Способ получения ксилита

Способ получения ксилита

Реферат

 

Способ относится к генной инженерии и может быть использован в микробиологической промышленности. Продуцирующие арабит дрожжи или грибы трансформируют ДНК, кодирующей образующую D-ксилозу D-арабитолдегидрогеназу, и ДНК, кодирующей ксилитолдегидрогеназу. Затем выращивают трансформированные дрожжи или грибы в условиях, обеспечивающих синтез ксилита. Ксилит извлекают. Дрожжи выбирают из Lygosaccharomyces rouxii, Candida polymorpha, Torulopsis candida, Pichia farinosa, Torulaspora hansenii. Грибы выбирают из Dendryphiella salina и Schizophyllum commune. Способ позволяет превращать легко доступные источники углерода, такие, как D-глюкоза в ксилит. 20 з.п. ф-лы, 7 табл., 11 ил.

Изобретение касается способов применения генетически модифицированных микроорганизмов для производства ценных химических соединений (метаболической инженерии) и, более конкретно, конструирования микробиологических штаммов посредством генетической манипуляции, способных превращать легко доступные источники углерода, такие, как D-глюкоза, в более ценный продукт, например, ксилит.

Ксилит представляет собой химическое соединение значительной ценности в качестве специального подслащивающего вещества. Он приблизительно так же сладок, как сахароза, и является нетоксичным и некариесогенным.

В настоящее время ксилит получают химической гидрогенизацией D-ксилозы. D-ксилозу получают из гидролизатов различных растительных материалов, в которых она всегда присутствует в смеси с другими пентозами и гексозами. Поэтому очистка ксилозы и также ксилита представляет собой значительную проблему. Известен ряд процессов такого рода. В качестве примеров можно упомянуть U.S. patents 3 784 408, 4 066 711, 4 075 406 и 4 008 285.

Восстановление D-ксилозы до ксилита может быть также достигнуто в микробиологическом процессе с применением либо природных штаммов (Barbosa, M.F.S. et al., J. Industrial Microbiol. 3:241 - 251 (1988)), либо полученных генной инженерией штаммов (Hallborn, J. et. al. , Biotechnology 9:1090 - 1095 (1991)). Однако получение субстрата D-ксилозы в форме, пригодной для дрожжевой ферментации, также представляет собой значительную проблему, вследствие того, что недорогие источники ксилозы, такие как сульфитно-спиртовая барда из таких процессов, как способ превращения в пульпу (сульфитный способ) и способ производства бумаги, содержит примеси, ингибирующие рост дрожжей.

Привлекательным альтернативным способом для производства ксилита было бы получение его ферментацией дешевого и легко доступного субстрата, такого как D-глюкоза. Однако неизвестны микроорганизмы, которые продуцируют ксилит в значительных количествах во время одноступенчатой ферментации какого-либо обычного источника углерода, иного, чем D-ксилоза и D-ксилулоза, которые структурно очень близки к ксилиту.

С другой стороны, многие микроорганизмы, в частности, осмофильные дрожжи, например, Zygosaccharomyces rouxii, Candida polymorpha и Torulopsis candida, продуцируют значительные количества близко родственного пентита, D-арабита, из D-глюкозы (Lewis D.H. and Smith D.C., New Phytol. 66:143 - 184 (1967)). Используя это свойство осмофильных дрожжей, H. Onishi and T. Suzuki разработали способ превращения D-глюкозы в ксилит посредством трех последовательных ферментаций (Appl. Microbiol. 18: 1031 - 1035 (1969)). В этом процессе D-глюкозу сначала превращают в D-арабит путем ферментации с осмофильным штаммом дрожжей. Затем D-арабит окисляют в D-ксилулозу ферментацией с Acetobacter auboxidans. Наконец, D-ксилулозу восстанавливают до ксилита в третьей ферментации с применением одного из многих штаммов дрожжей, способных восстанавливать D-ксилулозу в ксилит.

Очевидным недостатком этого способа является то, что он предусматривает три различные стадии ферментации, каждая из которых занимает от 2 до 5 дней; далее необходимы дополнительные стадии, такие как стерилизация и удаление клеток, что увеличивает стоимость технологии. Выход каждой стадии этого ферментационного процесса является низким, а количество побочных продуктов высоким. Таким образом, все еще существует необходимость в способах экономического получения ксилита в микробных системах из легко доступных субстратов.

Сущность изобретения.

