферментации значительно повысит уровень продукции rD15.

(VI) Иммуногенностъ рекомбинантного белка D15.

(rD15) полной длины.

Иммуногенность белка rD15 полной длины изучали на морских свинках и мышах. При использовании схем иммунизации, описанных на фигуре 7, доза rD15 в 15 мкг вызывала высокие титры IgG у морских свинок при введении в присутствии или адъюванта Фрейнда или AlPO₄. В исследовании зависимости ответа от дозы на мышах белок, по-видимому, был иммуногенным в такой низкой дозе, как 5 мкг, или в адъюванте Фрейнда (фигура 8А) или с AlPO₄ (фигура 8B).

Защитная способность rD15 против инфекции, вызываемой H.influenzae типа b, изучена на модели бактеремии у крысят по существу такой, которая описана Loeb (1987). Так, крысята, пассивно иммунизированные анти- rD15 антисывороткой морских свинок, имели значительно меньшую бактеремию, чем контрольные, которым вводили предварительно взятую сыворотку, что согласуется с предыдущим сообщением Thomas et.al (1990).

(VII) Очистка и определение характеристик N-концевого фрагмента rD15.

Усеченный фрагмент rD15, соответствующий N-концу белка D15 (остатки с 22 по 223), как описано в примере 6, экспрессировался в Е.coli, как растворимый белок, слитый с GST. Слитый белок (46 кDa) легко экстрагировался при использовании фосфатно-буферного раствора (ФБР). Очистка GST-D15 фрагмента слитого белка достигалась с помощью одностадийного процесса очистки с помощью аффинной хроматографии на колонке с глютатион-сефарозой (фигура 9, дорожа 3). Расщепление 46 кDа слитого белка с помощью тромбина давало два фрагмента (фигура 9, дорожка 4), 26 кDа белок, который соответствовал очищенному стандарту GST (фигура 9, дорожка 2), и 20 кDa полипептид, который имел размер, ожидаемый для N-концевого фрагмента rD15 (аминокислотные остатки с 63 по 223), соответственно. Разделение этих двух белков достигалось с помощью второго цикла аффинной хроматографии из глютатион-сефарозе 4B. Из экспериментов с выращиванием в колбах на качалке было установлено, что из 1 л бактериальной культуры E.coli выделяется около 1 мг очищенного N-концевого фрагмента rD15. Ясно, что выращивание рекомбинантых штаммов E.coli при оптимизированных условиях ферментации значительно повысит уровень продукции N-концевого фрагмента rD15.

Идентичность 20 кDa полипептида и 26 кDa белка была подтвержена как иммуноблоттингом, так и секвенированием белка. N-концевая последовательность 20 кDa полипептида, как было обнаружено, представляет собой NH₂-Ser-Leu-Phe-VaL-Ser-GLy-Arg-Phe-Asp-Asp-VaL-Lys-ALa-His- GLn-GLu-Gly-Asp-VaL-Leu-VaL-VaL-Ser (Посл. ИД N:12), которая соответствует остаткам с 63 по 85 первичной последовательности D15. Этот результат доказывает, что существует ложный сайт тромбинового расщепления в последовательности 15 и что первые 42 аминокислоты фрагмента rD15 отрезаются во время тромбинового расщепления. Таким образом, окончательный N-концевой фрагмент rD15 был длиной в 161 аминокислоту, соответствующую остаткам с 63 по 223 первичной последовательности D15. N-концевая последовательность, полученная для 26 кDa белка (NH2-Met-Ser-Pro-ILe-Leu-GLy-Tyr-Trp-Lys (ПОРСЛ ИД N:13) подтвердила, что это была GST.

(VIII) Иммуногенность N-концевого фрагмента rD15.

Иммуногенность N-концевого фрагмента rD15 была испытана на морских свинках с использованием различных адъювантов. При использовании схем иммунизации, описанных на фигуре 10, 10 мкг доза N-концевого фрагмента rD15 индуцировала хороший вторичный ответ у морских свинок почти со всеми испытанными адъювантами. Самый высокий титр против D15 наблюдался в группе морских свинок, иммунизированных N-концевым фрагментом rD15 в адъюванте Фрейнда. Вторым наилучшим адъювантом был Titermax (CytRx Inc). Другие два адъюванта, TPADA (трипалмитил-Cys-Ser-GLu₄) и AlPO₄ были одинаково сильнодействующими.

(IX). Защитная способность N-коцевого фрагмента rD15 от заражения H. influenzae типа b.

Моделью с заражением in vivo для оценки защитной способности антигена от заболеваний, вызываемых Haemophilus, является модель бактеремии у крысят, которая описана Loeb, 1987. Защитная способность N-концевого фрагмента rD15 от заражения H. influenzae типа b оценивали на этой модели на крысах. Как показано в таблице 1, у крысят, пассивно иммунизированных кроличьей сывороткой против N-концевого фрагмента rD15, выявлена значительно меньшая бактеремия по сравнению с бактеремией у крысят, которым вводили предварительно взятую сыворотку.

