Полинуклеотиды, способ их получения, гибридизационный анализ нуклеиновой кислоты

Полинуклеотиды, способ их получения, гибридизационный анализ нуклеиновой кислоты

Реферат

 

Изобретение относится к химии нуклеиновых кислот и биохимическим анализам, точнее гребневидно-разветвленным полинуклеотидам, которые используются в качестве накопительных мультимеров в гибридизационных исследованиях нуклеиновых кислот. Описывается новый крупный гребневидно-разветвленный полинуклеотид, включающий: а) скелет полинуклеотида, имеющий 1) не менее 15-мультифункциональных нуклеотидов, каждый из которых имеет место прикрепления боковой цепи, и 2) первую единицу одноцепочечного олигонуклеотида, способную специфически связываться с первой одноцепочечной полинуклеотидной последовательностью, представляющей интерес, и б) подвесные полинуклеотидные боковые цепи, простирающиеся от указанных мультифункциональных нуклеотидов, каждая из которых включает повторения второй одноцепочечной олигонуклеотидной единицы, которая способна специфически связываться со второй одноцепочечной полинуклеотидной последовательностью, представляющей интерес, при общем количестве повторений во всех боковых цепях не менее 20. Описываются способ его получения, а также гибридизационный анализ нуклеиновых кислот. 7 с. и 18 з.п.ф-лы, 1 табл.

Это изобретение относится к области химии нуклеиновых кислот и биохимических анализов. Точнее, оно касается крупных гребневидно-разветвленных полинуклеотидов, которые используются в качестве накопительных мультимеров в гибридизационных исследованиях нуклеиновых кислот.

Состояние вопроса Гибридизационный анализ нуклеиновых кислот обычно используется в исследованиях в области генетики и медицинской биохимии и в клинической диагностике. В гибридизационном анализе основной нуклеиновой кислоты из одноцепочечной исследуемой нуклеиновой кислоты образуют гибрид с меченым одноцепочечным зондом нуклеиновой кислоты и исследуют образовавшийся меченый дуплекс. Чтобы облегчить разделение дуплекса для распознавания постороннего материала и/или усилить сигнал, подлежащий исследованию, были разработаны варианты этой основной схемы. Один способ усиления сигнала для исследования описан в заявке в Европейское патентное бюро (EPA) 883096976 (соответствующей заявке США, серийный N 340031, поданной 18 апреля 1989 г.). В ней сигнал усиливается при помощи накопительных мультимеров. Эти мультимеры являются полинуклеотидами, которые сконструированы так, чтобы у них были первый сегмент, который специфически образует гибрид с анализируемой нуклеиновой кислотой или с нитью нуклеиновой кислоты, связанной с анализируемой, и повторения второго сегмента, который специфически образует гибрид с меченым зондом. Амплификация теоретически пропорциональна числу повторений второго сегмента. Мультимеры могут быть либо линейными, либо разветвленными. Описаны два главных типа разветвленных мультимеров: вилкообразные и гребневидные.

При исследовании двух типов разветвленных мультимеров было обнаружено, что вилкообразные структуры с большим числом ветвей, чем около 8, создают пространственную преграду, которая мешает фиксации меченого зонда на мультимерах. С другой стороны, у гребневидных структур не было пространственных препятствий, и поэтому их сочли предпочтительным типом разветвленного мультимера. Однако, к сожалению, повторные попытки создать гребневидные структуры с более чем 10 ветвями оказались безуспешными. Заявители разработали в настоящее время способы получения крупных гребневидно-разветвленных мультимеров. Эти крупные гребневидные структуры позволяют достичь большей степени амплификации, чем было возможно раньше.

Раскрытие изобретения Одним аспектом изобретения является крупный, гребневидно-разветвленный полинуклеотид, включающий: а) скелет полинуклеотида, имеющий: (I) не менее 15 мультифункциональных нуклеотидов, каждый из которых определяет место боковой цепи, и (II) первую одноцепочечную олигонуклеотидную единицу, которая может специфически связываться с интересующей первой одноцепочечной полинуклеотидной последовательностью; и б) подвесные полинуклеотидные боковые цепи, отходящие от указанных мультифункциональных нуклеотидов, каждая из которых включает повторения второй одноцепочечной олигонуклеотидной единицы, которая способна специфически связываться со второй интересующей одноцепочечной нуклеотидной последовательностью.

