Химерный регуляторный участок для экспрессии генов в растениях (варианты), кластер для экспрессии гена (варианты) , кластер для индуцибельной экспрессии чужеродного гена (варианты), способ экспрессии гена в растении (варианты), способ индуцибельной экспрессии чужеродного гена в растении (варианты) и плазмида (варианты)

Химерный регуляторный участок для экспрессии генов в растениях (варианты), кластер для экспрессии гена (варианты) , кластер для индуцибельной экспрессии чужеродного гена (варианты), способ экспрессии гена в растении (варианты), способ индуцибельной экспрессии чужеродного гена в растении (варианты) и плазмида (варианты)

Реферат

 

Группа изобретений может быть использована в селекции растений. Химерные регуляторные участки нуклеотидных последовательностей и генные конструкции на основе генов опин-синтазы Agrobacterium fumefaciens обеспечивают повышенные уровни экспрессии чужеродных генов в растениях. Для увеличения экспрессии генов различные "upstream"-расположенные активирующие последовательности, например, из генов маннопин- и октопин-синтазы операбельно соединяют с промоторами, которые, в свою очередь, операбельно соединяют с чужеродным геном. Конструкции вводят в растительные клетки с помощью плазмид. 19 с. и 13 з.п.ф-лы, 9 ил., 2 табл.

Изобретение относится к химерным регуляторным участкам, применяемым для контроля экспрессии генов в растениях. Эти химерные регуляторные участки выделены из генов опин-синтазы патогена растений Agrobacterium tumefaciens.

A. tumefaciens - грамотрицательная почвенная бактерия, которая инфицирует большинство двудольных и ряд однодольных растений. Инфекция A. tumefaciens часто приводит к образованию корончатых галлов на инфицированных растениях. В процессе инфекции A. tumefaciens определенный сегмент ДНК (Т-ДНК) большой плазмиды, индуцирующей опухоли (Ti), переносится в клетку чувствительного растения и интегрируются в ядерный геном растения. При этом происходит экспрессия генов Т-ДНК. Некоторые гены Т-ДНК кодируют ферменты, участвующие в синтезе гормонов, активных в растениях. Эти гормоны могут вызывать образование опухоли у инфицированных растений. Другие гены Т-ДНК направляют синтез и секрецию уникальных производных аминокислот и сахаров, называемых опинами. A. tumefaciens может использовать эти опины в качестве источников углерода и (иногда) азота. См. Gelvin, Plant Physiol. 92: 281-85 (1990); Gelvin, Transgenic Plants (Academic Press 1993); Ream, Ann. Rev. Phytopathol. 27: 583-618 (1989; Zambryski, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43: 465-90 (1992).

Гены Т-ДНК содержат участки, работающие в растениях и обладающие сходством с регуляторными участками растений. Например, большинство промоторов растений содержат цис-действующие элементы, такие как расположенные против хода транскрипции активирующие последовательности (UAS) (часто называемые энхансерами), которые, связывая транс-действующие факторы, определяют или влияют на силу промотора и тканеспецифичную экспрессию. Atchison, Annu. Rev. Cell Biol. 4:127-53 (1988). Общая сила промотора, а также экспрессия соответствующего ему гена может определяться комбинацией и пространственной ориентацией цис-действующих элементов, а также наличием ядерных факторов, взаимодействующих с этими элементами. Dynan, Cell 58:1-4 (1989). Изначально находясь на прокариотной плазмиде, гены Т-ДНК сохраняют все элементы последовательности (промоторы и UAS), необходимые для транскрипции в растениях. Например, гены Т-ДНК содержат области ТАТА, которые находятся в сайте инициации транскрипции и содержат расположенные перед ними элементы на расстоянии более ста пар осн. от сайта инициации транскрипции, что модулирует уровни транскрипции. См. Gelvin, Transgenic Plants (Academic Press 1993).

Два гена, которые содержат расположенные против хода транскрипции активирующие последовательности, представлены генами октопин-синтазы (ocs) и маннопин-синтазы (mas). Ген ocs кодирует продукт, который конденсирует аргинин и пируват с образованием октопина. Hack and Kemp, Plant Physiol. 65:949-55 (1980). Палиндром из 16 пар оснований, расположенный перед геном ocs, активирует гетерологичный промотор кукурузы adhl в временной экспрессирующей системе. Ellis et al., EMBO J. 6:11-16 (1987); Ellis et al., EMBO J. 6:3203-08 (1987). Этот палиндром также важен для активности промотора ocs в стабильно трансформированном каллюсе табака. Leisner and Gelvin, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85: 2553-57 (1988); Leisner and Gelvin, Plant Cell 1: 925-36 (1989).