Данное изобретение обеспечивает способы конструирования рекомбинантных хозяев и полученных этими способами рекомбинантных хозяев, способных продуцировать ксилит при росте на источниках углерода, отличающихся от D-ксилулозы или D-ксилозы, и отличающихся от их полимеров или олигомеров, или их смесей. Источники углерода, используемые этими хозяевами, являются недорогими и легко доступными. Микроорганизмы данного изобретения также способны секретировать синтезированный ксилит в культуральную среду.

Эта цель достигается посредством модификации метаболизма желательного микроорганизма, предпочтительно встречающегося в природе дрожжевого микроорганизма, путем введения и экспрессии желательных гетерологических генов. Эта цель также достигается посредством дальнейшей модификации метаболизма такого желательного микроорганизма таким образом, чтобы он избыточно экспрессировал и (или) имел инактивированную активность или экспрессию определенных генов, гомологичных для этого микроорганизма в его нативном состоянии.

Таким образом, целью данного изобретения является обеспечение способа получения ксилита, причем такой способ использует новый и неизвестный микробный штамм, рекомбинантного хозяина, называемого здесь также генетически сконструированным микроорганизмом, в качестве продуцента ксилита, причем такой генетически сконструированный микроорганизм продуцирует ксилит либо de novo, либо в увеличенных количествах по сравнению с нативным микроорганизмом.

Следующей целью данного изобретения является обеспечение способа получения ксилита, использующего новый метаболический путь, который был сконструирован в микроорганизме и который приводит к de novo или увеличенному продуцированию ксилита таким микроорганизмом.

Следующей целью данного изобретения является обеспечение способа получения ксилита, использующего указанный выше новый метаболический путь, модифицирующий путь и (или) метаболизм биосинтеза D-арабита, причем путь модифицирован таким образом, что микроорганизм теперь продуцирует ксилит посредством ферментации источников углерода, которые немодифицированный хозяин использует для биосинтеза D-арабита.

Дальнейшей целью изобретения является обеспечение способа получения ксилита, который использует упомянутый выше измененный путь D-арабита, причем такой путь был изменен путем удлинения предшествующего пути биосинтеза D-арабита) или путем замены одной или нескольких стадий пути D-арабита подобными стадиями, ведущими к образованию ксилита.

Дальнейшей целью изобретения является обеспечение способа получения ксилита, использующего описанный выше измененный путь биосинтеза D-арабита, причем этот путь изменяют удлинением предшествующего пути D-арабита путем введения и избыточной экспрессии генов, кодирующих образующую D-ксилулозу D-арабитолдегидрогеназу (EC 1.1.1.11) и ксилитолдегидрогеназу (EC 1.1.1.9) в продуцирующем D-арабит микроорганизме.

Дальнейшей целью изобретения является обеспечение способа получения ксилита при помощи указанного выше нового микроорганизма, использующего измененный путь биосинтеза D-арабита, упомянутого выше, причем этот путь изменен далее путем инактивации при помощи химически индуцированного мутагенеза или разрушения гена, кодирующего транскетолазу (EC 2.2.1.1), или гена, кодирующего D-ксилулокиназу (EC 2.7.1.17), в таком микроорганизме.

Дальнейшей целью изобретения является обеспечение способа получения ксилита при помощи описанного выше нового микроорганизма, причем этот способ использует генетически конструированную измененную избыточную экспрессию генов, кодирующих ферменты окислительной ветви пентозофосфатного пути и, в частности, D-глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу (EC 1.1.1.49) и (или) 6-фосфо-D-глюконатдегидрогеназу (EC 1.1.1.44) в этом микроорганизме.

Следующей целью изобретения является обеспечение способа получения ксилита при помощи нового микроорганизма, описанного выше, причем этот способ использует генетически сконструированную измененную избыточную экспрессию генов, кодирующих ферменты окислительной ветви пентозофосфатного пути, а также гена D-рибулозо-5-фосфатэпимеразы (EC 5.1.3.1).

Фиг. 1 является рестрикционной картой инсерции в плазмиде pARL2. Эта инсерция является инсерцией хромосомного локуса Klebsiella terrigena Php 1 и содержит ген D-арабитолдегидрогеназы K. terrigena. Открытый блок представляет хромосомную ДНК K. terrigena. Стрелка указывает местоположение и направление гена D-арабитолдегидрогеназы (EC 1.1.1.11) в этой ДНК.

Фиг. 2 показывает конструирование pYARD из pADH и pAAH5. На схемах плазмид одиночная линия (-) указывает бактериальные последовательности; волнистая линия указывает 2 мкм ДНК S. cerevisiae; открытая стрелка () указывает промотор ADCI (ADCI ген кодирует алкогольдегидрогеназу S. cerevisiae (ADCI, прежде называющуюся ADHI); открытый ромб указывает терминатор транскрипции ADCI; прямоугольный блок указывает ген LEU2 и заштрихованная стрелка указывает ген D-арабитолдегидрогеназы.