Другим аспектом этого изобретения является способ создания крупного гребневидно-разветвленного полинуклеотида, пригодного в качестве амплификационного мультимера при анализе гибридизации нуклеиновой кислоты, включающей: а) синтезирование скелета одноцепочечного полинуклеотида, включающего: (I) не менее 15 мультифункциональных нуклеотидов, каждый из которых имеет защищенную функциональную группу, которая служит местом отхождения нуклеотидов боковой цепи, и (II) первый сегмент места сшивания; б) снятие защиты с указанных функциональных групп; в) удлинение каждого из указанных мест, по крайней мере, до 5 нуклеотидов, чтобы создать вторые сегменты места сшивания; г) сшивание первой единицы одноцепочечного олигонуклеотида с первым местом сшивания так, чтобы указанная первая единица одноцепочечного олигонуклеотида оказалась способной образовывать специфическую связь с первой последовательностью одноцепочечной нуклеиновой кислоты, представляющей интерес; и д) сшивание вторых единиц одноцепочечного олигонуклеотида со вторыми сегментами места сшивания так, чтобы указанные вторые единицы одноцепочечного олигонуклеотида включали повторения последовательности, способной образовывать специфическую связь со вторым одноцепочечным олигонуклеотидом, представляющим интерес.

Еще одним аспектом этого изобретения является альтернативный способ создания крупного гребневидно-разветвленного полинуклеотида, пригодного в качестве амплификационного мультимера для анализа нуклеиновой кислоты методом гибридизации; этот способ включает: а) синтезирование скелета одноцепочечного полинуклеотида, включающего: (I) не менее 15 мультифункциональных нуклеотидов, каждый из которых имеет защищенную функциональную группу, служащую местом наращивания боковой цепи нуклеотидов, и (II) первую единицу одноцепочечного олигонуклеотида, способную образовывать специфическую связь с первой последовательностью одноцепочечного полинуклеотида, представляющего интерес; б) снятие защиты с указанных функциональных групп; в) удлинение каждого из указанных мест, по крайней мере, до 5 нуклеотидов, чтобы создать сегменты мест сшивания; и г) сшивание вторых единиц одноцепочечного олигонуклеотида с сегментами места сшивания указанных вторых единиц одноцепочечного олигонуклеотида, включающих повторения последовательности, способной связываться со вторым одноцепочечным олигонуклеотидом, представляющим интерес.

Еще одним аспектом этого изобретения является использование этих крупных гребневидно-разветвленных полинуклеотидов в анализах нуклеиновой кислоты методом гибридизации. В этих анализах: а) разветвленный полинуклеотид образует гибрид, через первую олигонуклеотидную единицу, с одноцепочечной анализируемой нуклеиновой кислотой, связанной с твердой фазой, или с одноцепочечным олигонуклеотидом, связанным с предметом анализа; б) несвязанный разветвленный полинуклеотид удаляется; в) одноцепочечный меченый олигонуклеотид образует гибрид с разветвленным полинуклеотидом через вторые олигонуклеотидные единицы; г) несвязанный меченый олигонуклеотид удаляется и д) определяется наличие метки, связанной с разветвленным полинуклеотидом.

Термины, употребляемые в описании изобретения "Крупный" применяется здесь для описания гребневидно-разветвленных полинуклеотидов изобретения и означает молекулу, имеющую не менее 15 мест ветвления и не менее 20 повторений последовательности, связывающей меченый зонд.

"Гребневидный" применяется здесь для описания структуры разветвленных полинуклеотидов изобретения и означает полинуклеотид, имеющий линейный скелет с множеством отходящих от него боковых ветвей.

"Мультифункциональный" или "модифицированный" нуклеотид означает мономер нуклеотида, который может стабильно включаться в полинуклеотид, имеющий добавочную функциональную группу (преимущественно - цитозин, у которого 4 положение изменено на функциональную гидроксигруппу), с которой нуклеотид может образовывать ковалентную связь для формирования боковой цепи.

"Расщепляемая молекула линкера" означает молекулу, которая может стабильно встраиваться в цепь полинуклеотида и образующая ковалентную связь, которая может разрываться или расщепляться химической обработкой или физическим воздействием, таким как облучение.

"Амплификационный мультимер" означает полинуклеотид, который способен, прямо или косвенно, образовывать гибрид с анализируемой нуклеиновой кислотой и создавать множество копий с меченых зондов.

Характеристика крупных гребневидно-разветвленных полинуклеотидов Полинуклеотидные мультимеры изобретения состоят из линейного скелета и подвесных боковых цепей. Скелет включает сегмент, который предоставляет специфическое место гибридизации для исследуемой нуклеиновой кислоты или нуклеиновой кислоты, связанной с анализируемой, тогда как подвешенные боковые цепи включают повторения сегмента, который обеспечивает специфические места гибридизации для меченого зонда.