Гены mas 1' и 2' делят двойной двунаправленный промотор и интергенный участок из 479 пар осн. Эти гены кодируют ферменты двустадийного пути синтеза маннопина Ellis et al., Mol. Gen. Genet. 195:466-73 (1984); Komro et al., Plant Mol. Biol. 4: 253-63 (1985). Транскрипция генов mas является дивергентной, а интергенный участок содержит все цис-действующие элементы, необходимые для транскрипции обоих генов. DiRita and Gelvin, Mol. Gen. Genet. 207: 233-41 (1987); Fox et al. Plant Mol. Biol. 20: 219-33 (1992); Leung et al., Mol. Gen. Genet. 230: 463-74 (1991); Guevara-Garcia et al., Plant J. 4: 495-505 (1993).

Промоторы генов ocs и mas использовали для направления экспрессии связанных генов в трансгенных растениях. Однако применение этих промоторов было ограничено низким уровнем экспрессии в определенных тканях трансгенных растений. DiRita and Gelvin, supra; Harpster et al., Mol. Gen. Genet. 212: 182-90 (1988); Sanger et al., Plant Mol. Biol. 14: 433-43 (1990). Например, промотор ocs направляет определенную, специфичную для клеток экспрессию в трансгенном табаке. Kononowicz et al., Plant Cell 4: 17-27(1992). Ген mas отличается слабой экспрессией в листьях и стеблях при более сильной экспрессии в корнях. Он проявляет повышенную экспрессию в повреждениях и индуцируется ауксином. Langridge et al. , Proc. Nat'l Acad. Sci 86: 7890-94 (1989); Teeri et al., EMBO J., 8: 343-50 (1989); Saito et al., Planta 184: 40-46 (1991) Guevara-Garcia et al., loc. cit.

Поскольку промоторы и другие регуляторные участки имеют различную силу и тканевую специфичность, были разработаны определенные рекомбинантные регуляторные участки. Например, энхансерные элементы, которые специфично связывают определенные транс-действующие факторы, могут модулировать активность транскрипции и экспрессию, специфичную для клеток. Bienz and Pelham, Cell 45: 753-60 (1986).

Известно также применение определенных конститутивных промоторов, например 35S конструкций вируса мозаики цветной капусты (CaMV). Промотор CaMV 35S имеет активаторы с множественными доменами, которые активируют промотор 35S в зависимости от стадии развития и тканевой специфичности. См. Benfey et al. , EMBO J. 8: 2195-2202 (1989); Benfey et al., EMBO J. 9: 1677-1684 (1990): Benfey et al., EMBO J. 9: 1685-96.

Публикация Koziel et al., Bio/Technology 11: 194-199 (1993) относится к промоторам, применяемым в конструкциях, получаемых для тканеспецифичной стимуляции гетерологичного гена. Koziel предлагает конструкцию системы экспрессии гена, которая содержит усеченный ген crylA(b) (фрагмент гена, кодирующий первые 648 аминокислот инсектицидного белка из Bacillus thuringiensis, состоящего из 1155 аминокислот), связанный с промотором CaMV 35S или комбинацией 2-х тканеспецифичных промоторов, выделенных из кукурузы (промотор фосфоенолпируват-карбоксилазы (PEPC) и промотор, специфичный для пыльцы). Koziel отмечает высокие уровни экспрессии при использовании любой промоторной конфигурации. Koziel et al. также использовали (1) промотор PEPC, который, как известно, вызывает специфичную для зеленых тканей экспрессию, и (2) промотор, специфичный для пыльцы кукурузы. Полученная экспрессия инсектицидного белка на уровне 1500 - 4000 нг/мг является достаточно высоким уровнем экспрессии. Кроме того, применение промоторов PEPC/специфичных к пыльце приводило к тканеспецифичной экспрессии.

Известны также попытки получить рекомбинантную экспрессию иными способами. Изобретение Bevan et al., PCT/GB92/00566 (1992) в основном относится к применению единственного промотора, отличного от промотора, описанного Koziel et al., для получения тканеспецифичной экспрессии гетерологичного гена. Это применение связано с использованием промотора фенилаланин-аммоний-лиазы бобов (PAL) для получения тканеспецифичной экспрессии. Был сконструирован гибридный ген, в котором слиты участки регуляции транскрипции геномного клона PAL (клона, содержащего в дополнение к кодирующим последовательностям, промежуточные последовательности, являющиеся частью последовательностей гена PAL) и открытая рамка считывания (ORF), содержащая 68 аминокислот N-конца белка PAL с полной ORF бета-глюкуронидазы (GUS) после участка полиаденилирования и терминации транскрипции нопалин-синтазы (слияние двух последних элементов типично для большинства экспрессирующих векторов эукариотных растений и обеспечивает эффективную экспрессию). Поскольку исходная конструкция обладала сильной активностью в ряде растений, исследователи создали делеции в участках промотора PAL гибридного гена. Минимальный промотор PAL, необходимый для полной экспрессии, как было показано, состоит из 253 пар осн. стартового сайта (инициации) транскрипции PAL. Варьированием участков делеции, главным образом в этом минимальном участке, исследователи установили возможность модификации степени тканеспецифичной экспрессии.