Фиг. 3 изображает конструирование плазмиды pJDB(AX)-16. XYL2 является геном ксилитдегидрогеназы из Pichia stipitis. daLD является геном D-арабитолдегидрогеназы. ADCI представляет собой зону регуляции транскрипции (промотор) гена ADCI, который предшествует кодирующей последовательности daLD и оперативно связан с ней. Эти символы неодинаковы с символами на фиг. 4. На схемах плазмид одиночная линия (-) обозначает бактериальные последовательности 2 мкм ДНК, где отмечено: темная стрелка обозначает промотор ADCI; затененный ромб обозначает терминатор транскрипции ADCI; прямоугольный блок обозначает маркерный ген LEU2; заштрихованная стрелка обозначает ген XYL2 и блокированный прямоугольник обозначает daLD ген.

Фиг. 4 показывает конструирование челночного вектора pSRT(AX)-9 E. coli-Z.rouxii. Символы такие же, что и в фиг. 3.

Фиг. 5 изображает рестрикционную карту клонированного фрагмента рДНК T. candida.

Фиг. 6 показывает конструирование плазмиды pTC(AX).

Фиг. 7 показывает рестрикционную карту клонированного фрагмента рДНК T. candida.

Фиг. 7a показывает конструирование плазмиды pCPU(AX).

Фиг. 8 изображает клонирование ZWF1 и gnd гена.

Фиг. 8a показывает конструирование плазмиды PAAH (gnd).

Фиг. 9 показывает конструирование плазмиды pSRT(ZG).

Фиг. 10 изображает культивирование штамма Z.rouxii ATCC 13356 (pSRT(AX)-09) в ферментере.

Фиг. 11 изображает культивирование мутанта, полученного из штамма Z. rouxii ATCC 13356 [pSRT(AX)-9] в ферментере.

Детальное описание предпочтительных вариантов.

В следующем далее описании широко используются термины, применяемые в технологии рекомбинантных ДНК (генной, или генетической инженерии). Для обеспечения ясного и согласующегося понимания данной специфики и формулы изобретения, в том числе сферы действия, давшей такие термины, даются следующие определения.

Источник углерода иной, чем ксилоза или ксилулоза.

В применении здесь "источник углерода иной, чем D-ксилоза и D-ксилулоза" обозначает углеродный субстрат для получения ксилита иной, чем D-ксилоза и D-ксилулоза или их полимеры или олигомеры, или их смеси (такие как ксилан и гемицеллюлоза). Такой источник углерода предпочтительно поддерживает рост генетически сконструированных микробных хозяев данного изобретения и ферментацию в дрожжевых хозяевах. Многие дешевые и легко доступные соединения можно использовать в качестве источников углерода для получения кслиита в микробных хозяевах данного изобретения, в том числе D-глюкозу и различные содержащие D-глюкозу сиропы и смеси D-глюкозы с другими сахарами. Другие сахара, ассимилируемые хозяевами данного изобретения, в том числе дрожжами и грибами, такие как различные альдо- и кетогексозы (например, D-фруктоза, D-галактоза и D-манноза) и их олигомеры и полимеры (например, сахароза, лактоза, крахмал, инулин и мальтоза), включаются в этот термин. Пентозы, иные, чем ксилоза и ксилулоза, и неуглеводные источники углерода, такие как глицерин, этанол, различные растительные масла или углеводороды (предпочтительно н-алканы, содержащие 14-16 атомов углерода) также включаются в этот термин. Спектр источников углерода, применимых в качестве субстратов для получения ксилита хозяевами данного изобретения, будут варьировать в зависимости от микробного хозяина. Например, глюкоза и содержащие глюкозу сиропы являются предпочтительным источником углерода для получения ксилита с применением генетически манипулируемых Zygosaccharomyces rouxii этого изобретения, тогда как н-алканы, предпочтительно имеющие 14-16 атомов углерода, являются предпочтительным источником для модифицированных штаммов Candida tropicalis.

Ген. Последовательность ДНК, содержащая матрицу для РНК-полимеразы. РНК, транскрибируемая с гена, может кодировать и не кодировать белок. РНК, которая кодирует белок, называют мессенджер РНК (мРНК) и, в эукариотах, она транскрибируется РНК-полимеразой II. Можно также сконструировать ген, содержащий матрицу РНК-полимеразы II (в результате присутствия промотора РНК-полимеразы II), с которой транскрибируется последовательность РНК, имеющая последовательность, комплементарную последовательности специфической мРНК, но не нетранслируемую нормально. Такая генная конструкция названа здесь "геном антисмысловой РНК", а такой РНК-транскрипт назван "антисмысловой РНК". Антисмысловые РНК не транслируются нормально, вследствие присутствия стоп-кодонов трансляции в антисмысловой последовательности РНК.