Предпочтительные воплощения этих гребневидных полинуклеотидов могут быть представлены следующей схематической формулой: где S - первый спейсерный сегмент из, по крайней мере, 15 нуклеотидов, предпочтительно из 15-50 нуклеотидов; X - мультифункциональный нуклеотид, который обеспечивает место ветвления; S' - спейсерный сегмент места ветвления из 0-15 нуклеотидов, предпочтительно 0-10 нуклеотидов; m - целое число, равное или более 15, предпочтительно 15-100; R - молекула отщепляемого линкера; n - 0 или 1; S'' - второй спейсерный сегмент из 0-10 нуклеотидов, предпочтительно 5-10 нуклеотидов; A - сегмент, способный образовывать гибрид специфически с анализируемой нуклеиновой кислотой или с нуклеиновой кислотой, связанной с анализируемой; S''' - третий спейсерный сегмент из 0-10 нуклеотидов; L - сегмент, содержащий 2-10 повторений, предпочтительно 3-6 повторений, нуклеотидной последовательности, способной образовывать гибрид специфически с меченым олигонуклеотидным зондом; E - олигонуклеотидный удлиняющий сегмент из 5-10 нуклеотидов.

Весь скелет мультимера или его часть от S до S'', включительно, и часть боковой цепи, исключая L, обычно синтезируются химическими методами и при помощи оборудования для общепринятых способов автоматизированного твердофазного синтеза олигонуклеотидов, как единое целое. В этом отношении спейсерный сегмент S служит разъединению части молекулы, которая содержит места ветвления, с твердой фазой (S' конец S связан с поверхностью твердой фазы).

Модифицированные нуклеотиды или ветвящиеся мономеры, обозначенные буквой X в приведенной формуле, являются мультифункциональными нуклеотидами, у которых одна функциональная группа используется для наращивания боковой цепи, а другие используются для связей скелета. Примеры мультифункциональных нуклеотидов описаны в EPA 883096976 (США, серийный N 340031), раскрытие которых включено сюда в порядке ссылки. Эти модифицированные нуклеотиды по преимуществу имеют формулу где R³ - водород, метил, I, Br или F; R⁴ - водород или метил; Z - выбирается из группы, состоящей из: ⁽²⁾-(CH₂-CH₂-O)_x-⁽¹⁾ и ⁽²⁾-(CH₂)_x-O-⁽¹⁾, где x и y могут быть одними и теми же или разными целыми числами в диапазоне от 1 до 8, включительно. (Обозначения (1) и (2) на Z связи указывают на ориентацию Z половины линкера).

Как указывалось, спейсейрный сегмент S' является факультативным и может использоваться по желанию для разделения каждого места ветвления от предшествующего-последующего фланговых мест ветвления или ряда прилежащих мест ветвления от фланговых рядов мест ветвления. Второй спейсерный сегмент S'' также является факультативным и может использоваться для разделения разветвленной части молекулы с сегментом A, с которым, в конце концов, связывается анализируемый материал. Было обнаружено, что такое разделение улучшает фиксацию анализируемого материала на мультимере. Таким же образом является факультативным третий спейсерный сегмент S'''. Он является преимущественно поли-T.

Сегмент A имеет последовательность и длину, позволяющие ему образовывать специфическую и устойчивую связь с анализируемой нуклеиновой кислотой или нуклеиновой кислотой, соединенной с анализируемым материалом. Для достижения такой специфичности и стабильности сегмент A нормально должен состоять из 15-50, предпочтительно из 15-30, нуклеотидов в длину и иметь содержание GC в диапазоне от 40 до 60%. Специфическая длина и последовательность этого сегмента будут, конечно, варьировать в зависимости от нуклеиновой кислоты, с которой он должен образовать гибрид.

Сегмент E является удлиняющим сегментом боковой цепи, который синтезируется при помощи оборудования и технологии автоматизированного твердофазного химического синтеза олигонуклеотидов. Обычно он длиной около 5-10 нуклеотидов и служит местом, с которым может быть ферментативно сшит сегмент L.