Так как пассивно вводимые антисыворотки против N-концевого фрагмента rD15, как было обнаружено, являются защитными на модели бактеремии у крысят, было интересно идентифицировать защищающий(е) эпитоп(ы) этого N-концевого фрагмента rD15. Первые девять перекрывающих пептидов из белка D15, которые перечислены в таблице 2, были химически синтезированы на основе аминокислотной последовательности, выведенной из последовательности гена D15 штамма Ca H.influenzae типа b (фигура 1). Эти синтетические пептиды оценивали по их реактивности или с кроличьей антисыворотки или с антисывороткой от морских свинок, полученных к очищенному N-концевому фрагменту rD15, с помощью ELISA. Как показано в таблице 3, как антисыворотка морских свинок, так и кроличья реагировали с группой пептидов D15, включая пептиды D15-Р4 - D15-P8, заключающие в себе остатки с 93 по 209 первичной последовательности D15.

Дополнительные исследования были выполнены, чтобы определить, может ли защита от H. influenzae типа b, наблюдаемая при применении кроличьей антисыворотки против D15 у крысят, нейтрализоваться пептидами D15. В первом эксперименте кроличью антисыворотку к N-концевому фрагменту rD15 вводили группе из семи крысят в присутствии или в отсутствие смеси девяти пептидов (D15-P2 - D15-P10). Животным в группе положительного контроля вводили кроличью антисыворотку к N-концевому фрагменту rD15, смешанную с очищенным фрагментом D15, а в группе отрицательного контроля вводили смесь только девяти пептидов. Как показано в таблице 4, у крысят, пассивно иммунизированных антисывороткой к N-концевому фрагменту rD15 (группа 1), выявлен значительно более низкий уровень бактеремии (3%, p = 1,2 10^-7) по сравнению с уровнем в группе отрицательного контроля (группа 4,100%), что согласовывалось с ранее полученными результатами. Защита, создаваемая кроличьей антисывороткой к N-концевому фрагменту rD15, в значительной степени нейтраизовалась добавлением очищенного N-концевого фрагмента rD15 (группа 3,64%), что демонстрируется отсутствием значительного различия в уровнях бактеремии между группой 3 и группой 4 (p = 0,09). Хотя добавление смеси девяти пептидов D15 только незначительно нейтрализовало защиту, придаваемую антисывороткой (группа 2,13%) по сравнению с группой 1 (3%), различие в числе бактерий между этими двумя группами было статистически значимым (p = 0,0037).

Чтобы более четко определить защитные эпитопы N-концевого фрагмента rD15, вышеизложенный эксперимент повторяли со смесью пяти пептидов (пептиды с D15-P4 до D15-P8), которые были выбраны по их сильной реактивности с кроличьей антисывороткой к N-концевому фрагменту rD15. Результаты, полученные из этого второго эксперимента, показали, что защита, наблюдаемая при использовании кроличьей антисыворотки к N-концевому фрагменту rD15 (таблица 5, группа 1), полностью блокировалась добавлением этой смеси из пяти пептидов (таблица 5,группа 2,106%, p = 0,53 10^-8). Эти результаты убедительно показывают, что смесь синтетических пептидов D15 может использоваться в качестве иммуногенов для индуцирования защитных антител к H.influenzae.

(X) Предсказание строения эпитопа и синтез пептида Чтобы картировать иммунодоминантные Т-клеточные или B-клеточные эпитопы D15, перекрывающие синтетические пептиды, включающие всю последовательность белка D15 (таблица 2 - ПОСЛ ИД N:14 - 49), были синтезированы с использованием t-Boc твердофазного пептидного синтеза, как описано в примере 15. Пептиды были выбраны на основе их высокого показателя гидрофильных -поворотов, установленного с помощью анализа по предсказанию вторичной структуры (фигура 11). Такие пептиды, вероятно, находятся на поверхности и являются антигенными. Пептиды длиной более 25 остатков были выбраны для лучшей имитации природных эпитопов.

(XI) Идентификация и определение характеристик иммунодоминантных эпитотов rD15 с использованием синтетических пептидов.

Чтобы картировать линейные B-клеточные эпитопы D15, перекрывающие синтетические пептиды, представляющие всю последовательность D15, отдельно наносили на платы для ELISA и испытывали с пробами нескольких анти rD15 антисыворотки, как описано в примере 19. Результаты суммированы в таблице 6. Мышиные антисыворотки, полученные к rD15, реагировали со всеми пептидами D15, но главные эпитопы располагались в пептидах D15 - Р8 (остатки 180-209 - ПОСЛ ИД N:21), D15 - Р10 (остатки 219-249 -ПОСЛ ИД N:23), D15- P11 (остатки 241- 270 -ПОСЛ ИД N:24) и D15 - Р26 (остатки 554-582 - ПОСЛ ИД N:39), соответственно. Кроличья анти-D15 антисыворотка распознавала только пептиды D15-Р4 (остатки 93-122- ПОСЛ ИД N:17), D15-Р14 (остатки 304-333 - ПОСЛ ИД N:27) и D15-P36 (остатки 769-798 - ПОСЛ ИД N:49). Антисыворотки морских свинок к D15 реагировали с пептидами D15-Р2 (остатки 45-72 -ПОСЛ ИД N:15), D15-Р4 (остатки 93-122 -ПОСЛ ИД N: 17), D15-Р6 (остатки 135-164 - ПОСЛ ИД N:19), D15-P8 (остатки 180-209 - ПОСЛ ИД N:21), D15-P14 (остатки 304-333 - ПОСЛ ИД N:27), D15-Р27 (остатки 577- 602 - ПОСЛ ИД N:40). Иммунодоминантные линейные В-клеточные эпитопы D15, таким образом,