"Комплементарная ДНК" или ген "кДНК" обозначает рекомбинантные гены, синтезированные, например, обратной транскрипцией мРНК и не имеющие поэтому расположенных внутренних интронов. Клоны генов из геномной ДНК обычно содержат интроны.

Клонирующий вектор. Плазмидная или фаговая ДНК или другая последовательность ДНК, которая способна переносить генетическую информацию, в частности ДНК, в клетку хозяина. Клонирующий вектор часто характеризуется одним или небольшим числом сайтов узнавания эндонуклеазами, в которых такие последовательности ДНК могут быть разрезаны определенным образом без потери основной биологической функции вектора и в которые может быть сплайсирована желаемая ДНК, чтобы вызвать ее клонирование в клетке хозяина. Клонирующий вектор может, кроме того, содержать маркер, пригодный для использования в идентификации клеток, трансформированных этим клонирующим вектором, и затравки репликации, делающие возможными сохранение и репликацию вектора в одном или нескольких прокариотических или эукариотических хозяевах. Маркерами могут быть, например, устойчивость к тетрациклину или устойчивость к ампициллину. Для "клонирующего вектора" иногда используют слово "вектор". "Плазмида" представляет собой клонирующий вектор, обычно кольцевую ДНК, которая сохраняется и реплицируется автономно по меньшей мере в клетке одного хозяина.

Экспрессирующий вектор. Переносчик или вектор, подобный клонирующему вектору, но такой вектор, который поддерживает экспрессию клонированного в него гена после трансформации в хозяина. Этот клонированный ген обычно помещают под контроль (то есть оперативно соединяют) определенных регуляторных последовательностей, таких как промоторные последовательности, которые могут быть обеспечены вектором или рекомбинантной конструкцией клонированного гена. Регуляторные последовательности экспрессии будут варьировать в зависимости от того, предназначен ли этот вектор для экспрессии оперативно связанного гена в прокариотическом или в эукариотическом хозяине, и могут дополнительно содержать элементы транскрипции, такие как энхансерные элементы (активирующие последовательности, расположенные в направлении 3'-5', то есть в обратном направлении от гена) и терминирующие последовательности, и (или) сайты инициации трансляции и сайты терминации трансляции.

Хозяин. Хозяином называют клетку, прокариотическую или эукариотическую, которую используют в качестве реципиента и носителя рекомбинантного материала.

Хозяин данного изобретения. "Хозяин данного изобретения" представляет собой микробного хозяина, который в природе не продуцирует ксилит в значительных количествах во время ферментации из обычных источников углерода, иных чем D-ксилоза или D-ксилулоза, или их полимеры, или олигомеры, или их смеси, но сконструирован таким образом, что он может продуцировать ксилит из таких источников углерода согласно способам данного изобретения. Под "значительным количеством" подразумевают количество, которое достаточно для выделения ксилита в чистом виде, или количество, которое можно надежно измерить аналитическими способами, обычно применяемыми для анализа углеводов в микробном ферментационном бульоне.

Арабитолдегидрогеназа. Существуют два типа D-арабитолдегидрогеназ: образующая D-ксилолозу (EC 1.1.11) и образующая D-рубилозу. Образующие D-рубилозу дегидрогеназы обнаружены в дрожжах и грибах дикого типа. Образующие D-ксилулозу арабитолдигидрогеназы известны только в бактериях. Если нет других указаний, здесь имеют в виду образующую D-ксилулозу арабитолдегидрогеназу и называют ее арабитолдегидрогеназой.

Окислительная ветвь пентозофосфатного пути. "Окислительная ветвь пентозофосфатного пути" включает ту часть пентозофосфатного шунта, которая катализирует окислительные реакции, такие как реакции, катализируемые D-глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой (EC 1.1.1.49) и 6-фосфо-D-глюконатдегидрогеназой (EC 1.1.1.44), и которая использует гексозные субстраты для образования пентозофосфатов. "Неокислительная" часть пентозофосфатного пути (которая также катализирует нетто-образование рибозы из D-глюкозы) характеризуется неокислительными реакциями изомеризации, например, реакциями, катализируемыми рибозо-5-фосфатизомеразой, D-рибулозо-5-фосфат-3- эпимеразой и трансальдолазой. См. Biological Chemistry, H.R. Mahler and E.H. Cordes, Harper and Row, publishers, New York, 1966, pp. 448-454.