Сегмент L включает повторения олигомерной единицы, которая может образовывать специфический и устойчивый гибрид с меченым олигонуклеотидным зондом. Эти единицы также обычно длиной в 15-150 нуклеотидов, предпочтительно в 20-120 нуклеотидов, и имеют содержание GC в диапазоне от 40 до 60%. Каждый сегмент L содержит в норме от 2 до 10 повторений единицы, предпочтительно от 3 до 6 повторений. Некоторые боковые цепи могут не включать L сегмент. Нормально не менее 50% боковых цепей, предпочтительно не менее 70% боковых цепей, должны включать L сегмент.

Расщепляемые молекулы линкера (R) в скелете и/или боковых цепях являются факультативными, но предпочтительными. Они содержат места расщепления, которые можно выбрать так, чтобы образцы крупного гребневидного полинуклеотида можно было отщепить для анализа и характеристики. В этом отношении предпочтительно, чтобы места расщепления имелись в каждой боковой цепи и место расщепления приходилось на положение 5', когда оно приходится на место ветвления. Примеры расщепляемых молекул линкера, которые могут встраиваться в полинуклеотиды, раскрыты в EPA 883096976 и в примерах, данных ниже.

Синтез крупных гребневидно-разветвленных мультимеров Сборка полинуклеотидов изобретения осуществляется сочетанием твердофазного прямого синтеза олигонуклеотидов с ферментативным сшиванием.

Тело гребня, включающее спейсер на стороне 3' (S), места ветвления (X), факультативно - сегменты S', S'' и S''', сегмент A, факультативно - заданные молекулы линкера (R) и удлиняющий сегмент боковой цепи E, синтезируется по технологии автоматизированного твердофазного синтеза олигонуклеотидов. Предпочтительной твердой фазой является стекло с заданным размером пор, не менее 2000 ангстрем. В этом синтезе спейсерный сегмент S наращивается от твердой фазы. Для удобства этот сегмент является поли-T. Затем к цепи добавляются мультифункциональные нуклеотиды, содержащие места ветвления, с или без вставочных нуклеотидов в виде спейсеров между местами ветвления. На модифицированных нуклеотидах используются ортогональные защитные или блокирующие группы так, что защитная группа, которая позволяет наращивать скелет, может удаляться, не повреждая защитную группу, которая позволяет наращивать боковую цепь.

Примеры подходящих защитных групп также описаны в EPA 883096976. В качестве блокирующей группы на углеводной части нуклеотида предпочтительно используется диметокситритил (ДМТ). В качестве блокирующей группы на гидроксильной части модифицированного нуклеотида предпочтительно используется левулинил или антрахинонильная группа следующей формулы: где R' - водород, арил или аралкил; R_i может быть одним и тем же или различным и избирается из группы, состоящей из амино-, нитро-, гало-, гидроксил-, низший алкил- и низший алкокси-; R_j может быть одним и тем же или различным и избирается из группы, состоящей из амино-, нитро-, гало-, гидроксил-, низший алкил- и низший алкокси-; i - 0, 1, 2 или 3; j - 0, 1, 2, 3 или 4.

После того, как было встроено заданное количество мест ветвления, 5' конец молекулы наращивается сегментами S'' (факультативный) и A или просто коротким сегментом S'' (5-10 нуклеотидов), содержащим место для энзиматического сшивания с сегментом A. Как указывалось выше, избираемое место расщепления предпочтительно встраивать в удлиняющий сегмент. Если сегмент A синтезируется прямо, а не добавляется сшиванием, для защиты мест боковых цепей модифицированных нуклеотидов нужно использовать защитную группу, такую как 2-метилантрахинонил, которую можно удалить избирательно, без нежелательного повреждения остатка молекулы.

После заданного удлинения конца 5' тела гребня удаляются группы, защищающие гидроксильную часть модифицированных нуклеотидов, и одновременно удлиняются места ветвления предпочтительно с включением избираемого места расщепления так, чтобы каждое место ветвления имело удлиняющий сегмент (E) из не мене 5-10 нуклеотидов, служащий местом сшивания.

Сегмент L (и также сегмент A, если он не синтезируется непосредственно) затем сшивается с удлиняющими сегментами боковых цепей при помощи добавления T4-лигазы и подходящих матриц линкера. Сегменты A и L так же можно синтезировать, используя доступные методы и оборудование для автоматизированного твердофазного синтеза олигонуклеотидов.

Анализы методом гибридизации В анализах нуклеиновой кислоты методом гибридизации крупный гребневидный мультимер изобретения связывается с анализируемой нуклеиновой кислотой или с одноцепочечным олигонуклеотидом, связанным с исследуемым материалом. Так как мультимер включает большое число (20 или более) повторений последовательности, предназначенной для специфической гибридизации с меченым олигонуклеотидом, с анализируемым материалом может связаться намного больше меченых групп, чем при аналогичных методиках. Большое количество меченых групп снижает порог обнаружения исследуемого материала.