Патент США N 5034322 в основном относится к применению промоторов нопалин-синазы с малой субъединицей гена рибулоза-1,5-бис-фосфат-карбоксилазы.

Было также показано, что химерный промотор, названный "Mac", который содержит участок от +65 до -301 mas и участок от -90 до -941 энхансера 35S, обладает активностью GUS на уровне, в несколько раз превышающем уровень двойного промотора CaMV 35S в трансгенных растениях табака Comai et al., Plant Mol. Biol. 15: 373-81 (1990).

Описанные выше конструкции имеют ряд ограничений в плане эффективности и контролируемости экспрессии. Например, известные подходы не обеспечивают сильную конститутивную экспрессию в условиях, когда она желательна.

Сущность изобретения Целью настоящего изобретения является получение химерных регуляторных участков для улучшенной экспрессии генов в растениях.

Изобретение также позволяет получать химерные регуляторные участки, которые содержат промоторы и находящиеся против хода транскрипции активирующие последовательности из A. tumefaciens.

Согласно изобретению также возможно получение генных кластеров, содержащих гены, экспрессирующиеся под контролем химерных регуляторных участков, которые содержат промоторы и находящиеся против хода транскрипции активирующие последовательности из A. tumefaciens.

Еще одним объектом изобретения является способ получения индуцибельной экспрессии чужеродных генов в растениях.

И, наконец, получение плазмид и трансгенных растений, содержащих генные кластеры, также предусмотрено настоящим изобретением.

В соответствии этим, согласно изобретению представлены химерные регуляторные участки для экспрессии генов в растениях, которые содержат указанную активирующую последовательность, выделенную из первого гена опин-синтазы A. tumefaciens, оперативно связанную с промотором, выделенным из второго гена опин-синтазы A. tumefaciens, отличного от первого гена опин-синтазы A. tumefaciens. Первый и второй гены опин-синтазы A. tumefaciens предпочтительно представлены генами маннопин-синтазы или октопин-синтазы.

Также представлены химерные регуляторные участки для экспрессии генов в растениях, содержащие по меньшей мере две активирующие последовательности опин-синтазы A. tumefaciens, оперативно связанные с промотором опин-синтазы A. tumefaciens. Указанные активирующие последовательности могут быть выделены из одного и того же или различных генов опин-синтазы A. tumefaciens, например маннопин-синтазы и октопин-синтазы. Дополнительно одна или обе активирующие последовательности и промотор могут быть выделены из одного и того же гена опин-синтазы A. tumefaciens.

В соответствии с изобретением предложены также генные кластеры, содержащие экспрессируемый ген, оперативно связанный с химерным регуляторным участком, как описано выше. Генный кластер может содержать также терминаторы транскрипции и сигналы полиаденилирования, например сигнал полиаденилирования нопалин-синтазы.

Кроме того, предложен кластер для индуцибельной экспрессии чужеродного гена, который содержит чужеродный ген, оперативно связанный с регуляторным участком, который содержит промотор, выделенный из гена маннопин-синтазы A. tumefaciens и расположенную против хода транскрипции активирующую последовательность, выделенную из гена маннопин-синтазы A. tumefaciens. Регуляторный участок может также содержать активирующие последовательности, выделенные из гена октопин-синтазы A. tumefaciens.

Объектами изобретения являются также способы экспрессии генов в растениях, которые предусматривают стадии связывания гена с химерным регуляторным участком, соответствующим изобретению, инсерцию гена и химерного регуляторного участка в растение и обеспечение экспрессии гена в растении.

Кроме того, представлены плазмиды и трансгенные растения, несущие описанные в изобретении химерные регуляторные участки и генные кластеры.

Иные объекты, отличия и преимущества настоящего изобретения будут рассмотрены при обсуждении экспериментальных данных и чертежей.

Краткое описание чертежей.

На фиг. 1 схематически представлена структура химерных регуляторных участков на основе mas и ocs. Стрелки указывают на ориентацию расположенных против хода транскрипции активирующих последовательностей относительно промоторов mas и ocs. Цифры означают положение нуклеотидов относительно сайтов инициации транскрипции. Тример активирующей последовательности ocs был использован в конструкциях 3 и 4. Мономер или тример активирующей последовательности ocs был использован в конструкциях 5 и 6.

На фиг. 2 показана активность GUS конструкций на основе промотора mas в экстрактах первичных трансформантов табака. Активность GUS оценивали по общему белку, выделенному из тканей листьев (граф. А), стеблей (граф. Б) или корней (граф. В). Каждый столбец представляет активность отдельного трансформанта. Различные конструкции указаны внизу графиков. Число отдельных трансгенных растений, проанализированных в отношении каждой конструкции, представлено "n". Средняя активность GUS для каждой конструкции обозначена "". A - активирующая последовательность, P - промотор, (Aocs)₃ - тример активирующей последовательности ocs.