Функциональное производное. "Функциональное производное" белка или нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу, которая была химически или биохимически произведена из (получена из) такого белка или нуклеионовой кислоты и которая сохраняет биологическую активность (либо функциональную, либо структурную), которая является характеристикой нативных белка или нуклеиновой кислоты. Термин "функциональное производное" охватывает "фрагменты", "варианты", "аналоги" или "химические производные" молекулы, которые сохраняют желаемую активность нативной молекулы.

В применении здесь, молекула, которую называют "химическим производным" другой молекулы, если она содержит дополнительные химические части молекулы, в норме не являющиеся частью этой молекулы. Такие части молекулы могут улучшать растворимость молекулы, период биологического полупревращения и т.д. Такие части молекул могут уменьшать токсичность молекулы или элиминировать или аттенуировать (ослаблять) какое-либо нежелательное действие молекулы и т. д. Молекулярные части, способные медиировать такие действия, описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences (1980). Способы соединения таких молекулярных частей с молекулой хорошо известны в данной области.

Фрагмент. Термин "фрагмент" молекулы, такой как белок или нуклеиновая кислота, относится к части нативной аминокислотной или нуклеотидной генетической последовательности и, в частности, к функциональным производным данного изобретения.

Вариант или аналог. Термин "вариант" или "аналог" белка или нуклеиновой кислоты относится к молекуле, в основном сходной по структуре и биологической активности с нативной молекулой, такой, которая кодируется функциональным аллелем.

Конструирование метаболических путей для биосинтеза ксилита.

Согласно данному изобретению нативные метаболические пути микробного хозяина манипулируются таким образом, чтобы уменьшить или элиминировать (исключить) использование углерода в целях других, чем образование ксилита. Все хозяева изобретения продуцируют ксилит в одной ферментационной стадии. В одном варианте хозяева данного изобретения могут обладать ксилитолдегидрогеназной (EC 1.1.9) активностью, достаточной для получения ксилита. Однако, как описано ниже, в тех хозяевах, в которых желательно перепроизводство ксилитолдегидрогеназной активности, в клетку хозяина могут быть трансформированы рекомбинантных гены, кодирующие ксилитолдегидрогеназу.

В практической реализации изобретения все хозяева данного изобретения отличаются способностью синтезировать ксилит из структурно неродственных источников углерода, таких как D-глюкоза, а не из D-ксилозы и (или) D-ксилулозы. Хозяева данного изобретения способны также секретировать синтезированный ксилит в среду.

В частности, в приведенных в качестве примеров и предпочтительных вариантах хозяева изобретения характеризуются наличием у них одного из двух путей. Во-первых, путь, в котором арабит является промежуточным продуктом в образовании ксилита, и, во-вторых, путь, в котором ксилулозо-5-фосфат направляется в образование ксилита через дефосфорилирование и восстановление. В соответствии с этим хозяева изобретения характеризуются по меньшей мере одним из следующих генетических изменений: (1) ген, кодирующий белок, обладающий D-арабитолдегидрогеназной активностью (EC 1.1.1.11) был клонирован в хозяине, что обеспечивает, таким образом, превращение D-арабита в D-ксилозу (характеристика пути I); и (или) (2) ген нативного хозяина, кодирующий транскетолазную активность, был инактивирован (характеристика пути II).

Кроме того, может быть выполнено множество других дополнительных модификаций хозяина, так чтобы усилить способности продуцирования ксилита такими хозяевами. Например, хозяева, описанные в (1) и (2), могут быть далее модифицированы таким образом, что: (3) ген, кодирующий белок, обладающий ксилитолдегирогеназной активностью (EC 1.1.1.9), был клонирован в хозяине; (3') ген нативного хозяина, кодирующий D-ксилулокиназу (EC 2.7.1.17), был инактивирован; (4) ген, кодирующий белок, обладающий D-глюкозо-6-фосфат- дегидрогеназной активностью (EC 1.1.1.49), был клонирован в хозяине; (4') ген, кодирующий белок, обладающий 6-фосфо-D-глюконат- дегидрогеназной активностью (EC 1.1.1.44), был клонирован в хозяине; (5) ген, кодирующий белок, обладающий D-рибулозо-5-фосфат-3- эпимеразной (EC 5.1.3.1) активностью, был клонирован в хозяине.