Мультимеры могут использоваться, в сущности, в любых известных типах гибридизации нуклеиновых кислот, как при тех, где исследуемый материал связывается непосредственно с твердой фазой, так и при гибридизации методом сэндвича, при котором анализируемый материал связывается с олигонуклеотидом, который, в свою очередь, связывается с твердой фазой. Это особенно полезно при сэндвич-гибридизации в жидкой фазе, методе анализа, описанном в EPA 883096976.

В таких анализах сэндвич-гибридизацией в жидкой фазе мультимер используется следующим образом. Одноцепочечная анализируемая нуклеиновая кислота инкубируется в условиях для гибридизации с избытком двух наборов зондов одноцепочечной нуклеиновой кислоты: (1) набора захватывающих зондов, имеющих каждый по первой фиксирующей последовательности, комплементарной к анализируемому материалу, и второй фиксирующей последовательности, комплементарной к одноцепочечному олигонуклеотиду, связанному с твердой фазой, и (2) набора усилительных зондов, имеющих каждый по первой фиксирующей последовательности, которая способна специфически связываться с анализируемым материалом, по второй фиксирующей последовательности, которая способна специфически связываться с A сегментом мультимера. При помощи усилительного зонда мультимер можно превратить в "универсальный" реагент, так что не нужно делать разные мультимеры для каждого анализируемого материала. Образовавшийся продукт является трехкомпонентным комплексом нуклеиновой кислоты из двух зондов, скрещенных с исследуемым материалом своими первыми фиксирующими последовательностями. Вторые фиксирующие последовательности зондов сохраняются в виде одноцепочечных хвостов, так как они не комплементарны анализируемому материалу.

Затем этот комплекс добавляется к твердой фазе, с которой связан одноцепочечный олигонуклеотид, комплементарный второй фиксирующей последовательности захватывающего зонда, и проводится гибридизация. Образовавшийся продукт включает комплекс, связанный с твердой фазой дуплексом, образованным олигонуклеотидом, связанным с твердой фазой, и второй фиксирующей последовательностью захватывающего зонда. Затем, твердая фаза с фиксированным комплексом отделяется от несвязанных материалов.

Затем, в условиях гибридизации к комплексу твердой фазы с анализируемым материалом и зондом добавляют крупный гребневидный амплификационный мультимер, чтобы дать мультимеру образовать гибрид с доступной второй фиксирующей последовательностью усилительного зонда комплекса. Образовавшийся твердофазный комплекс затем отделяется промыванием от несвязанного мультимера. Затем добавляют меченый олигонуклеотид в условиях, позволяющих ему образовать гибрид с олигонуклеотидными единицами на боковых цепях мультимера. Образовавшийся комплекс твердой фазы с меченой нуклеиновой кислотой отделяется затем от избытка меченого олигонуклеотида промыванием, удаляющим несвязанный меченый олигонуклеотид, и считывается.

Анализируемые нуклеотидные кислоты могут быть из разных источников, например биологические жидкости или твердые вещества, пищевые продукты, материалы из окружающей среды и т.п., и их можно приготовить для гибридизационного анализа различными способами, например протеиназа K/додецилсульфат натрия, хаотропные соли и т.п. Также может быть выгодно уменьшить среднюю величину анализируемых нуклеиновых кислот ферментными, физическими или химическим способами, например ферментами рестрикции, ультразвуковой дезинтеграцией, химической деградацией (например, ионами металлов) и т.п. Фрагменты могут быть такими маленькими, как на 0,1 тыс. оснований, обычно бывают размером не менее 0,5 тысяч оснований и могут быть на 1 тыс. оснований или больше. Для анализа исследуемая последовательность должна быть в одноцепочечной форме. Если последовательность имеет естественную одноцепочечную форму, денатурация не требуется. Однако, когда последовательность представлена двухцепочечной формой, ее нужно денатурировать. Денатурацию можно проводить различными способами, такими как воздействие щелочью, обычно от приблизительно 0,05 до 0,2 М гидроксидом, формамидом, солями, нагреванием или их сочетаниями.