На фиг. 3 показана активность GUS конструкций на основе промотора mas плюс активирующей последовательности в экстрактах первичных трансформантов табака. Активность GUS оценивали по общему белку, выделенному из тканей листьев (граф. А), стеблей (граф. Б) или корней (граф. В). Каждый столбец представляет активность отдельного трансформанта. Число отдельных трансгенных растений, проанализированных в отношении каждой конструкции, представлено "n". Различные конструкции указаны внизу графиков. Средняя активность GUS для каждой конструкции обозначена "". A - активирующая последовательность, P - промотор, AocsAmasPmas - мономер активирующей последовательности ocs, связанной с активирующей последовательностью mas и промотором; (Aocs)₃AmasPmas - тример активирующей последовательности ocs, связанной с активирующей последовательностью mas и промотором.

На фиг. 4 показана активность GUS конструкций на основе промотора ocs в экстрактах первичных трансформантов табака. Активность GUS оценивали по общему белку, выделенному из тканей листьев (граф. А), стеблей (граф. Б) или корней (граф. В). Каждый столбец представляет активность отдельного трансформанта. Различные конструкции указаны внизу графиков. Число отдельных трансгенных растений, проанализированных в отношении каждой конструкции, представлено "n". Средняя активность GUS для каждой конструкции обозначена "". A - активирующая последовательность, P - промотор, Amas' - участок mas от -213 до -318, Amas'' - участок mas от -111 до -318.

На фиг. 5 показана активность GUS конструкций на основе промотора ocs плюс активирующей последовательности в экстрактах первичных трансформантов табака. Активность GUS оценивали по общему белку, выделенному из тканей листьев (граф. А), стеблей (граф. Б) или корней (граф. В). Каждый столбец представляет активность отдельного трансформанта. Различные конструкции указаны внизу графиков. Число отдельных трансгенных растений, проанализированных в отношении каждой конструкции, представлено "n". Средняя активность GUS для каждой конструкции обозначена "". A - активирующая последовательность, P - промотор, Amas' - участок mas от -213 до -318, Amas'' - участок mas от -111 до -318.

На фиг. 6 представлены приблизительные уровни экспрессии активности GUS двойных промоторов CaMV 35S и Mac в листьях (двойной 35SL, MacL), стеблях (двойной 35SS, MacS) и корнях (двойной 35SR, MacR) нескольких трансгенных растений табака.

На фиг. 7 схематично представлены конструкции, использованные при изучении индуцибельной экспрессии. UAS - расположенная против хода транскрипции активирующая последовательность, pmas - промотор mas, GUS - ген -глюкуронидазы, NOS - сигналы полиаденилирования нопалин-синтазы.

На фиг. 8 представлен уровень активности GUS в выделенных зрелых яйцах нематод. Анализы проводили при pH 5,5 и 7,5 для проверки активности GUS бактериального и животного происхождения.

На фиг. 9 представлена активность индуцированной нематодами GUS в различных трансгенных растениях. На панели А представлены трансгенные растения, имеющие промотор Pmas, но не имеющие активирующих последовательностей, на панели Б - трансгенные растения, имеющие промотор AmasPmas, на панели В - трансгенные растения, имеющие промотор AocsAmasPmas.

Подробное описание предпочтительных вариантов изобретения.

Настоящее изобретение относится к химерным регуляторным участкам, содержащим различные расположенные против хода транскрипции активирующие последовательности и промоторы из генов опин-синтазы A. tumefaciens, которые применяют для контроля экспрессии чужеродных генов. Чужеродный ген содержит любую ДНК, планируемую для экспрессии в трансгенном растении. В данном контексте ген, независимо от его происхождения, вводят в геном растения, и он, таким образом, является чужеродным растению в локализации инсерции даже в случае, когда ген выделен из трансформируемого растения. Изобретенные конструкции в соответствии с настоящим изобретением также описаны в патентной заявке США N 08/155067, заявлено 19.11.93, включенной в настоящее описание путем ссылки.

Все типы продуктов, кодируемых генами, можно получить с помощью настоящего изобретения. Чужеродные гены, экспрессируемые в трансгенных растениях, согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются -глюкуронидазой, генами, кодирующими инсектицидные и фунгицидные токсины, соединениями, обусловливающими устойчивость к патогенам, соединениями, обусловливающими сверхчувствительную реакцию, например пероксидазами, глюканазами и хитиназами, а также фитоалексинами; генами устойчивости к пестицидам, гербицидам и фунгицидам; ферментами растений, например связанными с содержанием белков, крахмала, сахаров и жиров; ингибиторами ферментов растений, например ингибиторами протеазы и амилазы; гормонами растений; гормонами и феромонами насекомых; фармацевтическими и пищевыми соединениями, например бета-каротином; витаминами и антителами, в том числе фрагментами и одноцепочечными производными антител, и антисмысловыми транскриптами, нарушающими нуклеотидные последовательности, присутствующие в растениях. См., например, Kung and Wu, Transgenic Plants, vol. 1 (Academic Press 1993).