В предпочтительном варианте хозяева данного изобретения обладают более чем одним из описанных выше генетических изменений. Например, в предпочтительном варианте углерод идет "прямо" (то есть в одной стадии) от D-арабита к D-ксилулозе и от D-ксилулозы "прямо" к ксилиту. Таким образом, в таком варианте хозяин данного изобретения изменен таким образом, что в хозяина были клонированы ген, кодирующий белок, обладающий образующей D-ксилулозу D-арабитолдегидрогеназной активностью, и ген, кодирующий ксилитолдегидронагеназу (EC 1.1.1.9). Следует отметить, что в то время как во многих вариантах, D-арабит синтезируется внутри клетки из других источников углерода хозяевам изобретения, D-арабит можно было бы добавить извне непосредственно к среде.

В другом предпочтительном варианте путь биосинтеза ксилита не содержит арабит в качестве промежуточного продута. Предпочтительнее углерод идет из D-ксилулозо-5-фосфата к D-ксилулозе и далее ко ксилиту. При применении D-глюкозы в качестве источника углерода углерод идет через окислительную часть пентозофосфатного пути, из D-глюкозы к D-глюкозо-6-фосфату- к 6-фосфо-D-глюконату - к D-рибулозо-5-фосфату. D-рибулозо-5-фосфат эпимеризуется далее до D-ксилулозо-5-фосфата, дефосфорилируется до D-ксилулозы и восстанавливается до ксилита.

Таким образом, хозяин данного изобретения для применения этого варианта является хозяином, в котором: (a1) ген, кодирующий белок, имеющий D-глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназную (EC 1.1.1.49) активность, был клонирован в хозяина или нативный ген хозяина избыточно экспрессируется; и/или) (a2) ген, кодирующий белок, обладающий D-фосфо-D-глюконат-дегидрогеназной (EC 1.1.1.44) активностью, был клонирован в хозяина или нативный ген этого хозяина избыточно экспрессируется; и/или) (a3) ген, кодирующий белок, обладающий D-рибулозо-5-фосфат-3- эпимеразной активностью, был клонирован в хозяина или ген этого хозяина избыточно экспрессируется; и/или) (a4) ген, кодирующий белок, обладающий ксилитолдегидрогеназной (EC 1.1.1.9) активностью, был клонирован в хозяина или нативный ген этого хозяина избыточно экспрессируется; (b) нативный ген транскетолазы был инактивирован; и (или) (c) нативный ген хозяина, кодирующий ксилулокиназу (EC 2.7.1.17) было инактивирован.

Стадия дефосфорилирования (превращение D-ксилулозофосфата до D-ксилулозы) является единственной стадией, катализируемой ферментом, который не был охарактеризован в чистом виде. Однако предварительно было показано, что ферментная активность, ответственная за подобную стадию (превращение D-рибулозо-5-фосфата в D-рибулозу) в нативном образующем D-арабит пути осмофильных дрожжей, не является специфичной и способна также дефосфорилировать ксилулозо-5-фосфат (Ingram J. M. и W.A. Wood, J. Bacteriol 89: 1186 - 1194 (1965)). Мутация транскетолазы и избыточная экспрессия этих двух дегидрогеназ окислительного пентозофосфатного пути служит двойной цели. Во-первых, они могут увеличивать эффективность пути I путем увеличения количества рибулозо-5-фосфата в клетке и, следовательно, образования арабита и ксилита. Во-вторых, избыточное накопление ксилузозо-5-фосфата, который необходим для действия пути II, должно также вытекать из той же самой комбинации модификаций.

Таким образом, способы, использующие природно встречающийся путь, ведущий к образованию D-арабита из различных источников углерода и удлинение этого пути посредством еще двух реакций для превращения D-арабита в ксилит, не являются единственным возможным путем в данном изобретении. Могут быть сконструированы другие пути, ведущие ко ксилиту как конечному метаболическому продукту и не включающие в себя D-арабит в качестве промежуточного продукта. Таким образом, путь ко ксилиту от D-рибулозо-5-фосфата может быть реализован через более чем одну цепь реакций. D-рибулозо-5-фосфат может быть эффективно превращен в D-рибулозо-5-фосфат D-рибулозо-5-фосфат-3-эпимеразой и, если дальнейшее превращение D-рибулозо-5-фосфата предотвращается мутацией в гене транскетолазы, но накопленный D-рибулозо-5-фосфат может дефосфорилизоваться той же самой неспецифической фосфатазой, что и D-рибулозо-5-фосфат (Ingram, J.M. et al., J. Bacteriol. 89: 1186 - 1194 (1965)), и восстанавливаться в ксилит ксилитолдегидрогеназой. Реализация этого пути может далее требовать инактивации гена D-ксилулокиназы для того, чтобы уменьшить энергические потери, обусловленные бесполезной петлей: D-ксилулозо-5-фосфат ---> D-ксилулоза ---> D-ксилулозо-5-фосфат. Дополнительное генетическое изменение - введение и (избыточная) экспрессия гена D-рибулоксиназы (EC 2.7.1.47) могло бы уменьшить одновременное образование D-арабита такими штаммами путем улавливания D-рибулозы, продуцируемой неспецифической фосфатазой. D-рибулоза может превращаться опять в D-рибулозо-5-фосфат и далее в D-ксилулозо-5-фосфат.