Первые фиксирующие последовательности захватывающего и усилительного зондов, комплементарные исследуемой последовательности, должны иметь каждая не менее 15 нуклеотидов, обычно не менее 25 нуклеотидов, и не более 5 тыс. оснований, обычно не более 1 тыс. оснований, предпочтительно не более 100 нуклеотидов. Типично, чтобы они имели приблизительно 30 нуклеотидов. В номер они должны выбираться для связи с различными последовательностями анализируемого материала. Первые фиксирующие последовательности могут выбираться по разным соображениям. В зависимости от природы анализируемого материала можно интересоваться обобщающей типичной последовательностью, последовательностью, ассоциированной с полиморфизном, особенным фенотипом или генотипом, особенным штаммом или т.п.

Соответствующим подбором первых фиксирующих последовательностей усилительных и захватывающих зондов можно пользоваться для идентификации молекулы конкретной нуклеиновой кислоты, включающей отдельный ген, или другой последовательности, являющейся частью различных молекул нуклеиновой кислоты. Для того, чтобы отличить интересующую молекулу нуклеиновой кислоты от других молекул, также содержащих данную последовательность, один из зондов делается комплементарным к данной последовательности, а другой - к другой последовательности, которая является уникальной для этой молекулы (т.е. не присутствует в других молекулах, содержащих данную последовательность).

Вторые фиксирующие последовательности захватывающих и усилительных зондов выбираются по признаку комплементарности соответственно к олигонуклеотиду, прикрепленному к твердой фазе, и к сегменту A мультимера таким образом, чтобы они не пришли в соприкосновение с эндогенными последовательностями в этом образце/анализируемом материале. Вторая фиксирующая последовательность может контактировать с первой фиксирующей последовательностью или отделяться от нее промежуточной некомплементарной последовательностью. По желанию зонды могут включать другие некомплементарные последовательности. Эти некомплементарные последовательности не должны мешать связи фиксирующих последовательностей или вызывать неспецифическое связывание.

Захватывающие и усилительные зонды можно получить методами синтеза олигонуклеотидов или клонированием, предпочтительнее первое.

Нужно отдавать себе отчет в том, что фиксирующая последовательность не нуждается в совершенной комплементарности для образования гомодуплексов. Во многих ситуациях достаточно образования гетеродуплексов, где ошибочно спарены менее 10% оснований, игнорируя петли из 5 или более нуклеотидов. Соответственно, использующийся здесь термин "комплементарный" означает степень комплементарности, достаточную для того, чтобы обеспечить образование стабильной структуры дуплекса.

Твердая фаза, применяющаяся для анализа, может быть в виде частиц или быть поверхностью стенки любого из множества контейнеров, например центрифужной пробирки, колонки, лунки титрационного микропланшета, фильтра, трубки т. д. Когда пользуются частицами, предпочтительно, чтобы они имели размеры в диапазоне 0,4-200 мкм, чаще 0,8-4,0 мкм. Частицы могут быть из любого общепринятого материала, такого как латекс или стекло. Титрационные микропланшеты представляют предпочтительную твердую поверхность. Олигонуклеотиды, комплементарные ко второй фиксирующей последовательности захватывающего зонда, могут стабильно прикрепляться к твердой поверхности функциональными группами по известным методикам.

Необходимо отдавать себе отчет в том, что возможно замещение второй фиксирующей последовательности захватывающего зонда и олигонуклеотида, прикрепленного к твердой фазе, соответствующей парой лиганд-рецептор, которая потом образует стабильную связь, соединяющую твердую фазу с первой фиксирующей последовательностью захватывающего зонда. Примерами таких пар являются биотин/авидин, тироксин/тироксин-связывающий глобулин, антиген/антитело, углевод/лектин и т.п.

Меченый олигонуклеотид должен включать последовательность, комплементарную олигонуклеотидным единицам на боковых цепях мультимера. Меченый олигонуклеотид должен включать одну или более молекул ("меток"), которые прямо или косвенно дают поддающийся обнаружению сигнал. Метки могут быть связаны с отдельными членами комплементарной последовательности или могут быть представлены концевым членом или хвостом, имеющим множество меток. В литературе описаны различные способы создания связи метки с последовательностью. См., например, Leary et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1983) 80:4045; Renz and Kurz, Nucl. Acids Res. (1984) 12:3435; Richardson and Gumport, Nucl. Acids Res. (1983) 11:6167; Smitf et al., Nucl. Acids Res. (1985) 13:2399; Meinkoth and Wahl, Anal. Biochem. (1984) 138:267. Метки могут связываться с комплементарной последовательностью ковалентно или нековалентно. В качестве меток могут использоваться радионуклиды, флуоресценты, хемилюминесценты, красители, ферменты, субстраты ферментов, кофакторы ферментов, ингибиторы ферментов, субъединицы ферментов, ионы металлов и т.п. Иллюстративные специфические метки включают флуоресцеин, родамин, техасский красный, фикоэритрин, умбеллиферон, люминол, НАД.Н, альфа-бета-галактозидазу, перексидазу хрена и т.п.