В общем, природный промотор маннопин-синтазы с активирующей последовательностью или природный промотор октопин-синтазы с активирующей последовательностью являются относительно слабыми в тканях трансгенных растений табака (активность GUS, обусловленная связанными репортерными генами gusA, составляет несколько сотен, несколько тысяч единиц активности GUS). В соответствии с настоящим изобретением сочетание UAS из этих генов с промотором с активирующей последовательностью заметно повышает активность GUS связанного гена gusA (на два порядка), приводя к активностям порядка сотен тысяч единиц активности GUS. Гистохимическое исследование ткани трансгенных растений табака экспрессирующих эти слитые гены промотор-gusA показывает, что новые комбинации промотора и активирующей последовательности, представленные в изобретении, работают в большинстве типов клеток растений. Таким образом, эти комбинации (химерные регуляторные участки) могут быть более конститутивными по сравнению с известными промоторами.

Изобретение относится к улучшенным регуляторным участкам растений, обеспечивающим сильную и постоянную стимуляцию экспрессии генов. Дополнительно может быть получена тканенеспецифичная и/или повышенная в определенных тканях экспрессия. Выбор активирующих последовательностей и промоторов в соответствии с изобретением обусловливает желаемый тип экспрессии.

Представленные химерные регуляторные участки характеризуются более сильной экспрессией в табаке, чем любой другой известный регуляторный участок. Табак является широко используемой моделью для трансформации растений. Дополнительно описанные регуляторные участки могут быть близкими к конститутивным (постоянно включающимися) и потенциально могут быть использованы в большем числе тканей растений, чем известные регуляторные участки.

Изобретение относится к химерному регуляторному участку для экспрессии генов в растениях. Он может содержать расположенную против хода транскрипции активирующую последовательность, выделенную из первого гена опин-синтазы A. tumefaciens, оперативно связанную с последовательностью промотора, выделенной из второго гена опин-синтазы A. tumefaciens или с расположенной против хода транскрипции активирующей и промоторной последовательностью, выделенной из второго гена опин-синтазы A. tumefaciens.

Химерные регуляторные участки, согласно изобретению, могут быть оперативно связаны с последовательностью чужеродного гена, которая может быть оперативно связана с работающей в растении терминаторной последовательностью и далее оперативно связана с работающей в растении сигнальной последовательностью полиаденилирования. Химерный регуляторный участок в соответствии с изобретением может быть высоко конститутивным во многих случаях.

Расположенная против хода транскрипции активирующая последовательность является последовательностью, естественное положение которой обычно, по меньшей мере, на сто пар оснований предшествует положению природного сайта инициации транскрипции и которая может оказывать влияние на экспрессию. UAS генов октопин- и маннопин-синтазы используют, в частности, с этой целью. Эти UAS могут быть затем оперативно связаны с последовательностью промотора или с расположенной против хода транскрипции активирующей последовательностью и промотором, выделенными из иного гена опин-синтазы A. tumefaciens.

Термин "выделены", применяемый в отношении таких участков ДНК, как промоторы и расположенные против хода транскрипции активирующие последовательности, описывает ситуации, когда "выделенный" участок ДНК получают из участка ДНК или он имеет основой природный участок ДНК или участок ДНК из иного источника. "Выделенный" участок ДНК может отличаться мутацией от природного участка ДНК или участка ДНК, полученного из иного источника.

Выражение "оперативно связанные" относится к первой(ым) последовательности(ям), помещенной(ым) достаточно близко ко второй(ым) последовательности(ям) для того, чтобы первая(ые) последовательность(и) оказывала(и) влияние в области второй(ых) последовательности(ей) или участка, находящегося под контролем этой второй последовательности. Например, UAS может быть оперативно связана с промотором, при этом она повышает транскрипционную силу промотора. В такой ситуации типично 5'-расположение UAS относительно промотора. UAS и промотор, в свою очередь, могут быть оперативно связаны с генами, при этом экспрессия гена будет находиться под контролем комбинации UAS/промотор, для которой также типично 5'-положение относительно гена. Обычно промотор содержит 30 - 50 пар оснований от стартового сайта транскрипции и до нескольких сотен пар оснований от стартового сайта трансляции. Активирующая последовательность обычно составляет несколько сот пар оснований промотора. Например, большинство активирующих последовательностей содержат 300 - 400 пар оснований усиливаемого промотора. В вариантах изобретения, где используется более одной активирующей последовательности, они обычно содержат 100 - 200 пар оснований одна другой.