Конструирование хозяев данного изобретения.

Способ генетического конструирования хозяев данного изобретения, согласно изобретению, облегчается путем выделения и частичного секвенирования чистого белка, кодирующего целевой фермент или клонированием генетических последовательностей, способных кодировать такой белок с применением технологии полимеразной цепной реакции (PCR); и путем экспрессии таких генетических последовательностей. В применении здесь, термин "генетические последовательности" относится к молекуле нуклеиновой кислоты (предпочтительно ДНК). Генетические последовательности, способные кодировать белок, получены из множества источников. Эти источники включают в себя геномную ДНК, кДНК, синтетическую ДНК и их комбинации. Предпочтительным источником геномной ДНК является геномная библиотека дрожжей. Предпочтительным источником кДНК является библиотека кДНК, приготовленная из мРНК дрожжей, росших в условиях, о которых известно, что они индуцируют экспрессию целевой мРНК или белка.

кДНК изобретения не содержит природно встречающихся интронов, если эта кДНК получена с применением зрелой мРНК в качестве матрицы. Геномная ДНК изобретения может содержать и может не содержать природно встречающиеся интроны. Кроме того, такая геномная ДНК может быть получена в ассоциации с 5' промоторным районом последовательностей гена и (или) с 3'-районом терминации транскрипции. Кроме того, такая геномная ДНК может быть получена в ассоциации с генетическими последовательностями, кодирующими 5' нетранслируемый район этой мРНК, и (или) с генетическими последовательностями, кодирующими 3' нетранслируемый район. В том смысле, что клетка хозяина может узнавать регуляторные сигналы транскрипции и(или) трансляции, ассоциированные с экспрессией мРНК и белка, 5' и (или) 3' нетранскрибируемые районы нативного гена и (или) 5' и (или) 3' нетранслируемые районы этой мРНК могут сохраняться и применяться для регуляции транскрипции и трансляции. Геномная ДНК может быть экстрагирована и очищена из какой-либо клетки хозяина, в частности, грибного хозяина, которая природно экспрессирует целевой белок способами, хорошо известными в данной области (например, см. Guide of Molecular Cloning Techniques, S.L. Berger et al., eds. Academic Precc (1987)). Предпочтительно применяемые препараты мРНК обогащены мРНК, кодирующей целевой белок, либо природно, путем выделения из клеток, продуцирующих большие количества этого белка, либо in vitro, путем применения способов, обычно используемых для обогащения препаратов мРНК специфическими последовательностями, такими как центрифугирование в градиенте сахарозы, или обоими путями.

Для клонирования в векторе такие подходящие препараты ДНК (геномной ДНК или кДНК) фрагментируют гидродинамически или расщепляют ферментами соответственно и лигируют в подходящие векторы для образования библиотеки рекомбинантных генов (геномной библиотеки или библиотеки кДНК).

Последовательность ДНК, кодирующая целевой белок или его функциональные производные, может быть встроена в ДНК вектор в соответствии с обычными способами, такими как получение тупых концов или выступающих концов для лигирования, расщепление рестриктирующими ферментами для обеспечения подходящих концов, заполнение липких концов, если нужно, обработка щелочной фосфатазой для того, чтобы избежать нежелательного соединения, и лигирование при помощи соответствующих подходящих лигаз. Способы для таких манипуляций описаны Maniatis, T. , (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, second edition, 1988) и хорошо известны в этой области.

Библиотеки, содержащие последовательности, кодирующие целевой ген, можно скринировать и целевую последовательность можно идентифицировать при помощи средств, которые специфически выбирают последовательность, кодирующую такой ген или белок, таких, например, как a) гибридизация с подходящим зондом нуклеиновой кислоты (зондами), содержащим последовательность, специфическую для этой ДНК или этого белка, или b) гибридизационно-выбранный трансляционный анализ, в котором нативную мРНК, гибридизующуюся с целевым клоном, транслируют in vitro и продукты трансляции характеризуются далее, или с) если клонированные генетические последовательности сами способны экспрессировать мРНК, иммунопреципитация транслированного белкового продукта, продуцированного хозяином, содержащим этот клон.