Отношение захватывающего зонда и усилительного зонда к предполагаемому количеству молей анализируемого вещества должно быть у каждого, по крайней мере, стехиометрическим, а предпочтительно - избыточным. Предпочтительно соотношение не менее 1,5:1 и еще предпочтительнее - не менее 2:1. Нормальными были бы пределы от 2:1 до 10.000:1. Концентрация каждого из зондов, в общем, должна быть в пределах от около 10^-10 до 10^-6 М при концентрации образца нуклеиновой кислоты, варьирующей от 10^-21 до 10^-12 М. Стадии гибридизации в анализе занимают, в общем, от 10 минут до 2 часов, чаще завершаясь в пределах одного часа. Гибридизация может проводиться при слегка повышенной температуре, в общем, в пределах от около 20^oC до 80^oC, чаще - от около 35^oC до 70^oC, особенно - 65^oC.

Реакцию гибридизации обычно проводят в водной среде, особенно в забуференной водной среде, которая может включать различные добавки. Добавки, которыми можно пользоваться, включают низкие концентрации детергентов (0,1-1%), соли, например лимоннокислый натрий (0,017-0,17 М), фиколл, поливинилпирролидин, носители нуклеиновых кислот, носители белков и т.д. К водной среде можно добавить неводные растворители, такие как диметилформамид, диметилсульфоксид, спирты и формамид. Эти и другие растворители могут присутствовать в количестве от 2 до 50%.

Строгость среды гибридизации может регулироваться температурой, концентрациями солей, системой растворителя и т.п. Поэтому, в зависимости от длины и природы интересующей последовательности строгость среды должна изменяться.

Методика стадий разделения в анализе должна меняться в зависимости от природы твердой фазы. Когда используют частицы, для разделения используют центрифугирование или фильтрацию, сливая или удаляя супернатант. Когда анализируют частицы, они должны быть тщательно отмыты, обычно 1-5 раз, подходящей забуференной средой, например ЗФР, содержащей такой детергент, как додецилсульфат натрия. Когда разделительным средством служит стенка или опорная подложка, супернатант можно слить или удалить, и стенку отмывают так же, как частицы.

В зависимости от природы метки можно пользоваться различными методиками для выявления присутствия метки. Для флуоресцентов имеется множество флуорометров. Для хемилюминесцентов имеются люминометры или фотопленки. С ферментами можно получить флуоресцирующие, хемилюминесцентные или окрашенные продукты, которые выявляются флуорометрически, люминометрически, спектрофотометрически или визуально. Различные метки, использующиеся для иммуноанализа, и методики иммуноанализа можно использовать для данных анализов.

В гибридизационном анализе, при котором анализируемая нуклеиновая кислота непосредственно связана с твердой фазой так, как в анализе дот-блоттингом, мультимер образует гибрид непосредственно со связанным анализируемым материалом. В этих случаях сегмент A мультимера комплементарен последовательности исследуемого материала, а олигонуклеотидные единицы на боковых цепях комплементарны меченому олигонуклеотиду. Несвязанный мультимер удаляют с твердой фазы, после чего меченый олигонуклеотид образует гибрид со связанным комплексом: анализируемый материал-мультимер. Удаляют избыток меченого олигомера и считывают меченый, связанный комплекс.

Мультимеры можно также применять в других анализах, таких как прямой, непрямой и сэндвич-иммуноанализы. В этих случаях реагент, играющий роль меченого антитела или другого лиганда, связанного с анализируемым материалом прямо или косвенно, имеет олигонуклеотид, комплементарный A сегменту мультимера, больше связанный с ним, чем с меткой. Например, в сэндвич-иммуноанализе на антигенный анализируемый материал анализируемый образец инкубируют с твердой фазой, с которой связано первое антитело к этому антигену. Несвязаннный образец удаляют с твердой фазы, и второе антитело к этому антигену, которое связано с олигонуклеотидом, комплементарным единице мультимера, вступает в реакцию со связанным комплексом, образуя трехчленный комплекс. После удаления избытка второго антитела мультимер образует гибрид с комплексом через олигонуклеотид, связанный со вторым антителом. Избыток мультимера удаляют, и меченый олигонуклеотид образует гибрид с другими олигонуклеотидными единицами мультимера. После удаления избытка меченого олигонуклеотида считывают комплекс.