В сконструированном согласно изобретению химерном регуляторном участке источники генов опин-синтазы различны и предпочтительно выбраны из группы генов опин-синтазы, содержащей гены маннопин-, октопин-, нопалин- и агропин-синтазы.

Экспрессия активности GUS, направляемая промоторами mas и ocs с активирующими последовательностями, ограничена определенными типами клеток. Оперативное связывание активирующей последовательности ocs с промотором mas и с активирующей последовательностью, а также оперативное связывание активирующей последовательности mas с промотором ocs и с активирующей последовательностью показывает модуляцию экспрессии в сравнении с нативными конструкциями. Так, экспрессия GUS, а также иных генов может быть получена в большом числе типов клеток, включая сосуды ксилемы и эпидермальные клетки листьев. С другой стороны, ограниченные образцы экспрессии также могут быть получены в другом варианте изобретения. Химерный регуляторный участок, оперативно связывающий UAS ocs и минимальный промотор mas, дает сниженную экспрессию в сосудистой ткани листьев и экспрессию в стеблях, связанную с тканями флоэмы.

Изобретение также относится к рекомбинантному кластеру генов, кодирующему чужеродный полипептид. Рекомбинантный кластер генов может содержать находящуюся против хода транскрипции активирующую последовательность, выделенную из первого гена опин-синтазы A. tumefaciens и последовательность промотора или активирующую и промоторную последовательность, выделенные из иного, второго гена опин-синтазы A. tumefaciens. Все указанные последовательности оперативно связаны с последовательностью чужеродного гена. В конструкции последовательность чужеродного гена может быть оперативно связана с работающей в растении последовательностью терминатора и/или работающей в растении сигнальной последовательностью полиаденилирования. При этом последовательность терминатора и сигнал полиаденилирования могут оказывать влияние на ген или транскрипт гена. Последовательность терминатора и сигнал полиаденилирования имеют 3'-положение относительно гена.

Следующий аспект изобретения относится к комбинациям промотора и расположенной против хода транскрипции активирующей последовательности (регуляторным участкам), которые индуцируются повреждениями или вредителями. Первая из разработанных комбинаций (AmasPmas) предпочтительно экспрессируется в тканях корней и индуцируется патогенами, тогда как другая (AocsAmasPmas) экспрессируется во всем растении, но индуцируется вредителями. Эти экспрессирующие системы применимы для генов, направленных на корневых вредителей, например на нематоды или грибы, и могут использоваться против вредных насекомых и патогенов листьев. Например, гены, кодирующие нематоцидные токсины и белки, которые нарушают репродуктивный цикл нематод, могут быть применены в рамках настоящего изобретения.

Заражение патогенами индуцирует химерные регуляторные участки, в которых использован промотор маннопин-синтазы с активирующими последовательностями mas или ocs, как описано выше. Ряд генов, используемых для получения устойчивости против патогенов, описан Keen, Plant Molec. Biol. 19: 109-22 (1992).

Транскрипционные элементы, например промоторы и расположенные против хода транскрипции активирующие последовательности генов опин-синтазы, могут быть получены на основе имеющейся информации о последовательностях. Например, транскрипционные элементы генов октопин-синтазы описаны Leisner et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85: 2553-57 (1988); Leisner et al., Plant Cell 1: 925-36 (1989). Транскрипционные элементы генов маннопин-синтазы описаны DiRita and Gelvin, supra, Fox et al., Plant Molec. Biol. 20: 219-33(1992); Leung et al., Mol. Gen. Genet. 230:463-74 (1991); Langridge et al., Proc. Nat'l Acad. Sci USA 86: 3219-23 (1989). Транскрипционные элементы генов нопалин-синтазы Ha et al., Nucl. Acids Res. 17: 215-23 (1989); Mitra et al., Mol. Gen. Genet. 215: 294-99 (1989); Ebert et al., Proc. Nat'l Acad. Sci USA 84: 57-49 (1987); An et al. , Mol. Gen. Genet. 203: 245-50 (1986). Элементы контроля транскрипции гена агропин-синтазы описаны Bandyopadhyay et al., J. Biol. Chem. 264: 19399-406 (1989). Дополнительно, полная последовательность Т-ДНК описана Barker et al., Plant Molec. Biol. 2: 335-50 (1983).

Различные уровни и образцы экспрессии были получены следующими приведенными способами. Количество и образец экспрессии оценивают с помощью маркерных систем, например, описанных здесь gusA. Изобретение проиллюстрировано следующими примерами, которые не ограничивают его.

Пример 1 Добавление расположенных против хода транскрипции активирующих последовательностей mas или ocs к промотору mas или ocs и активирующей последовательности значительно увеличивает экспрессию GUS.