Олигонуклеотидные зонды, специфические для определенного белка, которые могут быть использованы для идентификации клонов для этого белка, могут быть построены на основе знания аминокислотной последовательности этого белка или на основе знания последовательности нуклеиновой кислоты ДНК, кодирующей этот белок или родственный белок. Альтернативно, можно получить антитела против очищенных форм данного белка и использовать их для идентификации присутствия уникальных белковых детерминант в трансформантах, экспрессирующих целевой клонированный белок. Последовательность аминокислотных остатков в пептиде обозначается здесь либо путем применения их обычных обозначений из трех букв, либо путем применения обозначений из одной буквы. Перечень этих трехбуквенных и однобуквенных обозначений можно найти в учебниках, таких как Biochemistry, Lehninger, A. , Worth Publishers, New York, NY (1970). Если аминокислотная последовательность написана горизонтально, если нет других указаний, амино-конец предполагается на левом конце, а карбокси-конец находится на правом конце. Подобным образом, если нет иных указаний или сообщений в контексте, последовательность нуклеиновой кислоты представлена с 5'-концом слева.

Поскольку генетический код является вырожденным, более чем один кодон может использоваться для кодирования определенной аминокислоты (Watson, J.D. , In: Molecular Biology of the gene, 3rd Ed., W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977), pp. 356 - 357). Пептидные фрагменты анализируют для идентификации последовательностей аминокислот, которые могут кодироваться олигонуклеотидами, имеющими самую низкую степень вырожденности. Это выполняют предпочтительно путем идентификации последовательностей, содержащих аминокислоты, которые кодируются только одним кодоном.

Хотя иногда аминокислотная последовательность может кодироваться только одной олигонуклеотидной последовательностью, часто аминокислотная последовательность может кодироваться любым из набора сходных олигонуклеотидов. Важно, что хотя все члены этого набора содержат олигонуклеотидные последовательности, способные кодировать один и тот же пептидный фрагмент и, следовательно, потенциально содержат ту же самую олигонуклеотидную последовательность, что и этот ген, который кодирует данный пептидный фрагмент, только один член этого набора содержит нуклеотидную последовательность, которая идентичная кодирующей экзон последовательности этого гена. Поскольку этот член присутствует внутри данного набора олигонуклеотидов и способен гибридизоваться с ДНК, даже в присутствии других членов этого набора, можно применять нефракционированный набор олигонуклеотидов тем же образом, каким применяли бы единственный олигонуклеотид, для клонирования гена кодирующего данный пептид.

С применением генетического кода один или несколько олигонуклеотидов могут быть идентифицированы из аминокислотной последовательности, каждый из которых был бы способен кодировать целевой белок. Вероятность того, что конкретный олигонуклеотид будет действительно составлять (образовывать) истинную кодирующую белок последовательность, можно оценить путем рассмотрения ненормального спаривания оснований и частоты, с которой конкретный кодон действительно используется (для кодирования конкретной аминокислоты) в эукариотических клетках. С применением "правил использования кодонов" можно идентифицировать одну олигонуклеотидную последовательность или набор олигонуклеотидных последовательностей, которые содержат теоретически "наиболее вероятную" нуклеотидную последовательность, способную кодировать эти белковые последовательности.

Пригодные для этого олигонуклеотиды или набор олигонуклеотидов, которые способны кодировать фрагмент определенного гена (или которые комплементарны такому олигонуклеотиду или набору олигонуклеотидов), могут быть синтезированы при помощи средств, хорошо известных в данной области (см. например, Synthesis and Application of DNA and RNA, S.A. Narang, ed., 1987, Academic Press, San Diego, CA) и применимы в качестве зонда для идентификации и выделения клона этого гена способами, известными в этой области. Способы гибридизации нуклеиновых кислот и идентификации клонов описаны Maniatis, T., et al. , in.: Molecular Cloning, A Laboratory Mannul, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1982) и Hames, B.D., et al., in: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)). Те члены описанной выше библиотеки генов, которые способны к такой гибридизации, затем анализируют для определения протяженности и природы кодирующих последовательностей, которые они содержат.

Для облегчения детектирования целевой кодирующей последовательности ДНК описанный выше зонд ДНК метят деткектируемой группой. Такой детектируемый группой может быть любой материал, имеющий детектируемое физическое или химическое свойство. Такие материалы были хорошо разработаны в области гибридизации нуклеиновых кислот и