Наборы для проведения анализов гибридизации амплифицированной нуклеиновой кислоты согласно изобретению должны включать сочетание следующих реагентов в одной упаковке: мультимер; соответствующий меченый олигонуклеотид; твердая фаза, способная связывать анализируемый материал; факультативно-захватывающий зонд, если тип анализа относится к одному из тех, в которых анализируемый материал фиксируется к твердой фазе через промежуточный олигонуклеотид или другой лиганд; и факультативно-усилительный зонд, если тип анализа относится к одному из тех, в которых мультимер не образует гибрид прямо с анализируемым материалом. Каждый из этих реагентов должен находиться в отдельном контейнере. В набор также можно включить реактив для денатурации анализируемого материала, буферы для гибридизации, растворы для промывания, субстраты для ферментов, материалы для положительного и отрицательного контроля и письменные инструкции по проведению анализа.

Следующие примеры изобретения предлагаются в порядке иллюстрации, а не ограничения.

Пример 1 Этот пример иллюстрирует синтез гребневидно-разветвленного полинуклеотида, имеющего 15 мест ветвления и области удлинения боковых цепей, имеющие три места фиксации меченого зонда. Этот полинуклеотид был сконструирован для использования при гибридизации в жидкой фазе, как описано в EPA 883096976.

Все олигонуклеотиды синтезированы химически на автоматическом синтезаторе ДНК (Applied Biosystems Inc. (ABI) модель 380 A/B). Использовался фосфорамидитный метод типа метокси, за исключением S'-фосфорилирования, в котором пользовались реактивом Phostel^TM (ABN). Применялись стандартные методики ABI с указанными исключениями. По показаниям пользовались мультипликацией цикла (например, 1,5 х цикл, 4,5 х цикл), в конкретном цикле применялось кратное увеличение стандартного количества амидита, рекомендованного ABI. Здесь приводятся программы проведения циклов 0,4, 1,5, 4,5 и CAP-PRIM для управления синтезатором Applied Biosystems модель 380 A/B.

Сначала получали тело гребня следующей структуры: 3'T₂₀-X₁₅(GTCAGTp5')₁₅-(GTTTGTp-5')₁ где X является модифицированным нуклеотидом, описанным ранее.

Первой синтезировали часть тела гребня с 15 повторениями при помощи стекла с регулируемыми порами (СРП) на 40 мг тимидина (3000 ангстрем, 3 мкМ тимидина на грамм подложки) в режиме 1,5 х циклов. Место ветвления нуклеотида имело формулу где R² представлен или Мономер, где R² представляет MAC, сделан следующим образом. К раствору N-4-(6-гидроксигексил)-5'-DMT-5-метил-2' дезоксицитидина (17 ммоль), приготовленному как описывалось ранее (Horn and Urdea, NAR vol. 17:17, p. 6959-6967 (1989)), в 200 мл метиленхлорида добавляли пиридин (40 ммоль) и смесь охлаждали до 0^oC. По каплям добавляли раствор 2-антрахинонметоксихлорформата (MAC-Cl) (20 ммоль) в 200 мл CH₂Cl₂ и перемешивали 10 минут. Анализ ТСХ (силиконовые пластинки, обработанные 10% метанол/CH₂Cl₂) показал, что исходный материал полностью израсходован. Реакционную смесь разводили 400 мл этилацетата и органическую фазу экстрагировали 2 раза по 300 мл 5% NaHCO₃ и 80% насыщенным водным раствором NaCl. После осушения органической фазы над Na₂SO₄ в течение 30 минут с последующей фильтрацией растворитель удаляли в вакууме. Продукт очищали хроматографией на силикагеле с градиентом метанола (0-6%) в CH₂Cl₂, чтобы получить 13 г чистого продукта (85% выхода).

Получали 0,1 М раствор 2-(гидроксиметил)-антрахинона (MAG-OH) растворяя 25 ммоль (5,95 г) в 250 мл диоксана. Желтый раствор фильтровали и растворитель выпаривали до удаления влаги. Остаток повторно растворяли в 200 мл диоксана и добавляли пиридин (2 мл, 25 ммоль). Этот раствор добавляли каплями в перемешиваемый раствор трифосгена (2,5 г, 25 Мэкв) в 50 мл CH₂Cl₂. Кончив добавлять, смесь перемешивали при 20^oC в течение 18 часов. Смесь разводили 800 мл этилацетата и органическую фазу промывали 3 раза 60 мл 80% насыще