Как показано на фиг. 1, были созданы новые комбинации промоторов mas и ocs. Были проанализированы различные субдомены UAS mas, поскольку предварительный делеционный анализ показал, что последовательности из 138 пар оснований, находящиеся перед сайтом инициации транскрипции, являются достаточными для точной инициации транскрипции слитого гена mas2'/nptll в тканях корончатых галл подсолнечника. Последовательности от -138 до -318, однако, могут также участвовать в регуляции количественного уровня активности промотора mas2'. DiRita and Gelvin, Mot. Gen. Genet. 207; 233-41 (1987). Проанализированные UAS mas представлены: (i) UAS от -318 до -138; (ii) UAS' от -318 до -213; (iii) UAS'' от -318 до -111. См. фиг. 1.

Первая группа химерных регуляторных участков была сконструирована и связана в качестве транскрипционных слияний с геном uidA (gusA) с помощью двух делеций -318 и -138 пар оснований от сайта инициации транскрипции (конструкции 1-6 фиг. 1) промотора mas. Первый сет химерных регуляторных участков содержит (в любой ориентации) мономер или тример активирующей последовательности ocs (от-116 до -333) перед делецией -138 промотора mas (конструкции 3 и 4 фиг. 1). Второй сет химерных регуляторных участков содержит подобные мономеры или тримеры активирующих последовательностей ocs перед делецией -318 промотора mas (конструкции 5 и 6 фиг. 1). Этот участок ocs содержит палиндром из 16 пар оснований, а также 5'- и 3'-последовательности модулятора, которые важны для активирования промотора ocs в каллюсе и растениях табака при стабильной инкорпорации в геном растений. Leisner and Gelvin, 1988 and 1989 supra; Kononowicz et al., Plant Cell 4: 17-27 (1992).

Вторая группа химерных регуляторных участков была сконструирована в виде трансляционных слияний с геном uidA на основе двух делеций ocs в положениях -333 и -116 от сайта инициации транскрипции (конструкция 8-16 фиг. 1). Было создано два участка расположенной против хода транскрипции активирующей последовательности mas. Короткий участок mas, содержащий последовательность от -213 до -318, был использован в конструкциях 9-12 фиг. 1. Длинный участок mas, содержащий последовательность от -111 до -318, был использован в конструкциях 13-16 фиг. 1. Короткий или длинный участки mas были введены перед двумя делециями ocs.

Химерные конструкции были получены следующим образом. Основой всех конструкций был бинарный вектор pBl101.2 из Clontech. Плазмида pBl101.2 имеет основой репликон pRK290. Плазмида pBl101.2 содержит границы Т-ДНК, химерный ген nos-nptll для селекции на фоне канамицина у растений и не имеющий промотора ген GUS после сигнала полиаденилирования. Регион промотора mas был получен из фрагмента EcoRV-XbaI, который содержит участок от -138 до +65, соответствующий сайту инициации транскрипции (пары оснований 20128 - 20343) из pKan2-138. Barker et al., Plant Mol. Biol. 2: 335-50 (1983): DiRita and Gelvin, supra. Активирующая последовательность и промоторный участок mas от -318 до +65, соответствующие сайту инициации транскрипции (пары оснований 20128 - 20513) из pKan2-318, были изначально клонированы в сайты SmaI-XbaI CUp31 (производное pUC13, имеющее основу pUC13, но содержащее полилинкер, считываемый в направлении 5' - 3' как HindIII, PstI, SstI, SmaI, BamH1, XbaI). Полученные фрагменты рестрикции HindIII-XbaI из CUp31 были последовательно реклонированы в сайты HindIII-XbaI мультилинкера pBl101.2, с образованием плазмид pNi1 и pNi2 (конструкции 1 и 2 соответственно).

Фрагмент энхансера ocs из плазмиды pEN 1 (Leisner and Gelvin (1988) supra) был получен с помощью линкеров HindIII. Этот фрагмент соответствует от -333 до -116 сайта инициации транскрипции (пары оснований 13774 -13991, Barker et al., supra). Он был клонирован как тример в сайт HindIII pNi1 перед промотором mas в обеих ориентациях, что дало конструкции 3 и 4 (см. фиг. 1). Для создания конструкций 5 и 6 этот же фрагмент активирующей последовательности ocs был клонирован как тример или как мономер в сайт HindIII pNi2 перед активирующей последовательностью и промотором mas.

Фрагмент BamH1-EcoRI, содержащий участок промотора ocs с частью структурного гена ocs, который соответствует от -116 до +296 сайта инициации транскрипции (пары оснований 13774 - 13362) и фрагмент XbaI-EcoRI, содержащий активирующую последовательность и промоторный участок ocs, соответствующий участку от -333 до +296 сайта инициации транскрипции (пары оснований 13991 - 13362) из pEN1 (Leisner and Gelvin (1988), supra) были клонированы в сайты BamH1-EcoRI и XbaI-EcoRI соответственно, pBluescriptll SK⁺ (Стратаген). Фрагменты XbaI-EcoRV из полученных производных pBluescript были последовательно клонированы в сайты XbaI-SmaI pBl101.2 с созданием трансляционных слияний GUS в плазмидах pLH3 (конструкция 7) и pNi3 (конструкция 8). Фрагмент XhoI-HaeIII, содержащий короткую активирующую последовательность mas, соответствующую участку от -318 до -213 сайта инициации транскрипции (пары оснований 20513 - 20407) из pKan2-318, был клонирован в сайты XhoI-HincII pUX13 (производное pUC13 содержащее основу pUC13, но с сайтом SmaI, превращенным в сайт XhoI). Полученный XhoI-HindIII фрагмент был сделан непосредственно из фрагмента Klenow при введении линкеров XnaI. Фрагмент клонирован в обеих ориентациях в сайты XbaI pLH3 (конструкции 9 и 19) и pNi3 (конструкции 11 и 12). Аналогично длинный фрагмент активирующей последовательности masXhoI-MnII, соответствующей сайту инициации транскрипции (пары оснований 20513-20305) из pKan2-318, был сделан при непосредственном использовании фрагмента Klenow. Были введены линкеры XbaI и фрагмент был клонирован в обеих ориентациях в сайты XbaI pLH3 (конструкции 13 и 14) и pNi3 (конструкции 15 и 16).

Каждой из описанных конструкций последовательно трансформировали E. coli DH5a, выращенную при 37^oC в среде LB с канамицином. Ориентации инсерций были определены рестрикционным картированием. Плазмида pBl121 (Clontech), содержащая фрагмент HindIII-BamHI из 800 пар оснований с промотором CaMV 35S была использована в качестве контроля для сравнения относительных длин химерных регуляторных участков.

Рекомбинантные плазмиды, содержащие инсерций, были введены в A. tumefaciens LBA4404 способом скрещивания с участием трех родителей с использованием E. coli MM294, несущей мобилизующую плазмиду pRK2013. Hoekema et al., Nature 303: 179-80 (1983); Ditta et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 77: 7347-51 (1980). В LBA4404 рекомбинантные плазмиды сохраняются как независимые репликоны (бинарные векторы), которые могут быть перенесены в растения с последующей интеграцией в ядерную ДНК растения. Иные способы, например электропорация, также могут быть использованы для трансформации клеток A. tumefaciens плазмидами.

Трансконьюганты A. tumefaciens были отселектированы на чашках с минимальной средой AB, содержащей 0,5% глюкозы, 10 мкг/мл рифампицина и 50 мкг/мл канамицина. Lichtenstein and Draper, DNA Cloning: a practical approach (Glover ed. , Oxford-IRL Press 1986). Интродукция мобилизованной плазмиды в реципиентный штамм A. tumefaciens была определена блоттингом ДНК.

Диски, вырезанные из листьев шестинедельных стерильных культур Nicotiana tabacum var. Wisconsin 38, были трансформированы с помощью A. tumefaciens несущей конструкции, с использованием способа трансформации листовых дисков. Horsh et al., Science 227: 1229-31 (1985). Инфицированные листовые диски в течение трех дней выращивали на среде MS3⁺ без антибиотиков, затем диски перенесли на свежую среду, индуцирующую образование проростков, которая содержала 1250 мг/л карбенициллина и 200 мг/л канамицина. Kononowicz et al., Plant Cell 4: 17-27 (1992). Через 4 - 5 недель по одному побегу с каждого листового диска перенесли в среду, индуцирующую образование корней, которая содержала 500 мг/л карбенициллина и 50 мг/л канамицина. Через две недели растения перенесли в среду BGS (среда MS, содержащая 1 мг/л фолиевой кислоты, 10 мг/л индол-уксусной кислоты и 30 мг/л кинетина), содержащую 50 мг/л канамицина, с целью поддержания культур каждой линии in vitro.

Регенерированные трансгенные растения табака, содержащие каждую из описанных конструкций, были проверены на активность GUS. Маленькие кусочки ткани растения были выделены из четвертого или пятого полностью развернувшегося листа, около стеблей и из активно растущих молодых корней, когда растения сформировали по 10 - 12 листьев. Ткани были растерты в 200 мкл экстракционного буфера и сохранялись при -70^oC. Jefferson and Wilson, Plant Molecular Biology (Gelvin & Schilperoot eds., Kluwer Acad. Press 1991). Активность GUS определяли по Jefferson and Wilson, используя 10 мкл экстракта (20 - 30 мкг белка) и MUG (4-метилумбеллиферил -- D-глюкуронид) в качестве субстрата. Концентрацию белка определяли по Patterson, Analyt Biochem. 83: 346-56 (1977).

Отдельные трансгенные растения, содержащие одну и ту же конструкцию, имели различия в активности GUS (см. фиг. 2 - 5). Однако, п